Ägeda entsefalopaatia ja febriilsete krampidega tserebrospinaalvedeliku erinevate omaduste visualiseerimine, kasutades 1h nmr mustrituvastusanalüüsi | laste uuringud

Ägeda entsefalopaatia ja febriilsete krampidega tserebrospinaalvedeliku erinevate omaduste visualiseerimine, kasutades 1h nmr mustrituvastusanalüüsi | laste uuringud

Anonim

Õppeained

  • Laste neuroloogilised häired

Abstraktne

Taust:

Ägeda entsefalopaatia korral võib seisundi halvenemine olla kiire ja haiguse progresseerumise vältimiseks on oluline varajane sekkumine. Kuid ägedal perioodil on raske eristada ägedat entsefalopaatiat febriilsetest krampidest. Seega on varase sekkumise võimaldamiseks otsitud varajast diagnostilist markerit. Bioloogiliste vedelike, näiteks tserebrospinaalvedeliku (CSF) keemiliste omaduste uurimiseks kasutatakse prootoni tuumamagnetresonantsspektroskoopiat (1H NMR). Selle uuringu eesmärk oli välja selgitada, kas 1H NMR spektrite tuvastamine võib eristada ägeda entsefalopaatia ja palavikuhoogudega patsientidest saadud CSF-i.

Meetodid:

CSF saadi patsientidelt, kellel oli äge entsefalopaatia ( n = 4), keerulised febriilsed krambid ( n = 9) ja lihtsad febriilsed krambid ( n = 9).

Tulemused:

CSF NMR spektrid ei erinenud visuaalselt kolmes rühmas. Spektraalseid andmeid analüüsiti väikseima ruutu osalise diskrimineeriva analüüsi abil ja visuaalseks joonistati iga proovi väikseimate ruutude osalised skoorid. Kolm patsiendirühma koondusid proovitükkidele eraldi.

Järeldus:

Selles eeluuringus suutsime visualiseerida1H-TMR andmete mustrituvastusanalüüsi abil ägeda entsefalopaatia ja lihtsate ja keeruliste palavikuhoogudega patsientidelt saadud CSF-i erinevaid tunnuseid.

Peamine

Ägedat entsefalopaatiat iseloomustab kõrge palaviku, letargia, krambihoogude ja teadvusekaotuse äkiline ilmnemine ning selle viirusnakkuste, sealhulgas põhjustavate viiruste, näiteks gripiviiruse, ja muude etioloogiate põhjustatud nakkuste korral on halb prognoos (1, 2, 3 ). Arvestades, et entsefalopaatia põhjustab kiiret halvenemist ja halva prognoosi, on varajane sekkumine haiguse progresseerumise ja neuroloogiliste komplikatsioonide vältimiseks hädavajalik. Kuid ägedal perioodil on raske eristada ägedat entsefalopaatiat palavikuhoogudest, eriti keerukatest palavikuhoogudest (4, 5, 6, 7). Seega on varase sekkumise võimaldamiseks otsitud varajast diagnostilist markerit. Varem tuvastasime tserebrospinaalvedelikus (CSF) ägeda entsefalopaatia uue neuropeptiidmarkeri, kasutades pinnaga täiustatud lasersorptsiooni / ionisatsiooni lennuaja massispektromeetriat (8).

Bioloogiliste vedelike nagu CSF, seerum ja uriin keemiliste omaduste muutuste uurimiseks on kasutatud prootoni tuumamagnetresonantsspektroskoopiat (1H NMR) (9). Mustrituvastus mitme muutujaga analüüsi abil on kemomeetriline tehnika. Hüpoteesisime, et 1H NMR spektroskoopia andmete tuvastamine eristab ägeda entsefalopaatia, keeruliste palavikuhoogude ja lihtsate palavikuhoogudega patsientidelt saadud CSF-i tunnuseid.

Tulemused

Patsientide keskmine vanus ei erinenud rühmade vahel, samuti ei vähenenud CSF-i rakkude arv, üldvalk ega üldsuhkrusisaldus ( tabel 1 ). CSF NMR spektrid ei erinenud visuaalselt kolmes rühmas. Osalise vähimruutude diskrimineeriva analüüsi (PLS-DA) skoorgraafik on näidatud joonisel fig 1a . Iga punkt tähistab üksikproovi. Faktorid 1 ja 2 arvutati PLS-DA algoritmi abil, kasutades kõiki 22 H-TMR spektriandmete komplekti. Kolm patsiendirühma koondusid proovitükile eraldi.

Täissuuruses tabel

Image

1 H NMR skoori ja korrelatsiooni-laadimisgraafikud PLS-DA- l . ( a ) Ägeda entsefalopaatia, lihtsate palavikuhoogude ja keerukate palavikuhoogudega patsientide tulemuste graafik, mis põhineb CSS1H NMR-i PLS-DA- l . Igas punktis on esitatud üksikproov. Mustad ruudud näitavad entsefalopaatiat; avatud ringid näitavad lihtsaid febriilseid krampe; täidetud ringid näitavad keerulisi palavikuhooge. ( b, c ) Koefitsiendid ( b ) teguri 1 ja ( c ) teguri 2 jaoks. Horisontaaltelg tähistab x-muutujaid ja vertikaaltelg tähistab panuse astet. Välisjoone lähedal asuv korrelatsioonikoormus näitab, et selle muutuja seletatav dispersioon kuvatavate komponentide korral on 100% lähedal. Sisemine kriipsjoon vastab seletatavale dispersioonile 50% (seega korrelatsioon 0, 7). CSF, tserebrospinaalvedelik; NMR, tuumamagnetresonants; PLS-DA, osalise vähimruutude diskrimineeriv analüüs.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Põhikomponentide analüüs (PCA) on matemaatiline protseduur, mis kasutab andmete ortogonaalset lineaarset teisendust võimalike korrelatsioonimuutjate teisendamiseks korreleerimata primaarkomponentideks. Erinevalt põhikomponentide analüüsist, mis maksimeerib dispersiooni ühes andmekogumis, maksimeerib PLS kahe andmekogumi kovariatsiooni, otsides mõlemast komplektist muutujate lineaarseid kombinatsioone. PLS-DA on klassikaline PLS-regressioon (koos regressioonirežiimiga), kuid vastuse muutuja on kategooriline, st näitab proovide klasse / kategooriaid. PLS-DA kasutatakse sageli klassifitseerimise ja diskrimineerimise probleemide korral (st kontrollitud klassifikatsioon). 1. tegur selgitab võimalikult palju andmete varieeruvust ja 2. tegur selgitab võimalikult palju ülejäänud varieeruvust. Säilitatakse ainult need tegurid, mis seletavad kõige erinevamat varianti. Faktorite 1 ja 2 punktide graafik annab teavet NMR andmete kohta ja võtab kokku andmete varieeruvuse. Faktor 1 hõivas 31% NMR andmete erinevusest ja tegur 2 hõivati ​​10%. Need kaks tegurit koos kirjeldasid 41% (31 + 10%) NMR andmete dispersioonist.

Igal PLS-DA skoorigraafikul on korrelatsiooni-laadimisprofiil, mis aitab määrata rühmitamise ja eraldamise eest vastutavad spektripiirkonnad. Vastavad korrelatsioonikoormused on näidatud joonisel 1b teguri 1 jaoks ja joonisel 1c teguri 2 jaoks, kus horisontaaltelg tähistab keemilist nihet ja vertikaaltelg tähistab panuse astet.

Kalibreerimise ja ristvalideerimise analüüsi tulemused on järgmised: äge entsefalopaatia tegur 1: kalibreerimise ruutkeskmine ruutkeskmine viga (RMSEC) = 0, 385, ristvalideerimise ruutkeskmine viga (RMSECV) = 0, 407, Kalibreerimisandmekogumi ( R 2 c) selgitatud dispersiooniga diagrammi R2 väärtus ( R 2 c) = 0, 004 ja valideerimise andmekogumi R2 väärtus ( R 2 CV ) = ei kohaldata; äge entsefalopaatia tegur 2: RMSEC = 0, 216, RMSECV = 0, 395, R2 = 0, 687 ja R2 CV = 0, 034; komplekssed febriilsed krambid tegur 1: RMSEC = 0, 355, RMSECV = 0, 414, R2 = 0, 478 ja R2 CV = 0, 348; komplekssed febriilsed krambid tegur 2: RMSEC = 0, 320, RMSECV = 0, 423, R2 = 0, 577 ja R2 CV = 0, 360; lihtsad febriilsed krambid tegur 1: RMSEC = 0, 329, RMSECV = 0, 378, R2 = 0, 551 ja R2 CV = 0, 431; ja lihtsad febriilsed krambid tegur 2: RMSEC = 0, 285, RMSECV = 0, 373, R2 = 0, 663 ja R2 CV = 0, 466.

Arutelu

CSF-i peetakse kesknärvisüsteemi aknaks. Lülisamba düsfunktsioon ja aju düsfunktsioon mõjutavad otseselt neuronaalset metabolismi ja muudavad selgroo CSF-i lokaalse miljöö. Varem oleme tuvastanud CSF-is järgmised neli võimalikku biomarkeri kandidaati ägeda entsefalopaatia eristamiseks febriilsetest krampidest, kasutades pinnaga täiustatud lasersorptsiooni / ionisatsiooni lennuaja massispektromeetriat (8): (i) 4, 8-kDa proteolüütiline peptiidi fragment neurosekretoorsest valgust VGF, mille massi ja laengu suhe (m / z) on 4 810 (viide 8), (ii) topeltlaetud transtüretiini liigid, mille m / z on 6 880 (viide 10), (iii) ubikvitiin, mille m / z on 8 564 (viide 11), ja (iv) tsüstatiini C 1–8 kärbitud vorm, mille m / z on 12 536 (viide 10, 12). Lisaks on tsütokiini, kemokiini ja valgu uuringud tuvastanud S100 (viide 13), IL-6 (viited 14, 15, 16) ja IL-8 (viide 17) kui võimalikud biomarkeri kandidaadid ägeda entsefalopaatia eristamiseks febriilne kramp. Need tulemused viitavad kindlalt sellele, et ägeda entsefalopaatia ja palavikuhoogude diferentsiaalse patofüsioloogiaga on seotud erinevad molekulid, mitte üks aine.

Fokaalsete ja pikaajaliste febriilsete krampidega lastel esinevad suurema tõenäosusega kõrvalekalded magnetresonantskujutistel kui lihtsate febriilsete krampidega lastel, mis viitab sellele, et nende aluseks olev kõrvalekalle võib eeldada endist patsientide rühma madala krambiläve suhtes (18). Pikaajalised uuringud on näidanud, et anamneesis esinevad lihtsad palavikulised krambid on seotud hipokampuse mahu vähenemise ja T2 lõdvestusaja pikenemisega rohkem kui 15 aastat pärast krambihoogu (19).

PLS-DA abil loodud punktid (graafikud) võivad anda rikka NMR-i andmete visuaalse esituse mõõtmete vähendamise abil (20). Skoorjoon näitab bioloogiliste proovide rühmitamist rühmadesse. Mida lähemal on proovid punktide graafikul, seda sarnasemad nad on kahe komponendi osas. Joonist saab kasutada proovide erinevuste ja sarnasuste tõlgendamiseks. Praeguses uuringus oli dispersioon faktori 1 korral 31% ja faktori 2 korral 10%. Faktor 1 aitas eralduda krampide raskusastmest lähtuvalt ja faktor 2 aitas eristada ägedat entsefalopaatiat ja palavikulisi krampe. Need kombineeritud tunnused selgitasid 41% dispersioonist.

Kasulik on vaadata skoori graafikut koos vastava korrelatsiooni-koormuse graafikuga, kui määratakse kindlaks, millised muutujad vastutavad valimite erinevuste eest. Korrelatsiooni-koormuste graafiku horisontaaltelg tähistab algupäraseid muutujaid ja vertikaaltelg tähistab panuse astet ja suunda, mis mõjutab hinnete eraldamist punktitabelil. Mida suurem on konkreetse muutuja laadimine tegurile, seda rohkem see sellele tegurile kaasa aitab. Koormuste positiivsetel ja negatiivsetel väärtustel on pluss- või miinussuuna eraldamiseks punktitabelil vastupidine jõud.

Selles uuringus visualiseeriti TMR-i andmete PLS-DA abil ägeda entsefalopaatia, keeruliste palavikuhoogude ja lihtsate palavikuhoogudega patsientide CSF-i keemiliste omaduste erinevused. Kasutatud CSF proovid saadi vastuvõtul, kui kindlat kliinilist diagnoosi ei olnud veel kinnitatud. Bioloogiliste vedelike, näiteks uriini ja plasma NMR-spektroskoopiat on edukalt kasutatud paljude haiguste ja toksiliste protsesside uurimiseks (9). Standardsed ühemõõtmelised TMR-spektrid kuluvad tavaliselt vaid mõne minuti omandamiseks ega vaja keeruka proovi ettevalmistamist. CSF-ist saadud NMR-andmed sisaldavad mitmesugust keemilist teavet, sealhulgas molekulaarsed muutused, molekulidevahelised jõud, struktuurimuutused ja metaboolsed muutused. Selles kliinilises uuringus eraldati kolm patsientide rühma ilma TMR-i andmete alusel loodud skoorijoone kattumiseta. Valideerisime diskrimineerimismudeli, et hinnata, kui hästi see uute andmetega töötab; aga RMSEC, RMSECV, R2 C ja R2 CV poolt hinnatud mudeli kvaliteet ei olnud piisavalt kõrge.

Kokkuvõtteks kasutasime äratundliku entsefalopaatia ja lihtsate ja keeruliste palavikuhoogudega patsientidelt saadud CSF-i erinevate tunnuste visualiseerimiseks1H-TMR andmete mustrituvastusanalüüsi. Selles uuringus kasutati vähe juhtumeid ja vaja on täiendavaid uuringuid.

Meetodid

Ägeda entsefalopaatia ja febriilsete krampide määratlus

Äge entsefalopaatia on üldnimetus ägeda aju düsfunktsiooni kohta, millele eelneb tavaliselt nakatumine (1, 2). Sellisena ei välistanud me selles uuringus nakkusega seotud entsefalopaatiat. Entsefalopaatia diagnoosimise kriteeriumid olid järgmised: i) teadvuse halvenemine, ii) ajuturse põhjustatud suurenenud koljusisese rõhu tunnused, näiteks ajukoore kaotamine või hall-valge diferentseerituse vähenemine, talamuse hüpodensiteet, tihendatud kolmandiku suurus, neljas ja külgne vatsakese tsistern aju kompuutertomograafias (21), (iii) krambid, (ov) aeglane aktiivsus elektroentsefalograafias, mis kestab rohkem kui 24 tundi pärast ägedat algust, ja (v) CSF-i kultuuril pole baktereid ega seeni (1), 2, 8). Lihtsad palavikulised krambid määratleti kui esmased generaliseerunud krambid, mis kestsid vähem kui 15 minutit ja ei kordunud 24 tunni jooksul. Kompleksseid palavikuhooge defineeriti kui fokaalseid krampe, mis olid pikenenud (≥ 15 minutit) ja / või korduvad 24 tunni jooksul (22).

Õppeained

Uuring viidi läbi Nipponi meditsiinikooli Chiba Hokusoh haigla pediaatriaosakonnas krambihoogudega patsientidelt saadud CSF-proovidega 1. oktoobrist 2003 kuni 31. detsembrini 2009. CSF-proovid saadi üheksalt kompleksse palavikuga krambihoogude lapselt, üheksa lihtsa palavikuga lapselt. krambid ja neli ägeda entsefalopaatiaga last. Diagnoosi panid kliiniliste leidude ja rutiinsete uuringute põhjal vähemalt kaks lasteneuroloogi. Tõepoolest, me ei teosta ka saematerjali punktsioone kõigil lastel, kellel on nii palavik kui ka sissepääs. Veebihoogusid käsitleva alakomitee juhiste kohaselt lihtsa febrilise krambiga lapse neurodiagnostilise hindamise juhendi (22) kohaselt teostasime nimmepunktsiooni lihtsa febriilse hooga lastel, kellel kahtlustati meningeaalseid märke ja sümptomeid (nt kael). jäikus ja Kernigi ja / või Brudzinski tunnused) või lastel, kelle anamneesis või uuringus osutatakse meningiidi või koljusisese infektsiooni esinemisele. Meningiidi korral jätsime selles uuringus läbi NMR analüüsi.

Kõik proovid koguti rutiinsete diagnostiliste testide jaoks vahetult pärast haiglaravi ja järelejäänud osa proovidest kasutati1H NMR analüüsiks. Nipponi meditsiinikooli Chiba Hokusoh haigla institutsionaalne kontrollnõukogu kiitis heaks proovide kogumise ja uurimise ning kõigi katsealuste vanematelt või seaduslikelt hooldajatelt saadi kirjalik teadlik nõusolek.

Nelja ägeda entsefalopaatiaga lapse lõplik diagnoos oli järgmine: kahel juhul esines ägedat entsefalopaatiat koos kahefaasiliste krambihoogudega ja hilja vähenenud difusiooniga, ühel juhul ägedat entsefaliiti koos refraktaarsete, korduvate osaliste krampidega ja ühel juhul lapseea ägeda nekrootilise entsefalopaatiaga (1) .

Proovi ettevalmistamine

Kõiki proove tsentrifuugiti rakkude eemaldamiseks kiirusel 300 g 5 minutit. Rakuvabad humoraalsed fraktsioonid jagati alikvootideks, külmutati kohe kuival jääl ja säilitati temperatuuril -80 ° C kuni edasise analüüsimiseni. CSF (200 μl) segati 340 μl deuteeriumoksiidiga (D20; Isotec, St Louis, MO), mis sisaldas 10 nmol / l naatriumi (3-trimetüülsilüül) tetradeuteriopropionaati-2, 2, 3, 3-d4 (TMSP) MSD Isotopes, Montreal, Kanada) ja pipeteeriti 5 mm NMR tuubidesse (Wilmad-LabGlass, Buena, NJ). D20 annab NMR-spektromeetri jaoks deuteeriumivälja sagedusluku ja TMSP pakub sisemise keemilise nihke referentsi ( δ = 0, 00).

'H-TMR andmete kogumine

Lahuse oleku 1H TMR-spektroskoopia viidi läbi prootonresonantssagedusega 300 MHz, kasutades ECX-tüüpi NMR-spektromeetrit, mis on liidetud TH5-proovivõtturiga, millel on automaatne 16-positsiooniline proovivõtur, ja Delta NMR-töötlus- ja juhtimistarkvara v. 4.3.2 (kõik Jeol Resonance'ilt, Tokyo, Jaapan). ' H-TMR spektrid saadi automaatselt sondi temperatuuril 23 ° C, kasutades automaatseks mõõtmiseks Delta süsteemi makroprogrammi. NMR-signaali vaatlusvahemik oli 5580 Hz. Veeresonantsi summutamiseks kasutati tavalise eelküllastunud impulsi jada vee (HDO) prootoni signaali summutamiseks, kasutades homogeetilist kiiritamist ja DANTE impulssijärjestust (eelküllastusaeg = 2 s, DANTE impulss = 8 μs, DANTE intervall = 0, 1 ms, DANTE) silmus = 185, DANTE nõrgendaja = 24 dB). Carr-Purcell-Meiboom-Gill spin-kajaspektrid mõõdeti, kasutades tsentrifuugi kaja ahelat 19, 2 ms, relaksatsiooni viivitust 2, 0 s ja 400 siirdet.

Andmete töötlemine ja vähendamine

Saadud spektrid töödeldi Alice2 (versioon 5.5; Jeol Resonance) abil. Vaba induktsiooni lagunemisel rakendati eksponentsiaalset kaalumisfunktsiooni 0, 2 Hz, Fourier teisendati ajaliselt sageduspiirkonnaks ja seejärel faasiti käsitsi, millele järgnes lineaarne baasjoone korrigeerimine ja viitamine TMSP ainsusele 0, 00 ppm.

1 H-TMR spektriandmete signaali intensiivsuse jaotus arvutati iga proovi jaoks, kasutades tarkvara Alice2 for Metabolome (versioon 1.0; Jeol Resonance) kirjutatud makroprogrammi, mis integreeris spektriandmed vahemikus 0, 5 kuni 9, 5 ppm 225 segmendi (prügikasti) väärtusega 0, 04. -ppm integraalpiirkonnad. Spektripiirkonnad, mis sisaldasid jäävee resonantsi (4, 5 kuni 5, 0 ppm), olid enne integreerimist välistatud. Mustrituvastuse jaoks oluliste integraalpiirkondade põhjalik uurimine tuvastas mõned juhtumid, kus üks resonants ületas kahte või enamat integreeritud prügikasti ja neid integreeritud piirkondi parandati, ühendades või laiendades piirkondi käsitsi, et hõlmata ühte resonantsi ühte terviklikku piirkonda. Teised piirkonnad, mis koosnesid suuresti mürast, jäeti olulisemast mitme muutujaga kaardistamisest välja. Lõpuks taandati kõik spektraalandmed 174 salve.

Mitmemõõtmeline ja statistiline analüüs

Iga spektri kohta saadud arvutatud andmed normaliseeriti ja imporditi PLS-DA jaoks Unscrambler X tarkvarasse (versioon 10.3; Camo Software AS, Oslo, Norra). Unscramber X tarkvara kasutava PLS-DA algoritmi üksikasju (23) on varem kirjeldatud (24). Lühidalt öeldes viidi erinevate klasside vahelise seose uurimiseks läbi ristvalideerimisega PLS-DA. PLS-mudelid kasutavad x-i ja y-maatriksit üheaegselt, et leida varjatud muutujad x-s, mis ennustavad kõige paremini y-d. Teisisõnu, PLS-DA viidi läbi, et teritada rühmade vahelist eraldumist põhikomponentide analüüsi komponentide pööramise abil eesmärgiga leida maksimaalne eraldus. Selles uuringus viidi PLS-DA läbi kolme patsientide rühma spektriprofiilide vahel (äge entsefalograafia, lihtsad febriilsed krambid ja keerulised febriilsed krambid). PLS-DA skoorgraafil on korrelatsiooni-laadimisprofiil, mis näitab spektripiirkondi, mis aitavad kaasa proovi rühmitamisele ja eraldamisele. Korrelatsiooni-laadimisprofiili horisontaaltelg tähistab spektripiirkondi ja vertikaaltelg tähistab panuse astet.

Ristvalideerimist kasutati statistilise meetodina õppealgoritmide hindamiseks ja võrdlemiseks, jagades andmed kahte segmenti: ühte kasutati mudeli õppimiseks või koolitamiseks ja teist mudeli valideerimiseks. Mudeli kvaliteedi hindamiseks arvutati kalibreerimisproovide (RMSEC) ja ristvalideerimise proovide (RMSECV) ruutkeskmine viga. Edaspidiste ennustuste sobivuse hindamiseks kindlaksmääratud arvu tegurite abil arvutati kalibreerimisandmekogumi ( R 2 C ) selgitatud dispersiooniga graafiku jaoks R 2 väärtus ja valideerimise andmekogumi selgitatud dispersiooniga graafiku jaoks ( R 2 CV ).

Patsientide demograafilisi karakteristikuid võrreldi rühmade lõikes Kruskal – Wallis H- testi abil Bonferroni korrektsiooniga ja olulisi erinevusi uuriti Mann – Whitney U- testide abil.

Finantstoetuse avaldus

Seda tööd toetasid “Jaapani erakoolide edendamise ja vastastikuse abi korporatsioon” ja “Teadusuuringute edendamise fond”. Rahastajad ei mänginud mingit rolli uuringute kavandamisel, andmete kogumisel ja analüüsimisel, avaldamise otsusel ega käsikirja ettevalmistamisel. .

Avalikustamine

Uuringus sisalduvate toodetega pole meil rahalisi sidemeid.