Utpa ja utpb chaperone tärkavad ribosoomi-eelne rna ja u3 snorna eukarüootsete ribosoomi assamblee algatamiseks | loodusside

Utpa ja utpb chaperone tärkavad ribosoomi-eelne rna ja u3 snorna eukarüootsete ribosoomi assamblee algatamiseks | loodusside

Anonim

Õppeained

  • Chaperones
  • Ribosoom
  • Supramolekulaarne koost

Abstraktne

Varases eukarüootses ribosoomi biogeneesis osalevad suured mitmevalgulised kompleksid, mis seostuvad transkriptsiooniliselt ribosoomi-eelse RNA-ga, moodustades väikese subühiku protsessioomi. Täpsed mehhanismid, mille abil kaks suurimat multivalgukompleksi - UtpA ja UtpB - interakteeruvad tärkava ribosomaalse RNA-ga, on vähe teada. Siin ühendasime biokeemilise ja struktuurilise bioloogia lähenemisviisid RNA-valgu ristsidumise andmete kogumitega, et selgitada mõlema kompleksi olulisi funktsioone. Näitame, et UtpA sisaldab suurt RNA-d siduvat saiti ja hõivab ribosomaalse RNA 5'-otsa. UtpB moodustab laiendatud struktuuri, mis seob varaseid ribosomaalseid vaheühendeid vahetus läheduses arhitektuuriliste saitidega, nagu näiteks RNA dupleks, mille moodustavad 5 'ETS ja U3 snoRNA, samuti 18S rRNA 3' piir. Mõlemad kompleksid toimivad seetõttu eukarüootsete ribosoomi assamblee käivitamiseks elutähtsate RNA chaperonidena.

Sissejuhatus

Eukarüootiline ribosoomi assamblee hõlmab> 200 ribosoomivaba teguri kooskõlastatud funktsioone, mis osalevad laias reaktsioonide vahemikus alates nukleooli transkriptsioonilistest sündmustest kuni tsütoplasmas 1 toimuvate lõplike kvaliteedikontrolli etappideni. Ehkki väikese subühiku 2, 3 ja suure subühiku küpsemise hiliste staadiumide kindlaksmääramisel on tehtud olulisi edusamme, on varajastest ko-transkriptsioonilistest sündmustest, mille käigus suured ribosoomi koostistegurid seostuvad tärkava pre -ribosomaalne RNA (pre-rRNA), moodustades väikese subühiku (SSU) protsessioomi 8, 9 .

SSU protsessom on määratletud kui varaseim ribosoomi koostise vaheühend väikese ribosoomi alaühiku küpsemise ajal. Selles kompleksis lõhestatakse tekkiv pre-rRNA transkriptsioon saitides A0, A1 ja A2, mille tulemuseks on 20S pre-rRNA vabanemine. SSU protsessomees on hiiglaslik osake, mis koosneb arvukatest ribosoomi koostisteguritest, sealhulgas UtpA, UtpB, UtpC ja Mpp10 kompleksidest, U3 väikesest nukleolaarsest ribonukleoproteiinist (snoRNP) ja paljudest individuaalsetest valkudest 8, 10 . Hiljuti analüüsisime SSU protsessomeetri moodustumist transkriptsiooni funktsioonina ja tuvastasime 2-MDa osakese, mis on seotud 5'-välise transkribeeritud speisseriga (5 'ETS). Lisaks 700-nukleotiidsele 5 'ETS pre-rRNA-le sisaldab see osake 26 valku, sealhulgas kõik UtpA, UtpB, Mpp10 ja U3 snoRNP komplekside 11 teadaolevad komponendid.

UtpA ja UtpB on mitme valgu kompleksid seitsme ja kuue alaühikuga, vastavalt 12, 13, 14 . Nende biokeemiliste funktsioonide selekteerimist ribosoomi sünteesi ajal on takistanud nende suurus, ribosoomide-eelne ajutine olemus ja ilmsete ensümaatiliste aktiivsuste puudumine. Mõlemad kompleksid sisaldavad valdavalt β-propellerit ja α-spiraalset kordusstruktuuri, mis viitab sellele, et nad moodustavad struktuurse raamistiku varase ribosoomi kokkupanemise ajal 3, 15, 16, 17, 18 . Kahanemiskatsed näitavad, et UtpA algatab ribosoomi-eelse assamblee seondumisega tärkava pre-rRNA-ga ja värbab seejärel UtpB ja U3 snoRNP 9, 19 . U3 snoRNP võib toimida RNA chaperonina, moodustades aluse sidumisel 5 'ETS ja 18S rRNA 20, 21, 22 järjestusega mitu järjestust ja viies need kokku. Kuid täpsed pre-rRNA-ga seondumise saidid ja mehhanismid, mille abil UtpA ja UtpB toimivad eukarüootsete ribosoomi assamblee varajastes staadiumides in vivo, pole veel kindlaks tehtud.

Mitmete ribosoomide koostise faktorite rRNA-ga seondumise saite on selgitatud UV-ristsidumise ja cDNA (CRAC) 23, 24, 25 analüüsi abil. Kui molekulmassid on vastavalt 660 ja 525 kDa, moodustavad UtpA ja UtpB umbes poole 5 ′ ETS-i osakese massist. UtpA-l ja UtpB-l on kokku 13 eraldiseisvat alaühikut ja tõenäoliselt on neil keerukamad ja / või liitkomponendid pre-rRNA-ga seonduvate saitide jaoks, mille määramiseks kasutame RNA-valgu ristsidumise andmete ansamblite süstemaatilist analüüsi mitmest alaühikust.

Siin kirjeldame nende komplekside arhitektuuri, funktsiooni ja täpseid rRNA-ga seondumise saite, kasutades RNA-valgu ja valgu-valgu ristsidumise andmeid koos elektronmikroskoopiaga (EM).

Tulemused

UtpA ja UtpB molekulaarsed arhitektuurid

UtpA ja UtpB molekulaarstruktuuride ja interaktsioonide kindlaksmääramiseks puhastati mõlemad ühendid pärmist, kasutades fluorestsentsvalkude vastu suunatud nanokoode, nagu on varem kirjeldatud 11, 26 (joonised 1 ja 2). UtpA on heptameerne kompleks, mis koosneb Utp4, Utp5, Utp8, Utp9, Utp10, Utp15 ja Utp17 (Nan1). Endogeenne kompleks puhastati proteaasiga lõhustatava Utp10-GFP sulandvalgu kaudu homogeensuseni (joonised fig 1a, b) ja seda kasutati ristsidumise ja massispektromeetria katsetes. UtpA stabiilsuse ja soolatundlikkuse testimiseks eraldati heptameerne kompleks madala soolasisaldusega tingimustes (200 mM NaCl) ja inkubeeriti seejärel suurenevate soolakontsentratsioonidega puhvritega. 400 mM NaCl juures eraldus Utp4 ülejäänud kuuest alaühikust (joonis fig 1c) ja 800 mM NaCl juures oli ainult Utp17 endiselt seotud immobiliseeritud Utp10-GFP-ga (joonis fig 1d). See tulemus viitab sellele, et suured valgud Utp10 (200 kDa) ja Utp17 (101 kDa) moodustavad kompleksi, millega ülejäänud viis väiksemat alaühikut seostuvad 14 . Lisaks näitab see, et Utp4 on viiest väiksemast alaühikust kõige soolatundlikum alaühik.

Image

a ) Endogeense UtpA suuruseralduskromatogramm ja ( b ) peamise piigifraktsiooni visualiseerimine 4–12% SDS-PAGE ja Coomassie-sinise värvimise abil. UtpA-d sisaldavad Utp valgud (Utp4, Utp5, Utp8, Utp9, Utp10, Utp15, Utp17) koos elueerivad märgistatud vasakul asuva vastava numbriga. ( c, d ) erineva ioontugevusega puhvritega puhastamisel saadud UtpA alakomplekside SDS-PAGE analüüs. Märgistatud UtpA (Utp10-3C-GFP ja Utp15-TEV-mCherry) puhastati 200 mM NaCl-ga anti-GFP sefaroosil ja inkubeeriti puhvritega, mis sisaldasid kas 400 mM NaCl, saades UtpAΔUtp4 ( c ) või 800 mM NaCl, saades Utp10 -Utp17 dimeer ( d ). 10 * tähistab Utp10 lagunemissaadust. MCherry (hall) elueerimiseks ja eemaldamiseks kasutati TEV ja 3C proteaase (hall). ( e ) Utp5, Utp8, Utp9 ja Utp15 kaas-elueerimise peamise piikide fraktsiooni SDS-PAGE analüüs suuruseralduskromatograafial. Utp4, Utp5, Utp8, Utp9 ja Utp15-TEV-mCherry üleekspresseeriti pärmis ja afiinsus puhastati. Utp4 dissotsieerus kompleksist suuruseralduskromatograafia ajal, mille tulemuseks oli näidatud heterotetrameeri elueerimine. f ) UtpA alaühikute vaheliste alamühikute DSS-ristsidemete (hallide joonte) skemaatiline esitus (ringid, mis on värvitud rohelise erinevat tooni). Alaühikuid ühendavate joonte paksus kajastab alaühikute vahel jagatud ristsidemete arvu.

Täissuuruses pilt

Image

a ) Endogeense UtpB suuruseralduskromatogramm ja ( b ) peamise piigifraktsiooni visualiseerimine 4–12% SDS-PAGE abil. UtpB-d (Utp1, Utp6, Utp12, Utp13, Utp18 ja Utp21) sisaldavad elueerivad Utp valgud on vasakul tähistatud vastava numbriga. * näitab, et afiinsuspuhastusmärgisena kasutati Utp21-3myc-TEV-mCherry-Flag ja see sisaldab pärast TEV lõhustamist 3 C-terminaalset myc-silti. ( c - f ) UtpB puhastatud rekombinantsed alakompleksid, mida ekspresseeritakse bakterites ja analüüsitakse 4–12% SDS-PAGE geelil. c ) koos ekspresseeritud ja puhastatud Utp12 ja Utp13-ga teostatud suuruseralduskromatograafia peamine piikfraktsioon. ( d ) Utp6 / Utp18 tõmbekontrolli 3C proteaasi elueerimine, mis on näidatud lisajoonisel 3c. e ) koekspresseeritud ja puhastatud Utp12 / Utp13 / Utp21 / Utp1 suuruseralduskromatograafia peamine piikfraktsioon. (S-21 tähistab StrepII-Sumo-Utp21). * tähistab GroEL-i saastumist. ( f ) koekspresseeritud heterotetrameersete Utp6 / Utp18 / Utp21 / Utp1 3C proteaasi elueerimine, puhastatud tandem-afiinsuspuhastamise teel His14-3C-Utp21 ja mCherry-3C-Utp6 abil. ( g ) UtpB alaühikute Utp12, Utp13, Utp21 ja Utp1 (DSR-i erineva varjundiga ringid) skeemidevaheline DSS-i ristsidemete (hallide joonte) skemaatiline esitus. Alaühikuid ühendavate joonte paksus kajastab alaühikute vahel jagatud ristsidemete arvu. Tahked jooned tähistavad selles uuringus määratletud DSS-i ristsidemeid. Katkendjooned tähistavad alaühikuid Utp6 ja Utp18, mida ristsidemete analüüs ei hõlmanud.

Täissuuruses pilt

Selgitamaks välja, kas viis väiksemat alaühikut võivad moodustada alakompleksi heterodimeeri Utp10-Utp17 puudumisel, ekspresseeriti pärmis üle Utp4, Utp5, Utp8, Utp9 ja proteaasiga lõhustatavat Utp15-mCherry liitvalku. Pärast afiinsuspuhastust olid kohal kõik viis alaühikut (täiendav joonis 1), kuid Utp4 eraldus Utp5, Utp8, Utp9 ja Utp15-mCherryst järgneva suuruse väljajätmise etapis (joonis 1e). Utp4 kadu madala soolasisaldusega puhvertingimustes suuruseralduskromatograafia ajal viitab kas Utp4 nõrgale assotsieerumisele teiste subühikutega või Utp10 ja / või Utp17 vajaduse järele stabiilseks integreerumiseks UtpA-sse.

Valgu ja valgu interaktsioonide UtpA-s edasise uurimise jaoks viisime läbi looduslikult märgistatud UtpA ristsidumise ja massispektromeetria (joonised 1a, b ja f). Utp10, Utp5, Utp15, Utp8 ja Utp17 vahel tuvastati tihe ristsidemete võrk, mis näitab, et need asuvad UtpA läheduses. Nagu arvata võis, jagab Utp10 ristsidemeid Utp17-ga, kuid jagab ka paljusid ristsidemeid Utp5 ja Utp8-ga. Utp4 ei olnud tugevalt ristseotud UtpA teiste alaühikutega ja jagas vaid väheseid ristsidemeid Utp8, Utp9 ja Utp15-ga (joonis 1f ja täiendav joonis 2a). Kokkuvõttes viitavad need tähelepanekud UtpA molekulaarsele korraldusele, milles Utp10 ja Utp17 moodustavad stabiilse dimeeri, millel on ruumiline lähedus Utp5, Utp8 ja Utp15 ning vähemal määral Utp9 ja soolalabivaba Utp4-ga (joonis 1d – f). .

UtpB on heksameerne kompleks, mis koosneb Utp1 (Pwp2), Utp6, Utp12 (Dip2), Utp13, Utp18 ja Utp21. Endogeenset kompleksi puhastati proteaasiga lõhustatava Utp21-mCherry sulandvalgu ja mCherry vastase nanokehaga kaetud sepharose vaigu 26 abil . Afiinsuspuhastamine ja proteaasi lõhustamine, millele järgneb suuruseralduskromatograafia, kinnitab kõigi kuue alaühiku olemasolu, mis olid varem kuulunud UtpB 13 hulka (joonis 2a, b), mida kinnitas veel massispektromeetria (andmeid pole näidatud).

Meie eesmärk oli taastada UtpB alakompleksid bakterites, et teha kindlaks, millised subühikud suhelda UtpB-s üksteisega otse. UtpB subühikute heteroloogilisel ekspresseerimisel ja bakteritest puhastamisel saadi mitu alakompleksi (joonis 2c – f). Mõnes eksperimendis (joonis 2d, f) täheldati märgistatud Utp6 super-stöhhiomeetrilisi koguseid, mis näitab lisaks stöhhiomeetrilisele kompleksile ka monomeerselt märgistatud valgu taastumist. Utp12 ja Utp13 elueeruvad koos suuruseralduskromatograafiaga ja interakteeruvad seega vahetult, saades stabiilse heterodimeerse kompleksi (joonis 2c, täiendav joonis 3a, b). Sarnaselt annab Utp6 ja Utp18 koekspressioon stabiilse heterodimeeri (joonis 2d). Need kaks UtpB heterodimeerset alakompleksi on ühendatud Utp21 ja Utp1 kaudu, kuna Utp21 / Utp1 koekspressioon Utp12 / Utp13 või Utp6 / Utp18-ga annab tulemuseks tetrameerse kompleksi (joonis 2e, f). Lisaks ei interakteeru heterodimeerne Utp6 / Utp18 otseselt Utp12 / Utp13, vaid ainult tetrameerse Utp12 / Utp13 / Utp1 / Utp21 kompleksiga, mis viitab sellele, et heterodimeerne Utp21 / Utp1 on lokaliseeritud kahe teise dimeeri vahel (täiendav joonis 3). ). Kokkuvõttes viitavad need andmed sellele, et UtpB võib jagada kolmeks heterodimeeriks, millest Utp12 / Utp13 alakompleks (joonis 2c, täiendav joonis 3a, b) interakteerub Utp21 / Utp1 keskse dimeeri (joonis 2e) kaudu Utp6 / Utp18 (joonis 2e). 2d, f, täiendav joonis 3c).

Uurisime Utp12, Utp13, Utp21 ja Utp1 sisaldava heterotetrameeri valkude ja valkude koostoimeid ristsidemete ja massispektromeetria abil. Tulemused kinnitasid, et see kompleks koosneb heterodimeeride paarist, millel on tugevad ristsidemed Utp12 ja Utp13, aga ka Utp21 ja Utp1 vahel (joonis 2g).

Koos varasemate UtpB ristsiduvate ja biokeemiliste andmetega viitab see sellele, et kaks heterodimeeri, mille moodustavad Utp12 ja Utp13 või Utp21 ja Utp1, võivad interakteeruda, moodustades keskse tuumakompleksi 14, 16, 17 . Varem näidati, et Utp6 ja Utp18 moodustavad kompleksi eraldi elemendi, millel on piiratud ristsidemed ülejäänud nelja alaühikuga 14, 17, 27 .

Utp12, Utp13, Utp21 ja Utp1 on ühise arhitektuuriga N-otsa tandem-P-propelleriga, millele järgneb a-spiraalne piirkond. Valgusiseseid ristsidemeid on arvukalt (täiendav joonis 2b), mis viitavad Utp1 ja Utp13 tandem-P-propellerite põimunud arhitektuurile, mis on sarnane varem Utp21-ga (viide 16).

UtpB-l on laiendatud struktuur eraldi moodulitega

Ristsiduva massispektromeetria analüüsi struktuurilise aluse mõistmiseks viisime läbi UtpA ja UtpB negatiivse peitsi EM-i. Kui UtpA näitas mitmesuguseid konformatsioone ja ei olnud 3D rekonstrueerimiseks sobiv (täiendav joonis 4), siis Saccharomyces cerevisiae'st puhastatud endogeenset UtpB analüüsiti täiendavalt juhusliku koonilise kaldega 3D rekonstrueerimisega (joonis 3). UtpB stabiliseerimiseks viidi läbi õrn ristsidumine kolonnilisel glutaraldehüüdil (täiendav joonis 5), mis suurendas järgmistes uuringutes puutumatute osakeste arvu, nagu on varem täheldatud teiste suurte valgukomplekside korral 28, 29 .

Image

( a ) ISAC 30 2D tüüpilised keskmised näitavad väga liikuva domeeniga tetrameerset piklikku keha, mis võib proovida suurt hulka konformatsioone. b ) Endogeense UtpB ja rekombinantse UtpB võrreldavad ISAC 2D klassi keskmised, millel puuduvad Utp6 ja Utp18. ( c ) UtpB (EMD-8223) juhusliku koonilise kalde rekonstrueerimise erinevad vaated näitavad tetrameerse südamiku piklikku struktuuri ja elastset domeeni nõrka tihedust jala tipus. Utp21 käsitsi dokitud topelt-pro-propeller (pdb-kood 4nsx (viide 16)) on kujutatud koomiksina punasega UtpB jalapiirkonnas.

Täissuuruses pilt

Iteratiivse stabiilse joondamise ja rühmitamise (ISAC) 30 abil saadud 2D klassi keskmiste analüüs näitas pikliku konstruktsioonisüdamiku olemasolu, mis on ühendatud ühest otsast teise väiksema mooduliga (joonis 3a ja täiendav joonis 6a). Väiksema mooduli asukoht südamiku suhtes varieerus erinevate klasside keskmiste vahel, mis viitab sellele, et see on painutatud siduri kaudu südamikule kinnitatud. Utp6 ja Utp18 positsiooni tuvastamiseks kasutasime negatiivse peitsi EM-i, et analüüsida rekombinantselt ekspresseeritud 400 kDa heterotetrameerset kompleksi, mis koosneb Utp12, Utp13, Utp21 ja Utp1. Saadud 2D klassi keskmised näitasid, et Utp12, Utp13, Utp21 ja Utp1 on UtpB struktuurisüdamiku moodustamiseks piisavad, mis tähendab, et mobiilne teine ​​moodul vastab Utp6 ja Utp18 (joonis 3b ja täiendav joonis 6b). Saime iseseisvalt suuruseralduskromatograafia abil näidata, et Utp18 on UtpB stabiilseks assotsieerumiseks UtpB südamikuga vajalik (täiendavad joonised 3c ja 7). Need andmed viitavad sellele, et Utp18 N-terminaalsele piirkonnale vastav painduv linker (täiendav joonis 7d) ühendab UtpB struktuursüdamiku, mis koosneb Utp12, Utp13, Utp1 ja Utp21, teise mooduliga, mis koosneb β-propellerist. ja Utp6 HAT-i kordust (joonis 3 ja täiendav joonis 7). See mudel on kooskõlas ka varem avaldatud andmetega, mis näitavad otsest interaktsiooni Utp18 N-terminaalse piirkonna (jäägid 100 kuni 190) vahel Utp21 N-terminaalse tandem-P-propelleriga (viide 16).

Konformatsiooniliselt elastse UtpB 3D-teabe saamiseks saime suure negatiivse peitsi EM-i kallutuspaaride andmekogu (täiendav joonis 8a, b). 2D klassifitseerimine 50 klassiks andis tulemuseks 2D keskmised, mis vastavad mitmele erinevale UtpB konformatsioonile, mis tähistavad erinevat paindeastet (täiendav joonis 8c). Nendest klassidest saab selgelt tuvastada ühe domineeriva kehaehituse (täiendav joonis 8d, rühmad 8, 13, 19, 33 ja 47). Nende klasside juhuslikud koonilised kaldega rekonstrueerimised andsid sarnased ruumalad, mille piklik struktuur oli umbes 230 Å pikkust ja 90 Å laiust (täiendav joonis 8d, sinised mahud). Enamikus rekonstruktsioonides täheldati mobiilse domeeni UtpB ühes otsas vähe või üldse mitte tihedust. Lõpliku mahu saamiseks ühendasime nende klasside kallutatud proovidest saadud osakesed 10% vastavate osakestega osakestest proovitud proovist ja viimistlesime nurga all SPIDER 31-ga (joonis 3c ja täiendav joonis 9). Lõpliku rekonstrueerimise eraldusvõime on 28 Å (täiendav joonis 9a). Utp6 / Utp18 koosneva mobiilimooduli (joonis 3c ja täiendav joonis 9c) korral võib täheldada nõrka, laiendatud tihedust. Topoloogiliselt on UtpB tuumastruktuur määratletud pea mooduliga, mis on ülejäänud osakesega ühendatud kõverdatud õlapiirkonna kaudu. Konstruktsiooni alumine osa koosneb kahest lohist, mida tähistame käsivarre ja jala piirkondadeks (joonis 3c). Jalapiirkond on lisaks ühenduseks elastse mooduliga, mis koosneb Utp6 / Utp18. Paindliku mooduli puhul täheldatakse erinevaid konformatsioone, mis võivad proovida peaaegu kogu jalakonstruktsiooni otsa ümbritsevat piirkonda (joonis 3a). Kuna varasemad biokeemilised katsed on näidanud, et Utp21 tandem-P-propelleri domeen võib vahetult suhelda N-terminaalse segmendiga, mis sisaldab Utp18 jääke 100 kuni 190 (viide 16), siis oleme esialgselt määranud N-terminaalse tandemi β-propelleri domeenid Utp21 järgi struktuuri jalapiirkonda. See paigutus võimaldab Utp21 N-terminaalsel regioonil suhelda Utp6 / Utp18 mooduliga, samas kui Utp21 C-terminaalsel regioonil on võimalik suhelda ülejäänud kolme alaühikuga. Varasema biokeemilise iseloomustuse põhjal võib öelda, et Utp21 tihe interaktsioon Utp1-ga näitab, et Utp1 aitab kaasa struktuuri alumises osas täheldatud tihedusele, samas kui Utp12 ja Utp13 annavad tõenäoliselt struktuuri ülaosa.

See esialgne määramine on kooskõlas tähelepanekuga, et Utp12 ja Utp13 ning Utp21 ja Utp1 moodustavad heterodimeere. Lisaks on valkude ristsiduvate andmetega väga hea kokkulangevus selgus, et Utp21 on kõige kergemini ristsidestatud Utp1-ga, vähem Utp12-ga ja palju vähem Utp13-ga (joonis 2g, täiendavad joonised 2b ja 9c).

UtpA ja UtpB seovad pre-rRNA ja U3 snoRNA erinevaid saite

Nii UtpA kui ka UtpB in vivo pre-rRNA-ga seonduvate saitide määramiseks rakendasime CRAC. Kolmepoolne märgis, mis koosneb polühistidiini märgisest, TEV lõikamissaidist ja valgu A märgisest (HTP), sisestati endogeensete promootorite kontrolli all UtpA ja UtpB kompleksi kodeerivaid genoomi lookustesse. Pärast in vivo ultraviolettkiirguse ristsidumist aktiivselt kasvavates rakkudes puhastati kovalentselt seotud RNA-valgu kompleksid mitmeastmeliselt. Algselt puhastati kompleksid IgG Sepharose'iga seondumisega, millele järgnes TEV proteaasi elueerimine. Seotud RNA-d digereeriti seejärel osaliselt, millele järgnes kaks denatureerivat puhastamisetappi; nikli afiinsuspuhastamine 4 M guanidiinium-HCl ja SDS-PAGE juuresolekul. Need etapid valivad spetsiifiliselt RNA, mis oli kovalentselt ristsidestatud märgistatud valgu alaühikuga, mis tuvastati RT-PCR ja Illumina sekveneerimise teel. Seega tuvastatakse ühe valgu subühiku kohta ainult ühes otsas RNA-valgu interaktsioonid. Sihtides iga kompleksi mitu alaühikut, saadi CRAC profiilide komplektid, mis näitavad iga kompleksi iseloomulikke mustreid (joonis 4). Silmatorkavalt näitasid UtpA kõik seitse alaühikut valdavat ristsidumist 5 'ETS-i proksimaalses piirkonnas (joonis 4a), mis vastab võtmerollile ribosoomi kokkupaneku protsessi käivitamisel. Metsikut tüüpi kontroll näitas 25S rRNA-s ainult silmapaistvat piiki, mida on nähtud paljudes katsetes ja mis esindab tavalist saasteainet 6, 23, 32 .

Image

a ) Järjestused, mis on saadud CRAC katsetest kõigi UtpA alaühikutega (rohelise varjundiga, duplikaadid helerohelisega), valitud UtpB alaühikutega (sinistes toonides, helesinised duplikaadid) ja märgistamata juhtelemendiga (hall, dubleeritud helehall) joondati rDNA lookusega (RDN37) ja kanti taastumissageduseks (tabamused miljoni kaardistatud lugemise kohta) igas nukleotiidi positsioonis (näidatud üle kõigi paneelide). Taastamise sageduse individuaalsed skaalad on näidatud iga alaühiku paneeli paremal. RDN37 kodeeritud 35S pre-rRNA on skemaatiliselt kujutatud jälgede all lõhestamiskohtadega (A0, A1, D, A2, A3, E, C2, C1, B2, B0), sisemise ja välimise eralduspiirkonnaga (ITS1, ITS2, 5). ′ ETS, 3 ′ ETS) ja ribosoomi RNA (18S, 5, 8S, 25S) on näidatud. b ) CRAC raamatukogu kokkuvõtete laiendatud vaade 5 ′ ETS-is (RDN37 nukleotiidid 1–700). U3 snoRNA aluste sidumissaitide (3 'hinge, 5' hinge) ja pre-rRNA lõhestamiskohtade (A0, A1) positsioonid on näidatud 5'-ETS skemaatiliselt.

Täissuuruses pilt

5'-ETS piirkonna laiendamine (joonis 4b) näitab erinevusi komponentide ristsidumise piikide saitides, mis viitab pre-rRNA rajale läbi kompleksi. Utp9-l oli kõige rohkem 5 'proksimaalne positsioon, tugeva ristsidemega ainult 5' ETS esimese 40 nt jooksul. Utp8 ja Utp17 seostuvad ka 5'40 nt, kuid näitasid täiendavat ristsidumist +90 ümber. Utp4 näitas ainult piiki temperatuuril +90, samal ajal kui Utp15 oli ristseotud selles kohas ja veel 3 'ümber +250, U3 snoRNA 3' hingepiirkonna sidumiskoha lähedal. Suur Utp10 valk näitas maksimaalset ristsidumist +110 ümbruses, nõrgema sidumisega kohtades 5'-otsast umbes +500-ni, mis viitab kindlalt sellele, et see interakteerub pre-rRNA-ga laiendatud konformatsioonis. Lõpuks nähti Utp5 ristsidumise tippu +130 paiku. Kokkuvõttes näitavad need andmed, et UtpA kompleks hõlmab tärkava pre-rRNA 5'-otsa, ulatuslike interaktsioonidega kuni umbes +150.

UtpB kompleksi jaoks ei olnud C-terminaalne märgistamine Utp12 ja Utp6 jaoks edukas, samas kui märgistatud Utp21 ei olnud RNA-ga oluliselt ristsidestatud (andmeid pole näidatud). Kolme UtpB alaühiku, Utp1, Utp13 ja Utp18 jaoks loeti loendeid, mis on kas UtpB tuuma (Utp1 ja Utp13) või mobiilimooduli (Utp18) osad (joonised 3 ja 4). Utp18 seondus UtpA tuuma siduva piirkonna keskosas +90 ümber. Utp1 oli valdavalt ristseotud U3 snoRNA sidumissaidi kohal +280 juures, samas kui Utp13 näitas ristsidumise piigi D-lõhe ümber piigi 18S rRNA 3'-otsas. Need seondumissaidid näitavad, et piklik ja konformatsiooniliselt paindlik UtpB kompleks ühendab funktsionaalselt olulisi saite, mis on dispergeeritud pre-rRNA järjestuses.

Lisaks näitasid mitmed valgud, eriti Utp5, Utp15 ja Utp18, ristsidumise piigid umbes +1 200 nt 35S juures (+500 18S rRNA piires). 18S rRNA sekundaarstruktuuris asub see sait 'keskse pseudoknot' lähedal, mis on väikese ribosomaalse subühiku põhiline struktuuriomadus, ning see võib paikneda tihedalt ka varasetes ribosoomides.

Enne rRNA-d ristsiduvad andmed asetavad UtpA ja UtpB kompleksid U3 snoRNA sidumissaitide lähedusse ja seetõttu analüüsisime ka sellele RNA-le vastavaid loendeid (joonis 5a). Nimelt näitasid kõik UtpA ja UtpB komponendid U3 snoRNA ristsidumist, mis oli oluliselt (> 10 korda) suurem kui negatiivne kontroll. Utp10 ja Utp1 ristsidumine U3 snoRNA-ga oli aga enam kui 10 korda kõrgem kui teistel UtpA või UtpB alaühikutel. Kuna joonisel fig 5 esitatud lugemisnumbrid on väljendatud tabamustena miljoni kaardistatud lugemise korral, peegeldab see nende valkude suhteliselt tugevat ristsidumist U3 snoRNA-ga võrreldes pre-rRNA-ga (piigi kõrgused joonistel 4 ja 5).

Image

a ) UtpA (rohelise tooni, helerohelise koopia) CRT raamatukogu järjestused, UtpB (sinistes toonides koopiad, helesinised koopiad) ja sildistamata juhtelemendi (hall, duplikaat helehall) kaardistatud splaissitud SNR17A (kodeerib U3 snoRNA) kantakse taastumissageduseks (tabamused miljoni kaardistatud lugemise kohta) igas nukleotiidi positsioonis (näidatud üle kõigi paneelide). Taastumissageduse individuaalsed skaalad on näidatud iga alaühiku paneelil vasakul. Allüksuste paneelid on järjestatud valgukompleksi järgi ja lisaks nende vastavate tabamuste arvu järgi miljon kaardistatud lugemist. 3 'ja 5' hingede positsioonid, mille aluspaar 5 'ETS-ga on näidatud jälgede all. ( b ) U3 snoRNA (must) skemaatiline sekundaarstruktuur alusepaaritud 5 ′ ETS (lilla) ja CRAC-põhiste seondumissaitidega U3 snoRNP valkudele Rrp9, Nop1, Nop56 ja Nop58, erinevates pruuni varjundites, nagu eelnevalt kindlaks tehtud 33, UtpA (roheline) sidumiskohad UtpA-st ja Utp1 (sinine) UtpB-st. Helices on tähistatud tähega H ja konserveeritud Box B / C / C ′ / D järjestuse elemendid on tähistatud vastavalt nende ühe tähega.

Täissuuruses pilt

U3 snoRNP-l on selgelt väljendunud domeenistruktuur, suure, väga struktureeritud 3'-domeeniga, mis seob põhilisi snoRNA valke, sealhulgas Nop56, Nop58, Nop1 (fibrillariin) ja Rrp9 33 . 5 '-domeen on suhteliselt struktureerimata ja sisaldab pre-rRNA aluse paralleelseid piirkondi, sealhulgas 5'- ja 3'-liigendpiirkondi ning kasti A (joonis 5b) 20, 21, 22 . Utp10 on ristsidestatud peamiselt U3 snoRNA 3 'domeeniga, snoRNP valkude peamiste sidumissaitide kõrval (joonis 5b). Seevastu ristseotud Utp1 oli ainult U3 snoRNA 5 'domeeni 3'-hinge piirkonnas (joonis 5b). See on kooskõlas Utp1 spetsiifilise seondumisega U3 snoRNA aluste paarimise pre-rRNA sihtmärgiga (joonis 4b). Teine UtpB alaühik Utp18 näitas U3 snoRNA-s 3'-hingega ristsidumise madalat taset (joonis 5a ja täiendav joonis 10).

Kõigil teistel Utp valkudel oli U3 snoRNA 3 'domeeni suures otsas tüvi madal loetavus; kas 5 '(Utp17) või 3' (Utp4, Utp5, Utp8, Utp13, Utp15, Utp18) küljel (täiendav joonis 10b, c). Nimelt ei täheldatud U3 snoRNA 5 'piirkonnas teiste eksperimentaalselt kinnitatud pre-rRNA-ga seondumissaitidega olulist ristsidumist; 5 'hinge ja kast A 20, 21, 22 .

Kokkuvõtlikult viitavad need andmed UtpA-kompleksi UtpA-le U3 snoRNP värbamisel, samal ajal kui UtpB-kompleksi Utp1 interakteerub seejärel mõlema RNA ahelaga baaspaaritud U3 snoRNA-s - pre-rRNA interaktsioonil +280 5'-s ETS .

Arutelu

Siin pakume esimest üksikasjalikku ülevaadet suurte, mitme alaühikuga valgukomplekside UtpA ja UtpB struktuurist ja funktsioonist. Kombineerides biokeemilisi ja struktuuribioloogilisi lähenemisviise RNA-valgu ristsiduvate andmete kogumitega, määrasime mõlema kompleksi molekulaarse korralduse, nende peamised RNA-valgu kontaktid in vivo ja UtpB ülesehituse.

UtpA ja UtpB paljude komponentide kõrge eraldusvõimega struktuuriteabe puudumine on siiani piiranud meie mõistmist nendest kompleksidest. Näitame siin, et valkude ristsidumise ja massispektromeetria kasutamine koos biokeemiaga võimaldas UtpA ja UtpB üldise ülesehituse dešifreerida. Kui suurem osa UtpB valkudevahelistest ristsidemetest paikneb nelja UtpB alaühiku C-terminaalses domeenis, siis UtpA subühikute puhul on valkudevaheliste ristsidemete laiem jaotus täheldatud (täiendav joonis 2).

CRAC tuvastatud RNA-valgu interaktsioonid vastavad ajaliste seisundite populatsioonile. Varasemad 'Milleri' kromatiini leviku EM-analüüsid ja metaboolse märgistuse analüüsid näitavad aga kindlalt, et varases ribosoomi-eelses koostises toimub transkriptsioon 34, 35 . Seetõttu, kuigi me ei suuda eristada UtpA või UtpB alaühikute järjestikuseid RNA-ga seondumise sündmusi, näib tõenäoline, et ristsiduvate saitide 5 'kuni 3' asukoht peegeldab vähemalt osaliselt seondumise järjekorda. Joonisel 6 esitame UtpA ja UtpB alakomplekside potentsiaalse, järjestikuse RNA sidumise mudeli. Transkriptsiooni kõige varasemates etappides seostuvad UtpA kolm subühikut (Utp8, Utp9 ja Utp17) tärkava pre-rRNA-ga üsna 5 'otsas, ülejäänud neli subühikut (Utp10, Utp4, Utp5 ja Utp15) interakteeruvad nukleotiididega, mis asuvad allpool voolu. 5 'ETS (joonis 6a). UtpB piklik ja painduv struktuur viitab sellele, et see kompleks sobib ideaalselt erinevate RNA-d siduvate saitide ületamiseks. Pärast Utp18 sisaldava painduva mooduli (joonised 3 ja 6b) algset sidumist 5'-ETS-iga interakteerub UtpB tuum dupleksi mõlema RNA ahelaga, mis on moodustatud Utp1 kaudu 5'-ETS-ist ja U3 snoRNA 3'-liigendist. (Joonis 6c). SSU töötlemisprotsessi hilisemates etappides võimaldavad 18S rRNA lõpuleviimine ja sellest tulenevad struktuurimuutused Utp13 suhelda 18S rRNA 3 'piiriga (joonis 6d, e). See mudel on hästi kooskõlas meie varasema tähelepanekuga, et SSU protsessomeeride moodustamise ajal 11 toimub etapispetsiifiline komplekteerimine, mida hiljuti sõltumatult kinnitati 36 .

Image

( a ) RNA polümeraas I (roosa) sünteesib 5 ′ ETS-i (tumepunane), mida kaas-transkriptsiooniliselt haaravad paljud UtpA subühikud (rohelised varjundid). b ) UtpB ja UtpB (sinise varjundiga) rohkem alaühikuid seonduvad 5 ′ ETS-iga. U3 snoRNP (oranž) värvatakse UtpA ja UtpB. c ) U3 snoRNP (oranž) on alusepaar 3'-liigendis 5'-ETS-iga ja Utp1 vahetus läheduses. ( d ) Transkriptsioon jätkub ja genereeritakse rohkem 18S rRNA (tumehall) osi. e ) SSU protsessomeetri lõpuleviimine suuresti volditud 18S-ga võimaldab Utp13-l seostuda 18S rRNA 3'-otsa läheduses.

Täissuuruses pilt

Meie RNA-valgu ristsidumise süstemaatiline analüüs näitab, et UtpA ja UtpB erinevate alaühikute jaoks on kattuvaid sidumissaite nii 5 ′ ETS kui ka U3 snoRNA sees (joonised 4 ja 5). Need võivad kajastada kas tihedat ruumilist lähedust SSU protsessoris või dünaamilisi struktuurimuutusi tekkiva SSU protsessoris. Nimelt näivad UtpA ja UtpB interaktsioonid U3 snoRNA-ga selle RNA spetsiifiliste alamstruktuuridega, kuna koostoimeid heeliksi 1a, 5'-hinge või piirkondadega, mis olid varem seotud Rrp9 seondumisega 33, ei täheldatud. See vaatlus toetab U3 snoRNA seondumise ajalist järjekorda pre-rRNA eraldiseisvate saitidega, milles 5 'ETS-i +280 juures on kõige 5'-vastasmõju sait +280 seotud U3 snoRNA-ga enne saite temperatuuril +470 ja sees 18S rRNA. The U3 snoRNA-5′ ETS interaction at +280 is required for subsequent pre-rRNA processing, but involves only a relatively short region of complementarity (11nt) 22 . We speculate that U3 snoRNP recruitment may be stimulated by UtpA via the Utp10-U3 snoRNA 3′ domain interactions, while specific U3 snoRNA-5′ ETS base-pairing may be facilitated by UtpB, via Utp1 bridging the interaction site.

Beyond the immediate early steps of eukaryotic ribosome assembly, the recent identification of Utp18 as an interaction partner of the RNA helicase and exosome cofactor Mtr4 suggests that Utp18 and hence UtpB could fulfil a dual role by both stabilizing the 5′ ETS and U3 snoRNA for productive ribosome assembly as well as recruiting Mtr4 for either degradation of 5′ ETS particles after A0/A1/A2 cleavage events or for degradation of defective ribosome assembly intermediates 37 . Intriguingly, early pre-ribosomal intermediates also contain Utp3/Sas10 and Lcp5-both of which carry putative exosome interaction domains based on their homology to Rrp47 (refs 11, 38).

In contrast to prokaryotic ribosome assembly, eukaryotic ribosome assembly is characterized by a largely expanded network of RNA chaperones and quality control factors. Many of these factors-including UtpA and UtpB subunits-contain β-propellers and α-helical repeats as building blocks. This suggests that these factors come together to assemble a very large structural framework. This structure may give rise to the 'terminal balls' long observed on the 5′ termini of the nascent pre-rRNA in 'Miller spreads' of rDNA chromatin. We speculate that this framework allows the large-scale organization-and reorganization-of the maturing pre-ribosomal particles 3 .

Methods

Strains and media

All yeast strains are derived from (BY4741, MATa; his3Δ1 ; leu2Δ0 ; met15Δ0 ; ura3Δ0 ). Standard techniques were used to integrate C-terminal affinity tags and integration of galactose-driven genes. Strains used are listed in Supplementary Data 1.

Growth of cultures and cell lysis (UtpA and UtpB)

Yeast strains used for endogenous complex purifications, YSK43 or YSK47 (UtpB) and YSK32 (UtpA), were grown to saturation in YPD medium and collected by centrifugation at 4, 000 g . Cell pellets were washed twice with ice-cold water and once with a volume of water supplemented with protease inhibitors (PMSF, Pepstatin A, E64) equal to the weight of each pellet. The final cell paste was flash-frozen as 'noodles' by pushing it through a syringe into liquid nitrogen. Cell disruption was performed by cryo-milling using a Retsch Planetary Ball Mill PM 100, and the cryo-ground powder was stored at −80 °C until further use.

To overexpress Utp4, Utp5, Utp8, Utp9 and Utp15-3myc-TEV-mCherry-3FLAG, a pre-culture of YSK122 was grown overnight in YP medium containing 2% (w/v) glucose at 30 °C. The pre-culture was used to inoculate a larger volume of YP medium supplemented with 2% (w/v) raffinose. Cells were grown at 30 °C in raffinose-containing medium until OD 600 =0.9. Expression of proteins under galactose promoters was induced by the addition of 2% (w/v) galactose overnight at 30 °C, and cells were collected and lysed as described above.

Purification of endogenous UtpA for protein cross-linking

30 grams of cryo-milled powder from strain YSK32 were resuspended in 30 ml of binding buffer (50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol) supplemented with protease inhibitors (PMSF, Pepstatin A, E64), DNAseI and RNaseA. The solution was incubated on ice for 30 min and cleared by centrifugation at 40, 000 g , 4 °C for 30 min. The cleared lysate was incubated with 500 μl of anti-GFP nanobody-coupled sepharose for 4 h at 4 °C on a nutator and washed six times with binding buffer. Bound protein complexes were eluted by incubation with TEV and 3C protease for 150 min at 4 °C. Eluted protein complexes were further purified by size-exclusion chromatography (Superose 6 10/300 GL, GE Healthcare) in binding buffer lacking glycerol and DTT.

Purification of subcomplexes of UtpA

UtpAΔUtp4, Utp10-Utp17 . 11 grams of cryo-milled YSK32 powder were resuspended in 44 ml binding buffer (50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol) supplemented with protease inhibitors (PMSF, Pepstatin A, E64). The lysate was cleared for 30 min at 40, 000 g , 4 °C. 560 μl of anti-GFP nanobody-coupled sepharose was added to the supernatant and incubated for 3.5 h at 4 °C. Beads were washed twice with binding buffer and distributed in 14 tubes (40 μl of beads each). The aliquots were washed and incubated with binding buffer lacking glycerol and containing concentrations of NaCl ranging from 200 mM to 800 mM in 100 mM steps (50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 200–800 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) for 7 h at 4 °C. Protein complexes were eluted by 3C protease cleavage overnight at 4 °C. Elutions were spun at 15, 000 g for 6 min and supernatants were analysed on a 4–12% SDS-PAGE gel by Coomassie-blue staining.

UtpAΔUtp4ΔUtp10ΔUtp17 . 20 grams of cryo-milled YSK122 powder were resuspended with 80 ml of binding buffer (50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol) supplemented with protease inhibitors (PMSF, Pepstatin A, E64), DNAseI and RNaseA. The lysate was cleared by centrifugation at 40, 000 g , 4 °C for 30 min. 800 μl of anti-mCherry nanobody-coupled sepharose were added to the supernatant and incubated for 4 h at 4 °C. Beads were washed six times with binding buffer. The protein complex was eluted by TEV cleavage at 4 °C for 150 min. Endogenous UtpA was removed through Utp10-sbp-H14-3C-GFP by incubating the elution with anti-GFP nanobody-coupled sepharose for 30 min. The flow through was stored overnight at 4 °C and centrifuged for 10 min at 15, 000 rpm at 4 °C before injection on a Superose 6 Increase 10/300 GL column (GE Healthcare) equilibrated with 50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA.

Purification of UtpB for random conical tilt reconstruction

21 grams of cryo-milled powder from strain YSK43 were resuspended with 42 ml of buffer K (100 mM CHES-NaOH pH 9 (4 °C), 300 mM potassium acetate, 5 mM EDTA, 1 mM DTT) supplemented with protease inhibitors (PMSF, Pepstatin A, E64), DNAseI and RNAseA. The solution was incubated on ice for 10 min and then cleared by centrifugation at 40, 000 g , 4 °C for 30 min. The cleared lysate was incubated with 666 μl anti-mCherry nanobody-coupled sepharose for 4 h at 4 °C on a nutator and washed four times with buffer K. Protease cleavage was performed in 600 μl of 50 mM HEPES-NaOH pH 7.8 (4 °C), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA and 2 μM TEV protease for 2 h on a nutator. The supernatant was collected, centrifuged for 15 min at 15, 000 rpm at 4 °C before injection on a Superose 6 Increase 10/300 GL (GE Healthcare).

On-column glutaraldehyde cross-linking

The complex was on-column glutaraldehyde cross-linked 28 in 50 mM HEPES-NaOH pH 7.7 (4 °C), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA as follows: 500 μl of a 0.25% glutaraldehyde solution was pre-injected onto a size-exclusion column (Superose 6 Increase 10/300 GL, GE Healthcare) and run for 20 min at a flow rate of 0.25 ml/min. The run was paused, the injection loop vigorously washed, UtpB injected, and the run was continued at the same flow rate. The on-column cross-linking procedure was optimized with UtpB purified using affinity tags on different subunits (YSK43 and YSK47, Supplementary Data 1). UtpB from both strains exposed to the pre-injected glutaraldehyde bolus exhibited the same elution behaviour as the non cross-linked complex (Supplementary Fig. 5a) and the protein complex eluted at 13.14 ml.

Purification of UtpB and subcomplexes from bacteria

Standard techniques were used to clone genes of UtpB subunits from Saccharomyces cerevisia BY4741 genomic DNA into pRSFDuet1- or pETDuet1-derivatized expression plasmids. Constructs used for bacterial expression of UtpB are listed in Supplementary Data 2. The plasmid-containing His14-3C-Utp12/Utp13/StrepII-Sumo-Utp21/Utp1 was derived by combining plasmid pSKA048 (backbone, cut with AgeI) with a PCR amplified insert from pSKA052 via compatible NgoMIV/AgeI sites (The PCR introduced NgoMIV sites in front of T7 and after T7 terminator). This resulted in a construct containing His14-3C-Utp12/Utp13/StrepII-Sumo-Utp21/Utp1.

All constructs were expressed in E. coli RIL plasmid-containing cells. For co-expression of pSKA041-His-3C-Utp21/Utp1 with pSKA056-mCherry-3C-Utp6/Utp18 competent E. coli RIL cells were prepared with a pre-transformed plasmid pSKA041. Protein expression was induced by addition of 1 mM IPTG at an OD 600 between 0.6 and 1.0. Cells were grown overnight at 20 °C, collected and flash-frozen as cell pellet or used immediately. Cell pellets were resuspended in Lysis and Wash buffer consisting of 50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 300 mM NaCl supplemented with protease inhibitors (PMFS, Pepstatin A, E64), DNAse and Sumo protease in the case of pSKA061 (no second affinity step was required). Cell lysis was performed using a cell disruptor (TS5, Constant Systems), and the cell lysate was cleared by centrifugation at 40, 000 g , 4 °C for 60 min. The cleared lysate was passed through a 5-ml HisTrap column (GE Healthcare) and washed by increasing the imidazole concentration to 70 mM. Proteins were eluted in 250 mM imidazole and fractions containing protein were pooled, supplemented with 3C protease and dialyzed overnight against 50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM DTT. To remove uncleaved protein and the cleaved affinity tag, the solution was passed once more over the 5-ml HisTrap column. The flow through was concentrated and further purified on a HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade (GE Healthcare) in 50 mM HEPES-NaOH pH 7.6 (4 °C), 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT. Proteins were supplemented with 10% glycerol, flash-frozen and stored at −80 °C.

Analytical size-exclusion chromatography

Size-exclusion chromatography analysis of bacterial subcomplexes of UtpB (Supplementary Figs 3a and 7a) was performed in 50 mM HEPES-NaOH pH 7.7 (4 °C), 300 mM NaCl, 1 mM EDTA using a Superose 6 Increase 10/300 GL column (GE Healthcare) at a flow rate of 0.5 ml/min. 500 μl samples of 2 μM UtpBΔUtp6ΔUtp18 were injected either alone, with 4 μM Utp6/Utp18 or with 4 μM Utp6. For the Utp12/Utp13 size-exclusion chromatography run, 500 μl of 0.25 μM Utp12/Utp13 were injected. Peak fractions were analysed on 4–12% SDS-PAGE and Coomassie-blue staining (Supplementary Figs 3b and 7b, c).

UtpB pull-down experiments

The pull-down assay (Supplementary Fig. 3c) was performed using Nickel Sepharose 6 fast flow beads (GE Healthcare). His-tagged Utp6 was used as bait either alone or co-expressed with Utp18. Proteins were pre-incubated at a concentration of 1 μM in 100 μl for 10 min on ice in buffer PD (50 mM Hepes-NaOH, pH 7.7 (4 °C), 300 mM NaCl, 70 mM Imidazole) and applied on 20 μl of washed and dried beads. After 20 min incubation on ice, beads were washed 5 times with buffer PD and carefully dried. Proteins were eluted with 45 μl buffer PD supplemented with 2 μM 3C protease. The supernatant was removed and analysed by 4–12% SDS-PAGE and Coomassie-blue staining.

DSS cross-linking of UtpA

Peak fractions of size-exclusion chromatography-purified UtpA (in 50 mM HEPES-NaOH pH 7.6, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA) were pooled (total volume 2 ml) and split into 200 μl cross-linking reactions. To each 200-μl aliquot 0.8 μl of DiSuccinimidylSuberate (DSS; 50 mM, 1:1 molar ratio mixture of DSS-H12 and DSS-D12, Creative Molecules Inc.) was added to yield a final DSS concentration of 0.2 mM. Samples were incubated at 25 °C for 30 min with 400 rpm constant shaking. The cross-linking reaction was quenched with 50 mM ammonium bicarbonate. Cross-linked samples were precipitated by adding methanol to a final concentration of 90% and overnight incubation at −80 °C. Precipitated cross-linked UtpA was collected in one tube by repeated centrifugation of the precipitated solution at 21, 000 g , 4 °C for 15 min. The resulting pellet was washed once with 1 ml cold 90% methanol, air-dried and resuspended in 50 μl of 1X NuPAGE LDS buffer (Thermo Fisher Scientific, #NP0007).

DSS cross-linking of UtpBΔUtp6ΔUtp18

The cross-linking reaction of UtpBΔUtp6ΔUtp18 (size-exclusion purified in buffer 50 mM HEPES-NaOH pH 7.7 (4 °C), 300 mM NaCl, 1 mM EDTA) was performed in a total reaction volume of 150 μl at room temperature using different DSS concentrations (0.2, 0.4 and 0.8 mM 1:1 molar ratio mixture of DSS-H12 and DSS-D12, Creative Molecules Inc.) at a protein concentration of 0.2 mg/ml. The reaction was stopped after 30 min with 50 mM ammonium bicarbonate and supplemented with NuPAGE LDS (1X final). 10 μl of the reaction was analysed by 4–12% SDS-PAGE.

Mass spectrometry analysis of UtpA and UtpBΔUtp6ΔUtp18

DSS-i ristseotud UtpA või UtpB kompleksid LDS-puhvris redutseeriti 25 mM DTT-ga, alküüliti 100 mM 2-kloroatseetamiidiga, eraldati SDS-PAGE abil, kasutades mitut 4–12% Bis-Tris geeli rada, ja värviti Coomassie- sinine. Ristseotud kompleksidele vastav geelipiirkond viilutati ja lagundati geelisiseselt öö läbi trüpsiiniga, et saada ristseotud peptiide. Pärast lagundamist hapestati peptiidide segu ja ekstraheeriti geelist, nagu eelpool kirjeldatud, 39, 40 . LC-ESI-MS abil teostati analüüsid kas otse ekstraheeritud peptiididel või pärast fraktsioneerimist suuruseralduskromatograafia 41 või kõrge pH pöördfaasikromatograafia abil. Peptiidid laaditi EASY-Spray kolonni (Thermo Fisher Scientific, kas ES800: 15 cm × 75 μm ID, PepMap C18, 3 μm või ES801: 15 cm × 50 μm ID, PepMap RSLC C18, 2 μm) EASY- nLC 1000. MS ja MS / MS analüüsid viidi läbi Q Exactive Plus massispektromeetriga (Thermo Fisher Scientific). Igal täisskannimisel kaheksa parima prekursori MS / MS analüüsimisel kasutati järgmisi parameetreid: eraldusvõime: 17 500 (200 th juures); AGC eesmärk: 2 × 105; maksimaalne süstimisaeg: 800 ms; isolatsioonilaius: 1, 4 m / z; normaliseeritud kokkupõrke energia: 29%; laeng: 3–7; intensiivsuse lävi: 2, 5 × 10 3 ; peptiidide vaste: välja lülitatud; dünaamilise välistamise tolerants: 1500 mmu. Ristseotud peptiidid identifitseeriti massispektritest pLink 17 abil . Kõiki siin esitatud spektreid kontrolliti käsitsi 39, 40 .

Kõik UtpA ja UtpB jaoks leitud ristsidemed on esitatud lisaandmetes 3 ja lisaandmetes 4. Joonised on koostatud xiNET 42 abil (joonised 1f ja 2g ning täiendavad joonised 2).

CDNA (CRAC) ultraviolett-ristsidumise ja suure läbilaskevõimega analüüs

Pärmi tüvesid, mis kasvasid aktiivselt SD-TRP söötmes temperatuuril 30 ° C, mille OD6o oli 0, 5, kiiritati kiirusel 254 nm UV-kiirgusega 100–110 s, nagu kirjeldatud 24 . RNA-valgu komplekside puhastamine ja seotud RNA fragmentide RT-PCR amplifikatsioon viidi läbi vastavalt kirjeldusele 33 . cDNA raamatukogud sekveneeriti Illinina HiSeq2500 abil Edinburghi genoomikas Edinburghi ülikoolis. Illumina sekveneerimise andmed joondati pärmi genoomiga, kasutades Novoalignit (//www.novocraft.com). Bioinformaatika analüüsid viidi läbi vastavalt kirjeldusele, kasutades PyCRAC 43, 44 .

UtpA negatiivse peitsi EM-i analüüs

Puhastatud UtpA kanti hõõglahendusega kodus valmistatud söekattega vaskvõredele ja värviti negatiivselt 0, 75% uranüülformiaadiga, nagu eelpool kirjeldatud 45 . Pildid salvestati Philips CM10-l, mida töötati kiirenduspingega 100 kV ja mis oli varustatud XR16-ActiveVu (AMT) kaameraga nominaalse suurendusega 52 000 × ja kalibreeritud piksli suurusega 2, 8 A proovi tasemel.

UtpB negatiivse peitsi EM-analüüs, millel puuduvad Utp6 ja Utp18

Taastatud UtpB, milles puuduvad Utp6 ja Utp18, ristsidestati kolonnil endogeense UtpB-na, kanti hõõglahendusega süsinikuga kaetud 200 silmaga vaskvõredele (Electron Microscopy Sciences, CF200-Cu) ja värviti 2% uranüülatsetaadiga. Tecnai G2 piiritusel, mille tööpinge oli 120 kV ja tulemuseks olev piksli suurus oli 2, 17 Å proovi tasemel, koguti 98 mikrograafi nominaalse suurendusega 49 000, fookuses −1, 6 μm. E2boxer.py abil valiti käsitsi 8 171 osakest, mis akendati 230x230 pikslilistesse piltidesse. Osakesed töödeldi ISAC-iga, määrates 50 pilti rühmas ja pikslivigade lävi 0, 7. 23 põlvkonda andis 171 klassi, mis moodustas 3343 osakest (41% kogu andmestikust; täiendav joonis 6b).

UtpB negatiivsete värvidega EM ja 3D rekonstrueerimine

Endogeenset UtpB kanti hõõglahendusega kodus valmistatud süsinikuga kaetud vaskvõredele ja värviti negatiivselt 0, 75% uranüülformiaadiga, nagu eelpool kirjeldatud 45 . Pildid salvestati Tecnai T12, mis töötas kiirenduspingel 120 kV. Kallutatavaid paare registreeriti Gatan 4k CCD kaameraga madala doosiga tingimustes kalibreeritud suurendusega 57 555 × ja saadud piksli suuruseks 2, 61 Å proovi tasemel. Kokku koguti 420 kallutuspaari mikrograafi, mille fookus oli –1, 6 μm (mikrograafipaarid 1–159 kaldenurgaga 50 ° ja 0 °, ülejäänud paarid kaldenurgaga 60 ° ja 0 °).

Kasutades e2RCTboxer.py 46, valiti käsitsi 26 510 osakeste paari ja kallutusnurk määrati kallutusega 47 . Osakesed akendati 192 × 192 pikslilistesse piltidesse ja normaliseeriti. Kuni valminud proovide osakeste kujutised töödeldi ISAC-iga, määrates 50 pilti rühmas ja pikslivigade lävi 0, 7. 14 põlvkonda andis 598 klassi, mis moodustas 9 077 osakest (34% kogu andmestikust; täiendav joonis 6a). Paralleelselt joondati osakeste kujutised pöörlevalt ja translaarselt ning viidi läbi SPIDER 31 abil 10 mitme võrdlustsükli tsüklit. Igale mitme referentsjoonduse ringile järgnes K-väärtuste klassifikatsioon, täpsustades 50 väljundklassi (täiendav joonis 8c). Esimesel mitme viitega joondamisel kasutatud viited valiti osakeste kujutiste hulgast juhuslikult. Valitud klasside jaoks arvutati 3D-rekonstruktsioonid seejärel kallutatud proovist koos osakeste kujutistega, kasutades SPIDERis tagantprojektsiooni ja tagantprojektsiooni täpsustamise protseduure (täiendav joonis 8d). Lõplik UtpB maht (joonis 3c, täiendav joonis 9b) saadi 5 klassi (rühmad 8, 13, 19, 33 ja 47, täiendav joonis 8d: sinised ruudud) ühendamise ja nurga täpsustamise protseduuri abil Ämblik. See tiheduskaart sisaldas 3 517 osakest, mis olid valitud kallutatud proovi piltide hulgast, ja 319 osakest, mis olid valitud kuni proovitud proovi piltidelt. Kõik mahud filtreeriti madalpääsfiltrini 20 A-ni ja ruumala ümbritsev müra eemaldati automaatse maski protseduuri abil e2proc3d.py-s (viide 46).

Andmete kättesaadavus

Saccharomyces cerevisiae UtpB kompleksi negatiivse värvusega EM-kaart on hoiustatud elektronmikroskoopia andmepangas liitumiskoodi EMD-8223 all. Kõik jadaandmed on deponeeritud geeniekspressiooni omnibussi (GEO) andmebaasi (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) registreerimisnumbri GSE79950 all. Selle uuringu järeldusi toetavad andmed on soovi korral kättesaadavad vastavalt autorilt.

Lisainformatsioon

Kuidas seda artiklit tsiteerida: Hunziker, M. jt . UtpA ja UtpB chaperone tärkav ribosomaalne RNA ja U3 snoRNA, et algatada eukarüootne ribosoomi assamblee. Nat. Kommuun. 7: 12090 doi: 10.1038 / ncomms12090 (2016).

Liitumised

Elektronmikroskoopia andmepank

  • EMD-8223

Geeniekspressiooni omnibus

  • GSE79950

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendavad joonised ja viited

    Täiendavad joonised 1-11 ja täiendavad viited

  2. 2

    Vastastikuse eksperdihinnangu fail

Exceli failid

  1. 1

    1. lisa tabel

    pärmitüved

  2. 2

    2. tabel

    plasmiidid

  3. 3

    Lisalaud 3

    UtpA CL-MS andmed

  4. 4

    Lisalaud 4

    UtpB CL-MS andmed

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.