Il-2 signaalide häälestamine cd25 adp-ribosüülimisega | teaduslikud aruanded

Il-2 signaalide häälestamine cd25 adp-ribosüülimisega | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Interleukins
  • Meditsiinilised uuringud

Abstraktne

Immunoloogilise tolerantsuse ja homöostaasi kontroll põhineb Foxp3 + CD4 + CD25 + regulatoorsetel T-rakkudel (Tregs), mis ekspresseerivad põhiliselt interleukiin-2, CD25 kõrge afiinsusega retseptorit. Tregid vohavad vastusena IL-2 / anti-IL-2 antikehakomplekside süstimisele või IL-2 väikestele annustele. Endogeensetest mehhanismidest, mis reguleerivad CD25 tundlikkust IL-2 signaaliülekande suhtes, on aga vähe teada. Siin demonstreerime, et CD25 on ADP-ribosüülitud IL-2 seondumiskohas Arg35 juures ekto-ADP-ribosüültransferaasi ARTC2.2 abil, mis on toksiinidega seotud GPI-ga ankurdatud ektoensüüm. ADP-ribosüülimine pärsib IL-2 seondumist CD25-ga, IL-2-indutseeritud STAT5 fosforüülimist ja IL-2-sõltuvat rakkude proliferatsiooni. Meie uuring selgitab veel tuvastamata mehhanismi IL-2 signaalide häälestamiseks. See äsja leitud mehhanism võib takistada Tregsi põletikukohtades ja seeläbi võimaldada aktiveeritud efektor-T-rakkude tugevamat reageerimist.

Sissejuhatus

Interleukiin 2 (IL-2) aktiveerib paljusid immuunrakke, kuid kinnitavad tõendid näitavad, et selle peamine ülesanne on toetada immuunreaktsioone pärssivate ja autoimmuunhaigusi ennetavate tregide generatsiooni ja ellujäämist 1, 2, 3, 4 . IL-2 signaalid kõrge ja madala afiinsusega rakupinna retseptorite kaudu 5, 6, 7 . CD25, IL-2 retseptori a-ahel, on konstitutiivselt seotud lipiidide parvedega 8 . Heterotrimeerse kõrge afiinsusega retseptori kompleksi kokkupanek initsieeritakse IL-2 seondumisega CD25-ga, millele järgneb CD122 ja CD132 värbamine. CD25 puudumisel moodustavad β ja y ahelad retseptori, mille afiinsus IL-2 9 suhtes on 10–100 korda madalam. Seda madala afiinsusega retseptorit ekspresseerivad naiivsed T-rakud, mälu CD8 + T-rakud ja NK-rakud. Mõlemad retseptorid annavad signaali STAT5 (signaalimuundur ja transkriptsiooni 5 aktivaator) fosforüülimise kaudu 10, 11, 12 . IL-2 kristallstruktuur koos selle retseptoriga näitas CD25 jääke, mis on seotud IL-2 6, 7 sidumisega, sealhulgas silmapaistev arginiini dublett (R35R36) (täiendav joonis 1a, b).

T-raku alamkomplekte moduleeritakse diferentseeritult IL-2 signaali abil, sõltuvalt IL-2 kontsentratsioonist ja IL-2 retseptori alaühikute ekspressioonist. CD25 ekspresseerub põhiliselt kõrgel tasemel Tregsi poolt ja IL-2 signaalide edastamine läbi CD25 on nende rakkude 1, 2, 3, 13, 14, 15 genereerimise, ellujäämise ja funktsioneerimiseks ülioluline . IL-2 tõhusa tarbimisega võivad tregid naaberalas olevatest T-rakkudest ilma jätta selle tsütokiini 16, 17 . Värsked uuringud näitavad, et in vivo ravi IL-2 väikeste annustega või IL-2-ga anti-IL-2 antikehade kompleksi korral võib pärssida immuunsuse vahendatud haigusi, indutseerides Tregide laienemist 17, 18, 19, 20, 21, 22 . IL-2-spetsiifilised antikehad võivad pikendada IL-2 seerumi poolestusaega, pärssides madala molekulmassiga tsütokiini 23 neerufiltratsiooni. Intrigeerivalt kutsuvad erinevad IL-2 / anti-IL-2 antikehakompleksid in vivo esile erinevad vastused, sõltuvalt konkreetse antikehaga seotud IL-2 epitoobist: hiire IL-2 kompleksis mAb-ga (monoklonaalne antikeha) JES6-1A12 või Inimese IL-2 koos kompleksis mAb 5344-ga indutseerib Tregide eelistatava laienemise, samal ajal kui hiire IL-2 kompleksis mAb S4B6-ga või inimese IL-2 kompleksis mAb-602-ga kutsub esile CD8 + tsütotoksiliste T-rakkude ja NK-rakkude eelistatava laienemise. 23, 24, 25, 26, 27, 28 . Need leiud tõstatavad küsimuse, kas on olemas endogeensed mehhanismid, mis võiksid sarnaselt moduleerida IL-2 signaaliülekannet in vivo .

NAD + sõltuv ADP-ribosüülimine on üks translatsioonijärgseid modifikatsioone, mis reguleerib valgufunktsioone 29, 30 . NAD + (nikotiinamiidadeniindinukleotiid) vabaneb rakkudest põletiku ajal ja toimib signaalmolekulina, mis hoiatab immuunrakke kudede kahjustuskohtadesse 31, 32, 33, 34 . NAD + -sõltuv toksiiniga seotud ADP-ribosüültransferaas ARTC2.2 on GPI-ga ankurdatud ensüüm, mida ekspresseeritakse naiivsete T-rakkude rakumembraanil ja Foxp3 + CD4 + CD25 + regulatoorsetel T-rakkudel ( Tregs ) 35, 36, 37 . ARTC2.2 kannab ADP-riboosi fragmendi NAD + -st teiste parvega seotud membraanivalkude 35, 38 arginiinijääkidesse . Näiteks indutseerib P2X7 ioonikanali ADP ribosüülimine R125 juures ioonkanali 38 nihkumist. Rakupinnavalkude ADP-ribosüülimist saab jälgida autoradiograafia või antikehadel põhinevate immuunanalüüside abil (täiendav joonis fig 1c, d).

Siin leiame CD25 ADP-ribosüülimise kui uudse mehhanismi, mis kontrollib IL-2 signaaliülekannet pärast Tregide kokkupuudet rakuvälise NAD + -ga. Kasutades ADP-ribosüülitud rakupinnavalkude afiinsuspuhastust ja massispektromeetriat, tuvastasime CD25 ARTC2.2 peamiseks sihtmärgiks. Näitame, et CD25 ARTC2.2-ga katalüüsitud, NAD + -st sõltuv ADP-ribosüülimine pärsib IL-2 seondumist, STAT5 IL-2 indutseeritud fosforüülimist ja IL-2-sõltuvat raku proliferatsiooni. Pakume välja, et CD25 ADP-ribosüülimine pakub endogeenset mehhanismi IL-2 signaalide häälestamiseks vastusena NAD + -le, mis vabaneb vigastatud rakkudest põletiku ja koekahjustuse ajal. Inhibeerides normaalsetes T-rakkudes looduslikult ekspresseeritava kõrge afiinsusega IL-2 retseptori moodustumist, võib see mehhanism võimaldada aktiveeritud efektor-T-rakkude eelistatavat laienemist põletikulises keskkonnas.

Tulemused

CD25 tuvastamine ARTC2.2 peamise sihtmärgina

YAC-1 lümfoomi rakuliin ekspresseerib konstitutiivselt ARTC2.2 ja CD25 (joonis 1a). Nende rakkude inkubeerimine 32 P-NAD + -ga andis tulemuseks mitme riba, sealhulgas silmatorkava riba 50 kD, märgistamise (joonis 1b, rada 1, noolepea). Sarnased tulemused saadi ka siis, kui substraadina kasutati etheno-NAD + (joonis fig 1d, rada 1, noolepea). Eteen-ADP-ribosüülitud valkude afiinsuspuhastamine YAC-1 rakulüsaatidest (joonis fig 1c, d), millele järgnes massispektromeetria analüüs (joonis fig 1e), identifitseeris selle riba valgu CD25-na. Immunosadestamise analüüs CD25-spetsiifiliste antikehadega kinnitas valgu identsust selles silmatorkavas 50 kD ribavahemikus kui CD25, st see riba oli raku lüsaatidest tühjendatud ja immuunsademes taastatud (joonis 1b, võrrelge radasid 1, 2 ja 4). .

Image

(a) YAC-1 rakud värviti ARTC2.2 ja CD25 spetsiifiliste fluorokroomiga konjugeeritud mAb-dega ja neid analüüsiti voolutsütomeetria abil. (b) YAC-1 rakke inkubeeriti 32 P-NAD + -ga. Rakulüsaadid töödeldi immunosadestamisega, valgud fraktsioneeriti suurusega SDS-PAGE abil ja nende radioaktiivsus tuvastati autoradiograafia abil. Rajad 1, 2: rakulüsaadid enne ja pärast CD25 sadestamist; rada 3: kontrollsadestamine valgu G-ga, rada 4: sadestumine anti-CD25-ga (PC61). (c – e) YAC-1 rakke inkubeeriti eteno-NAD + -ga. Eteno-ADP-ribosüülitud valgud puhastati rakulüsaadist, kasutades afiinsuskolonni etenoadenosiini-spetsiifilise monoklonaalse antikehaga 1G4. Seotud proteiinid elueeriti neljas fraktsioonis etenoadenosiiniga. Rakulüsaadi (rada 1), kolonni voolavuse (rada 2), pesemise (rada 3) ja eluaatide (read 4–7) valgud fraktsioneeriti SDS-PAGE abil. Koguvalku visualiseeriti Coomassie värvimisega (c), eteeno-ADP-ribosüülitud valgud visualiseeriti paralleelsel immunoblotanalüüsil monoklonaalse antikehaga 1G4 (d). 50 kD riba 5. rajal (paneel c) lõigati geelist välja ja töödeldi trüpsiini abil ja nanospreide massispektromeetriaga. Fragmentitud trüptilise peptiidi MALDI-TOF spekter 1892, 9 kD (e). Karbis olevad numbrid tähistavad üksikute peptiidi piikide masse, sulgude kohal olevad numbrid tähistavad külgnevate peptiidi piikide masside erinevusi. CD25 N-terminaalse peptiidi aminohappeline järjestus on näidatud ülaosas numbritega, mis vastavad vastavate peptiidifragmentide massidele. Tulemused esindavad kolme sõltumatut katset.

Täissuuruses pilt

ARTC2.2 ADP-ribosüülib R25 juures IL-2 seondumiskohas CD25

Inimese IL-2 3D-struktuurist koos selle heterotrimeerse retseptoriga selgub, et CD25 rakuvälise domeeni nähtavas osas asuvad kõik kaheksa arginiinijääki lokaliseeruvad valgu pinnale ja on seega potentsiaalselt kättesaadavad ADP-ribosüülimiseks (täiendav Joonis 1b, joonis 2a). Et testida, milliseid neist arginiinidest saaks ARTC2.2 abil ADP-ribosüülida, asendasime iga arginiini jäägi lüsiiniga individuaalselt saitidele suunatud mutageneesi teel. Lisaks ostsime CD25 sünteetilise cDNA konstrukti, milles kõik 11 arginiini olid asendatud lüsiiniga (RallK). Selles konstruktsioonis asendasime iga lüsiini individuaalselt arginiiniga, luues seeläbi CD25 variandid, mis sisaldavad ainult ühte arginiinijääki. Iga mutant transfekteeriti koos ARTC2.2-ga HEK (inimese embrüonaalse neeru) rakkudesse. 40 tundi pärast transfektsiooni hinnati rakupinna ekspressioonitaset voolutsütomeetria abil, kasutades ARTC2.2 ja CD25-spetsiifilisi mAb-sid (täiendav joonis 2). Rakkude paralleelseid alikvoote inkubeeriti 32 P-märgistatud NAD + -ga. CD25 ja teiste rakupinna valkude radiomärgistamist hinnati SDS-PAGE autoradiograafia abil (joonis 2b, c).

Image

(a) Inimese CD25 rakuvälistes domeenides sisalduva 11 arginiinijäägi skemaatiline diagramm. Numbrid vastavad positsioonile loodusliku valgu aminohapete järjestuses, st pärast signaalpeptiidi eemaldamist. Katkendjooned tähistavad jääke, mis pole nähtavad IL-2-ga komplekseeritud IL-2 retseptori 3D-struktuuris (2erj). TMD: transmembraanne domeen. (b, c) HEK-rakke transfekteeriti koos ARTC2.2 ekspressioonivektoritega ja kas mitte-ADP-ribosüülitud kontrollantigeeniga (co), metsiktüüpi CD25 (WT) või CD25 variantidega. CD25 analüüsitud mutandid hõlmavad üksikuid R> K mutante ( B ), sünteetilist konstrukti, milles kõik rakuvälises domeenis olevad arginiinijäägid on asendatud lüsiiniga (RallK), ja RallK variante, mis kannavad individuaalseid K> R tagasi mutatsioone (c). 48 tundi pärast transfektsiooni inkubeeriti rakke 32 P-NAD + -ga. Radioaktiivselt märgistatud valgud tuvastati SDS-PAGE autoradiograafia abil. Tulemused esindavad nelja sõltumatut katset. Numbrid näitavad üksikute ribade suhtelist märgistamise intensiivsust (keskmine nelja korduse korral).

Täissuuruses pilt

Tulemused näitasid, et CD25 üksikud R> K mutandid olid endiselt ARTC2.2 sihtmärk, mis viitab sellele, et CD25 on ADP-ribosüülitud rohkem kui ühes kohas (joonis 2b). Sarnased tulemused saadi ka hiire CD25 korral (täiendav joonis 3). See tuletab meelde varasemaid teateid P2X7 ja defensiin 1 ADP-ribosüülimise kohta, mis mõlemad on ADP-ribosüülitud enam kui ühe arginiini 38, 39 juures . RallK, mutant, milles kõik arginiinid olid asendatud lüsiiniga, ei sisaldanud radioaktiivset märgist (joonis 2c, rada 1) vaatamata raku pinna tugevale ekspressioonile (täiendav joonis 2). See leid kinnitab, et CD25 ADP ribosüülimine ARTC2.2 poolt on arginiini-spetsiifiline. Neli RallK reversioonimutanti, mis sisaldasid ühte arginiinijääki, märgistati ARTC2.2-ga radiomärgistusega, mis näitab, et need saidid võivad põhimõtteliselt olla ARTC2.2 ADP-ribosüülimiskohtadena (joonis 2c, R32, R35, R67, R140). . Nendest jääkidest kolm (R32, R35, R140) on säilinud hiire CD25-s (täiendav joonis 4). Neljas jääk (R67) asub kahe sushi-domeeni vahel olevas linkeris, mis pole 3D-struktuuris nähtav. R67 revertandi tugevam märgistamine näitab, et see jääk on ARTC2.2 jaoks paremini kättesaadav kui teised revertandid. R35 on osa arginiini dubletist (R35 / R36), nagu ka primaarsed ADP ribosüülimise saidid P2X7 ja defensiin 1 38, 39 . R35 asub IL-2 seondumisliideses (täiendav joonis 1), R32 ja R140 asuvad vastavalt esimese ja teise Sushi domeeni servades ja R67 asub elastsel linkeril kahe sushi domeeni vahel, mis on pole nähtav IL-2 retseptori kompleksi 3D-struktuuris (täiendav joonis 4).

ADP-ribosüülimine inhibeerib mAb 7D4 seondumist, kuid mitte mAb PC61

ADP-ribosüülimise tulemuseks on mahukas jäägi kinnitumine ja see muudab kohaliku laengu muutuse (positiivselt laetud arginiinist negatiivselt laetud ADP-ribosüülarginiiniks) 40 . Seetõttu on mõeldav, et CD25 ADP ribosüülimine antikeha sidumiskohas või selle läheduses võib takistada antikeha sidumist. Selle küsimuse lahendamiseks inkubeerisime hiire splenotsüüte NAD + puudumisel või juuresolekul, millele järgnes värvimine CD25-spetsiifiliste monokloonsete antikehadega PC61 ja 7D4 (joonis 3). Tulemused näitavad NAD + annusest sõltuvat värvumise pärssimist 7D4 võrra, kuid NAD + mõju PC61 seondumisele on vähene, kui see üldse ilmneb (joonis 3b), mis näitab, et ADP-ribosüülimine mõjutab 7D4 poolt tunnustatud epitoopi, kuid mitte seda, mida PC61.

Image

Enne värvimist CD4 ja CD25 vastu suunatud fluorokroomiga konjugeeritud mAb-dega (mAb PC61 või mAb 7D4) inkubeeriti DEREG-hiirte splenotsüüte NAD + näidatud kontsentratsioonide puudumisel või juuresolekul. Liivamine viidi läbi CD4 + rakkudel. a) Tüüpilised rakkude punktid, mida inkubeeritakse 12 μM NAD + puudumisel või olemasolul. (b) CD4 + GFP + rakkude protsent, mis värviti anti-CD25 mAb-dega, joonistatud funktsioonina lisatud NAD + kontsentratsioonist. Tulemused esindavad kahte sõltumatut katset.

Täissuuruses pilt

ADP-ribosüülimine pärsib CTLL-2 rakkude IL-2 sidumist ja IL-2-sõltuvat proliferatsiooni

Et teha kindlaks, kas ADP-ribosüülimine mõjutab IL-2 ja IL-2-sõltuva raku proliferatsiooni seondumist, pöördusime IL-2-sõltuva CTLL-2 rakuliini poole (joonis 4). Vastupidiselt YAC-1 rakkudele ei prolifereeru CTLL-2 rakud eksogeense IL-2 puudumisel. Pealegi, ka vastupidiselt YAC-1 rakkudele, ei ekspresseeri CTLL-2 rakud ARTC2.2 ja neil on ART aktiivsus raku pinnal vähene või üldse mitte (joonis 4a, paneelid 2 ja 3). Pärast stabiilset transfektsiooni ARTC2.2-ga omandavad CTLL-2 ARTC2.2 rakud võime ADP-ribosüleerida raku pinnavalke (joonis 4a, paneel 6), silmapaistva sihtmärgina CD25 (joonis 4b). ART-negatiivsete ja ARTC2.2-d ekspresseerivate CTLL-2 rakkude kättesaadavus võimaldab otseselt hinnata ADP-ribosüülimise mõju raku funktsioonidele, nt võrreldes CTLL-2 ARTC2.2 ja vanemate CTLL-2 rakkude vastuseid rakuvälistele rakkudele NAD + .

Image

(a) Transfekteerimata vanemlikke ja ARTC2.2-ga transfekteeritud CTLL-2 rakke inkubeeriti eteno-NAD + -ga ja värviti CD25, ARTC2.2-le spetsiifiliste fluorokroomiga konjugeeritud monoklonaalsete antikehade ja etenoadenosiiniga ning analüüsiti voolutsütomeetria abil. (b) CTLL-2 ARTC2.2 rakke inkubeeriti 32 P-NAD + -ga ja rakulüsaadid immunosadestati anti-CD25 ja SDS-PAGE autoradiograafia abil, nagu joonisel fig 1b. Rajad 1, 2: lüsaadid enne ja pärast CD25 sadestamist, rada 3: kontrollsadestamine valguga G, rada 4: sadestumine anti-CD25-ga. (c) CTLL-2 ja CTLL-2 ARTC2.2 rakke eelinkubeeriti NAD + või märgistamata IL-2 puudumisel või puudumisel. Seejärel inkubeeriti rakke biotinüleeritud IL-2-ga enne fluorokroomiga konjugeeritud streptavidiini lisamist ja analüüsi voolutsütomeetria abil. (d) CTLL-2 ja CTLL-2 ARTC2.2 rakud külvati 24-augulisele kultuuriplaadile ( 3x104 süvendi kohta) ja inkubeeriti neli päeva söötmes, mis sisaldas näidatud IL-2 kontsentratsioone. Söödet, milles puudub NAD + või mis seda sisaldas, lisati iga 12 tunni järel. Rakkude arvu hinnati voolutsütomeetria abil Trucount graanulite (BD) abil. Tulemused esindavad kahte sõltumatut katset.

Täissuuruses pilt

Hindamaks, kas CD25 ADP ribosüülimine mõjutab IL-2, CTLL-2 ja CTLL-2 seondumist, inkubeeriti ARTC2.2 rakke 15 minutit biotinüleeritud IL-2-ga märgistamata IL-2 või NAD puudumisel või puudumisel + . Seejärel hinnati biotinüleeritud IL-2 seondumist APC-konjugeeritud streptavidiiniga (joonis 4c). Tulemused näitavad, et eelinkubatsioon NAD + -ga pärsib IL-2 seondumist CTLL-2 ARTC2.2 rakkudega, kuid mitte CTLL-2 vanemate rakkudega (halli varjundiga histogrammid). Kontrollanalüüsid, mis tehti raku eelinkubeerimisega märgistamata IL-2-ga, blokeerisid biotinüleeritud IL-2 seondumist nii CTLL-2 ARTC2.2 kui ka vanemate CTLL-2 rakkude poolt (joonis 4c, kriipsjoontega histogrammid).

Hinnamaks, kas ADP-ribosüülimine mõjutab IL-2-sõltuvat rakkude proliferatsiooni, eemaldati CTLL-2 ja CTLL-2 ARTC2.2 rakud IL-2-st, pestes PBS-ga, millele järgnes 6-tunnine inkubeerimine IL-2 vabas söötmes . Seejärel külvati rakud 24-augulistele plaatidele söötmes, mis sisaldas IL-2 järjestikuseid lahjendusi, ja rakke kasvatati 3, 5 päeva jooksul NAD + puudumisel või juuresolekul. Rakkude arvu hinnati voolutsütomeetria abil, kasutades Trucount graanuleid (joonis 4d). Tulemused näitavad, et NAD + ei mõjuta vanemlike CTLL-2 rakkude paljunemist, samas kui see pärsib märkimisväärselt CTLL-2 ARTC2.2 rakkude proliferatsiooni IL-2 madalatel ja keskmistel annustel (alla 5 ng / ml). Need tulemused viitavad sellele, et rakupinnavalkude ADP-ribosüülimine häirib IL-2 sidumist ja IL-2 signaaliülekannet.

ADP-ribosüülimine pärsib STAT5 IL-2 indutseeritud fosforüülimist

On teada, et IL-2 seondumine käivitab signaali ülekandetee, mille tulemuseks on STAT5 aktiveerimine fosforüülimise teel. Viimast saab visualiseerida pSTAT5 spetsiifilise mAb 47-ga voolutsütomeetria abil (joonis 5). Et hinnata, kas ADP-ribosüülimine häirib STAT5 IL-2 põhjustatud fosforüülimist, töödeldi CTLL-2 ja CTLL-2 ARTC2.2 rakke NAD + -ga ja seejärel analüüsiti FACS-iga IL-2-indutseeritud STAT5 fosforüülimise suhtes ( Joonis 5a). Tulemused näitavad, et rakuvälise NAD + -ga töötlemine pärsib IL-2-indutseeritud STAT5 fosforüülimist CTLL-2 ARTC2.2 rakkude korral (joonis 5a, paneel 2, varjutatud histogramm), kuid mitte vanemate CTLL-2 rakkude korral (joonis fig. 5a, paneel 1). Rakupinnavalkude ARTC2.2-katalüüsitud ADP-ribosüülimise ennetamine ARTC2.2-d blokeeriva nanokehaga s + 16a 41 takistas täielikult STAT5 fosforüülimise pärssimist CTLL-2 ARTC2.2 rakkudes NAD + juuresolekul (joonis 5b, paneel 2), kinnitades, et NAD + mõju STAT5 fosforüülimisele sõltub ARTC2.2 katalüüsitud ADP-ribosüülimisest.

Image

(a) CTLL-2 ja CTLL-2 ARTC2.2 rakke eelinkubeeriti NAD + puudumisel või juuresolekul enne stimuleerimist IL-2-ga 15 minutit. Rakud fikseeriti ja värviti fosforüülitud STAT5 (pSTAT5) vastaste fluorokroomiga konjugeeritud antikehadega. Kontrollrakke inkubeeriti ilma NAD + või IL-2ta. (b) CTLL-2 ja CTLL-2 ARTC2.2 rakke eelinkubeeriti enne NAD + lisamist ja IL-2-ga stimuleerimist ARTC2.2 blokeeriva nanokehaga s + 16a (nb). (c) Tregid sorteeriti FACS metsiktüüpi DEREG hiirtelt ja inkubeeriti enne IL-2-ga stimuleerimist ja pSTAT5 värvimist NAD + puudumisel või juuresolekul. Tulemused esindavad kahte sõltumatut katset.

Täissuuruses pilt

Looduses esinevad Foxp3 + tregid ekspresseerivad põhiliselt CD25 ja ARTC2.2 37 . DEREG-transgeensed hiired ekspresseerivad foxp3 promootori kontrolli all difteeria-toksiini retseptori-GFP sulandvalku, võimaldades elavaid trege visualiseerida voolutsütomeetria abil 42 . ARTC2 - / - DEREG hiirte 37 kättesaadavus võimaldab otseselt hinnata NAD + -sõltuva ADP-ribosüülimise mõju Tregidele, näiteks võrrelda ARTC2 - / - ja metsiktüüpi DEREG hiirte Tregs vastuseid rakuvälisele NAD + (joonis fig. 5c ja täiendav joonis 5). FACS-i sorteeritud tregide töötlemine rakuvälise NAD + -ga pärssis STAT5 IL-2 indutseeritud fosforüülimist (joonis 5c). Sarnaselt pärssis sortimata splenotsüütide töötlemine NAD + -ga STAT5 fosforüülimist metsiktüüpi Tregsi rakkudes, kuid mitte ARTC2 - / - Tregides (täiendav joonis 5a – c). Oleme varem näidanud, et ADP-ribosüülimine indutseerib P2X7 ioonkanali nihkumist, mille tulemuseks on kaltsiumi sissevool ja fosfatidüülseriini 38 eksterniseerimine. Et teha kindlaks, kas IL-2-indutseeritud STAT5 fosforüülimise pärssimist vahendab P2X7, analüüsisime rakuvälise NAD + mõju ka P2X7 - / - (ARTC2 + / + ) DEREG hiirte rakkudele (täiendav joonis 5e). . Tulemused näitavad, et NAD + töötlemine pärsib STAT5 fosforüülimist ka P2X7 - / - (ARTC2 + / + hiirtest) puhastatud Tregides, osutades, et see toime ei sõltu P2X7 aktiveerimisest.

Arutelu

Siin esitatud tulemused identifitseerivad interleukiin-2 retseptori α-ahela CD25 kui peamise sihtmärgi toksiinidega seotud ektoensüümi ARTC2.2 poolt ADP-ribosüülimisel (joonis 1) ja annavad ülevaate ADP- CD25 ribosüülimine. ADP-ribosüülimistestid ARTEK2.2 ja CD25 mutantidega kaas-transfekteeritud HEK-rakkudes identifitseerisid R35 arginiini dubletis R35R36 ADP-ribosüülimise sihtkohana (joonis 2). See tuletab meelde hiire P2X7 ja inimese defensiini 1, mis mõlemad sisaldavad ADP-ribosüülimise primaarsete saitidena topeltarginiine, kuid on lisaks muudele arginiinijääkidele 38, 39 ADP-ribosüülitud. R35 on lokaliseeritud IL-2 seondumispiirkonnas (täiendavad joonised 1d, 4) 7, 43 . Arvestades, et ADP-ribosüülimise tulemuseks on mahukas jäägi kinnitumine, muundades positiivselt laetud arginiini negatiivselt laetud ADP-ribosüülarginiiniks, pole üllatav, et selle jäägi ADP-ribosüülimine häirib IL-2 sidumist (joonis 4c). . Järjepidevalt pärsib CD25 ADP-ribosüülimine STAT5 IL-2 indutseeritud fosforüülimist (joonis 5a, c), samuti IL-2-sõltuvat rakkude proliferatsiooni (joonis 4f). Märkimist väärib see, et CD25 ADP ribosüülimine blokeerib monoklonaalse antikeha 7D4 (joonis 3), antikeha, mida tavaliselt kasutatakse tregide helmestega sorteerimisel, seondumist (joonis 3). Arvestades, et rakkude 37, 44 manipuleerimise käigus võib vabaneda endogeenset NAD +, võib CD25 tahtmatu ADP ribosüülimine enne 7D4-ga värvimist takistada tregide sorteerimist helmestega. CD25 NAD + vahendatud ADP-ribosüülimine võib tõepoolest seletada raskusi CD38ko hiirte Tregide puhastamisel helmeste abil sorteerimisel 45, kuna peamise raku pinna NAD-hüdrolaasi puudumine nendes hiirtes põhjustab rakkude ekspositsiooni rakuvälise kõrgema tasemega NAD + 37, 46 . Kirjeldasime hiljuti lihtsat vahendit rakupinnavalkude tahtmatu ADP-ribosüülimise ärahoidmiseks põrnast või maksast rakkude ettevalmistamise ajal, st ARTC2.2-d blokeeriva nanokeha süstemaatiline süstimine kümme minutit enne hiirte 47 ohverdamist.

Joonis fig 6 illustreerib mudelit, kus CD25 ADP-ribosüülimine annab regulatiivse mehhanismi IL-2 signaalide häälestamiseks, st CD25-st sõltuvast kõrge afiinsusega signaalimisest CD25-st sõltumatuks madala afiinsusega signaalimiseks CD122 / CD132 kaudu. Põletikuvabas keskkonnas, kus rakuvälise NAD + kontsentratsioon on madal, jätaks Tregsi rakuvälise IL-2 tarbimine ilma teistest T-rakkudest ja NK-rakkudest IL-2 (joonis 6a) 48 . Sarnaselt võib IL-2 väikeste annuste süstemaatiline süstimine põhjustada Tregsi eelistatavat laienemist 17, 19, 20, 21, 49 . Põletikulises keskkonnas, kus stressis ja kahjustatud rakud vabastavad suures koguses NAD + rakuvälisse sektsiooni 44, 50, suunaks CD25 ADP-ribosüülimine IL-2 signaali edastamise Tregsist NK-rakkudesse ja CD8 + tsütotoksilistesse T-rakkudesse (joonis. 6b). Seda IL-2 signaalimise häälestamise mehhanismi võivad jäljendada teatud in vivo kasutatavad IL-2 antikehad (joonis 6c), st hiire IL-2 süsteemsed süstid kompleksis mAb-de S4B6 või JES6-5HA või inimese IL-2-ga Mab-602-ga moodustunud kompleks põhjustab NK-rakkude ja tsütotoksiliste T-rakkude eelistatavat laienemist 22, 24, 27 . Lisaks CD25-d konstitutiivselt ekspresseerivatele tregidele reguleeritakse CD25-d ka pärast TCR (T-raku retseptori) 51 käivitumist aktiveeritud T-rakkudega (täiendav joonis 6). Kuna TCR vallandamine kutsub esile ARTC2.2 metalloproteaasi vahendatud raiskamise, muudetakse aktiveeritud T-rakud raku pinnavalkude 52 ADP-ribosüülimise suhtes resistentseks. Seetõttu võib CD25 ADP-ribosüülimine olla Tregi-spetsiifiline regulatiivne mehhanism. Avastus, et NAD + ravi ei mõjuta mõnda tregi (joonis 5C, täiendav joonis 5), võib olla põhjustatud ARTC2.2 või CD25 madalamast ekspressioonist või nende antigeenide erinevast lokaliseerumisest plasmamembraanis, nt seest / väljast lipiidide parved 8, 35 . Tulevased uuringud peaksid käsitlema Tregide erinevate alampopulatsioonide võimalikke erinevusi nende tundlikkuses IL-2 signaalide NAD + vahendatud regulatsiooni suhtes.

Image

(a) Tregid ekspresseerivad põhiliselt CD25 kõrget taset, samal ajal kui CD8 + T-rakud ja NK-rakud ekspresseerivad ainult IL-2 retseptori (CD132, CD122) β ja y ahelaid. Mittepõletikulises keskkonnas tarbivad tregid IL-2 CD25 suurema afiinsuse tõttu võrreldes CD122 / CD132-ga, jättes sellega naabruses olevad CD8-rakud ja NK-rakud selle tsütokiini ilma. (b) Põletikulises keskkonnas, st pärast NAD + vabanemist kahjustatud rakkudest, suunab CD25 (sinised ringid) ADP-ribosüülimine IL-2 kõrge afiinsusega retseptorist madala afiinsusega β ja γ ahelatesse, võimaldades CD8 ja NK rakud. (c) IL-2 süsteemne süstimine antikehadega kompleksi, mis takistab IL-2 seondumist CD25-ga, põhjustab CD8-rakkude ja NK-rakkude eelistatava laienemise.

Täissuuruses pilt

Kokkuvõtlikult kirjeldasime siin varem tundmatut mehhanismi signaalide häälestamiseks IL-2 abil CD25 ADP-ribosüülimisega. Selle mehhanismi toimimine in vivo sõltub tõenäoliselt olukorrast, milles T-rakud puutuvad kokku NAD + -ga. Niisiis, kohtades, kus NAD + vabaneb kahjustatud rakkudest suurtes kogustes, näiteks lüütilise viirusinfektsiooni ajal, soodustaks CD25 ADP-ribosüülimine Tregsil CD8 + efektor-T-rakkude proliferatsiooni ja funktsioneerimist, soodustades seeläbi patogeeni likvideerimist. Tervetes kudedes, kus NAD + vabaneb vähe, ei pärsiks Treg-funktsiooni ADP-ribosüülimine, võimaldades Tregide IL-2 vahendatud laienemist ja potentsiaalselt auto-reaktiivsete T-rakkude tõhusat allasurumist.

Meetodid

Hiired ja rakud

ARTC2 - / - hiired 53 ja P2X7 - / - hiired 54 ristutati C57BL / 6 WT ja DEREG hiirtele 42 C57BL / 6 taustal 12 põlvkonna jooksul tagasi ja neid peeti spetsiifilistes patogeenivabades tingimustes Suurbritannia keskne loomaaed . Kõik katsed viidi läbi vastavalt riiklikele juhistele, mille oli heaks kiitnud kohalik institutsionaalne regulatiivkomitee (registreerimisnumbrid ORG153 ja A10a). YAC-1 lümfoomi rakke, mida lahkelt varustas Jürgen Löhler, Heinrich Pette instituut, Hamburg, Saksamaa, kasvatati RPMI-1640, millele oli lisatud 10% FCS, 2 mM glutamiini, 2 mM naatriumpüruvaati. IL-2-sõltuvat CTLL-2 rakuliini, mille lahkelt varustas Marc Pallardy, INSERM U 461, Châtenay-Malabry, Prantsusmaa, hoiti täissöötmes, millele oli lisatud 10 ng / ml inimese rekombinantset IL-2 (10000 Ü / ml)., Roche) ja 0, 0001% 2-merkaptoetanooli. CTLL-2 rakud transfekteeriti stabiilselt ekspressioonikonstruktiga ARTC2.2 (pME.CD8LF-ARTC2.2) 55 jaoks . Tregid sorteeriti FACS järgi GERP + rakkudeks DEREG hiirte primaarsetest põrnarakkudest 4 ° C juures. Teise võimalusena valiti pärast erütrotsüütide lüüsi Ack-i lüüsipuhvriga (Bio Whittaker) ja B-rakkude kahanemist Dynabead-iga konjugeeritud lamba hiirevastase IgG-ga (Invitrogen) magnetiliste rakkude sorteerimise teel, kasutades PE-konjugeeritud anti-CD25 (7D4) ja 7 magnetiliste helmestega konjugeeritud PE-vastased antikehad vastavalt tootja juhistele (Miltenyi Biotec). Tregide puhtust jälgiti voolutsütomeetria abil ja see oli> 90%.

Voolutsütomeetria

Fluorokroomiga konjugeeritud monoklonaalseid antikehi kasutati hiire CD25 (PC61, 7D4) inimese CD25 (M-A251), CD4 (GK1.5), ARTC2.2 (Nika102), eteenoadenosiini (1G4) ja pSTAT5 (47) vastu. Värvitud rakke analüüsiti FACS Canto II (BD) ja FlowJo tarkvaraga (TriStar).

Saidi suunatud mutagenees ja rakkude transfektsioonid

Hiire ja inimese CD25 kodeerivad piirkonnad amplifitseeriti PCR-iga vastavalt YAC-1 lümfoomirakkudest ja ConA-stimuleeritud PBL-idest ning klooniti vektorisse pCMV-Sport6 ​​(Invitrogen). Arginiinijäägid asendati lüsiiniga, kasutades saitidele suunatud mutageneesi. CD25 kodeeriv sünteetiline cDNA, milles kõik rakuvälises domeenis olevad arginiinijäägid olid asendatud lüsiiniga, osteti firmast Geneart (Invitrogen) ja klooniti pCMV-Sport6. Ekspressioonikonstruktid (2 μg 10 6 raku kohta) transfekteeriti elektroporatsiooni teel CTLL-2 rakkudesse ja jetPEI transfektsioonireaktiiviga (Polyplus) HEK rakkudesse.

Eteeno-ADP-ribosüülitud valkude puhastamine ja massispektromeetria

YAC-1 rakke ( 109 rakku 10 ml-s) inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril 10 μM eteno-NAD + -ga (Sigma) ja pesti kaks korda PBS-is enne lüüsi 1% Triton-X 100-ga 20 minutit temperatuuril 4 ° C. . Rakulüsaadid selgitati kiire tsentrifuugimisega (20 minutit 15 000 g) enne 1-ml afiinsuskolonni, mis sisaldas monoklonaalset antikeha 1G4, mis oli immobiliseeritud Amino-Link Matrix (Pierce). Kolonni pesti ulatuslikult 1% Triton X-100 ja PBS-ga, seostunud valgud elueeriti 1 mM etenoadenosiiniga PBS / 0, 1% Triton-X-100. Elueeritud valgud fraktsioneeriti suurusega SDS-PAGE abil. Valgud värviti Coomassie sinisega ja nähtavad ribad lõigati välja. Paralleelne geel blotiseeriti PVDF membraanile ja sellele tehti Western-Blot analüüsid etenoadenosiin-spetsiifilise monoklonaalse antikehaga 1G4 ja peroksidaasiga konjugeeritud hiirevastase IgG-ga. Geelist lõigati silmapaistev 50 kD riba. Pärast disulfiidsidemete redutseerimist DTT-ga (10 mM, 56 ° C, 30 minutit) ja tsüsteiinide modifitseerimist jodoatseetamiidiga (55 mM, RT, 20 min) viidi proteiinid läbi geelisisese lagundamise trüpsiiniga (5 ng / μl). 50 mM NH4HCO3, 37 ° C, 16 tundi). Peptiide ekstraheeriti 50% atsetonitriili / 5% sipelghappega, kuivatati vaakumkontsentraadis, lahustati uuesti 5% metanoolis / 5% sipelghappes, mis oli magestatud C18 μZipTipil (Millipore), elueeriti 1 μl 60% metanooli / 5% sipelghappega ja analüüsiti nanoelektropihustusega massispektromeetria abil QTOF II seadmes (Micromass). Kokkupõrkest põhjustatud fragmenteerimisel saadud prekursori käsitsi valimisel saadud MS / MS spektrit hinnati nii käsitsi kui ka Mascot MS / MS otsingu algoritmi versiooniga 2.2 (Matrix Sciences, London, Suurbritannia).

Raadio-ADP ribosüülimistestid

HEK-rakud transfekteeriti mööduvalt lahuses olevate ARTC2.2 (1 μg / 106 rakku) ja CD25-ga (2 μg / 106 rakku) ja kanti paralleelsete alikvootidena 6-süvendilistele plaatidele, mis olid eelnevalt kaetud polü-L-lüsiiniga . 48 tundi pärast transfektsiooni kasutati transfektsiooni efektiivsuse jälgimiseks ühte alikvooti FACS-i analüüside abil, kasutades mAb-sid, mis olid suunatud ARTC2.2 ja CD25 vastu. Teise alikvoodi kleepunud rakke pesti õrnalt eelsoojendatud seerumivaba X vivo söötmega (Bio Whittaker) ja inkubeeriti seejärel seerumivabas X vivo söötmes, mis sisaldas 32 P-NAD + (2, 5 μCi, 0, 4 μM). 20 minutit temperatuuril 37 ° C. Rakke pesti õrnalt eelsoojendatud X vivo söötmega ja lüüsiti seejärel 20 minutit temperatuuril 4 ° C PBS-is, 1% Triton-X100, 1 mM AEBSF (Sigma). Lahustumatu materjal sadestati kiire tsentrifuugimisega (15 minutit 13 000 g) ja lahustunud membraaniproteiinid fraktsioneeriti suurusega SDS-PAGE eelgeelidel (Invitrogen) (1 x 105 rakuekvivalenti raja kohta). Valgud tuvastati geelide Coomassie värvimisega. Radioaktiivselt märgistatud valkude tuvastamiseks eksponeeriti geelid röntgenkilega temperatuuril –80 ° C 6–6 päeva.

CD25 immunosadestamine

CD25-spetsiifiline monoklonaalne antikeha PC61 konjugeeriti aminolink-helmestega vastavalt tootja juhistele (Pierce). Pärast 60-minutist rakulüsaatidega inkubeerimist temperatuuril 4 ° C pesti helmeid PBS-ga, 1% Triton-X 100. Seejärel proove inkubeeriti 15 minutit temperatuuril 70 ° C ja maatriks sadestati tsentrifuugimisega. Maatriksist elueeritud valke analüüsiti SDS-PAGE autoradiograafia abil, nagu eespool kirjeldatud.

Rakkude proliferatsiooni test

CTLL-2 rakkude kahandamiseks IL-2-st pesti rakke kaks korda ja inkubeeriti 6 tundi kultuurisöötmes ilma IL-2ta. Rakud külvati 24-augulisele plaadile (3 x 104 rakku süvendi kohta) ja kasvatati söötmes, mis sisaldas IL-2 järjestikuseid lahjendusi. Iga 12 tunni järel lisati väike alikvoot söödet, mis sisaldas NAD + või puudus sellest (lõppkontsentratsioon 100 μM). Rakkude arv määrati nelja päeva pärast voolutsütomeetria abil, kasutades Trucount ™ graanuleid (BD).

STAT5 fosforüülimisanalüüs

Primaarseid splenotsüüte ja puhastatud trege (1 × 105 rakku / 100 μl) inkubeeriti 30 μM NAD + puudumisel või juuresolekul 15 minutit temperatuuril 4 ° C enne 2, 5 U / ml hiire IL-2 (eBioscience) lisamist ja veel inkubeeritakse 5 minutit temperatuuril 37 ° C. Seejärel fikseeriti rakud 10% 2% PFA-s temperatuuril 37 ° C ja 90% metanoolis temperatuuril -20 ° C, enne kui värviti APC-konjugeeritud anti-fospho-STAT5-ga vastavalt tootja juhistele (BD). Enne IL-2-ga inkubeerimist kontrolliti splenotsüütide anti-CD4-ga vastavust. Mõnes eksperimendis inkubeeriti rakke 15 minutit ARTC2.2-d blokeeriva nanokeha s + 16a (50 ng / ml) 41 juuresolekul.

Interleukiin-2 seondumisanalüüs

1 x 105 rakku inkubeeriti 5 ng biotinüleeritud interleukiin-2 (R&D Systems) või 10 ng biotinüleeritud sojaoa-trüpsiini inhibiitoriga 100 μl PBS-is, 0, 1% BSA-ga 60 minutit 4 ° C juures, enne kui lisati 100 ng APC-konjugeeritud streptavidiini. (BD). Rakkude paralleelseid alikvoote inkubeeriti eelnevalt märgistamata mIL-2-ga (500 ng, eBioscience) või 50 μM NAD + või ilma selleta.

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

    Täiendav teave

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.