Pseudomonas fluorescens pf0-1 transkriptsioonilised ja antagonistlikud vastused fülogeneetiliselt erinevatele bakterikonkurentidele | tund ajakiri

Pseudomonas fluorescens pf0-1 transkriptsioonilised ja antagonistlikud vastused fülogeneetiliselt erinevatele bakterikonkurentidele | tund ajakiri

Anonim

Õppeained

  • Bakterid
  • Kogukonna ökoloogia
  • Geeniekspressioon
  • Mikroobide ökoloogia

Abstraktne

Mullabakterite võime konkureerida edukalt paljude teiste mikroobsete liikidega on ülioluline nende kasvu ja ellujäämise tagamiseks toitainetega piiratud mullakeskkonnas. Käesolevas töös uurisime toitainetevaesel agaril pinnases elava Pseudomonas fluorescens tüve Pf0-1 käitumist ja transkriptsioonilisi vastuseid vastandumisele kolme fülogeneetiliselt erineva bakteri perekonna, st Bacilluse , Brevundimonase ja Pedobacteri tüvedega . Konkurents toitainete osas oli ilmne, kuna kõigil kolmel bakteri perekonnal oli negatiivne mõju P. fluorescens Pf0-1 tihedusele; see mõju oli kõige tugevam koostoimes Bacillusega . Mikrokiibil põhinevad analüüsid näitasid tugevaid erinevusi Pf0-1 transkriptsioonivastuses erinevatel konkurentidel. P. fluorescens Pf0-1 geeniekspressiooni vastuses gramnegatiivsete bakterite suhtes oli suurem sarnasus grampositiivse tüvega. Gramnegatiivsed tüved käivitasid Pf0-1-s ka tundmatu laia toimespektriga antibiootikumi tootmise. Üksikasjalikum analüüs näitas, et konkurentide identiteet mõjutas tugevalt signaali ülekandes ja sekundaarsete metaboliitide tootmises osalevate Pf0-1 geenide ekspressiooni, mis viitab sellele, et Pf0-1 suudab eristada erinevaid konkurente ja täpsustada oma konkurentsistrateegiaid. Siin esitatud tulemused näitavad, et P. fluorescens Pf0-1 näitab liigispetsiifilist transkriptsioonilist ja metaboolset reaktsiooni bakterikonkurentide suhtes ning pakub uusi viise bakterite ja bakterite vastastikmõjude konkreetsete näpunäidete ning uudsete konkurentsistrateegiate, antimikroobsete tunnuste ja geenide tuvastamisel.

Sissejuhatus

Mulla mikroobikooslused esindavad maailma seni teadaolevat suurimat bioloogilise mitmekesisuse veehoidlat (Curtis jt, 2002; Torsvik ja Ovreas, 2002). Enamik teadaolevaid mullabakterite liike on organotroofid, see tähendab, et nad saavad kasvuenergiat orgaaniliste ühendite assimileerimisel. Kuid lagunevate orgaaniliste ühendite kättesaadavus või juurdepääsetavus on enamikus muldades piiratud (Alden jt, 2001; Demoling jt, 2007). Lisaks on organotroofsete bakterite metaboolsed võimed suurel määral kattuvad (Strickland jt, 2009). See tähendab, et konkreetne bakteriliik kohtub pinnase ökosüsteemide erinevates mikrosiitides tõenäoliselt arvukalt taksonoomiliselt erinevaid konkurente.

Bakterid uurivad nende biootilisi ja abiootilisi keskkondi, tunnetades ja reageerides mitmesugustele keemilistele stiimulitele (Taga ja Bassler, 2003; Ryan jt, 2008; Shank ja Kolter, 2009; Straight ja Kolter, 2009), pakkudes neile tõenäoliselt teavet lähima konkurendi (te) nimi. Hiljutised uuringud näitasid tõepoolest, et bakterid muudavad nende geeniekspressiooni kokkupuutel teise bakteriliigiga (Garbeva ja de Boer, 2009; Tai jt, 2009).

Enim iseloomustatud bakteriliigid sisaldavad mitut kahekomponendilist signaali ülekandesüsteemi, mis võimaldab siduda mitmesuguseid adaptiivseid reaktsioone naabermakro- ja mikroorganismidega ning abiootiliste keskkonnamuutustega (Gao et al., 2007). Pseudomonas liikidel, mis on sageli isoleeritud keerukatest keskkondadest, näiteks pinnasest ja risosfäärist, on palju kahekomponentseid signaaliülekandevalke (näiteks 212 Pseudomonas fluorescens Pf0-1, 223 P. fluorescens Pf-5, 179 ingl.) P. putida KT2440 ja 203 P. syringae DC3000 (//genomics.ornl.gov/mist)), mis arvatakse võimaldavat kiiret reageerimist keskkonnamuutustele (Heeb ja Haas, 2001; Dubuis jt, 2007; Humair et al., 2010). Selles keerulises looduskeskkonnas eksisteerivad Pseudomonas liigid koos paljude teiste bakteriliikidega. Hüpotees on, et osaliselt võivad signaaliülekandesüsteemid oma reaktsioone lähima konkureeriva mikroobi suunas häälestada ja nende konkurentsikäitumist optimeerida.

Spetsiifiliste bakteritevahelise interaktsiooni ajal ülesreguleeritud geenide hulgas on sageli ka antibiootikumide tootmises osalevad geenid, mis viitab sellele, et antibioos võib olla mikroobide interaktsioonide tavaline kaitse- või solvav strateegia (Fong jt, 2001; Harrison jt, 2008; Garbeva ja de Boer, 2009). Lisaks leiti konkureerivate interaktsioonide käigus ülesreguleeritud ka toksiinide vastu resistentsust pakkuvad geenid, mis viitavad kaitsele iseenda intoksikatsiooni või mikroobiringkonna teiste liikmete toodetud toksiinide vastu (Dantas jt, 2008; Martinez 2008, 2009). Kas selles "keemilises sõjapidamises" osalevate geenide ülesreguleerimine parandab konkurentsi edukust, sõltub konkurendi tundlikkusest antibiootikumide suhtes ja huvipakkuva tüve vastupidavusest konkurendi toksiinidele. Seetõttu on tõenäoline, et nii toksiini tootmist kui ka resistentsust võib olla vaja kohandada või kohandada vastavalt konkurendi identiteedile. Toksiinitootmise ja resistentsuse kõrval võib populatsiooni püsimiseks dünaamilises ja konkurentsitihedas keskkonnas vajada ka teiste geenide ja rakuliste protsesside moduleerimist. Siiani pole ükski aruanne dokumenteerinud bakterite transkriptsioonivastuste varieerumist erinevate konkurentide vahel.

Käesolevas töös uurisime pinnases elava P. fluorescens tüve Pf0-1 võimet toime tulla erinevate konkurentidega toitainevaestes tingimustes. Uurisime Pf0-1 käitumist ja transkriptsioonivastuseid kolme fülogeneetiliselt erineva bakterite perekonna, st Bacilluse , Brevundimonase ja Pedobacteri tüvedega interaktsiooni ajal . Tulemused näitavad, et P. fluorescens Pf0-1 suudab eristada erinevaid konkurente. Tuvastati ka tavalised transkriptsioonivastused, sealhulgas krüptogeenide ülesreguleerimine Pf0-1-s, mis on meie arvates olulised antimikroobse ühendi tootmisel.

materjalid ja meetodid

Bakterikultuurid ja kasvutingimused

Selles uuringus kasutatud bakteritüved on kokku võetud tabelis 1.

Täissuuruses tabel

Nende hulka kuuluvad P. fluorescens Pf0-1, Pedobacter sp. V48 , Brevundimonas sp. V52 ja Bacillus sp. V102. P. fluorescens Pf0-1 isoleeriti Sherborni (MA, USA) põllumajanduslikust savimullast, teised tüved isoleeriti Hollandi rannikualade luitekohast (Compeau et al., 1988; de Boer jt, 2003)., 2007). See rannikualade luidemuld sisaldab ka pseudomonaade, mis on tihedalt seotud P. fluorescens Pf0-1-ga (de Boer jt, 2007). Tüvesid kultiveeriti külmutatud glütseroolivarudest 1/10 kangusega Tryptic Soy Buloth agaril.

Koostoimekatsed viidi läbi süsinikuga piiratud veega agarit sisaldava söötme (WA-N) abil, mida on kasutatud ühes eelmises uuringus (Garbeva ja de Boer, 2009). See sööde sisaldas 20 gl –1 agarit, 5 gl – 1 NaCl, 1 gl – 1 KH2P04 ja 0, 1 gl –1 (NH4) 2S04. Enne autoklaavimist reguleeriti pH väärtusele 6, 5. (Garbeva ja de Boer, 2009). WA-N agariplaadid (läbimõõduga 8, 5 cm) jagati kaheks tsooniks (täiendava teabe joonis S1): tsoon B1, sadamad P. fluorescens Pf0-1; ja tsoon B2 sisaldab ühte konkureerivat bakterit. Tsoonid B1 ja B2 eraldati üksteisest 1, 5 cm ja kõik tüved inokuleeriti võrdse tihedusega. Bakteriaalsed inokulaadid, mis koosnesid 20 μl pestud rakususpensioonidest 10 mM fosfaatpuhvris (pH 6, 5) ja sisaldasid 107 rakku ml kohta, laotati sobivasse tsooni. Kõiki plaate inkubeeriti 5 päeva temperatuuril 20 ° C. Viiendal päeval koguti bakterirakud loendamiseks (vt allpool), samas kui RNA ekstraheerimiseks koguti ka P. fluorescens Pf0-1 .

Bakterite loendamine

WA-N plaatidel lõigati bakteritsoonidest välja kaks agar ketast (läbimõõduga 1 cm) ja loksutati 10 min M fosfaatpuhvris (pH 6, 5) 90 minutit. Järjestikused lahjendused kanti 1/10 trüptilistele sojapuljongi agariplaatidele. Plaate inkubeeriti temperatuuril 20 ° C ja kolooniad loeti 48 tunni pärast.

Mikrokiibi eksperiment, RNA eraldamine ja cDNA süntees

Kogu RNA ekstraheeriti P. fluorescens Pf0-1-st, mis kasvasid WA-N plaatidel konkureerivate bakterite olemasolul või ilma (kontroll). RNA täielikuks ekstraheerimiseks lõigati plaadilt P. fluorescens Pf0-1 kandev WA-N agaritsoon (et konkureerivad liigid ei saastaks rakkude taastumisel) ja rakud suspendeeriti 1, 5 ml steriilses fosfaatpuhvris. Kõik suspensioonid lahjendati steriilses fosfaatpuhvris sama optilise tiheduseni (OD; 600 nm), et saada RNA ekstraheerimiseks võrdses koguses rakke. Rakke tsentrifuugiti kiirusel 16 000 x g 3 minutit. RNA ekstraheeriti rakupelletitest Artrum Total RNA Mini Kit abil (Bio-Rad, Veenendaal, Hollandi kass nr 732-6820) vastavalt tootja soovitustele. Ekstraheeritud kogu RNA-d töödeldi DNA eemaldamiseks TURBO DNA-vaba komplektiga (Ambion, Nieuwerkerk a / d lJssel, Holland; kass nr 1907). Enne täiendava DNA (cDNA) loomist määrati proovides sisalduvad RNA kontsentratsioonid NanoDrop-spektrofotomeetriga (Isogen Life Science, IJssestein, Holland). RNA kvaliteeti kontrolliti, kasutades katsesüsteemi (Bio-Rad).

Esimese ahela cDNA sünteesiti 10 μg kogu RNA-st juhuslike heksameeri praimeritega firmalt Invitrogen (Breda, Holland; kat nr 48190-011), kasutades SuperScripti kaheahelalisi cDNA sünteesi komplekte (Invitrogen cat nr 11917-010). CDNA süntees viidi läbi kahekordse ahelaga cDNA sünteesi jaoks vastavalt NimbleGeni protokollile.

Mikrokiibi kujundamine ja andmete analüüs

P. fluorescens Pf0-1 järjestuse ja annotatsiooniandmete põhjal konstrueeris ja produtseeris Roche NimbleGen (Island, Reykjavík, NimbleGen Systems; Islandi nimi; kass nr A7241) suure tihedusega, multipleksseid (4 × 72 K) mikromaid. -00-01). Massiivid koosnesid 60-meersest sondist, mis hõlmasid 5735 geeni, 6 sondist geeni kohta ja 2 kordust. CDNA märgistamine Cy3 värviga ja hübridisatsioon viidi läbi Roche NimbleGen poolt.

Igal 4 × 72 K formaadis mikrokiibil viidi läbi kaks kordusinteraktsiooni ja kaks korduskontrolli. Diferentseeritud ekspresseeritud geenide loendid ekstraheeriti, võrreldes iga interaktsiooni kontrolliga. Tugeva mikrokiibi analüüsi abil normaliseeritud geeniekspressiooni andmeid analüüsiti Array Star 2 tarkvara abil mikrotiivrite analüüsimiseks (DNASTAR, Madison, WI, USA). Analüüs viidi läbi valede avastamismäära (Benjamini – Hochbergi meetod) ja mitmete testimiskorrektsioonide abil.

Kvantitatiivne reaalajas PCR

Algsete RNA-ekstraktidega viidi läbi kvantitatiivne reaalajas PCR (qRT-PCR), et kontrollida mikrokiibi analüüsi abil tuvastatud geeni ekspressiooni. Esimese ahela cDNA saadi ülalkirjeldatud viisil. Mahus 2 μl cDNA viidi RT-PCR-i, kasutades SYBR Green PCR põhisegu (Applied Biosystem, Warrington, UK). Iga sihtgeeni jaoks (35 diferentseeritult ekspresseerunud geeni ja 3 diferentseeritult ekspresseeritavat kontrollgeeni) kujundati päri- ja pöördpraimerid (täiendava teabe tabel S1), kasutades tarkvara Primer Express (PE, Applied Biosystem). Kõiki reaalajas PCR-is kasutatud praimereid testiti kõigepealt tavapärase PCR-iga, kasutades DNA-d, mis oli eraldatud P. fluorescens Pf0-1-st. Reaalajas PCR viidi läbi kasutades Corbett Research Rotor-Gene 3000 termotsüklit (Westburg, Leusden, Holland) järgmistel tingimustel: algtsükkel 95 ° C 15 minutit ja 40 tsüklit: 95 ° C 15 sekundit; 56 ° C 50 s; ja 72 ° C 50 s. SYBR Greeni inkorporeerimine kaheahelalisse DNA-sse võimaldas määrata lävitsükli, mis identifitseerib PCR-tsükli hetke, mil PCR-amplikonid ületavad avastamispiiri. Iga cDNA proovi jaoks kehtestati standardkõverad.

Antimikroobsete ühendite ekstraheerimine

Antimikroobsed ühendid ekstraheeriti vastavalt meetoditele, mida on kirjeldanud Raaijmakers et al. (1999). Lühidalt, P. fluorescens Pf0-1 kandev WA-N agaritsoon eemaldati plaadilt ettevaatlikult ja lõigati väikesteks (läbimõõduga 1 cm) tükkideks. Neid tükke loksutati intensiivselt toatemperatuuril 1 tund 20 ml 80% (maht / maht) atsetoonis. Atsetoonilahust tsentrifuugiti 10 minutit kiirusega 4000 x g ja atsetoon aurustati õhuvoolu all. Vesifraktsioon hapestati trifluoroäädikhappega (0, 1% (maht / maht)), segati 2 mahuosa etüülatsetaadiga ja loksutati tugevasti 5 minutit.

Pärast üleöö inkubeerimist temperatuuril -20 ° C viidi toimeaineid sisaldav külmutatud (etüülatsetaat) fraktsioon ettevaatlikult uude kolbi ja kuivatati õhuvoolu all. Kuivatatud ekstrakt lahustati 150 μl 50% (maht / maht) metanoolis ja töödeldi pöördfaasi kõrgsurvevedelikkromatograafiaga.

Pf0-1 mutantide konstrueerimine ja kasutamine

Mikrokiibi ja qRT-PCR analüüside põhjal valiti saidispetsiifilise mutageneesi jaoks mitu geeniklastrit. Geenid kustutati P. fluorescens Pf0-1 genoomist SOE-PCR abil (Horton et al., 1989) ja alleelivahetus, kasutades enesetapu plasmiidi pSR47 (Matthews ja Roy, 2000), nagu eelnevalt kirjeldatud (Silby ja Levy, 2004). Saadud deletsioonimutantidest kahte, Pfl01_3463-66 (alused 3947327-3952129) ja Pfl01_3655-59 (alused 4136447-4143889), kasutati antibiootikumi tootmise võrdlemiseks metsiktüüpi tüvega. Iga deletsiooni kinnitati PCR-analüüsiga, kasutades vähemalt ühte praimerit, mis anniileerub deletsioonide loomiseks alleelivahetuses kasutatud piirkondadest.

Katse ekstrakti antimikroobse toime testimiseks

Metanoolis lahustatud antimikroobsete ühendite ekstraktide aktiivsust kontrolliti seente Rhizoctonia solani, Fusarium culmorum , Trichoderma harzianum ja Mucor hiemalis hüpofaalse kasvu suhtes 12-augulistel avatud kambriga plaatidel (kass nr 665180 Greiner bio-one, Frickenhausen, Saksamaa) ) igas süvendis 250 μl WA-N agariga. Iga süvend inokuleeriti ühel küljel seente hüfae sisaldavate 6 mm läbimõõduga agar ketastega. Steriilsetele filterpaberi ketastele (Whatman nr 1, Whatman, Whatman Nederland BV, Hertogenbosch, Holland; läbimõõt 6 mm) lisati maht 10 μl ekstrakte ja asetati aukude vastasküljele. 12-augulisi plaate inokuleeriti 48 tundi temperatuuril 20 ° C ja kontrolliti, kas seente inhibeerimine toimub hüpomaalse pikenemise mõõtmisega. Kontrollina kasutati filterpaberi kettaid, mis sisaldasid 10 μl 50% metanooli.

Antimikroobsete ühendite mõju Bacillus sp. V102, Pedobacter sp. V48 ja Brevundimonas sp. V52 kasvu testimiseks segati 5 μl ekstrakte 25 μl bakterirakkude suspensioonidega, mis sisaldasid 107 rakku milliliitris, ja viidi bakterisuspensioon otsekohe plaadile 1/10 trüptilise sojapuljongi agariplaatidele. Plaate inkubeeriti temperatuuril 20 ° C ja loendamine viidi läbi 72 tunni pärast. Kontrollina lisati 25 μl bakterirakkude suspensioonidele 5 μl 50% metanooli.

Statistiline analüüs

Igas katses kasutati kordusi: kaht mikrokiibi katseteks ja kolme kõigi muude katsete jaoks. Mikrokiibi andmete statistiline analüüs viidi läbi Array Star 2 tarkvaraga mikrokiibi analüüsimiseks (DNASTAR).

Bakterite loendamise statistilised analüüsid, antagonistlikud testid ja qRT-PCR andmed viidi läbi XLStat 2010 abil (Addinsoft, New York, NY, USA), kasutades kahepoolset t- testi, eeldades, et andmekogumite erinevus on erinev. Andmeid peeti statistiliselt erinevaks P 0, 05.

Tulemused

Spetsiifiliste interaktsioonide mõju P. fluorescens populatsioonidele

Eri tsoonides (B1 ja B2, vt täiendava teabe joonis S1) WA-N agaril arenenud bakterite arv kinnitas hinnanguliselt, et P. fluorescens Pf0-1 ja teiste tüvede vahel toimusid konkureerivad interaktsioonid. P. fluorescens Pf0-1 tihedust, väljendatud kolooniaid moodustavate ühikutena (CFU-dena) inokulatsioonitsoonis B1, vähendati märkimisväärselt teise bakteriliigi olemasoluga (joonis fig 1a). Pf0-1 rakutihedust mõjutas kõige negatiivsemalt Bacilluse tüve olemasolu. Viimast oli interaktsiooni ajal rikkalikumalt kui P. fluorescens Pf0-1, samas kui P. fluorescens Pf0-1 arv oli suurem kui Brevundimonase ja Pedobacteri tüvedel. Brevundimonase ja Pedobacteri monokultuuride CFU (joonis 1b) oli P. fluorescens Pf0-1-ga interaktsiooni ajal oluliselt suurem kui Brevundimonase ja Pedobacteri CFU. Puudus oluline erinevus Bacilluse monokultuuri CFU ja P. fluorescens Pf0-1-ga interakteeruva Bacilluse CFU vahel.

Image

a ) Pseudomonas fluorescens Pf-01 konkureeriva interaktsiooni käigus toitainetevaesel agaril toodetud bakterikolooniaid moodustavate ühikute (CFU) arv: Pf0-1 × Pf0-1, interaktsioon P. fluorescens Pf0-1-ga; Pf0-1 × PdV48, koostoime Pedobacter sp. V48; Pf0-1 × BrV52, koostoime Brevundimonas sp. V52; ja Pf0-1 × Bacil, interaktsioon Bacillus sp. V102. Katse üksikasjad on esitatud osas Materjalid ja meetodid. Esitatud väärtused on kolme korduse keskmised, vearibad tähistavad sd ja erinevad tähed tähistavad olulisi erinevusi ( P <0, 05) Pf0-1 CFU-s. ( b ) Pf0-1, P. fluorescens Pf0-1 monokultuuridest toodetud bakteriaalsete CFU-de arv; PdV48, Pedobacter sp. V48; BrV52, Brevundimonas sp. V52; ja Bacil, Bacillus sp. V102. * Näitab olulisi erinevusi CFU monokultuuri ja interaktsiooni vahel P. fluorescens Pf0-1-ga ( P <0, 05).

Täissuuruses pilt

P. fluorescens Pf0-1 transkriptsioonilised vastused teistele bakteriliikidele

P. fluorescens Pf0-1 vastust erinevatele bakterikonkurenditele uuriti geeniekspressiooniprofiilide määramisega. Fülogeneetiliselt erinevate mullabakterite esinemine toitainevaesel agaril füüsiliselt eraldatud tsoonides põhjustas arvukalt muutusi Pf0-1 geeni ekspressioonis (tabel 2). Vale avastamismäära (Benjamini – Hochbergi meetod) ja korduvate testimisparanduste rakendamine näitas, et iga konkureeriv tüvi põhjustas olulisi ( P <0, 05) transkriptsiooni muutusi kahes või enam; qRT-PCR analüüs 35 valitud diferentsiaalselt ekspresseeritud geeniga kinnitas mikrokiibi andmeid (andmeid pole näidatud). Bacillus sp. põhjustas kõige rohkem (571) geeniekspressiooni muutusi. Pedobacter sp. ja Brevundimonas sp. põhjustas muutusi vastavalt geenide 422 ja 325 ekspressioonis (täieliku loetelu leiate täiendava teabe tabelitest S2, S3 ja S4).

Täissuuruses tabel

Seejärel otsisime Pf0-1 ühiseid transkriptsioonimuutusi vastuseks kolme erineva konkureeriva bakteriliigi olemasolule. Vaatamata suurele arvule geenidele, mida väljendati igas interaktsioonis erinevalt, oli kõigil kolmel interaktsioonil ühine vaid 42, koos eeldatavate funktsioonidega energia tootmisel ja muundamisel (kaheksa geeni), aminohapete transpordil ja ainevahetusel (kuus geeni), signaali ülekandemehhanismidel ( kuus geeni), anorgaaniliste ioonide transport ja metabolism (neli geeni), nukleotiidide transport ja metabolism (neli geeni) ning rakkude liikuvus ja sekretsioon (kolm geeni) (joonis 2, tabel 3).

Image

Venni diagramm, mis tähistab diferentseeritult ekspresseeritud geenide arvu P. fluorescens Pf0-1-s spetsiifiliste võistlevate interaktsioonide ajal. Iga ring tähistab diferentseeritult ekspresseeritud geenide arvu spetsiifilise konkureeriva interaktsiooni ajal ühe tüvega: roheline ring, interaktsioon Pedobacter sp. V48 (kokku 422 geeni); sinine ring, interaktsioon Brevundimonas sp. V52 (kokku 325 geeni); ja kerge indigo-ring, interaktsioon Bacillus sp. V102 (kokku 571 geeni). Kursiiv- ja paksus numbrid tähistavad levinud diferentseerunud geene vastavalt kahes ja kolmes interaktsioonis.

Täissuuruses pilt

Täissuuruses tabel

P. fluorescens Pf0-1 ja Pedobacter sp. Interaktsioonide võrdlus ja Bacillus sp. näitasid, et mõlemad geenid mõjutasid 92 geeni ekspressiooni (43 üles- ja 49 allareguleeritud), samas kui muutused 71 geenis (43 üles- ja 28 allareguleeritud) olid tavalised interaktsioonis Brevundimonas sp. ja Bacillus sp. Kahe gramnegatiivse bakteri ühine vastus oli siiski palju suurem (joonis 2), sisaldades 184 geeni (87 ülesreguleeritud ja 97 allareguleeritud geeni; täiendava teabe tabel S5).

Signaali ülekandega seotud diferentseeritult ekspresseeritud geenide võrdlus

Liikidevahelise interaktsiooni käigus leiti, et kahekomponendilise signaali ülekandesüsteemidega seotud mitme geeni ekspressioon on monokultuuriga võrreldes muutunud (tabel 4), kusjuures kõigil kolmel interaktsioonil on kuus ühist.

Täissuuruses tabel

Kahekomponendilise signaali ülekandesüsteemidega seotud mõjutatud geenide suurim arv tuvastati Pf0-1 interaktsiooni ajal Bacillus sp. (31 üles ja 5 alla reguleeritud). Pedobacter sp. ja Brevundimonas sp. vastavalt kahekomponentsete signaaliülekandesüsteemidega seotud 16 ja 15 geeni muudetud ekspressioon. Kuid ainult seitse neist olid mõlema koostoime korral tavalised.

Ribosomaalsete valkude ja faagiga seotud geenide diferentsiaalne ekspressioon

Kõigis kolmes interaktsioonis täheldati ribosomaalseid valke kodeerivate geenide erinevat ekspressiooni. Koostoimetel Pedobacter sp. ja Brevundimonas sp., peaaegu identne ribosomaalsete valgugeenide komplekt näitas muudetud ekspressiooni sarnaste suundadega (ülesreguleerimine ja allareguleerimine). Koostoime Bacillus sp. viinud 13 ribosomaalse valgu geeni allareguleerimiseni, millest muudes interaktsioonides nähti ainult kahte (täiendava teabe joonis S2).

Interaktsiooni ajal Bacillus sp.-Ga täheldati faagiga seotud geenide suurenenud ekspressiooni. Täpsemalt, kõigi geenide (välja arvatud Pfl01_1136 ja 1163) ekspressioon oletatavates profaagipiirkondades Pfl01_1136 kuni Pfl01_1173 tõusis vahemikus 2, 1–8, 5, kusjuures suurem osa ekspressioonist kasvas vähemalt neli korda (kõik ülesreguleeritud faagiga seotud geenid on märgitud lisatabelis S2 paksus kirjas (täiendav teave). Ükski neist oletatavatest profaagigeenidest ei olnud Brevundimonas sp. ja Pedobacter sp.

Liikidevaheline interaktsioon kutsub esile P. fluorescens Pf0-1 antimikroobsete ühendite tootmises osalevad geenid

Koostoime ajal Pedobacter sp. ja Brevundimonas sp. mitmed geenid olid Pf0-1-s ülesreguleeritud, mis võivad olla seotud valiini, leutsiini ja isoleutsiini lagunemisrajaga. Selle raja kaks geeniklastrit, Pfl01_3463-3466 ja Pfl01_3655-59, on kirjeldatud joonisel 3. Geeniklaster Pfl01_3463-3466 võib kodeerida hargnenud ahelaga a-ketohappe dehüdrogenaasi kompleksi komponente. Streptomyces avermitilis'es on hargnenud ahelaga a-ketohappe dehüdrogenaasi geeniklaster polüketiidi karkassi sünteesil hädavajalik (Denoya, 1995; Yoon jt, 2004). Lisaks näidati, et hargnenud ahelaga aminohapped võivad olla II tüüpi polüketiidi sünteesi eelkäijateks toitainetest sõltuvate radade kaudu (Stirrett et al., 2009). Selle geeniklastri ülesreguleerimist täheldati ainult Pf0-1 koostoimetes Brevundimonase ja Pedobacteriga , kuid mitte Bacillusega .

Image

Antibiootikume mittetootvates mutantides kustutatud geeniklastrite graafiline esitus. ( a ) Pfl01_3463-3466 (Pfl01_3463 ja Pfl01_3464, kaks hargnenud ahelaga a-ketohappe dehüdrogenaasi E1 komponenti; Pfl01_3465, hargnenud ahelaga α-ketohappe dehüdrogenaasi alaühik E2; ja Pfl01_3466), dihüdrolüpoksiid. ( b ) Pfl01_3655-3659 (Pfl01_3655, AMP-d siduva domeeni valk; Pfl01_3656, isovaleryl-CoA dehüdrogenaas; Pfl01_3657, propionüül-CoA-karboksülaas; Pfl01_3658, γ-karboksügeranoüül-CoAa3-metüül-, amino-3-amino-hüdrotaas; ja Pfl0_03-karboksü-hüdroksaas); ). Mõlemal paneelil tähistavad kriipsjooned kustutatud piirkonda ja kastides olevad numbrid viitavad nukleotiidi positsioonile Pf0-1 genoomis.

Täissuuruses pilt

Ülesreguleeritud hargnenud ahelaga aminohapete lagunemisgeenide roll antimikroobsete ühendite tootmisel

Esimene samm, et teha kindlaks, kas Pf0-1 produtseerib antimikroobseid ühendeid interaktsioonide käigus konkureerivate bakteritega, mis osalevad Pf0-1 ümbritseva agari orgaanilises ekstraheerimisel, kui need puutuvad kokku kolmest bakteritüvest, millele järgneb analüüs, milles antimikroobsed toimed ekstrakte testiti. Pedobacteri , Brevundimonase ja Bacilluse tihedused olid tõepoolest märkimisväärselt vähenenud, kui neid töödeldi Pedobacteriga kultiveeritud P. fluorescens Pf0-1 ekstraktiga võrreldes monokultuuri Pf0-1 ekstraktiga (joonis 4a). Järgnevalt uurisime, kas Pf0-1 ja Pedobacteriga interaktsiooni käigus tekkinud antimikroobsed ühendid omavad ka mullas leiduvate saprofüütiliste ja patogeensete seente vastast toimet. Aktiivsuse biotestid näitasid, et ekstrakt pärsib mitmete seente, sealhulgas Rhizoctonia solani, Mucor hiemalis ja Trichoderma harzianum mütseeli kasvu (joonis 4b). Bacillusega interaktsiooni ajal Pf0-1 toodetud ekstrakti korral sellist inhibeerivat toimet ei täheldatud (joonis 4c).

Image

a ) P. fluorescens Pf0-1 tsoonide ekstraktide mõju bakterite kasvule: Bacill, Bacillus sp. V102; BrV52, Brevundimonas sp. V52; ja PdV48, Pedobacter sp. V48. Kontroll, ekstrakt P. fluorescens Pf0-1 monokultuurist; Antimikroobsed ekstraktid, ekstraktid P. fluorescens Pf0-1 tsoonist koostoimes Pedobacter sp. V48. * Näitab olulisi erinevusi veerupaaride vahel ( P <0, 05). (Lisa joonis 4) ( b ) P. fluorescens Pf0-1 tsoonide ekstraktide mõju seente i, Rhizoctonia solani kasvule; ii) Mucor hiemalis ; iii) Trichoderma harzianum . C, kontrollväljavõte P. fluorescens Pf0-1 monokultuurist; M, 50% metanool; ja E, ekstraktid P. fluorescens Pf0-1 tsoonist koostoimes Pedobacter sp. V48. c ) P. fluorescens Pf0-1 tsoonide ekstraktide mõju R. solani'le. C, kontroll 50% metanooli; 1, väljavõte monokultuurist Pf0-1; 2, ekstrakt Pf0-1-st, interakteerudes Bacillus sp. V102; ja 3, ekstrakt Pf0-1-st, interakteerudes Pedobacter sp. V48.

Täissuuruses pilt

Et teha kindlaks, kas Pfl01_3463-3466 ja Pfl01_3655-3659 klastrite ülesreguleeritud geenid on tõepoolest kaasatud täheldatud antimikroobse aktiivsuse tootmisse, kustutati Pf0-1-st kaks geeniklastrit saidi suunatud mutageneesi abil (tabel 1 ja joonis fig. 3). Vastupidiselt metsikut tüüpi tüvest Pf0-1 saadud ekstraktidele, kui nad interakteerusid Pedobacteriga , ei ilmnenud samades interaktsioonitingimustes deletsioonimutantide A3463-66 ja A3655-59 ekstraktid R. solani suhtes aktiivsust (joonis 5). Nende ekstraktide hilisem analüüs kõrgsurvevedelikkromatograafia abil näitas, et metsikut tüüpi tüve ekstraktides sisalduvates mutantide ekstraktides ei olnud vähemalt kolme spetsiifilist piiki (täiendava teabe joonis S3). Kõrgsurvevedelikkromatograafia analüüs, millele järgnes kromatogrammide fotodioodide maatriksanalüüs (288 nm), näitas veel väga sarnaseid P. fluorescens Pf0-1 ekstraktide metaboliitide mustrit, kui neid kultiveeriti koos Pedobacteri või Brevundimonasega . Seevastu Bacillusega kultiveeritud P. fluorescens Pf0-1-st saadud ekstraktide metaboliidimuster erines ekstraktidest, mis saadi Pf0-1-st, interakteerudes kahe teise tüvega (täiendava teabe joonis S3). Kõigi ekstraktide metaboliidi profiilid erinesid ka kontroll-ekstraktist saadavatest, st Pf0-1 monokultuurist saadud ekstraktidest.

Image

Rhizoctonia solani vastane antagonistlik analüüs ekstraktidega: 1, P. fluorescens Pf0-1 monokultuurist; 2, P. fluorescens Pf0-1 interakteerudes R. solani-ga ; 3, P. fluorescens Pf0-1 interakteerudes Pedobacter sp.V48-ga; 4, P. fluorescens Pf0-1A3655 interakteerudes Pedobacter sp.V48-ga; 5, P. fluorescens Pf0-1 A3463, interakteerudes Pedobacter sp.V48-ga; ja C, kontrollige 50% metanooli.

Täissuuruses pilt

Arutelu

Pinnase ja risosfääri keskkonnas eksisteerivad Pseudomonas liigid koos paljude teiste bakteriliikidega. Mitmed neist liikidest konkureerivad sama ökoloogilise niši ja toitainevarude pärast (Demoling et al., 2007). Seetõttu on pinnase ökosüsteemides kasvu ja ellujäämise jaoks hädavajalik võime konkureerida paljude konkureerivate mikroobsete liikidega. Selle uuringu tulemused näitasid, et konkureeriva bakteri identiteet on P. fluorescens Pf0-1 käitumusliku ja geneetilise vastuse oluline määraja. Genoomi hõlmavad mikrotiivanalüüsid paljastasid Pf0-1 spetsiifilise transkriptsioonilise vastuse igale konkurendile, kuna kõigil kolmel interaktsioonil oli ühine vaid väike protsent diferentsiaalselt ekspresseeritud geenidest. Nii Brevundimonas kui ka Pedobacter , kuid mitte Bacillus , kutsusid esile antimikroobsete metaboliitide tootmise P. fluorescens Pf0-1-s, toetades veelgi P. fluorescens Pf0-1 reageerimise spetsiifilist olemust erinevatele konkurentidele.

Enamikul bakteritel, sealhulgas Pseudomonadidel, on kahekomponentsed signaaliülekandesüsteemid, mis aitavad neil kohaneda kõikuvate keskkonnatingimustega (Gao et al., 2007). Mitme kahekomponendilise signaali ülekandes osaleva P. fluorescens Pf0-1 geeni ekspressioon suurenes spetsiifilise interaktsiooni ajal. See viitab P. fluorescens Pf0-1 adaptiivsele reageerimisele sõltumatute mikroorganismide olemasolule. Kahekomponendiliste regulatoorsete geenide hulgas, mida oli kõigis kolmes interaktsioonis märkimisväärselt ülesreguleeritud, oli regulatiivne geen Pfl01_1534. See geen on P. aeruginosa fleR-i ortoloog, mis on flagella biogeneesi, kemotaksise, fimbriaalse biogeneesi geenide regulaator ja mitmed geenid, millele on viidatud kui hüpoteetilisele (Dasgupta et al., 2003). Selle regulaatori kõrgendatud ekspressioon võib viidata sellele, et liikuvus ja / või kemotaksis on P. fluorescens'i teiste bakterite vastuse olulised komponendid ja üldised komponendid. Erinevalt Pfl01_1534, olid enamus diferentseeritult väljendatud „signaaliülekande geene” konkreetse interaktsiooni suhtes spetsiifilised (kolme uuritud interaktsiooni hulgas oli levinud vaid kuus), mis viitab sellele, et iga konkureeriv bakteriliik võib tekitada spetsiifilisi näpunäiteid, mida tajub P. fluorescens Pf0- 1, käivitades lisaks üldistele vastustele ka konkreetsed vastused. Kui võrrelda P. fluorescens Pf0-1 transkriptsioonivastuseid erinevate konkureerivate tüvede olemasoluga, leiti suurim sarnasus kahe gramnegatiivse bakteri Brevundimonas ja Pedobacter suhtes. See kehtis kõigi geenide kohta, kaasa arvatud need, mis olid seotud kahekomponendilise signaali ülekandesüsteemidega. Seda, kas selles uuringus testitud gramnegatiivsetel bakteritel on spetsiifiliste näpunäidete kattuvus suurem, võrreldes grampositiivse Bacilluse tüve tekitatavatega, tuleb veel kontrollida.

Konkureerivatel tüvedel oli spetsiifiline mõju ka ribosomaalseid valke kodeerivatele Pf0-1 geenidele. Brevundimonase ja Pedobacteriga interaktsiooni ajal oli peaaegu identne ribosomaalsete valkude komplekt üles- või alareguleeritud, samal ajal kui interaktsiooni käigus Bacillusega leiti ainult allareguleeritud ribosoomi valke (täiendava teabe joonis S2). Ribosomal proteins may have various functions apart from ribosome and protein synthesis (Wool, 1996). Downregulation of ribosomal proteins has been linked to various stress responses as well to a decrease of cellular growth (Ishige et al., 2003; Stintzi, 2003; Silberbach and Burkovski, 2006). Moreover, de Carvalho et al. (2010) recently reported antimicrobial activities of ribosomal proteins.

Growth of P. fluorescens Pf0-1 was most strongly reduced when confronted with Bacillus . Apart from the downregulation of ribosomal proteins also other stress-related genes were differentially regulated, such as the prophage genes in the cluster Pfl01_1136 to Pfl01_1173. This prophage region carries two genes annotated as Pyocin R2_PP, holin (Pfl01_1137) and Pyocin R2_PP, lytic enzyme (Pfl01_1172), which may be related to pyocin biosynthesis. Pyocins are proteinaceous, narrow-spectrum antibacterial bacteriocins that are generally effective against closely related species. Whether this prophage region is functional or degenerated in Pf0-1 is not known, but the induction of nearly all genes in this region during the interaction with Bacillus may be an indication of a response to a particular stress factor not encountered by Pf0-1 in the other two interactions. Prophage induction after exposure to DNA-damage-causing agents, oxidative stress, or to other stress factors like antibiotic treatment, heat and starvation has been well documented (Frye et al., 2005; Garcia-Russell et al., 2009), leading to our suggestion that Bacillus induces a specific stress response in Pf0-1.

Organic extracts contained antimicrobial activity when isolated from cultures where P. fluorescens Pf0-1 was interacting with Brevundimonas or Pedobacter , but not Bacillus . The observation that antibiotic production is only triggered during interspecific interactions suggests a cost-effective strategy whereby the antibiotic is produced only when needed, or a strategy to avoid adaptation of competitors to the antibiotic (Garbeva and de Boer, 2009). Evidence that gene clusters Pfl01_3463-66 and Pfl01_3655-59 are indeed involved in the production of an antimicrobial compound was obtained by site-directed mutagenesis followed by activity bioassays. A strain carrying a deletion of these gene clusters did not show antimicrobial activity when confronted with Pedobacter sp. or Brevundimonas sp. In addition, high pressure liquid chromatography analysis confirmed that the mutants Pfl01_Δ3463-66 and Pfl01_3655-59 are defective in the production of compound(s) specifically induced in the wild-type strain when cocultured with Pedobacter or Brevundimonas . The nature and identity of these antimicrobial compound(s) produced by P. fluorescens Pf0-1 are not yet known and will require large-scale extractions, purifications and extensive analytical-chemical analyses (for example, liquid chromatography-mass spectrometry and nuclear magnetic resonance). The observed inhibition of both bacterial and fungal growth suggests that these antimicrobial compound(s) produced by P. fluorescens Pf0-1 can be effective in competitive interactions with many different bacterial and fungal species. It is interesting to note that the antibiotic compound(s) were not produced by P. fluorescens Pf0-1 during confrontation with the Bacillus strain even though growth of Bacillus is affected when exposed to the extracted ccompound(s). This could point to the absence of appropriate cues produced by Bacillus to induce production of the antimicrobial compound(s) by Pf0-1 or to deregulation of its production.

This study did not reveal information on the identity of the cues that trigger the specific differential gene expression observed for P. fluorescens Pf0-1. However, these cues should either be diffusible or volatile metabolites as the differential expression occurred without direct cell–cell contact of P. fluorescens Pf0-1 with the competing strains. In an additional experiment (data not shown), a range of reporter constructs (responding to different N -Acyl Homoserine Lactones, Autoinducer-2 family compounds, or Diffusible Signal Factor compounds) were tested to resolve the putative nature of the signals produced by the interacting bacteria. Brevundimonas sp. was capable of triggering a positive response in a bioreporter strain that detects production of the Diffusible Signal Factor signal 2-dodecenoic acid. P. fluorescens Pf0-1 itself cannot produce Diffusible Signal Factor, but has the gene for perception (Pfl01_3253). Neither Pedobacter sp. nor Bacillus sp. stimulated a response from any of the tested bioreporters (unpublished data). This is again pointing at specificity in the response of P. fluorescens Pf0-1 to different competitors.

In the present work, we studied the response of P. fluorescens Pf0-1 to different bacterial competitors in a one-to-one confrontation. However, in natural environmental settings bacteria are likely to encounter several different competitors at the same time or in sequential events. In such situations, the production of a broad-spectrum antibiotic may be a beneficial strategy for Pf0-1 as it will target diverse competitors. It is even plausible that superior competitors, like Bacillus in the current study, can be inhibited by the antibiotic when it is triggered by another species in a microbial consortium. In this study, we investigated bacteria–bacteria interactions using an agar plate model system. Although these assays are somewhat artificial, they do allow an in-depth analysis of fundamental mechanisms and genes underlying microbial interactions. In addition, the experiments were performed under carbon-limiting conditions, which to some extent mimics the situation in most soils (Demoling et al, 2007; Rousk and Baath, 2007).

It is interesting to note that several of the differentially expressed genes during the inter-specific interactions have an unknown function. Some of these so-called orphan or cryptic genes are commonly found in all three interactions. For example, gene Pfl_1702 encodes a protein of unknown function (DUF989) that is upregulated in all three interactions. A related gene was also previously reported to be upregulated during inter-specific interactions in Pseudomonas sp. A21 (Garbeva and de Boer, 2009). Although our experiments did not reveal the functions nor the products of these genes, they do suggest that these genes have a role in the response to other microbes. It will be interesting in a further study to determine the precise function of such genes in bacterial interactions.

In summary, our results demonstrate that P. fluorescens Pf0-1 shows a species-specific transcriptional and metabolic response to bacterial competitors, which may provide new leads in the identification of specific cues in bacteria–bacteria interactions and of novel competitive strategies, antimicrobial traits and genes.

Täiendav teave

Wordi dokumendid

  1. 1

    Supplementary Figure S1

  2. 2

    Supplementary Figure S2

  3. 3

    Supplementary Figure S3

  4. 4

    Supplementary Figure S4

  5. 5

    Supplementary Figures Legends

  6. 6

    Supplementary Table S1

  7. 7

    Supplementary Table S2

  8. 8

    Supplementary Table S3

  9. 9

    Supplementary Table S4

  10. 10.

    Supplementary Table S5

    Supplementary Information accompanies the paper on The ISME Journal website (//www.nature.com/ismej)