Somaatiline pirnarada drosophila rasvakehas tagab metaboolse homöostaasi ja normaalse eluea loodusside

Somaatiline pirnarada drosophila rasvakehas tagab metaboolse homöostaasi ja normaalse eluea loodusside

Anonim

Õppeained

  • Homöostaas
  • Piwi RNA-d
  • Ülevõtmine

Abstraktne

Gonadaalsetes kudedes säilitab Piwi-interaktsiooni (piRNA) rada genoomi terviklikkuse, kasutades selleks argonautevalkudega komplekseerunud 23–29 nukleotiidi (nt) väikest RNA-d, et suruda maha DNA parasiitseid liikuvaid järjestusi, mida nimetatakse ülekantavateks elementideks (TE). Ehkki hiljutised tõendid viitavad sellele, et piRNA-rada võib esineda valitud somaatilistes rakkudes väljaspool sugunäärmeid, ei ole mitte-gonadaalse somaatilise piRNA-raja roll hästi iseloomustatud. Siin on teada funktsionaalse somaatilise piRNA raja täiskasvanud Drosophila rasvakehas, sealhulgas piRNA efektorvalgu Piwi ja kanooniliste 23–29 nt pikkuste TE-kaardistavate piRNA-de olemasolu. Piwi- mutantidel on rasva keha piRNA-de kahanemine, suurenenud TE mobilisatsioon, suurenenud DNA kahjustuse tase ja vähenenud lipiidide varud. Need mutandid on näljatundlikud, immunoloogiliselt kahjustatud ja lühikese elueaga - kõik fenotüübid on seotud rasvakeha funktsioonide kahjustumisega. Need leiud näitavad täiskasvanu rasvakehas funktsionaalse mittegeonaalse somaatilise piRNA raja olemasolu, mis mõjutab normaalset ainevahetust ja üldist organisatsiooni tervist.

Sissejuhatus

Ülekantavad elemendid (TE-d) parasiteerivad nende peremeesorganismide DNA-d ja moodustavad suure osa eukarüootsetest genoomidest 1, 2 . TE-de sissetungi ja laienemise vastu võitlemiseks on välja töötatud väikesed RNA (smRNA) vaigistamisrajad, et pärssida TE-sid liikide vahel taimedest inimesteni 3 . Lühike segav RNA rada surub TE-sid kõigis taimede ja loomade kudedes, samal ajal kui Piwiga interakteeruva RNA (piRNA) raja aktiivsus arvatakse olevat piiratud peamiselt metasoonide 4, 5 sugunäärmetega. Nende radade kaotamine või langus põhjustab TE taasaktiveerimisest ja ülevõtmisest põhjustatud genoomset ebastabiilsust ja raku talitlushäireid 6, 7, 8, 9 .

PiRNA rada on kõige paremini tuntud oma rolli sugunäärmekudedes, kus see kaitseb TE taasaktiveerumisest põhjustatud genoomsete kahjustuste eest, 4, 5 . Rada vaigistab TE-sid, rakendades komplementaarseid väikeseid RNA-sid, mida nimetatakse piRNA-deks, mis on genereeritud suurtest TE-rikastest genoomsetest piirkondadest, mida nimetatakse piRNA klastriteks. Kärbestes transkribeerivad need klastrid pikki üheahelalisi RNA prekursoreid, mida seejärel töödeldakse väiksemateks 23–29 nukleotiidi (nt) piRNA-deks. Need piRNA-d on partneriks argonaute efektorvalkudega (Piwi, Baklažaan või AGO3), mis on seejärel võimelised vaigistama TE-sid oma homoloogia kaudu TE transkriptidega 4, 10 . See protsess viiakse läbi ühega kahest summutusmehhanismist. Primaarses piRNA-rajas, mis on aktiivne nii idutee kui ka munasarjade somaatilistes folliikulite rakkudes, surub Piwi maha TE transkriptsiooni, luues heterokromatiini 5, 11 . Sekundaarses piRNA-rajas, mis on aktiivne ainult iduliinis, vaikivad baklažaan ja AGO3 TE-d transkriptsiooni teel tsütoplasmas Messenger RNA lõhustumise kaudu 4, 5, 10 . Ehkki varem arvati, et piRNA raja roll on piiratud sugunäärmetega, viitavad hiljutised tõendid organismide mitmekesisuses, et see rada võib esineda ka sonaarsetes rakkudes väljaspool sugunääre 12 .

Viimase kümnendi jooksul on hakanud ilmnema uusi tõendusmaterjale piRNA raja mitte-gonadaalsete näidete kohta, sealhulgas ka piRNA raja roll tüvirakkude funktsioonis 12 . Plantaarias on piRNA raja valgud hädavajalikud tüvirakkude pluripotentsuse ja nende loomade regenereerimisvõime säilitamiseks 13 . piRNA raja komponendid on aktiivsed mitut tüüpi vähktõve korral 12, sealhulgas imetajate ja kärbeste spetsiifilised vähid 12, 14, 15, 16, 17, 18 ja kärbeste puhul on näidatud, et piwi aitab kaasa pahaloomuliste kasvajate kasvule 19 . PiRNA raja rolli kohta normaalsetes diferentseerunud somaatilistes kudedes on vähem teavet, ehkki on teada tõendeid sekundaarse piRNA raja aktiivsuse kohta täiskasvanud kärbeste spetsiifilistes neuronites 20 . Kuna avastatakse rohkem mitte-gonadaalseid näiteid aktiivsest RNA interferentsi süsteemist, näib, et piRNA rajal võib olla ka muid teadaolevaid funktsioone peale sugunäärmete koes muid olulisi rolle.

Näitame siinkohal funktsionaalse somaatilise piRNA raja olemasolu täiskasvanute kärbesrasva kehas. PiRNA raja rasvakehas avaldab primaarse piRNA raja kõiki kanoonilisi tunnuseid ja pärsib aktiivselt TE mobilisatsiooni selles koes. Jälgime, et selle raja kaotamine on korrelatsioonis rasvakeha funktsioonide halvenemise ja lühema elueaga. Need leiud näitavad piRNA-raja uudset rolli sugunäärmetest väljaspool täielikult diferentseerunud somaatilises koes.

Tulemused

Rasvakehas on puutumatu piRNA raja komponendid

Arvestades hiljutisi tõendeid selle kohta, et piRNA rada võib olla aktiivne ka valitud mittegeonaalsetes somaatilistes rakkudes 12, uurisime piRNA raja geenide ekspressiooni väljaspool sugunäärmeid. Leidsime, et RNA järjestamise (RNA-seq) raamatukogude uurimisel täiskasvanute kärbsetelt eemaldatud siseelunditest eemaldatud kõhust, kuid mitte peadest ega rindkerest, oli piRNA raja geenide rikastamine teiste somaatiliste kehaosadega võrreldes oluline (joonis 1a, täiendav joonis 1 ja täiendav) Andmekogum 1). Immunofluorestsentsmikroskoopia näitas Piwi valgu spetsiifilist lokaliseerumist täiskasvanud kõhu ja pericerebraalse rasva keharakkude tuumades, kuid mitte sugurakkude välistest muudest kudedest koosnevate rakkude tuumades või homosügootsete piwi- nullmutantide rasvakehades (joonis 1b). Isoleeritud puhastatud rasvakeha, rindkere ja pea immunoblotanalüüs näitas ka Piwi valgu olemasolu rasvakehas (joonis 1c ja täiendav joonis 2). Piwi valgu olemasolu rasvakehas viitab puutumatu piRNA raja võimalusele selles koes.

Image

a ) Pea, rindkere, siseelunditest eemaldatud kõhu ja munasarja RNA-seq kogukogudest genereeritud primaarsete ja sekundaarsete piRNA-raja geenide ekspressioon. piRNA raja geenid ekspresseeritakse suuremal määral siseelunditest puhastatud kõhus kui peas või rinnus. Munasarja raamatukogude andmeväärtused, mis ületavad graafiku vahemikku, on näidatud iga vastava riba kohal. RPKM, loendatakse ühe baasi miljoni kohta. Vearibad tähistavad sem; n = 3 paljundusraamatukogu. Kõrvaldatud siseelundite pea ja rindkere kontrolliga võrreldes on 11 geenist 10 (välja arvatud tj ) statistiliselt olulised ( P <0, 0001). Vt statistika 1. lisaandmekogumit. ( b ) Piwi valk lokaliseerub kõhurasva keharakkude tuumadesse. DAPI tähistab rasva keha tuumasid. Värvimine membraanis on rasva keharakkudele tüüpiline autofluorestsents. Skaalaribad esindavad 20 μm. c ) Rasvakehas on Piwi valk. Munasarja proovides on kõik piRNA argonaudid. Aktiin on laadimiskontroll. ( d ) rasvakeha smRNA suuruse profiil oksüdeeritud smRNA-seq raamatukogudest. Oksüdeerimine võimaldab rikastada 2'- O- metüülitud smRNA-sid. Maksimaalne kiirus 21 nt tähistab tõenäoliselt lühikest segavat RNA (siRNA) populatsiooni. Laiem tipp vahemikus 23 kuni 29 nt tähistab oletatavaid rasva keha piRNA-sid. Analüüsist jäeti välja rRNA ja miRNA-le vastavad jooned. e ) Rasvakeha piRNA-d (23–29 nt), mis on kärbeste genoomi kaardil joondatud peamiselt TE-dega. ( f ) TE-kaardistavate rasvakeha piRNA-de (23–29 nt) järjestuste koostis näitab uratsiili esimese positsiooni nukleotiidide nihkeid.

Täissuuruses pilt

Funktsionaalsetes piRNA summutuskompleksides aktiveeritud piRNA-d on nende 3'-otsas 2'- O- metüülitud ning neid saab selektiivselt rikastada ja detekteerida, kasutades periodaadi oksüdatsiooni 4, 21 . Leidsime puhta täiskasvanu kõhupiirkonna rasvakeha oksüdeeritud väikestes RNA-seq (smRNA-seq) raamatukogudes laia piRNA-taolise smRNA-de piigi vahemikus 23 kuni 29 nt (joonis 1d), mis viitab piRNA-de olemasolule 2'- O-ga -metüülimine nende 3'-otsas, nagu on tüüpiline piRNA-argonaute kompleksi aktiivselt laetud gonadaalsete piRNA-de jaoks 22 . Oksüdeeritud rasvakeha piRNA-dest 49% (23–29 nt smRNA-sid), mis olid kaardistatud TE-dega (joonis 1e), ja nende lugemiste tulemuseks oli tugev antisenss-diagonaal (täiendav joonis 3a) ja uratsiili 10 kanooniline esimese positsiooni nukleotiidide diagonaal (joonis 1a). 1f), mis näitab, et nad on tõenäoliselt suutelised vaigistama TE ärakirju. Kahe kaugelt suguluses oleva drosofiidi, Drosophila simulans ja Drosophila yakuba ( puhastatud joonis 3b) puhastatud kõhu rasvakehade oksüdeeritud smRNA raamatukogud näitasid samuti 23–29 nt piRNA-sid, mis kaardistavad TE-sid (täiendav joonis 3c – f) antisense TE-kaardistavate piRNA-dega. uratsiili tugeva esimese positsiooni kallutatus (täiendav joonis 3g, h), mis näitab, et täiskasvanud rasvakeha piRNA-d on konserveeritud erinevates drosofiilide liikides. Need andmed viitavad koos rasvakeha piRNA-de olemasolule, millel on kanoonilised piRNA-omadused, mis on seotud aktiivse piRNA-argonaute vaigistava kompleksiga ja on evolutsiooniliselt konserveeritud.

Rasva keha piRNA rada surub maha TE-d

Järgmisena uurisime, kas rasvakeha piRNA-rajal on aktiivse piRNA-raja kanoonilised tunnused. Piwi kaotamine sugunäärmekudedesse põhjustab piRNA-de dramaatilise vähenemise ja nende vastavate TE-de depressiooni 11, 23 . Piwi- nullmutantide rasvakehades täheldasime mitmete TE-de transkriptsiooni taseme märkimisväärset suurenemist ja nendega seotud piRNA-de vastavat vähenemist (joonis 2a ja täiendav joonis 4). Samuti vähenes piRNA-de koguarv (vähenemine 28, 1%) ja TE-kaardistavate piRNA-de arv (langus 70, 5%) (joonis 2b, külgpaneel). Kasutasime endogeense mustlase retrotransposooni ( mustlane-TRAP ) 9, 24, Piwi teadaoleva sihtmärgi munasarjas 25, transpositsiooni reporterit , et tuvastada rasvakeha rakkudes transpositsiooni ja leidsime, et piwi mutantsete rasvakehade mustlastes sisaldus oli märkimisväärselt kõrgem transpositsioon kontrollide suhtes (joonis 2c). Need andmed näitavad koos, et somaatiline piRNA-rada pärsib aktiivselt TE ekspressiooni ja mobilisatsiooni täiskasvanud rasva keharakkudes.

Image

( a ) TE transkripti tasemete (kogu RNA-seq) log 2- kordse muutuse soojuskaart> 1, 2-kordne muutus ja vastavad piRNA-d (smRNA-seq) piwi- mutandis ( piwi - / - ) võrreldes heterosügootse kontrolliga ( piwi - / + ) rasvakehad; n = 3 paljundusraamatukogu. * Vale avastamise määr (FDR) <0, 05. ( b ) Rasvakeha smRNA suuruse profiil piwi mutantsete rasvakehade (punane) ja heterosügootsete kontrollide (must) oksüdeeritud smRNA-seq raamatukogudest. Kuvatud on smRNA-d (ülalt), TE-kaardistavad smRNA-d (keskel) ja 3'UTR-kaardistavad smRNA-d (alumine). Parempoolsed paneelid näitavad tasemel 23–29 nt smRNA-sid iga genotüübi korral. c ) rasvakehaspetsiifiline transpositsioonireporter, mustlas-TRAP / r4-GAL4 :: UAS-GFP , piwi mutandi taustal (vt meetodid). GFP-positiivsed rakud on rakud, milles transpositsioon on aktiveerinud reporteri funktsiooni. 10-päevastel piwi- mutantidel on heterosügootsete kontrollidega võrreldes kõrgenenud GFP-positiivsete rakkude tase. Pildid on esindatud kärbestest, kellel on GFP-positiivsete rakkude kõrge, keskmine ja madal tase (vasakpoolsed paneelid). Skaalaribad esindavad 150 μm. Paremal asuv paneel näitab kärbeste jaotust genotüübi järgi igas rühmas; numbrid igas ribas on iga rühma vastavad protsendimäärad. Fisheri täpses testis võrreldi iga genotüübi kombineeritud rühmi 'kõrge' + 'keskmine' ja madala madalrühma. piwi - / + : n = 140 kärbest; piwi - / - : n = 142 kärbest; P <0, 0001. ( d ) Piwi- mutantide klastriliste piRNA-de kordne kaardistamise suhe heterosügootsete kontrollidega. Flamenko klaster näitab suurimat reageeringut piwi kaotamisele. ( e ) Ainulaadne piRNA loeb (23–29 nt) kaardil flamenko lookust metsiktüüpi (wt) ja piwi heterosügootides ning on kadunud piwi mutantidest. ( f, g ) Ainulaadne piRNA loeb (23–29 nt) kaardil tj geeni keha wt ja piwi heterosügootides ning on kadunud piwi mutantidest. Geenimudeli ( g ) paksud jooned tähistavad kodeerivat järjestust ja õhukesed jooned tähistavad 5 'ja 3'UTR. Algandmete kohta vaata 2. lisaandmekogumit.

Täissuuruses pilt

Teadaolevalt pärinevad piRNA-d, mis sihtivad ja pärsivad munasarjade kudedes TE-sid, pärit genoomsest piirkonnast, mida nimetatakse piRNA klastriteks 10 . Rasva keha piRNA-de kaardistamine varem märkustega lend-piRNA-klastritega näitas, et paljud kaardistavad flamenko klastri, mis on teadaolevalt spetsiifiline somaatiliste folliikulite rakkudele (joonis 2d, e) 10, 11 . Kokkuleppel munasarja folliikulite rakkude 10, 11 uuringutega kahanesid flamenkoga kaardistavad piRNA- d piwi- mutantide rasvakehades (joonis 2d, e). Need andmed toetavad lisaks funktsionaalse rasvakeha piRNA raja olemasolu, kus somaatilistest piRNA klastritest toodetud piRNA-d paarituvad Piwiga, et supresseerida TE-sid, nagu esmane piRNA rada teeb munasarja folliikulite rakkudes 10, 11 .

Varasemad uuringud kärbestega on näidanud, et primaarsed piRNA-d on samuti tuletatud kodeerivate geenide 26, 27 3'-transleerimata piirkondadest (UTR). Vaatasime, et 17% rasvakeha piRNA-sid oksüdeeritud rasvakeha raamatukogust kaardistati kodeerivate geenide külge (joonis 1e) ja 3'UTR-i sensibiliseerivad piRNA-d olid kahandatud piwi- mutantidesse (langus 17, 5%; joonis 2b, külgpaneel). . Need 3′UTR-st tuletatud piRNA-d on vahemikus 78% ( piwi / / + ) kuni 87% (massiprotsenti) senss-kaardistamisel, nagu võib eeldada geeniliste piRNA-de korral (täiendav joonis 5a). Rasvakeha piRNA-d, mis kaardistavad liiklusummiku 3′UTR-i ( tj ), mis on munasarjade folliikulite rakkudes 26, 27 tuntud geeniliste piRNA-de allikas, olid kahandatud piwi- mutantidega (joonis 2f, g ja täiendav andmestik 2) koos teiste 3-ga. 'UTR-st tuletatud piRNA-d (täiendav joonis 5b – e ja täiendav andmestik 2). Koos annavad need andmed tõendusmaterjali 3'UTR-st tuletatud rasvakeha geeniliste piRNA-de kohta, mis on veel üks esmase piRNA-raja tunnusjooni.

Vältimaks võimalust, et rasva keha piRNA-d tulenevad saastumisest munasarjade kudede dissekteerimisel ja raamatukogu ettevalmistamisel, viisime smRNA-seq oksüdeeritud rasvakeha raamatukogudesse, mis olid eraldatud ovo D1 kärbestest. Kuna munaraku geenis domineeriv emane steriilne mutatsioon, on neil kärbestel tugevalt degenereerunud munasarjad, vähendades seega oluliselt tõenäosust, et nende loomade rasvakehast eraldatud kõik piRNA-d tekivad munarakkude saastumisest. Vaatlesime nii metsiktüüpi kui ka munarakkude D1 rasvakehades 23–29 nt smRNA-sid, mis kaardistasid ainulaadselt flamenko lookuse (täiendav joonis 6a, b), mis viitab sellele, et oksüdeeritud rasvakehakogudes täheldatud piRNA-d pärinevad tegelikult sellest koest ja mitte munasarjade saastumise tagajärg. Lisaks näitab immunoblotanalüüs Piwi valgu olemasolu siseelunditest puhastatud kõhus ja munarakkude D1 kärbeste isoleeritud rasvakehas (täiendav joonis 6c). Need andmed koos meie vaatlusega Piwi valgu kohta rasvakeha rakkudes (joonis 1b ja täiendav joonis 2) toetavad tugevalt funktsionaalse kanoonilise piRNA raja olemasolu rasvakehas.

PiRNA mutantide DNA kahjustus ja metaboolne düsregulatsioon

TE-de replikatiivne liikuvus võib aidata kaasa mutageneesile nende võime kaudu sisestada uutesse genoomsetesse lookustesse 6 . On näidatud, et TE taasaktiveerimine ja transpositsioon korreleeruvad kromosomaalsete ümberkorralduste, kaheahelaliste DNA purunemiste ja apoptoosiga 7, 8 . Histooni variandi H2A.v (γ-H2A.v) fosforüülimine DNA parandamise ajal on kaheahelaliste DNA purunemiste usaldusväärne marker ja on tõestatud, et see korreleerub suurenenud TE aktiivsusega rasvakehas 9, 28 . Kasutades immunofluorestsentsmikroskoopiat, täheldasime piwi- mutantide y-H2A.v värvumise intensiivsuse suurenemist kontrollide suhtes (joonis 3a, b). Need andmed viitavad sellele, et rasvakeha piRNA-rada kaitseb tavaliselt rasvakeha rakke DNA kahjustuste kogunemise eest, mis võib olla põhjustatud TE taasaktiveerimisest.

Image

a ) Piwi- mutantide ja heterosügootsete kontrollide värvimise γ-H2A.v esinduslikud pildid. Piwi- mutantidega võrreldes on heterosügootsete kontrollidega kõrgem γ-H2A.v värvimistase. Skaalaribad esindavad 20 μm. ( b ) Punktis ( a ) värvitud y-H2A.v kvantifitseerimine. piwi - / + ja piwi - / - : vearibad on õpilase kahepoolne t- test, võrreldes heterosügootse kontrolliga; n = 104 tuuma genotüübi kohta. * P <0, 0001. c ) Piwi- mutantide ja heterosügootsete kontrollide rasvakeha lipiiditilkade Niiluse punase värvumise representatiivsed pildid. piwi- mutantidel on heterosügootsete kontrollide suhtes väiksemad lipiiditilgad. Skaalaribad esindavad 20 μm. ( d ) Punktis c värvunud lipiidipiisade kvantitatiivne määramine. piwi - / + : n = 6 kärbest, piwi - / - : n = 5 kärbest. Algandmete kohta vaata 3. lisaandmekogumit. e ) Joonis (lipiidipiiskade jaotus> 200 μm 2 alates punktist d ), võrreldes piwi- mutante heterosügootsete kontrollidega. ( f - i ) Piwi ( f, h ) või flamenco ( g, i ) mutantide kogu keha täiskasvanud kärbseseente ( f, g ) ja glükogeeni ( h, i ) mõõtmised võrreldes heterosügootsete kontrollidega. Andmed normaliseeriti iga proovi üldvalgu kontsentratsioonini ja moodustasid protsendi heterosügootsest kontrollist. Vea ribad on sem. Iga testi jaoks on n = 5 bioloogilist kordust genotüübi kohta. Õpilase kahepoolne t- test võrreldes heterosügootse kontrolliga. * P <0, 01; ** P <0, 001. Kõik testid viidi läbi 10-päevaste kärbestega.

Täissuuruses pilt

Kärbserasva keha on imetaja maksa ja rasvkoe funktsionaalne analoog, mille üks peamisi rolle on lipiidide ja glükogeeni 29 talletamine. Meie tähelepanek, et piwi mutantsete rasvarakkude rakud näitasid suurenenud TE mobilisatsiooni ja kõrgenenud DNA kahjustuse taset (joonised 2c ja 3a, b), viisid meil hüpoteesini, et see võib põhjustada rasvakeha funktsioonide häirimist. Rasva keha lipiidipiiskade niiluspunane värvimine näitas piwi- mutantide lipiiditilkade suuruse vähenemist võrreldes kontrollidega, suuremate lipiiditilkade (> 200 μm 2 ) arvukus oli oluliselt vähenenud (joonis 3c – e ja täiendav andmestik 3). Need andmed korreleeruvad rasvakehas sisalduvate kahe peamise metaboliidi, triatsüülglütseriidide (TAG) ja glükogeeni, nii piwi kui ka flamenko mutantide (joonis 3f – i ja täiendav joonis 7a, b) olulise vähenemisega. Järgmisena küsisime, kas need fenotüübid olid korrelatsioonis rasvakeha muudetud transkriptoomiga, kuna ainult TE-de transkriptsioon võib põhjustada RNA toksilisust ja aidata kaasa raku talitlushäiretele 8 . Me genereerisime piwi mutantsetest ja kontrollrasvakehadest RNA-seq raamatukogud ja leidsime, et paljud diferentseeritult ekspresseeritud geenid ainevahetusega seotud radades olid oluliselt muutunud (täiendav joonis 7c). Need andmed toetavad mudelit, kus piRNA raja funktsiooni kaotamine põhjustab lipiidide ja talletatud metaboliitide vähenemist, metaboolse homöostaasi häireid ja rakulise funktsiooni langust, võimalik, et TE-de taasaktiveerimise tõttu.

piRNA mutandid näitavad muutunud rasva keha funktsiooni ja eluiga

Kärbserasva keha mängib suurt rolli selliste stressi tekitajate vastu nagu paastumine ja kaasasündinud immuunsuse kaudu patogeensete infektsioonide vastupanus 29 . Me täheldasime, et piwi- mutandid olid väga tundlikud nii näljaseisundite kui ka patogeense putukabakteri nakatumise suhtes (joonis 4a, b ja täiendav tabel 1). Kuna rasvakeha mängib keskset rolli pikaealisuse reguleerimisel 30, 31, uurisime järgnevalt piRNA raja katkemise mõju elueale. Leidsime, et nii piwi kui ka flamenko lookuse mutatsioonid lühendavad eluiga dramaatiliselt (joonis 4c, d ja täiendav tabel 1). Lõpuks testisime, kas piRNA raja mutantide lühendatud eluiga sõltub TE aktiivsusest. Paljud Drosophila TE-d on retrotransposoonid, sealhulgas mustlased , ja nende replikatiivne liikuvus sõltub pöördtranskriptaasist 32 . Tuntud pöördtranskriptaasi inhibiitori 3TC manustamine pärsib mustlaste mobilisatsiooni normaalset vanusega seotud kasvu ja pikendab Dcr-2 mutantide lühendatud eluiga, mis on teine ​​seisund, kus TE- de depressioon toimub 9 . Me manustasime flamenko mutantidele 3TC ja täheldasime olulist eluea pikenemist (joonis 4e ja lisa tabel 1), mis viitab sellele, et lühenenud eluea fenotüüp sõltub vähemalt osaliselt TE mobilisatsioonist. Need tulemused viitavad sellele, et rasva keha piRNA raja kadumine ning TE aktiivsuse suurenemine ja mobiliseerumine on korrelatsioonis rasvakeha funktsioonide kahjustumisega, sealhulgas tema võimega muul viisil leevendada keskkonnastressorite kahjulikku mõju.

Image

a ) Piwi- mutantide ja heterosügootsete kontrollide nälga jäämise kõverad. piwi mutandid on nälgimise suhtes tundlikumad kui heterosügootsed kontrollid. Logi astme test võrreldes heterosügootsete kontrollidega; n = 50; P <0, 0005. b ) Piwi- mutantide immuunprobleemide ja heterosügootsete kontrollide ellujäämiskõverad . piwi mutandid on infektsiooni suhtes tundlikumad kui heterosügootsed kontrollid. Kärbsed nakatati kas kontrollitud EtOH kontrolliga (-) või E. carotovora kultuuriga (+). Logi astme test võrreldes heterosügootse või mõnitava EtOH kontrolliga (-); n = 50; P <0, 0005. c ) Piwi- mutantide ellujäämiskõverad ja heterosügootne kontroll. Piwi- mutandid on heterosügootsete kontrollidega võrreldes lühema elueaga. Wilcoxoni järgu summa test võrreldes heterosügootse kontrolliga; n = 250; P <0, 0005. d ) Flam- mutantide ellujäämiskõverad ja heterosügootne kontroll. flam- mutandid on heterosügootsete kontrollidega võrreldes lühemad. Wilcoxoni järgu summa test võrreldes heterosügootse kontrolliga; n = 250; P <0, 0005. e ) 10 mM 3TC söödetud flam- mutantide ellujäämiskõverad. 3TC söödetud flam- mutantsed kärbsed elavad kauem kui töötlemata kontrollid. Wilcoxoni auastmesumma test võrreldes kontrolliga; n = 250; P <0, 0005. Analüüsiparameetrite ja statistika kohta vaata 1. lisa tabelit. Kõiki analüüse korrati kaks korda sarnaste tulemustega.

Täissuuruses pilt

Arutelu

Siin on näidatud tõestatud funktsioneeriv piRNA-rada mitte-sugunäärmete somaatilises koes - täiskasvanud kärbseseene kehas -, mis on tõenäoliselt vajalik kudede korralikuks funktsioneerimiseks ja üldiseks organisatsiooniliseks terviseks. Need tulemused näitavad, et täiskasvanud rasvakeha piRNA-rajal on sugunäärmete somaatilistes rakkudes leiduvad kanoonilised omadused ja selle aktiivsus mõjutab positiivselt metaboolse homöostaasi ja füsioloogilise tervise jaoks olulise koe funktsiooni. Ehkki me ei suuda täielikult välistada sugunäärmete piRNA raja panust rasvakeha funktsioneerimisse, on paljud meie täheldatud fenotüübid vastupidised nendele, mida tavaliselt täheldatakse loomadel, kellel on kahjustatud sugunäärme koe funktsioon, ning esindavad seetõttu tõenäoliselt rasvade kaotuse mõju. rasva keha piRNA rada. Näiteks lüRNA raja mutantide lühendatud eluiga ja vähendatud lipiidide varud näitavad, et piRNA rada on oluline mitte-gonadaalsete somaatiliste kudede tervises ja toimimises, kuna kärbeste sugunäärmete funktsiooni vähendamine või ablatsioon pikendab sageli eluiga ja suurendab lipiidide varusid kui eluea ja rasvavarude vähendamine 31 . Värsked uuringud metsikut tüüpi kärbestega on näidanud ka olulist seost TE aktiivsuse ja pikaealisuse vahel 9 ning meie uuringud, mis näitavad flamenko mutantide lühendatud eluea osalist päästmist pöördtranskriptsiooni inhibiitori manustamisel, toetavad seda seost veelgi.

Huvi piRNA raja funktsiooni vastu soma on viimasel ajal suurenenud, kuna selle raja uued rollid on valgustatud. Erilist huvi pakub piRNA raja seos kudedega, mis säilitavad iduliinil sarnase immortaliseerumise astme12. Näiteks Hydra somaatiliste tüvirakkude nišid säilitavad aktiivse piRNA raja, mis represseerib TE-sid, aidates tõenäoliselt kaasa selle organismi märkimisväärselt pikale elueale 33 . Need uuringud koos meie leidudega viitavad sellele, et piRNA raja olemasolu normaalsetes somaatilistes kudedes võib pakkuda täiendavat rakukaitset TE taasaktiveerimise ja võimaliku somaatilise genoomikahjustuse vastu. Meie avastus piRNA raja rollist metaboolse homöostaasi ja kärbeste üldise tervise säilitamisel viitab piRNA raja potentsiaalsele tähtsusele teistes somaatilistes kudedes. Lõpuks võivad spetsiifiliselt piRNA raja laiendamisega seotud sekkumised anda olulist kasu genoomi terviklikkuse, kudede funktsiooni ja tervisliku eluea säilitamisel.

Meetodid

Lendavarud ja loomakasvatus

Drosophila varusid hoiti kõik standardsetel söötmetel (30, 5 g l - 1 autolüüsitud pärmi, 121, 8 g l - 1 sahharoosi, 52, 3 g l - 1 maisijahu, 8, 75 g l - 1 agarit ja 2, 62 g l - 1 tegosept, kogu mahu järgi) temperatuuril 25 ° C. 12-tunnine valguse ja pimeduse tsükkel 60% suhtelise õhuniiskuse juures. Kui ei ole teisiti öeldud, koguti kõigis katsetes kasutatud kärbsed 48 tunni jooksul, paigutati tihedusega kontrollitud segasegu viaalidesse ja vanandati 10 päeva toidus, mis sisaldas 150 g l - 1 autolüüsitud pärmi, 150 g l - 1 sahharoosi ja 20 gl - 1 agar, massiprotsentides. Kui pole märgitud teisiti, viidi kõik katsed läbi nendes tingimustes kasvatatud paaritatud emaskärbeste abil.

Metsikut tüüpi katsetes kasutati Canton S või w 1118 laborivarusid . flam KG / FM4 (Bloomington 16453) saadi Indiana ülikooli Bloomington Drosophila Stock Centerist. D. yakuba ja D. simulansi varud varustati San Diegos asuva California ülikooli Drosophila aktsiakeskusega . Piwi mutantse rasvakeha mustlase-TRAP reporterliin loodi mustlas-TRAP liinilt, mille meile andsid Joshua Dubnau 24, r4-GAL4 (Bloomington 33832), UAS-GFP (Bloomington 1522) ja piwi 2 / CyO liin Haifanilt. Lin. ovo D1 mutandid, kus puuduvad munasarjad, genereeriti ovo D1 ( ovo D1 v 24 / C (1) DX, y 1 w 1 f 1 ) (Bloomington 1309) isaste ristumisel neitsi Canton S emasloomadele.

RNA ja smRNA-seq raamatukogu ettevalmistused

Kärbsed külmutati kuival jääl kiirkülmutatud ja pea ning rindkere kehaosad lõigati lahti temperatuuril –20 ° C ja neid hoiti temperatuuril –80 ° C. Siseelunditest puhastatud kõht ja puhtad täiskasvanud rasvakehad lõigati kõhupiirkonnast külmas fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS) ja neid hoiti samuti temperatuuril –80 ° C.

Kogu RNA eraldati asjaomastest kärbsekudedest, kasutades mirVana miRNA eralduskomplekti (ThermoFisher Scientific AM1560). RNA-seq raamatukogu ettevalmistamiseks kasutati Ovation Universal RNA-seq System komplekti (Nugen 0343) sisendina 100 ng kogu RNA-d koos Drosophila ribosomaalse RNA (rRNA) kahanemismooduliga vastavalt tootja juhistele. Iga koe jaoks tehti kolm bioloogiliselt sõltumatut raamatukogu. SmRNA-seq raamatukogude jaoks oksüdeeriti 2 μg kogu RNA-d 25 mM naatriumperiodaadis 30 mM booraksi ja 30 mM boorhappega (pH 8, 6) 30 minutit toatemperatuuril (Phillip Zamore Lab Illumina TruSeq väikese RNA kloonimisprotokoll, aprill 2014). ; //www.umassmed.edu/zamore/resources/protocols/). Seejärel eraldati RNA RNA Clean & Concentrator-5 komplektiga (Zymo Research R1015) ja seda kasutati sisendina Illumina NEBNext Multiplex väikese RNA raamatukogu ettevalmistuskomplekti (New England Biolabs E7300), modifikatsioonidega alates 34 (2S rRNA blokeerida oligo lisati enne 5 'ligeerimisetappi, et vähendada rRNA lugemist lõplikus raamatukogus).

Kudede RNA-seq

Lugemised kaardistati Tophat abil dm3 genoomi. Bioconductor R paketti easyRNASeq kasutati lugemiste loendamiseks (kasutades kokkuvõtvat parameetrit 'geneModels') ja normaliseeritud lugemiste arvutamiseks kilobase miljoni kohta (RPKM). Esitatud vearibad tähistavad kolme tingimuse sõltumatut bioloogilist kordust sem. Vigade avastamise määra väärtused 1. lisaandmestikus arvutati Bioconductor edgeR paketi abil, GLM-iga korrigeerides partiiefekte vastavalt vinjettile.

smRNA suuruse profiilid ja nukleotiidide eelistused

Oksüdeeritud väikesed RNA raamatukogud kärbiti esmalt adapterjärjestuste abil, kasutades cutattipt, ja seejärel joondati Drosophila rRNA järjestuste suhtes Bowtie abil, et eemaldada rRNA joondavad lugemised. Pie diagrammide korral viidi lugemised esmalt vastavusse dm3 genoomiga, hoides ainult neid, mis olid joondatud. Järgmised kaardistati loendid Bowtie abil (−v 1) järgmistesse genoomsetesse sektsioonidesse: sno + tRNA, mikroRNA (miRNA), TE-d, eksonid ja intergeensed piirkonnad (kõik järjestused laaditi alla FlyBase-ist, välja arvatud TE-d, mis tulid Repbase-ist). Diagrammi koostamiseks arvestati iga sektsiooniga joondatud lugemisi.

Kõigi väikeste RNA suuruse profiilide jaoks (vt näiteks joonis 1d) eemaldati miRNA-d esmalt Bowtie abil (−v 1) ja allesjäänud lugemised sisestati Perli skripti, mis loendas lugemiste arvu iga erineva pikkuse vahel 18 ja 50 nukleotiidi. TE-kaardistamise lugemite (lisajoonis 2) suuruseprofiilide jaoks joondati lugemised Bowtie abil Repbase Drosophila konsensusjärjestuste komplektiga (−v 1 –k 1 - parim) ja sorteeriti senssse / antisenssi (vastavalt TE) kasutades samtooole. Seejärel teisendati joondused aluspõhja abil FASTQ-failideks ja suuruseprofiilid arvutati ülalkirjeldatud viisil. D. simulans ja D. yakuba pirnadiagrammide ja suuruseprofiilide jaoks viidi analüüs läbi vastavalt kirjeldusele, kasutades asjakohaseid genoomi sektsioone iga liigi jaoks, mis on alla laaditud Flybase'ist. Ülekantavate elementide jaoks kasutati kõigi Reprosest pärinevate Drosophila liikide transposoonide komplekti.

Nukleotiidide diagonaalide arvutamiseks teisendati 23–29 aluspaari pikkused TE-kaardistamise antisenss-joondused FASTA-vormingusse, kasutades vooditooli ja EMBOSS-i, kärbiti FASTX-i tööriistakomplekti abil ühtlaseks pikkuseks 23 aluspaari ja neid kasutati WebLogo 3 programmi 35 sisendina.

TE ja kodeeriva geeni analüüs

Mitme kaardistamise RNA-seq väärtuste korrektseks arvestamiseks TE-de analüüsimisel kasutasime iga TE-i lugemiste arvu kvantifitseerimiseks RepEnrichi meetodit 36 . See lähenemisviis ühendab genoomis iga märkusega TE kõik esinemisjuhud ja loendab lugemist, kui see vastab vähemalt ühele neist vähemalt üks kord, võimaldades korrektset kvantitatiivset lugemist, mis muidu oleks mitmesse kohta kaardistamise tõttu ära jäetud. RepEnrichi loetud loendustabeleid töötati paketiga edgeR normaliseerimiseks ja log 2 kordse muutuse arvutamiseks. Väikeste RNA-seq raamatukogude jaoks joondati lugemised RepEnrichi abil ja loendused normaliseeriti, kasutades kordumatuid joondusi cisNAT-ide ja struktureeritud lookuste suhtes, nagu on kirjeldatud viites. 11. Logi 2- kordsed muutused ( piwi - / - / piwi + / - ) arvutati normaliseeritud lugemisarvude abil. TE-d, mille RNA-seq log 2- kordne muutus> 0, 263 (1, 2-kordne suurenemine) piwi- mutantides, võrreldes heterosügootsete kontrollidega, kanti soojuskaardile koos iga elemendi vastava piRNA-seq-i muutusega. Soojusekaardid genereeriti Gplots paketiga R-s.

TE joondamisprofiilide (täiendav joonis 4) loomiseks kaardistati loendid Bowtie abil (−v 1 −m 1) unikaalselt vastava TE Repbase konsensusjärjestusega. TE-i konsensusjärjestuse lugemise sügavus määrati, kasutades käsku bedtools genomecov, kasutades kogu teegis ainulaadselt kaardistatud lugemisi, et normaliseerida raamatukogu suuruse erinevusi. Krundid loodi R-s.

Normaalse kodeeriva geenianalüüsi jaoks kasutati edgeR diferentseeritult ekspresseeritud geenide määramiseks, mille ekspressioon oli märkimisväärselt muutunud piwi mutantse rasvakeha kogu RNA-seq raamatukogudes võrreldes heterosügootsete kontrollidega. Seejärel viisime nende geenide KEGG raja analüüsi läbi, kasutades Flymine.org 37 .

piRNA klastri analüüs

Antud märkusega piRNA klastrite kaardistamise väikeste RNA lugemiste arvukuse määramiseks joondati valitud 23–29 bp suurused lugemised Bowtie abil unikaalselt genoomiga (−v 1 –m 1). piRNA klastri-spetsiifilised näidud ekstraheeriti bedtooolide abil, kasutades viiteviidetes 10, 11 määratletud 15 kõige ekspresseerivamat piRNA-klastrit, kasutades klastri spetsiifilisi katvuse krunte, kasutades bedtools genomecov, normaliseerides kogu unikaalselt joonduvate lugemiste koguarvuni (välja arvatud väikesed nukleolaarsed RNAd, RNA ülekandmine) ja miRNA) ja kanti graafikule Bioconductor 38 Sushi R pakendiga.

Geeniliste piRNA lugemiste testimiseks eraldati 23–29 bp joondatud lugemised iga geeni jaoks 5′UTR, kodeerivas järjestuses ja 3′UTR regioonides (Flybase annotatsioonid) ning loendati ja sorteeriti senss / antisenss, kasutades bedtools. Valitud geenide jaoks, milles 3'UTR-is on palju antisenss-piRNA-sid (vt näiteks joonis 2g), arvutati katvus ülalkirjeldatud viisil. Katvuse ja geenimudelid kanti graafikule Sushi 38 abil .

Immunoblot

Kärbeskeha lõigud ja koed eraldati jaotises „RNA / smRNA-seq raamatukogu ettevalmistused“. Terve raku lüsaadi proovid valmistati RIPA puhvris (50 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitool, 1% Triton-X-100, 1% Na-desoksükolaat, 0, 1% SDS ja 2, 5 μg ml - 1 Pepstatin A, Leupeptin, Antipain, Aproptinin and Chymostatin). Seejärel laaditi 15 μg koguvalku ja lasti 12% polüakrüülamiidi – SDS geelil. Seejärel viidi valgud polüvinülideendifluoriidmembraanile ja membraan blokeeriti üleöö Tris-puhverdatud soolalahuses, mis sisaldas 0, 1% Tween-20 5% piimas, temperatuuril 4 ° C. Membraanid lõigati kõigepealt vahemikus 75 kuni 50 kDa ja membraani alumist molekulmassi pool inkubeeriti anti-aktiiniga (hiir 1: 2000; EMD Millipore MAB1501). Membraani ülemist molekulmassi poolt inkubeeriti anti-Piwi (hiir 1: 200; Santa Cruz sc-390946), baklažaanivastaste (küülik 1: 2000) või anti-AGO3 (küülik 1: 3000). Enne blotistamist kas baklažaanide või anti-AGO3-ga ja iga kordusproovimise vahel destilleeriti blot puhastamispuhvriga (50 mM Tris-HCl, pH 6, 8, 20 g l - 1 SDS ja 0, 8% β-merkaptoetanooli) temperatuuril 60 ° C. Pärast iga primaarse antikehaga töötlemist inkubeeriti membraane kas mädarõika peroksüdaasiga konjugeeritud hiirevastase ravimiga (kits 1: 5000; ThermoFisher 31430) või küülikuvastase ravimiga (kits 1: 5000; ThermoFisher 31460). AGO3- ja baklažaanivastased antikehad olid Phillip Zamore kingitused. Algsete immunoblottide kopeerimata pilte võib leida täiendavalt jooniselt 2.

Immunofluorestsentsanalüüsid ja lipiidide värvimine

Kärbsed kasteti korraks EtOH-sse ja blotteeriti, fikseeriti 20 minutit 4% paraformaldehüüdis PBS-is, pesti jääl PBS-ga ja manustati Tris-puhverdatud soolalahusesse kudede külmutuskeskkonda (Fisher Scientific 15-183-13). Vormid külmutati kuival jääl ja säilitati temperatuuril -80 ° C. Vormid krüoseeriti 10 um lõikudeks ja pesti ettevaatlikult PBS-ga. Piwi-vastase immunofluorestsentsi saamiseks inkubeeriti slaidid Piwi-vastase antikehaga (hiir 1:50; Santa Cruz sc-390946) 1 tund toatemperatuuril, pesti PBS-ga, inkubeeriti hiirevastase Alexa Fluor-568-konjugeeritud antikehaga ( kits 1: 2000; ThermoFisher A-11031) 1 tund toatemperatuuril ja seejärel pesti uuesti PBS-ga. Nii Piwi-vastased primaarsed kui ka sekundaarsed antikehad lahjendati 5% tavalises kitseerumis ja 0, 1% Triton X-100. Lipiidide värvimiseks inkubeeriti lõike lõigul toatemperatuuril Niiluse punasega (0, 5 μg ml - 1 ; ThermoFisher N-1142) ja pesti PBS-ga. Anti-y-H2A.v immunofluorestsentsi saamiseks pesti objektiklaase PBS-ga ja blokeeriti toatemperatuuril 30 minutiks 5% normaalse kitseerumiga ja 0, 5% Triton X-100-ga. Seejärel loputati objektiklaase korraks PBS-is, inkubeeriti 2 h toatemperatuuril anti-γ-H2A.v antikehaga (hiir 1:20; DSHB unc93-5.2.1), pesti PBS + 0, 1% Tween-20 (PBST), inkubeeriti hiirevastase Alexa Fluor-568-konjugeeritud antikehaga (kits 1: 1000; ThermoFisher A-11031) 1 tund toatemperatuuril ja pesti kaks korda PBST-ga, millele järgnes üks viimane pesemine PBS-iga. Anti-γ-H2A.v primaarsed ja sekundaarsed antikehad lahjendati 5% normaalses kitse seerumis ja 0, 1% Tween-20. Kõik objektiklaasid paigaldati ja värviti 4, 6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI; ThermoFisher P36935).

Piwi pildid saadi Zeiss LSM 510 metakonfokaalse laserskaneerimise mikroskoobi ja γ-H2A.v abil ning lipiidide värvimisega Zeiss AxioImager.Z1 ApoTome mikroskoobiga. Tüüpiliste tuumade, valkude ja lipiidide pildid valiti välja ja töödeldi ImageJ ja Adobe Photoshop abil. y-H2A.v intensiivsus mõõdeti ja kvantifitseeriti, kasutades ImageJ, vastavalt viites avaldatud meetodile. 28. Lipiidide tilga suurust mõõdeti ja kvantifitseeriti ImageJ abil üksikute kärbeste sektsioonidest. Γ-H2A.v fluorestsentsi intensiivsuse ja lipiidipiiskade suuruse kvantitatiivseks määramiseks viidi olulisuse määramiseks läbi Studenti kahepoolne t- test.

mustlas-TRAP-i ülevõtmisreporter

Piwi mutantse rasvakeha mustlase-TRAP reporteri liin loodi, kasutades linke, mida on mainitud jaotises „ Kärbeste varud ja loomakasvatus”. Lühidalt, rasva kehaspetsiifiline r4-GAL4 juhi liin rekombineeriti kõigepealt UAS-GFP liiniga, luues uue stabiilse liini, mis ekspresseerib rohelist fluorestsentsvalku (GFP) ainult rasva kehas. Seejärel ületati see joon mustlase-TRAP reporteri liiniga 24 - liin, mis sisaldab GAL80, mida juhib tubuliini promootor, eraldatuna ovo- sidumissaidiga, mis tõmbab ligi mustlase TE-d, mis pärsib GFP ekspressiooni, kuni TE transpositsioon aktiveerib reporteri funktsiooni. Olles stabiilne, ristati see uus liin edasi Piwi 2 / CyO mutantseks taustaks, genereerides sellega lõpliku Piwi mutandi rasvakeha mustlase-TRAP reporteri liini. Sellest vanusest koosnevaid heterosügootseid ja homosügootseid kärbseid vanandati seejärel koos 10 päeva. Seejärel eraldati kärbsed piwi genotüübiga ja iga piwi genotüübi emaskärbsed eraldati fluorestsentsi järgi jaotatuna kolme rühma vastavalt ventaalse kõhu seina all nähtavalt fluorestseeruvate GFP rakkude ligikaudsele arvule. Rühmad olid järgmised: madal (puuduvad nähtavad GFP-positiivsed rakud), keskmised (50% kõhupiirkond näitab GFP-positiivseid rakke). Tähtsuse määramiseks kombineeritud keskmise + kõrge rühma ja madala rühma vahel viidi läbi Fisheri täpne test.

As was demonstrated for adult mushroom body neurons 24, we found that the GFP-positive cells in the fat body were dependent upon endogenous gypsy insertion as mutant ovo binding sites in the wild-type gypsy-TRAP / r4-GAL4::UAS-GFP reporter line resulted in no GFP-positive cells as expected 9 . All representative images were taken from heterozygous piwi mutant fat body gypsy-TRAP flies.

Metabolic assays

Assays were performed as in ref. 39 with the following modifications. Biological replicates for each genotype assayed were generated using five whole adult flies. All data were normalized to total protein concentration and calculated as a percent relative to the control genotype. For each assay, Student's two-tailed t -test was performed to determine significance.

TAG assay

Flies were homogenized in 200 μl of cold PBST buffer. The homogenate was heat-treated at 70 °C for 5 min to inactivate endogenous enzymes. Protein concentration was measured using a Bradford assay (Bio-Rad 5000006). Samples were diluted with PBST and 15 μl of heat-treated homogenate or glycogen standard (Standbio 2103-030) were incubated with 200 μl of Trigylceride Reagent (Thermo Scientific TR22421) for 5 min at 37 °C. Absorbance was measured at 540 nm and TAG content of samples was calculated based on a standard curve of TAG that was run in parallel with experimental samples.

Glycogen assay

Flies were homogenized in 200 μl of cold PBS. The homogenate was heat-treated at 70 °C for 5 min to inactivate endogenous enzymes. Samples were centrifuged for 3 min at 16, 100 × g and the supernatant collected. Protein concentration was measured using a Bradford assay (Bio-Rad 5000006). Samples were diluted with PBS and 90 μl of heat-treated homogenate were incubated with either 20 μl of amyloglucosidase (Sigma-Aldrich A7420) or 20 μl of PBS. To create a glycogen standard curve, 50 μl of glycogen standards (Ambion AM9510) were treated with either 50 μl of amyloglucosidase or 50 μl of PBS. All samples were incubated at 37 °C for 1 h. Then, 30 μl of each sample was added to a 96-well plate. Next, 100 μl of Infinity Glucose Hexokinase reagent (Thermo TR15421) was added to all samples and incubated at room temperature for 15 min. The absorbance of samples was then measured at 340 nm and normalized by subtracting the absorbance of the free glucose of untreated samples from the absorbance of the total amount of glucose present in samples treated with amyloglucosidase. Glycogen content was then calculated based on the normalized glycogen standard curve.

Trehalose assay

Flies were homogenized in 200 μl of cold trehalose buffer (5 mM Tris-HCl, pH 6.6, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl). The homogenate was heat-treated at 70 °C for 5 min to inactivate endogenous enzymes. Samples were centrifuged for 3 min at 16, 100 × g and the supernatant collected. Protein concentration was measured using a Bradford assay (Bio-Rad 5000006). Samples were diluted with trehalose buffer and 90 μl of heat-treated homogenate were incubated with either 20 μl of trehalase (Sigma-Aldrich T8778) or 20 μl of trehalose buffer. To create a trehalose (Sigma-Aldrich T9531) standard curve, 50 μl of standard were incubated with either 30 μl of trehalase or 30 μl of trehalose buffer. A free glucose (Fisher Scientific 50-99-7) standard curve was also generated. All samples were incubated at 37 °C overnight. Then, 30 μl of each sample was added to a 96-well plate. To all samples, 100 μl of Infinity Glucose Hexokinase reagent (Thermo TR15421) was added and incubated at room temperature for 15 min. The absorbance of samples was then measured at 340 nm and normalized by subtracting the absorbance of free glucose present in untreated samples from the total amount of glucose present in samples treated with trehalase. Trehalose and free glucose content were calculated based on standard curves of trehalose and glucose respectively.

Glucose assay

Flies were homogenized in 200 μl of cold PBS. The homogenate was heat-treated at 70 °C for 5 min to inactivate endogenous enzymes. Samples were centrifuged for 3 min at 16, 100 × g and the supernatant collected. Protein concentration was measured using a Bradford assay (Bio-Rad 5000006). Samples were diluted with PBS and 30 μl of supernatant was then added to a 96-well plate. To all samples, 100 μl of Infinity Glucose Hexokinase reagent (Fisher Scientific TR15421) was added and incubated at room temperature for 15 min. The absorbance of samples was then measured at 340 nm and glucose content was calculated based on a standard curve of glucose (Fisher Scientific 50-99-7).

Starvation assay

Before permanent starvation, flies were synchronized in their feeding by fasting on 2% agar for 4 h followed by a final period of feeding for 2 h. Flies were then sorted under CO 2 anaesthesia into separate sex vials containing 2% agar at a density of 10 males or 10 females per vial, with a total of 5 vials ( n ≈50) for each genotype. Dead flies were scored and counted every 6 h. Starvation analyses were performed and log rank statistics calculated using the online application OASIS 40 . Starvation assays were repeated at least twice.

Immune challenge assay

A bacterial culture of Erwinia carotovora (Gram-negative insect/plant pathogen), a gift from Neal Silverman, was grown overnight in Luria broth, shaking at 220 rpm on a platform shaker at 37 °C. The culture was allowed to reach OD 600nm ≈2.0 before removing 1 ml for centrifugation at 2, 000 × g for 2 min. The supernatant was removed and the bacterial pellet gently washed with 1 ml of 10 mM MgSO 4 to remove traces of culture media. The wash was removed and the pellet resuspended in 10 μl of fresh 10 mM MgSO 4 . A 0.15 mm needle was then dipped into 80% EtOH and flame sterilized. Flies were sorted under CO 2 anaesthesia and inoculated by dipping the needle into either the bacterial suspension or EtOH for mock infection controls, and inserting the needle midway into one side of the thorax. Flies were then sorted into separate sex vials at a density of 10 males or 10 females per vial, with a total of 5 vials ( n ≈50) for each condition/genotype, and passed to fresh food at least every other day. Dead flies were scored and counted every 24 h. Immune challenge analyses were performed and log rank statistics calculated using the online application OASIS 40 . Immune challenge assays were repeated at least twice.

Lifespan assay

Flies used in lifespan experiments were collected upon eclosion over a 48 h period and were sorted under CO 2 anaesthesia and placed in food vials at a density of 25 males and 25 females per vial, with a total of 10 vials ( n ≈250) for each genotype. Lifespan food consists of 50 g l − 1 autolysed yeast, 50 g l − 1 sucrose and 20 g l − 1 agar (all w/v). For the flamenco 3TC lifespans, flamenco homozygous mutant flies were collected and aged on either food containing 150 g l − 1 autolysed yeast, 150 g l − 1 sucrose and 20 g l − 1 agar, (all w/v) or identical food with 10 mM lamivudine (3TC). Flies were passed to fresh food every other day, and dead flies scored and counted. Lifespan analyses were performed and Wilcoxon rank sum test statistics calculated using the online application OASIS 40 . Lifespan assays were repeated twice.

Data availability

The data sets generated and analysed in this study have been deposited and are available in the GEO database, under the series accession number GSE89260. Additional relevant data sets and computer code are available either in this published article (and its Supplementary Information Files) or are available from the corresponding author on reasonable request.

Additional information

How to cite this article: Jones, BC et al . A somatic piRNA pathway in the Drosophila fat body ensures metabolic homeostasis and normal lifespan. Nat. Commun. 7, 13856 doi: 10.1038/ncomms13856 (2016).

Kirjastaja märkus: Springer Nature on avaldatud kaartidel ja institutsionaalsetes seostes kohtualluvusnõuete osas neutraalne.

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

    Supplementary Figures and Supplementary Tables.

  2. 2

    Peer Review File

Exceli failid

  1. 1

    Supplementary Data 1

    FDR values for all pairwise comparisons between somatic body segments and tissues for all genes reported in Fig. 1 and Supplementary Fig 1.

  2. 2

    Supplementary Data 2

    Fat body genic piRNAs.

  3. 3

    Supplementary Data 3

    Raw data of fat body lipid droplet quantification for piwi mutants and heterozygous controls.

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.