Fluorotürosiinide kohaspetsiifiline liitmine e2 r2 subühikusse. coli ribonukleotiidi reduktaas ekspresseeritud valgu ligeerimise teel | loodusprotokollid

Fluorotürosiinide kohaspetsiifiline liitmine e2 r2 subühikusse. coli ribonukleotiidi reduktaas ekspresseeritud valgu ligeerimise teel | loodusprotokollid

Anonim

Abstraktne

Ekspresseeritud valgu ligeerimine (EPL) võimaldab sihtvalgu senisünteesi, sondide või ebaloomulike aminohapete spetsiifilise inkorporeerimisega selle N- või C-otsa. Siin kirjeldame protokolli, mille meie labor on välja töötanud fluorotürosiinide (F n Ys) lisamiseks Escherichia coli ribonukleotiidi reduktaasi väikese subühiku jääki 356, kasutades EPL. Selle protseduuri käigus sulatatakse suurem osa valgust (jäägid 1–353 375-st) inteini domeeniks ja valmistatakse rekombinantse ekspressiooni teel, saades valgu tioestriga aktiveeritud kärbitud kujul. Ülejäänud valgu osa, 22-meeriline peptiid, valmistatakse peptiidi tahke faasi sünteesi teel ja see sisaldab soovitud asukohas FnY-d. 22-meerse peptiidi ligeerimine tioestriga aktiveeritud R2-ga ja sellele järgnev puhastamine annab täispika R2 Fn Y-ga jäägis 356. Protseduur Y 356 FnY-R2 100 mg koguste saamiseks võtab 3–4 kuud. .

Sissejuhatus

Uuritav probleem

Escherichia coli ribonukleotiidreduktaas (RNR) katalüüsib kõigi nelja nukleotiidi muundamist vastavateks 2'-deoksünukleotiidideks ja koosneb kahest homodimeersest alaühikust: R1 ja R2 (viited 1, 2, 3). R1 on homodimeerne alaühik, kus toimub nukleotiidi redutseerimine. See sisaldab nukleosiiddifosfaatsubstraatide, samuti deoksünukleosiidtrifosfaadi ja AOS-i allosteeriliste efektorite sidumissaite, mis reguleerivad substraadi spetsiifilisust ja käibe määra. R2 on homodimeerne subühik, milles asub katalüüsi jaoks hädavajalik diiron-türosüülradikaali kofaktor (Y 122 •). Iga käive eeldab radikaalset migratsiooni Y 122 saidilt R2 R2 aktiivsele saidile 35 Å kaugusel. Selle radikaalse pika leviku sündmuse mehhanism on aktiivne uurimisvaldkond 4, 5 .

Aktiivse RNR struktuurid, R1 ja R2 1: 1 kompleks, pole saadaval. Kuid Uhlin ja Eklund 6 on genereerinud selle kompleksi dokkimismudeli R1 ja R2 üksikute struktuuride järgi (viited 7, 8). Nende analüüs koos enam kui 160 I klassi RNR-järjestuse Clustal W joondamisega on pakkunud pöörduva radikaalide migratsiooni raja, mis hõlmab järgmisi jääke ja võib-olla ka diironi keskpunkti: [Y 122 - Fe klaster - W 48 - Y 356 ] R2 ja [Y 731 - Y 730 - C 439 ° substraat] R1-s (joonis 1) (viide 5, 6). Kohapealset mutageneesi on kasutatud tõendite saamiseks selle kohta, et need jäägid on radikaalse initsiatsiooni jaoks olulised 9, 10, 11, 12, 13 . Need mutandid ei ole aga olnud mehhaaniliselt informatiivsed, kuna neil on vaid marginaalne katalüütiline aktiivsus, mis on tõenäoliselt seotud puhastatud mutantide metsiktüüpi jääva saastumisega. 19-st looduslikust aminohappest, mis võivad selles asendis Tyr asendada, on ainult Trp ja Cys oksüdatsioonipotentsiaalid Tyr lähedased, kuid need on halvad struktuurilised asendajad 5 . Mehaaniliselt tähendusrikkamate mutatsioonide genereerimiseks võtsime eesmärgiks asendada jääk Y 356 kavandatud radikaalse initsiatsiooni rajal R2 ebaloomulike aminohapetega, mis sarnanevad steeriliselt Tyr ja millel on varieeruvad oksüdatsioonipotentsiaalid ja nende fenoolsete külgahelate pKa-d.

Image

Pange tähele, et jääk 356 pole C-otsa sabas esinevate häirete tõttu üheski R2 struktuuris nähtav; seetõttu pole kaugus W 48 ja Y 731 kuni Y 356 teada. Kaugused R1-s põhinevad R1 struktuuril ref. 6 ja R2 seostuvad suure eraldusvõimega struktuuriga ref. 8

Täissuuruses pilt

Selleks uurisime F n Y-de ( n = 1–4) omadusi ja näitasime, et need võivad olla proovid valkude redoks-aktiivsete Tyr-jääkide reaktiivsuse eraldamiseks sondidena (joonis 2) (vt viide 14). . F n Y-d on türosiiniga isosteerilised, esinevad nii fenoolsete pKa-de vahemikus kui ka suurel hulgal oksüdatsioonipotentsiaalide vahemikus (tabel 1). Fn Y ja reaktsiooni pH õige valiku korral saab muuta FnY 356 protonatsiooni olekut, selle oksüdatsioonipotentsiaali või mõlemat. Seega on FnY-d suurepärased sondid prootoniga seotud elektronide ülekandemehhanismide uurimiseks radikaalsel levimisel ja peaksid olema üldiselt kasulikud valkude uurimiseks, mis vajavad katalüüsiks stabiilseid või mööduvaid türosüülradikaale 15, 16 . Järgmisena töötasime välja inteini-vahendatud R2 poolsünteesi, mis võimaldab jäägi Y 356 kohaspetsiifilist asendamist R2-s F n Ys-ga 17, 18 .

Image

Nende FnY-de N- atsetüül-, C-amiidiga kaitstud variantide olulised füüsikalised ja keemilised omadused on loetletud tabelis 1 (vt viide 14).

Täissuuruses pilt

Täissuuruses tabel

Inteiinid ja valgu splaissimise mehhanism

Intein on valgudomeen, mis katalüüsib ka inteini domääni 19, 20 külgnevate N- ja C-terminaalsete domeenide (N-eksteini ja C-eksteini) splaissimist suuremast polüpeptiidist omaenda translatsioonijärgset enesiekstsineerimist. . Esimene interiin, Sacmaharcesces cerevisiae'st pärit Vma, avastati 1990. aastate alguses (viide 21). Enda splaissimise potentsiaalne kasulikkus proteiinide tootmisel soodustas selle mitmeastmelise protsessi toimemehhanismi üksikasjalikke uuringuid. See arusaam viis välja paljude ümberehitatud inteini konstruktide väljatöötamiseni, mis on nüüd müügil, võimaldades valkude 22, 23 senisünteesi ja sellest tulenevalt ebaloomulike aminohapete spetsiifilist inkorporeerimist. Selle protokolli keskmes on üks neist tehnikatest, EPL.

EPLi toimimise demonstreerimiseks tuleb kõigepealt visandada inteini enesest väljasaatmise mehhanism. S. cerevisiae Vma inteini väljapakutud mehhanism on näidatud joonisel 3 (vt viiteid 24, 25). Splaissimise initsieerib NS atsüülnihe, mis muundab peptiidsideme tioestriks N-eksteini ristumiskohas. C-extein Cys jäägi kaudu transstioesterdamisel saadakse hargnenud vaheühend. See vaheühend läbib inteini domääni, asn-jäägi rünnakuga peptiidsidemele C-eksteini liitumiskohas, moodustades integiini suktsiinimiidi ja splaissitud eksteini domeene. Spontaanne SN atsüüli ümberkorraldamine tekitab amiidsideme kaudu ühendatud N- ja C-eksteiini.

Image

Täissuuruses pilt

R2 poolsüntees EPL abil

Oleme rakendanud EPL-i, et muuta E. coli RNR R2 subühikuks poolsünteetiline. R2 on homodimeer, milles iga polüpeptiid sisaldab 375 aminohapet. E. coli R2 C-terminaalsed 35 aminohapet on korrastamata ja selles piirkonnas on Y 356, jääk, mis arvatakse olevat oluline ülalkirjeldatud mehhaaniliselt ebaharilikul radikaalide paljundamise protsessil (joonis 1) (viide 5). Üldine skeem, mida oleme kasutanud R2 poolsünteesi jaoks, on näidatud joonisel 4 (vt viide 17). Algseisundisse volditud jäägid 1–353 valmistatakse rekombinantse DNA tehnoloogia abil ja ligeeritakse jääkidega 354–375, mis on valmistatud peptiidi tahke faasi sünteesil (SPPS). Suurem osa R2-st (jäägid 1–353) on sulandunud inteini mutandiga, millel puuduvad C-eksteini Asn ja Cys jäägid, kuid mis sisaldab puhastusmärgist, kitiini siduvat domeeni (CBD) 26 . Pärast rekombinantset ekspressiooni katalüüsib integreeritud termotuumasünteesi produkt iseenesliku lõhustumise reaktsiooni esimest etappi, kuid mitte järgnevaid splaissimisetappe. Moodustatud tioester hõivatakse seejärel transthiosesterdamise teel väikese molekuliga tiooliga, näiteks 2-merkaptoetaansulfoonhappega (MESNA), mille tulemuseks on sihtvalgu lõhustamine inteini-CBD konstruktsioonist. Tioestriga aktiveeritud kärbitud R2 ligeeritakse seejärel ülejäänud R2-ga - peptiidiga, mis sisaldab jääke 354–375, mitteloodusliku aminohappega jäägis 356 ja Cys-ga selle N-otsas (jääk 354). Peptiidi N-terminaalse Cys jäägi transstioesterdamine, millele järgneb spontaanne SN-atsüüli nihe, annab täispika R2. Metsikut tüüpi R2 sisaldab Ser-i 354 juures ja seega sisestatakse R2-s jäägi 354 kõrval lisaks ebaloomulikule aminohappele ka teine ​​mutatsioon. Lõpuks on ligatsiooni efektiivsuse suurendamiseks vajalik kolmas mutatsioon - V 353 G. ja sellest tulenevalt saadakse biofüüsikalisteks katseteks vajalik poolsünteetilise R2 kogus 100 mg-ni.

Image

Jääke 1–353 ekspresseeritakse rekombinantselt integreeritud CBD kimäärina. Pärast esialgset NS atsüüli nihutamist kasutatakse kärbitud R2 eraldamiseks CBD-i domeenist väikese molekuliga tiooli, MESNA-d. Saadud MESNA-ga aktiveeritud R2 ligeeritakse Fn Y-22-ga, mille on valmistanud SPPS ja mis sisaldab jääke 354–375 koos FnY-ga jäägis 356. Pange tähele, et V 353 G mutatsioon oli vajalik lõhestamise ja ligeerimise suurendamiseks saagikus.

Täissuuruses pilt

EPL-i eelised ja piirangud

Ebaloomulike aminohapete valkudesse lisamiseks on praegu väljatöötamisel arvukalt meetodeid 27, 28 . Oleme valinud EPL-i R2 poolsünteesi jaoks mitmel põhjusel. Esiteks on mehaaniliste biofüüsikaliste katsete jaoks vajalik 100 mg poolsünteetilise R2 koguseid. Teiseks on puhastamine CBD-märgisega tugev. Kolmandaks, jääk Y 356, radikaalse initsiatsiooni ahela liige ja pakub meile mehaaniliselt suurt huvi (joonis 1), on valgu korrastamata C-terminaalses sabas ja seetõttu hea sihtmärk EPL-ga asendamiseks. Lõpuks on mitmed inteliinid nüüd müügil. Nagu on näidatud joonisel 4, oleme aktiveeritud kärbitud R2 eraldamiseks CBD-i integreeritud konstruktsioonist kasutanud tioolmeetodit, kuid soovitud liikide saamiseks võib kasutada ka temperatuuri ja pH indutseeritud lõhustamist. Nende eeliste tõttu on EPL-meetodit kasutanud arvukad uurijad ja selle rakenduste kohta on saadaval suurepäraseid ülevaateid 29, 30, 31 .

EPL-l on ka mitmeid piiranguid. Esiteks võib sondide kohaspetsiifiline inkorporeerimine toimuda ainult valgu N- või C-otsa lähedal, kuna peptiide, mille jäägid on pikemad kui 40–50, on raske sünteesida ja puhastada. Teiseks, ligeerimise koht peab olema ligipääsetav loodusliku valgu lahustile. Kui ligeerimise koht on maetud, tuleb ligeerimisreaktsioon läbi viia denatureerimise tingimustes ja on vaja meetodeid valgu ümbervoltimiseks. Kolmandaks, tioestriga kärbitud valk hüdrolüüsub konkureerides peptiidiga ligeerimisega. Ligeerimise kiirust, bimolekulaarset reaktsiooni, suurendatakse kontsentratsioonide suurendamise teel. Kuid ligeerimine on endiselt aeglane ja järelikult kaasneb soovitud reaktsiooniga peaaegu alati hüdrolüüs. Seega on vaja meetodeid kärbitud valgu eraldamiseks täispikkadest ligeeritud valkudest. See probleem süveneb, kui huvipakkuv valk on multimeerne, nagu R2 puhul.

R2 semesünteesiga seotud probleemid

R2 on homodimeer ja seetõttu oli kärbitud homodimeeri, heterodimeeri ja täispika homodimeeri eraldamiseks vaja meetodeid. Lisaks sisaldab R2 diferric-Y 122 • kofaktorit, mis on katalüüsi jaoks hädavajalik ja tundlik tioolide toimel redutseerumiseks. Poolsüntees nõuab omakorda kõrgeid tiooli kontsentratsioone nii intein-CBD domeeni eraldamiseks kärbitud R2-st kui ka ligeerimisreaktsiooniks. Seetõttu sisaldasid meie R2 esimesed poolsünteesid madalat Y 122 • sisaldust ja seega madalat ensümaatilist aktiivsust. Kuid meil on õnnestunud muuta EPL meetodit R2 poolsünteesi jaoks nii, et Y 122 saagised on nüüd sarnased rekombinantselt ekspresseeritud metsiktüüpi R2 saagistega (MRS, CSY ja JS, käsikiri valmistamisel - üksikasjalik protokoll on saadaval nõudmisel). Loodetavasti saavad teised teadlased, kes soovivad kasutada EPL-i oma sihtvalgu F-Y lisamiseks pool-sünteesimiseks, kasu siin kirjeldatud üksikasjalikest protseduuridest ja lahendustest, mille oleme leidnud täiendavatele probleemidele, mille on põhjustanud R2 multimeerne olemus, selle võimetus pärast denatureerimist uuesti kokku ja selle ebastabiilne Y122 • redutseerivatel tingimustel.

Protokolli skemaatiline ülevaade

FnY-de R2-sse integreerimise protseduur EPL-is nõuab kolme etapi rakendamist, mida võib pidada vastastikku sõltumatuteks järjestikusteks protokolliplokkideks:

1. F n Y (de) süntees ja puhastamine. Seda plokki käsitletakse protseduuri etappides 1–9.

2. FnY (de) aminorühma kaitsmine 9-fluorenüülmetoksükarbonüül (Fmoc) -rühmaga ning peptiidi-22mer (H2N – CS (FnY) LVGQIDSEVDTDDLSNFQL-COOH) süntees ja puhastamine sisaldavad soovitud F n Y (d), sammud 10–34.

3. MESNA aktiveeritud, kärbitud R2 kasvu ja ligeerimisega F n Y-22mer (id), etapid 35-50.

Materjalid

Reaktiivid

  • Pange tähele, et kõik ostetud kemikaalid peaksid olema märgitud müüja kõrgeima võimaliku kvaliteediga. Lisaks on tavaks teada iga kasutatud kemikaali omadusi ja potentsiaalseid ohte - neid võib saada materjali ohutuskaartidelt (nt //hazard.com/msds).

  • Türosiinfenoollüas (TPL): TPL ekspressioon ja puhastamine pTZTPL plasmiidist on varem teada andnud 32, 33, 34

  • Ammooniumatsetaat (Sigma-Aldrich)

  • Püruvichape (Sigma-Aldrich)

  • Püridoksaal-5'-fosfaat (PLP) (Sigma-Aldrich)

    Kriitiline

    • PLP-d tuleb hoida pimedas kuivas temperatuuril –20 ° C.

  • (Fluoro) n- fenoolid ( n = 1–4) (Sigma-Aldrich)

  • Ninhüdriin (Sigma-Aldrich)

  • n- butanool (Sigma-Aldrich)

  • Celite 545 (Sigma-Aldrich)

  • β-merkaptoetanool (βME) (Mallinckrodt)

  • Etüülatsetaat (Mallinckrodt)

    Ettevaatust

    Etüülatsetaat on tuleohtlik - hoidke eemal süttimisallikatest.

  • Äädikhape (Mallinckrodt)

    Ettevaatust

    Äädikhape on söövitav.

  • Naatriumkloriid (NaCl) (Mallinckrodt)

  • HCl lahus (∼ 6 N)

  • Katioonivahetusvaigu vesinikuvorm, AG50W-X8, silmaga 50-100 (Bio-Rad)

  • 10% (maht / maht) ammooniumhüdroksiidi lahus

  • Naatriumkarbonaat (Na 2 CO 3 ) (Sigma-Aldrich)

  • 9-fluorenüülmetüül- N- suktsinimidüülkarbonaat (Fmoc-OSu) (Sigma-Aldrich)

    Kriitiline

    • Fmoc-OSu tuleb hoida kuivas temperatuuril –20 ° C.

  • Dioksaan (Sigma-Aldrich)

  • Diisopropüületüülamiin (DIPEA) (Sigma-Aldrich)

  • Dimetüülformamiid (DMF) (Sigma-Aldrich)

    Ettevaatust

    DMF on tuleohtlik ja tugevalt ärritav.

  • Piperidiin (Sigma-Aldrich)

    Ettevaatust

    Piperidiin on mutageen ja reproduktiivtoksiin.

  • Trifluoroäädikhape (TFA) (Sigma-Aldrich)

    Ettevaatust

    TFA on väga söövitav.

  • Triisopropüülsilaan (TIS) (Sigma-Aldrich)

  • α-tsüano-4-hüdroksükaneiinhappe (CHA) ja maatriksi abil toimuva laseri desorptsiooni / ionisatsiooni lennuaeg (MALDI TOF) standardid: angiotensiini, sünteetilise P14R peptiidi, adrenokortikotroopse hormooni fragment ja oksüdeeritud B-ahela insuliin (Sigma-Aldrich)

  • Kloroform (CHCl 3 ) (Mallinckrodt)

    Ettevaatust

    CHCl 3 on reproduktiivtoksiin ja tõenäoliselt inimese kantserogeen.

  • Metanool (Mallinckrodt)

    Ettevaatust

    Metanool on väga tuleohtlik ja ärritav.

  • Atsetonitriil (MeCN) (Mallinckrodt)

    Ettevaatust

    MeCN on tuleohtlik ja võimalik mutageen.

  • Diklorometaan (CH2CI2) (Mallinckrodt)

    Ettevaatust

    CH2CI2 on potentsiaalne kantserogeen.

  • Dietüüleeter (Mallinckrodt)

    Ettevaatust

    Dietüüleeter on ärritav ja väga tuleohtlik.

  • Magneesiumsulfaat (MgSO 4 ) (Mallinckrodt)

  • NaCl (Mallinckrodt)

  • Ammooniumvesinikkarbonaat (NH 4 HCO 3 ) (Mallinckrodt)

  • Kaaliumfosfaat (KPi) (Mallinckrodt)

  • Silikageel 60 (osakeste suurus 0, 04–0, 063 mm, silma suurus 230–400) (EMD Bioscience)

  • O - (7-asabensotriasool-1-üül) -N , N , N ', N ', tetrametüülurooniumheksafluorofosfaat (HATU) (Applied BioSystems)

    Kriitiline

    • HATU tuleb hoida kuivalt temperatuuril <5 ° C.

  • Fmoc-L-Lee-PEG-PS (0, 2 mmol g- 1 ) (Applied BioSystems)

  • Fmoc-Leu-OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Gln (Trt) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Phe-OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Asn (Trt) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Ser (OtBu) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Asp (OtBu) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Thr (OtBu) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Val-OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Glu (OtBu) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Asp (OtBu) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Ile-OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Gly-OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Asp (OtBu) -Ser (ψ Me, Me pro) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Cys ( t Buthio) -OPfp (NovaBiochem)

  • 1-hüdroksübensotriasoolhüdraat (HOBt) (NovaBiochem)

  • F n Ys eelmisest etapist

  • BL21-DE3 koodon + rakud (Stratagene)

  • R2-intein-CBD plasmiid 17

  • Luria – Bertani sööde (LB) (Becton Dickerson)

  • Isopropüül-β-D-tiogalaktopüranosiid (IPTG; Promega)

  • DL-ditiotreitool (DTT) (Promega)

  • MESNA (Sigma-Aldrich)

  • Ampitsilliin (Amp) (Sigma-Aldrich)

  • Klooramfenikool (Cm) (Sigma-Aldrich)

  • Triton X-100 (Sigma-Aldrich)

  • Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich)

  • Fenüülmetaansulfonüülfluoriid (PMSF) (Sigma-Aldrich)

    Ettevaatust

    PMSF on mürgine.

  • Glütserool (Sigma-Aldrich)

  • Bradfordi reagent (Sigma-Aldrich)

  • Naatriumaskorbaat (Sigma-Aldrich)

  • Raud ammooniumsulfaadi heksahüdraat (Fe II (NH4) 2 (SO 4 ) 2 ) (Sigma-Aldrich)

  • Etüleendiamiintetraäädikhape (EDTA) (Sigma-Aldrich)

    Ettevaatust

    EDTA on ärritav.

  • Kitiinhelmed (NEB)

  • 4- (2-hüdroksüetüül) piperasiin-1-etaansulfoonhape (HEPES) (EMD Bioscience)

  • DNaas I (veise pankreas) (Roche)

  • Tris (hüdroksümetüül) aminometaan (Tris-alus) (Roche)

Varustus

  • Suur jaotuslehter (2 liitrit)

  • Suur Buchneri lehter (1 liiter)

  • Segage plaat

  • Pöördaurusti

  • Lüofilisaator

  • Õhekihikromatograafia (TLC) plaadid - 2, 5 × 7, 5 cm (JT Baker)

  • Pioneeride peptiidide süntesaator (rakenduslikud biosüsteemid)

  • Ühekordseks kasutamiseks mõeldud friteeritud ökono-Paci kolonnid (Bio-Rad)

  • Vortexer (Fisher Scientific)

  • HPLC-süsteem 2487 kahekordse neeldumisdetektoriga ja 515 HPLC-pumpa töötab aastatuhandete tarkvaraga (Waters)

  • Poolpreparatiivne XTerra MS C 18 5 μm (19 × 100 mm) kolonn (Waters)

  • Analüütiline fenomenex C18 5 μm (150 x 4, 6 mm) kolonn (Jupiter)

  • 1000 Da väljalõigatud dialüüsi torustik (SpectraPor)

  • 50 ml polüpropüleenist Falcon torud (BD Bioscience)

  • Loksutaja / inkubaator (New Brunswick Scientific)

  • Prantsuse surveelemendipress (Sim-Aminco Spectronic Instruments)

  • Kindalaegas (M. Braun)

  • SDS-PAGE seadistamine (Bio-Rad)

  • Sprint Biocad FPLC süsteem (Applied Biosystems)

  • MonoQ HR 16/10 anioonivahetuskolonn (10 μm, 2 × 10, 5 cm, 33 ml) (Amersham Bioscience)

  • Centriprepi valkude kontsentreerimisseade (YM-30) (Millipore)

  • Amiconi ultrafiltrimisseade (Millipore)

  • YM-30 ultrafiltratsioonimembraanid (Millipore)

  • OmniFlex MALDI TOF massispektromeeter ja vastav sihtmärk (Bruker)

Reaktiivi seadistamine

  • Ninhüdriini test Vabade amiinide olemasolu kontrollimiseks kasutatakse ninhüdriini lahust, mis sisaldab 0, 19% (mass / maht) ninhüdriini, 95% (mahu järgi) n- butanooli, 0, 5% (mahu järgi) äädikhapet ja 4, 5% (mahu järgi) / v) vesi tuleb ette valmistada. Ninhüdriini testi tegemiseks tilgutage tilk lahust TLC-plaadile ja laske plaadil kuivada. Kastke TLC-plaat ninhüdriini lahusesse ja kuumutage plaati kuumutuspüstoliga 10–15 s. Lilla / roosa täpp annab positiivse tulemuse ja näitab vaba amiini funktsionaalsust.

  • TPL-i aktiivsus Enne FnY-de sünteesi tuleks puhastatud TPL-i aktiivsus määrata eelnevalt kirjeldatud meetoditega 32, 33 . Üks TPL aktiivsuse ühik (U) on määratletud kui 1 μmol produkti minutis. Meie käes oleva puhastatud TPL spetsiifiline aktiivsus on 6–10 U mg −1 .

  • MALDI TOF MS massispektrid saadakse negatiivses režiimis, kasutades maatriksina CHA. Maatriks valmistatakse, suspendeerides 10 mg CHA 50% (maht / maht) MeCN ja 0, 1% (maht / maht) TFA 1 ml lahusesse - seejärel segatakse 1 μl peptiidi (0, 5–3 mM) lahust. kanti MALDI TOF sihtmärgile 1 μl maatrikslahusega ja lasti enne analüüsi kuivada 0, 5–1 tundi. MALDI TOF massispektromeeter kalibreeritakse negatiivse režiimi korral angiotensiin II (1 044, 5423 Da), sünteetilise P14R peptiidi (1, 531, 8582 Da), adrenokortikotroopse hormooni fragmendi (2463, 1989 Da) ja insuliini, oksüdeeritud B-ahela (3, 492, 6513 Da) seguga.

  • Puhastuspuhvrid MESNA-ga aktiveeritud kärbitud R2 eraldamiseks mõeldud lüüsipuhver koosneb 30 mM HEPES, 500 mM NaCl ja 0, 1% (mass / maht) Triton X-100 (pH 7, 6). Enne raku lüüsimist lisage lüüsipuhvrit 25 U DNaas I-ga rakupasta grammi ja 1 mM PMSF-ga. Lõhustamispuhver sisaldab 50 mM HEPES ja 500 mM NaCl (pH 7, 6).

Seadmete seadistamine

  • Manuaalne SPPS käsitsi eemaldamine ja sidumisreaktsioonid teostatakse keeristikul, mis on varustatud adapteriga, mis sobib 50 ml Falconi torude hoidmiseks, mis omakorda hoiavad frititud Econo-pac kolonne.

  • Anaeroobne dialüüs Madala hapnikusisalduse säilitamiseks dialüüsi ajal puhverdatakse puhver puhverdatud argooniga 15 minutit enne dialüüsikoti sukeldamist ja seejärel pidevalt. Anaeroobne dialüüs viiakse läbi Erlenmeyeri kolvis toatemperatuuril (25 ° C).

  • Kitiinikolonni eelbalansseerimine Märga rakupasta grammi kohta on vaja kokku 5 ml kitiinvaiku. 200 ml kitiinvaigu jaoks kasutatakse kolonni mõõtmetega 5 × 10 cm. Enne töötlemata ekstrakti lisamist tasakaalustage kitiinikolonn 10 kolonnimahuga (CV) lüüsipuhvriga. Pärast kasutamist tuleb kolonni pesta 10 CV veega, 5 CV 1% (mass / maht) SDS lahusega ja seejärel 20 CV veega. Vaik tuleb hoida 20% (maht / maht) etanooli lahuses temperatuuril 4 ° C.

  • Ligeerimissegu monoQ anioonvahetuse eraldamine MonoQ kolonnkromatograafia viiakse läbi voolukiirusel 3 ml min- 1 . Kolonni tasakaalustatakse 50 mM Tris, 5% glütserooli ja 1 mM DTT-ga, pH 7, 6 (puhver Q). Pärast laadimist pestakse kolonni 2 minutit puhver Q-ga. Seejärel elueeritakse valk, kasutades puhvris Q lineaarset gradienti 0 kuni 200 mM NaCl 3 minuti jooksul, millele järgneb lineaarne gradient puhverlahuses Q kuni 200 kuni 440 mM NaCl. üle 37 min. Täispikk R2 elueerub puhver Q tavaliselt temperatuuril 360–380 mM NaCl.

Protseduur

F n Y (de) süntees

Ajastus: 1–4 nädalat

  1. Valmistage 1-liitrine 30 mM ammooniumatsetaadi lahus. Lisage sobiv fluorofenool lõppkontsentratsioonini 10 mM. Seejärel lisage püruviinhape ja βME lõppkontsentratsioonini vastavalt 60 ja 5 mM.

    Kriitiline samm

    • Fluorofenooli kontsentratsioon, mis ületab 10 mM, põhjustab ensüümi denaturatsiooni. Veenduge, et (fluoro) n- fenooli kontsentratsioon oleks ≤10 mM.

  2. Lahuse pH reguleeritakse ammooniumhüdroksiidiga väärtusele 8, 0. Kaitske reaktsiooninõu valguse eest, mässides selle alumiiniumfooliumiga, kuna TPL-i kasutatav PLP-kofaktor on valgustundlik.

  3. Kõigi muude fluorofenoolide (välja arvatud 2, 3, 5, 6-tetrafluorofenool) sünteesimiseks järgige varianti A; vastasel korral järgige valiku B juhiseid:

    1. Variant (A)

      1. Lisage 30 U TPL-i ja PLP-d lõppkontsentratsioonini 40 μM.

        Paus punkt

        • Segage 3–4 päeva toatemperatuuril.

        Kriitiline samm

        • Anum peaks selle protsessi ajal olema kaetud alumiiniumfooliumiga, et vältida valgust põhjustatud PLP lagunemist.

    2. Variant (B)

      1. 2, 3, 5, 6-tetrafluorofenooli jaoks lisage 300 U TPL ja 40 μM PLP.

        Paus punkt

        • Segage 3–4 nädalat. Anum peaks sel perioodil jääma alumiiniumfooliumiga kaetud (vt eespool). Igal nädalal lisage segu veel 20 U TPL-ga ja 1 mM 2, 3, 5, 6-tetrafluorofenooliga.

  4. Enne töötlemist tuleb katioonivahetusvaik ette valmistada. 1-liitrise reaktsiooni jaoks kasutage kolonnis mõõtmetega 4 × 17 cm 220 ml katioonivahetusvaiku. Pärast 10 CV veega pesemist võib kasutada uut protoneeritud vormi (H + vorm) vaiku. Pärast iga pealekandmist tuleb vaik puhastada ja protoneeritud vormi tagasi viia. Sel eesmärgil tuleks järgida tootja juhiseid.

  5. Pärast TPL-vahendatud Fn Y moodustumise lõppu eemaldage alumiiniumfoolium ja alandage segu pH 6 N HCl abil 2–3. Selle tulemuseks on TPL sade.

  6. Sadestunud TPL eemaldamiseks valmistage tseliidipadjake: lisage 2–3 cm paksune tseliidipulber 1-liitrisesse Buchneri lehtrisse (jäme fritt), mis toetub külgmise vaakumkolbi külge, mis on ühendatud vaakumtoruga. Loputage tseliidipadi 500 ml veega, filtreerige segu läbi tseliidipadja ja koguge filtraat.

  7. Filtraati ekstraheeritakse üks kord 0, 5 mahuosa etüülatsetaadiga; eraldage kaks kihti jaotuslehtriga ja eemaldage etüülatsetaadi kiht (ülemine kiht). Koguge keeduklaasi vesikiht (alumine kiht), mis sisaldab F n Y-d.

  8. Pange see segu etapis 4 valmistatud katioonivahetusvaigule, et eraldada F nY püruviirhappe jäägist, äädikhappest ja PLP-st. Pärast laadimist peske kolonni 8 CV veega.

  9. Elueerige F n Y kolonnist ∼ 8 CV 10% -lise ammooniumhüdroksiidi lahusega ja koguge 10 ml fraktsioone. Fraktsioonid, mis annavad positiivse ninhüdriini testi (vt REAGENDI SEADISTAMINE), kogutakse ja kontsentreeritakse vaakumis mahuni 20–30 ml , kasutades veevanni temperatuuri 35–40 ° C. Ülejäänud lahus lüofiliseeritakse kuivaks ja hoitakse temperatuuril 4 ° C. F nY identiteet põhineb UV omadustel (tabel 1) ja selle TMR spektril, millest on varem teatatud 14 .

    Paus punkt

    • F n Y-sid võib mitme aasta jooksul ohutult hoida temperatuuril 4 ° C.

F n Y (de) kaitsmine Fmoc-ga ja F n Y-22 meeri peptiidide süntees

Ajastus: 3 nädalat

  1. Fmoc-kaitserühma lisamine igale FnY viiakse tavaliselt läbi skaalal 0, 5–1 mmol 35 . Lahustage F n Y (1 mmol) 3, 4 ml 10% Na2C03 lahuses.

  2. Lahustage Fmoc-OSu (1, 35 mmol) 3, 5 ml dioksaanis segamisvardaga varustatud 100 ml pirnikujulises kolvis. Jahutage mõlemad segud temperatuurini 0–4 ° C, inkubeerides jääl või segades külmas ruumis.

  3. Ühes etapis lisage Fn Y-lahus Fmoc-OSu segule segades, seejärel laske reaktsioonil soojeneda toatemperatuurini. Jätkake segu segamist toatemperatuuril ja jälgige reaktsiooni kulgu TLC abil (liikuva faasi ja iga Fmoc-F n Y-OH vastava Rf väärtuse kohta vt tabel 2). Reaktsioon on lõppenud, kui Fmoc-FnY-OH-le vastava punkti intensiivsus lakkab tõusmast.

  4. Pärast reaktsiooni lõppu, tavaliselt 0, 5–2, 5 tundi (suurem fluori asendamine nõuab pikemaid reaktsiooniaegu), lisage reaktsioonile 36 ml vett ja ekstraheerige segu kaks korda 15 ml EtOAc-ga, kasutades jaotuslehtrit reageerimata Fmoc-OSu eemaldamiseks. Visake EtOAc kiht (ülemine kiht) ära.

  5. Fmoc-F n Y-OH sisaldava vesifaasi pH alandage 2 N HCl-ga 2–3 ja ekstraheerige saadus EtOAc-ga (∼ 10x, 15 ml). Kombineerige EtOAc ekstraktid.

  6. Peske EtOAc ekstraktid küllastunud NaCl lahuse (3 x, 4 ml) ja veega (2 x, 4 ml) ja kuivatage MgS04 kohal : lisage EtOAc ekstraktile MgS04 spaatliots ja lisage kolbi. MgS04, mis imab vett, moodustab tükke, kuiv MgS04 jääb aga pulbritaoliseks. Jätkake MgS04 lisamist EtOAc-ekstrakti loksutades, kuni hüdreeritud MgS04 tükid enam ei moodustu ja MgS04 pulber settib kolvi põhjale. Seejärel eemaldage hüdraatunud MgS04 vaakumfiltreerimisega. Lõpuks eemaldage lahusti vaakumis (veevanni temperatuur seati 25 ° C).

    Paus punkt

    • Selle protseduuri tulemusel saadud toodet võib säilitada kuude jooksul temperatuuril –20 ° C.

  7. Puhastage Fmoc-Fn Y-OH silikageeli kromatograafiaga (25 g, 1, 5 x 40 cm), kasutades tabelis 2 toodud lahustisüsteeme. Puhastatud Fmoc-Fn Y-OH saab kasutada otse peptiidide sünteesis. Pange tähele, et fluorofenooli hüdroksüülrühm ei vaja kaitset.

    Paus punkt

    • Puhastatud kuiva Fmoc-F n Y-OH võib säilitada temperatuuril –20 ° C kuni aasta.

  8. FnY-22meri esimesed 19 jääki (H2NL 19 VGQID 14S13 EVDTDDLSNFQL 1 -COOH) valmistatakse peptiidsüntesaatoril. Pange tähele, et jäägid 13 (Ser) ja 14 (Asp) lisati pseudo-proliini dipeptiidina, et vältida peptiidi agregatsiooni ( vide allpool ) 36 . Ülejäänud kolm jääki, F n Y 20, S 21 ja C 22, lisatakse käsitsi. Sel viisil saab samasse 19-meerse peptiidi partiist genereerida mitu FnY-22meeri peptiidi. Kui huvipakkuv on ainult üks joonisel 2 olevatest F n Y-st, võib süntesaatoril valmistada kogu F n Y-22-meeri. Kuna peptiidsüntesaatori töörežiim on kaubamärgi- ja mudelispetsiifiline, tuleks järgida konkreetse instrumendi kasutusjuhendit. Peptiidi süntees nõuab kahte etappi, mida korratakse, kuni süntees on lõppenud. Esimene samm on N-Fmoc-kaitserühma eemaldamine ja teine ​​samm on sidestamine järgmise N-Fmoc-kaitstud aminohappega peptiidijärjestuses. Süntesaatori abil eemaldatakse Fmoc-rühm 10 minutiks DMF-is, mis sisaldab 20% (maht / maht) piperidiini ja 0, 1 M HOBt (vt joonis 5 ja selle reaktiivi jaoks kriitiline samm allpool), seadme eelseatud voolukiirusega. Sidumisreaktsioonides kasutati 4 ekvivalenti Fmoc-kaitstud aminohapet, 3, 6 ekvivalenti HATU ja 8 ekvivalenti DIPEA peptiidi koguse suhtes vastavalt lõppkontsentratsioonides vastavalt 0, 5, 0, 45 ja 1 M ning jätkati 1 tund.

    Kriitiline samm

    • FnY-22meeri peptiidi sünteesiks on HOBt kaasamine deblokeerimissegusse, et vältida joonisel 5 näidatud reaktsioonijärjestusest tulenevat aspartimiidi moodustumist. HOBt väljajätmine Fmoc rühma deblokeerimise korral annab peptiide, mis sisaldavad a- või β-piperidiidid. See kõrvalprodukt võib moodustada kuni 80% kogu peptiidist, kui deblokeerimine toimub ilma HOBt 37ta.

    Kriitiline samm

    • Pseudo-proliini dipeptiid, Fmoc-Asp (OtBu) -Ser (ψ Me, Me pro) -OH, on oluline, et vältida FnY-22meri peptiidi agregatsiooni sünteesi ajal. Fn Y-22meri peptiid on eriti altid agregatsioonile, mille tulemuseks on järsult vähenenud deblokeerimise ja sidumise saagis, kui peptiidi pikkus ületab 18 jääki. Pseudo-proliini dipeptiid hoiab ära agregatsiooni, lõhustades sekundaarstruktuure 36 . Lisaks on pseudo-proliini fragment happelabiilne ja annab soovitud S13 ja D14 jäägid pärast peptiidi TFA-vahendatud lõhustamist tahkefaasilisest vaigust ( vt allpool ).

    Paus punkt

    • 19-meerse peptiidi automatiseeritud sünteesi lõpus võib vaiguga seotud Fmoc-kaitsega peptiidi hoida aasta läbi kuivas temperatuuril –80 ° C.

  9. Järgmised kolm jääki võib nüüd käsitsi ühendada. Viige vaiguga seotud peptiid korgiga Econo-pac kolonni. Need kolonnid kaetakse reaktsiooni ajal üla- ja alaosas. Eemaldage Fmoc-rühm vaiguga seotud tärkava peptiidi N-terminaalsest otsast, raputades seda Econo-pac kolonnis keeristisse deblokeerimise seguga, mis koosneb 20% (maht / maht) piperidiinist ja 0, 1 M HOBt-st DMF-is. 10–12 min. Lahtivõetava segu tühjendamiseks eemaldage alumine ja ülemine kate. Lisage värske deblokeerimissegu ja keetke veel 10–12 minutit. Tühjendage deblokeerimislahendus nagu varem. Kasutage vaigu grammi kohta 15 ml eemaldavat lahust.

  10. Pärast ummistuse eemaldamist peske vaiku 4–5 korda DMF-iga, lisades 7–8 ml DMF-i vaigu grammi, keeristades umbes 1 min ja tühjendades DMF-i kolonnist, eemaldades ülemised ja alumised korgid. Pärast viimast pesemist puhuge N2 gaas läbi kolonni, et jääk-DMF täielikult eemaldada.

  11. Lisage järgmine jääk (Fmoc-F n Y-OH), segades vaiguga seotud peptiidi vorteksimise teel tund aega vähemalt 6 ekvivalendi N-Fmoc-kaitstud aminohappe, 5, 4 ekvivalendi HATU ja 12 ekvivalendi DIPEA-ga DMF-is. kontsentratsioonid vastavalt 0, 5, 0, 45 ja 1 M. Selle segu valmistamiseks lahustatakse kõigepealt Fmoc-kaitstud aminohape vajalikus koguses DMF-i, seejärel HATU ja DIPEA-ga. Komponentide täielikuks lahustamiseks segatakse vooratut segu 10–15 sekundit; seejärel lisage need vaiguga seotud peptiidi Econo-pac veerus. (Näiteks 1 g vaiguga seotud peptiidile lisatakse 2, 5–3 ml DMF-i segu Fmoc-kaitstud aminohappe, HATU ja DIPEA-ga lõppkontsentratsioonides vastavalt 0, 5, 0, 45 ja 1 M.) Vortex Segage segu toatemperatuuril 1 tund, peske vaiguga seotud peptiid 2–3 korda DMF-iga, nagu etapis 19.

  12. Korrake samme 18–20 järjestuse 21. aminohappe jaoks (Fmoc-Ser (OtBu) -OH). Seejärel eemaldage 21. aminohappe Fmoc-kaitsev rühm, nagu on kirjeldatud etappides 18 ja 19.

  13. Lisage N-terminaalne Cys-i jääk selle pentafluorofenooliga aktiveeritud ja buthio-kaitstud kujul. Selle jäägi sidumiseks on vaja keerutada 6 ekvivalendi Fmoc-Cys ( t Buthio) -OPfp ja 6 ekvivalendiga HOBt peptiidi suhtes, lõppkontsentratsioonil 0, 5 M, 1, 5 tundi. Peske vaik 2–3 korda DMF-iga, nagu kirjeldatud etapis 19, ja eemaldage Fmoc-kaitserühm blokeerimisel, nagu on kirjeldatud etappides 18 ja 19.

    Kriitiline samm

    • Cys jääkidel on kalduvus ratseemuda, kui neid seostatakse DIPEA 38 abil . Cys ratseemiseerimise vältimiseks seotakse N-terminaalne Cys jääk aktiveeritud OPfp estrina, vältides aluse vajadust.

  14. Enne peptiidi vaigust eraldamist peske vaiguga seotud peptiidi 2–3 korda CH2CI2- ga, nagu on kirjeldatud etapis 19 DMF-i pesemiseks. Seejärel sulgege Econo-Paci veerg ülaosas, kuid mitte allosas, ja ühendage kolonni põhi vaakumisvoolikuga. Vaigu täielikuks kuivamiseks tõmmake vaakumit 5–10 minutit.

  15. Puhastage peptiid vaigust, raputades vaiku 4 tunni jooksul lahusega, mis sisaldab 95% TFA, 2, 5% TIS ja 2, 5% vett. Kasutage vaigu grammi kohta 25 ml lõhustamislahust.

  16. 4 tunni pärast sisaldab TFA lahus vaba peptiidi. Nõrutage see lahus 50 ml Falconi torusse ja peske vaiku 2–3 korda väikese koguse TFA-ga. Kombineerige TFA pesud lõhestuslahusega.

  17. Kontsentreerige peptiid, puhutades lahusest N2 (g) läbi kuni sadestumiseni. Seejärel lisage 8–10 osa jahutatud dietüüleetrit ja inkubeerige segu temperatuuril 4 ° C umbes 45 minutit.

  18. Peptiid kogutakse tsentrifuugimisega (∼ 5000 g , 10–15 min, 4 ° C) ja supernatant visatakse ära. Pese peptiidi üks kord külma dietüüleetriga, lisades samas mahus külma dietüüleetrit nagu etapis 26, inkubeerides umbes 5 minutit temperatuuril 4 ° C ja eemaldades eetri pärast tsentrifuugimist. Eemaldage järelejäänud eeter vaakumis või asetage Falconi toru kapuutsiga ümbritsemata toatemperatuurile üleöö.

    Paus punkt

    • Selles vormis võib peptiidi säilitada temperatuuril –80 ° C aasta.

  19. Lahustage peptiid 0, 1 M NH4HCO3-s (pH 8, 0) kontsentratsioonini ≥0, 3 mM.

    Kriitiline samm

    • Fn Y-22-meeriumis sisalduva suure hulga karboksülaatide tõttu (kokku kuus) lahustub see ainult kergelt aluselistes tingimustes. See on ebatavaline, kuna enamik peptiide on happes kergesti lahustuvad.

  20. Puhastusi poolreparatiivsel skaalal võib teha Waters XTerra kolonnil. Sellesse kolonni saab süsti kohta lisada kuni 2 μmol peptiidi (5 ml süstimissilmust). Elueerige peptiid 0, 1 M NH4HCO3- ga (pH 8, 0) lineaarse gradiendiga 10–20% MeCN 5 minuti jooksul, millele järgneb lineaarne gradient 20–35% MeCN 23 minuti jooksul. Jälgida peptiidi elueerimist spetsiifilise F n Y neeldumise järgi lainepikkusel 215 nm ja λ max (tabel 1). Koguge peptiidi sisaldavad fraktsioonid, eemaldage MeCN vaakumis rotaatoraurustis (veevanni temperatuur seatud 25 ° C-ni) ja lüofiliseerige järelejäänud peptiidilahus kuivaks.

  21. Peptiidi puhtust hinnati analüütilise HPLC abil. Jupiter Phenomenex kolonnist peptiidi elueerimiseks kasutatakse lineaarset gradienti 10–75% MeCN 45 minuti jooksul versus 0, 1 M NH4HCO3 (pH 8, 0). Tüüpiline profiil on näidatud joonisel 6.

  22. Hankige iga puhastatud peptiidi jaoks UV-spekter ja MALDI-TOF MS, et tuvastada selle identiteet. Tabelis 1 on kokku võetud C- ja N-otsaga blokeeritud FnY-de neeldumise maksimumid ja ekstinktsioonikoefitsiendid fenooli ja fenolaadi vormides. Kuna peptiidjärjestuses ei ole teisi Trp või Tyr jääke, vastutavad FnY-d neeldumise eest nm 270 nm piirkonnas.

  23. Lõpuks tuleb eemaldada N-terminaalse Cys jäägi t- buthio-kaitserühm. Molekulaarsete disulfiidsidemete moodustumise vältimiseks kahe peptiidi vahel viiakse t- buthio-rühm välja anaeroobsetes tingimustes. Disulfiidide moodustumine on rohkem levinud Cys-jäägi tiolaatvormist, peamiselt esinedes, kuna peptiid lahustub ainult kergelt aluselistes tingimustes. Suspendeerige lüofiliseeritud peptiid 0, 1 M NH4HC03 (vesilahus) (pH 8, 0) lõppkontsentratsioonini 1–7 mM ja lisage 0, 1 ruumala 250 mM Tris-i (pH 8, 0). Näiteks 5 μmol peptiidi kaitse eemaldamiseks suspendeerige see 3 ml 0, 1 M NH4HCO3 lahuses (pH 8, 0) ja lisage 300 μl 250 mM Tris (pH 8, 0). Lahus kantakse pirnikujulisse kolbi ja deoksügeenitakse Schlenki liinil vahelduvate degaseerimise tsüklite abil, vaakumi abil, millele järgneb argooni gaasi lisamine. Täielikuks degaseerimiseks on vaja kuus kuni kaheksa tsüklit. Igas tsüklis degaseeritakse kolb vaakumit tõmmates umbes 2–5 minutit ja seejärel loputatakse argooniga segades umbes 5 minutit.

  24. Lisage tahke DTT peptiidi 15-kordses molaarses liias. Selle lisamise ajal puutub segu lühiajaliselt atmosfääri. Seetõttu degaseerige segu uuesti, nagu kirjeldatud etapis 32. Segage reaktsioonisegu toatemperatuuril 4 tundi.

  25. 4 tunni pärast kantakse reaktsioonisegu dialüüsikotti ja dialüüsitakse anaeroobselt (nagu on kirjeldatud SEADMETE SEADETES) 5 mM kaaliumfosfaadi (pH 6, 0) (1 liiter, 2–3 muutust 4 h mõlemal). Pärast dialüüsi viige peptiidilahus Falconi tuubi, külmutage ja lüofiliseerige kuivaks.

    Paus punkt

    • Puhastatud kuiva peptiidi võib hoida temperatuuril –80 ° C aasta.

Täissuuruses tabel

Image

Aspartimiidid tulenevad amiidi kondenseerumisest lähedalasuva Asp jäägi kõrvalahelaga, mida kaitseb t- butüülrühm. Piperidiini reageerimine aspartimiidiga Fmoc deblokeerimise ajal annab a- ja β-piperidiidiga modifitseeritud peptiidid. Aspartimiidi moodustumist takistatakse deblokeerimisreaktsioonide abil HOBt juuresolekul, nagu varem on teatatud 36 .

Täissuuruses pilt

Image

Peptiid elueeriti lineaarse gradiendiga 10–75% MeCN versus 0, 1 M NH4HCO3 (pH 8, 0).

Täissuuruses pilt

Fn Y-22meeri (de) ligeerimine MESNA-aktiveeritud R2-ga

Ajastus: 3–4 nädalat

  1. Transformeerige pR2-intein-CBD 17 BL21-DE3 koodoni + rakkudesse, kasutades tootja juhiseid.

    Kriitiline samm

    • R2 poolsünteesiks andis Stratagene koodon + pädev rakuliin optimaalse ekspressiooni, puhastamise ja radikaalide sisalduse. Pange tähele, et sõltuvalt inteini päritolust ei pruugi koodon + rakuliinid olla vajalikud. Koodon + rakuliinide vajalikkuse kindlakstegemiseks tuleks inteini päritolu organismi koodoni kasutamist võrrelda E. coli või selle organismiga, kus ekspressioon toimub.

  2. Viige väikesed ja suured kultuurikasvud loksutades (200 p / min) temperatuuril 37 ° C LB-s, mis sisaldab Amp (100 μg ml −1 ) ja Cm (50 μg ml −1 ). Inokuleeritakse 5 ml LB / Amp / Cm kultuur (12 ml bakterikultuuri katseklaasis) ühe kolooniaga, mis saadakse etapis 35 saadud muundamise teel.

    Paus punkt

    • Rakke kasvatage üleöö (~ 12 h) küllastumiseni.

  3. Lahjendage 0, 5 ml küllastunud väikest kultuuri LB / Amp / Cm 100 ml söötme 500 ml Erlenmeyeri kolvis.

    Paus punkt

    • Kasvatage seda söödet küllastumiseni üleöö (umbes 12 tundi).

  4. Lõpuks inokuleeritakse 10-liitrine LB / Amp / Cm kultuur (5x2-liitrised kultuurid 6-liitristes Erlenmeyeri kolbides) 50 ml küllastunud söötmega ja jätkatakse kasvu temperatuuril 37 ° C.

  5. Kui OD 600 nm jõuab väärtuseni 0, 7–0, 8 (umbes 4 tundi pärast inokuleerimist), alandage temperatuuri 23 ° C-ni. 15 minuti pärast lisage IPTG lõppkontsentratsioonini 0, 5 mM ja jätkake inkubeerimist temperatuuril 23 ° C veel 5–6 tundi. Sel ajal kogutakse rakud tsentrifuugimisega (10 000 g , 15 minutit, 4 ° C); tavaliselt saadakse saagis 5 g niisket rakupastat ühe liitri kultuuri kohta.

    Kriitiline samm

    • R2-intein-CBD kimäär on 37 ° C juures lahustumatu; seetõttu tuleb ekspressioon läbi viia temperatuuril 23 ° C. Samuti on tioestri aheldatud ekspresseeritud kärbitud R2-s ebastabiilne isegi temperatuuril -80 ° C. Seetõttu tuleb optimaalse ligeerimise saagise saamiseks kärbitud R2 konstrukti puhastada mõne päeva jooksul pärast kasvu.

  6. Resuspendeerige iga grammi rakupastat 5 ml lüüsipuhvris, millele on lisatud 1 mM PMSF ja 25 U DNaasi I. Lüseerige rakud Prantsuse rõhu lahtris rõhul 14 000 psi ühe läbimisega. Piimatoodete kogumiseks R2-s piisava raua tagamiseks lahustatakse Fe II (NH4) 2 (SO 4 ) 2 ja naatriumaskorbaat (5 mg raku pasta grammi kohta) umbes 10 ml lüüsipuhvris ja lisage see lahus tilkhaaval 10 minutit toatekstraktini temperatuuril 4 ° C segades. Seejärel segage segu veel 15 minutit. Lõpuks eemaldage rakujäägid tsentrifuugimisega temperatuuril 4 ° C (15 000 g , 35 minutit).

  7. Supernatant kogutakse ja laaditakse eelnevalt tasakaalustatud kitiinikolonni (vt SEADMETE SEADISTAMINE) voolukiirusel ∼ 1–3 ml min –1 . Rakupasta grammi kohta on vaja kokku 5 ml kitiinvaiku.

  8. Peske vaik 30–40 CV lüüsipuhvriga, mis sisaldab 0, 2 mM PMSF, millele järgneb 2 CV lõhustamispuhvrit. Seejärel laadige kolonn 1, 5 CV lõhustamispuhvriga, mis sisaldab 100 mM MESNA.

    Paus punkt

    • Inkubeerige temperatuuril 4 ° C 30 tundi.

    Kriitiline samm

    • Lõhustumise efektiivsus sõltub otseselt MESNA kontsentratsioonist ja inkubatsiooni ajast. Leiame, et inkubeerimine 100 mM MESNA-ga 30 tundi annab optimaalse lõhustumise (5 mg MESNA-ga aktiveeritud R2 grammi rakupasta kohta), kuid annab Y 122 • radikaalide sisalduseks ainult ∼ 0, 3 R2 kohta. See on vastuolus rekombinantse tehnoloogia abil genereeritud 1, 2 Y 122 • s R2 kohta. Inkubatsioon madala MESNA kontsentratsiooniga ja lühemate inkubatsiooniperioodidega, vastavalt 50 mM ja 20 h, annab omakorda madala lõhustumisefektiivsuse (3 mg MESNA-ga aktiveeritud R2 rakupasta grammi kohta), kuid suurema radikaalide sisalduse (∼ 0, 45 R2 kohta) .

  9. 30 tunni pärast elueerige MESNA-ga aktiveeritud R2 kitiinikolonnist lõhestamispuhvriga. Valgu kogust jälgitakse Bradfordi reagendi testi abil (vt tootja juhiseid). Jätkake elueerimist, kuni enam valku ei tuvastata.

    Kriitiline samm

    • Kolonnist elueerunud MESNA-ga aktiveeritud R2 kogus sõltub MESNA kontsentratsioonist ja ülalpool kirjeldatud inkubatsiooniperioodist. See sõltub ka MESNA tioestrit sisaldava kärbitud R2 C-terminaalsest jäägist (jääk 353, mis on metsik-tüüpi R2 valiin, kuid glütsiin kõigis meie R2-intein-CBD konstruktsioonides). Selles asendis olevad mahukad külgahelad takistavad steeriliselt väikese molekuliga tiooli juurdepääsu tioestrile. Oleme määranud lõhustumisefektiivsuseks 50%, 15% ja 10%, kui jääk 353 on vastavalt Gly, Ala ja Val. Kuna biofüüsikalisteks katseteks, mida soovisime läbi viia, vajasime 100 mg koguseid poolsünteetilist R2, viidi kõik R2 poolsünteesid Gly-ga läbi jäägi 353. Lõhestamise efektiivsus sõltub ka väikese molekuliga tioolist. Ideaalis on tiool hea nukleofiil optimaalseks lõhestamiseks ja hea lahkuv rühm optimaalseks ligeerimiseks ( vide infra ). Leidsime, et MESNA annab parima kombineeritud lõhustamise ja ligeerimise efektiivsuse. Ehkki DTT andis kõrgeima lõhustamise efektiivsuse, olid ligeerimise saagised halvad. Teised testitud tioolid olid βME, etataanool, tiofenool ja bensüülmerkaptaan. Ehkki eeldatakse, et tiofenool ei ole hea lõhustamisreaktiiv, on selle kasutamist sel eesmärgil kasutatud 39 .

  10. Pärast elueerimist kontsentreerige MESNA-ga aktiveeritud R2 kontsentratsioonini 20–25 mg ml – 1, kasutades YIC-30 membraaniga Amiconi kontsentreerimisseadet. Seejärel eemaldage MESNA-aktiveeritud R2-st MESNA liig, kasutades Sephadex G-25 kromatograafiat lõhestamispuhvris. Kuna selle magestamisetapi tulemuseks on valkude lahjendamine, kontsentreerige MESNA-ga aktiveeritud R2 uuesti kontsentratsioonini YM-30 Centriprep kontsentratsiooniga 20–25 mg ml –1 .

  11. Degaseerige valk Schlenki liinil kümne vaakumgaaside eraldamise tsükliga 5–10 s, millele järgneb segamine argooniga 1 minut. Viige valguproov ligeerimisetapi jaoks kindakasti. Viige lüofiliseeritud peptiid ka kindalaekasse.

  12. Seadistage ligeerimisreaktsioon, lisades degaseeritud, kärbitud, MESNA-ga aktiveeritud R2-le peptiidi lõppkontsentratsioonini 2 mM. Seejärel lisage 0, 1 mahuosa 1, 5 M HEPES ja 0, 4 mM EDTA (pH 7, 9). Tavaliselt sisaldab ligeerimisreaktsioon lõppmahus 3 ml 20 mg ml –1 MESNA-ga aktiveeritud R2 (0, 7 µmol) ja 2 mM peptiidi (6 µmol).

    Paus punkt

    • Inkubeerige reaktsioonisegu kindalaekas temperatuuril 4 ° C 36 tundi.

    Kriitiline samm

    • Pange tähele, et segamist ei soovitata, kuna see põhjustab nendes tingimustes valgu sadestumist. Selle asemel loksutage kolbi inkubatsiooniperioodi vältel õrnalt 3–4 korda.

    Kriitiline samm

    • Nagu on kirjeldatud etapis 43, on valitud väikese molekuliga tiool selline, mis annab kõrge lõhustamise ja ligeerimise efektiivsuse. Varem teatasid Kent ja kaastöötajad 40 väikese molekuliga tioolkatalüsaatorite kasutamisest ligeerimisreaktsioonis. Testisime tiofenooli ja p- nitrotiofenooli võimet selles mahus toimida, kasutades kärbitud, MESNA-ga aktiveeritud R2. Ligeerimise saagise paranemist ei täheldatud.

  13. Jagage ml 3 ml ligeerimissegu 1 ml alikvootideks 1, 5 ml Eppendorfi tuubides, kiirkülmutage vedelas N2 ja hoidke temperatuuril –80 ° C.

    Paus punkt

    • Ligeerimissegu on stabiilne temperatuuril –80 ° C aasta läbi.

  14. Ligeerimisel kasutatud reageerimata peptiid moodustab ligeeritud peptiidiga sageli molekulidevahelise disulfiidsilla, mis tekitab täispika R2 (vt viide 17) Selle disulfiidsideme vähendamiseks sulatage ligeerimissegu alikvoot ja lisage DTT lõppkontsentratsioonini. 5 mM. Inkubeerige reaktsioonisegu 20 minutit temperatuuril 4 ° C. Seejärel eemaldage tsentriprepiini valgukontsentraatoris kontsentratsiooni-lahjendustsüklite abil peptiidi liig R2-st.

    Kriitiline samm

    • Juhuslikult seotud peptiidi eemaldamine on R2-ga tehtavate katsete jaoks kriitilise tähtsusega, kuna C-terminaalne peptiid pakub peamisi sidumissaite R1-ga interaktsiooniks. Pange tähele, et sõltuvalt peptiidijärjestusest ei pruugi seda eemaldada kontsentratsiooni-lahjendustsüklitega läbi membraani - seda võimalust tuleb huvipakkuva peptiidi osas uurida (nt SDS-PAGE mitte redutseeriva abil). Kui eemaldamist ei toimu kontsentreerimise ja lahjendamise tsüklite abil, võib peptiidi eemaldamiseks kasutada redutseerivates tingimustes Sephadex G-25 kromatograafiat. Lisaks sellele teostatakse järgnev puhastamine MonoQ kolonnis (etapp 49) redutseerivates tingimustes, et tagada juhuslikult seotud peptiidi täielik eemaldamine.

  15. Süstige 10–20 mg ligeerimisreaktsiooni MonoQ anioonide vahetuskolonni (2 ml süstimissilmus). Elueerige R2 lineaarse NaCl gradiendiga - tüüpiline elueerimisprofiil on näidatud joonisel 7. R2 C-terminaalse 22 aminohappega seotud negatiivse laengu tõttu saab heterodimeeri eraldada kahest homodimeerist. Soovitud fraktsioonid (mis vastavad joonisel 7 toodud piikidele 2 ja 3) kogutakse, kontsentreeritakse temperatuurini ∼ 150 μM ja hoitakse temperatuuril -80 ° C. Tavaliselt andis 10 g märg rakupasta 50 mg kärbitud MESNA-ga aktiveeritud R2, mis pärast ligeerimist andis 15–20 mg täispikka R2.

    Paus punkt

    • F n Y-R2 võib mitu aastat ohutult hoida temperatuuril –80 ° C.

  16. Iseloomustage poolsünteesitud R2-sid SDS-PAGE ja ESI-MS abil positiivse režiimi korral otsese infusiooni teel (mitte LC-MS kaudu). MS andmete abil saab kindlaks teha, et huvipakkuvat FnY sisaldav peptiid sisaldab 22 aminohapet.

    Veaotsing

Image

Mittetäielik ligeerimine nõuab kolme produkti eraldamist: kärbitud homodimeer 1, heterodimeerne valk 2, mis koosneb kärbitud protomeerist ja täispikkast protomeerist ning täispikk homodimeer 3, mis koosneb kahest täispikast protomeerist. See eraldamine viiakse läbi MonoQ anioonvahetuskolonni abil, elueerides lineaarse gradiendiga 0, 2–0, 44 M NaCl 37 minuti jooksul (viide 17, 18).

Täissuuruses pilt

Veaotsing

Tõrkeotsingu nõuanded leiate tabelist 3.

Täissuuruses tabel

Ajastus

Üksiku FnY R2-sse sisestamise aeg on näidatud allpool. Pange tähele, et F4Y süntees nõuab 4 nädalat.

Reagent and equipment setup (including expression and purification of TPL): 1 month

Synthesis and purification of an FnY (other than F4Y) in Figure 2: 1 week

Synthesis and purification of Fmoc-FnY and FnY-22mer: 3 weeks

Semisynthesis and purification of FnY-R2: 3–4 weeks

Oodatud tulemused

A typical 1 liter enzymatic synthesis of 3, 5-F 2 Y yields 1.7 g of the desired product (80% yield). Addition of the Fmoc-protecting group by the described procedure yields Fmoc-3, 5-F 2 Y-OH in good yield (85%). The 3, 5-F 2 Y-22mer is synthesized by a combination of automatic and manual SPPS. After purification and deprotection of the t Buthio-protecting group of the N-terminal Cys, 4.5 μmol of 3, 5-F 2 Y-22mer is obtained from a theoretical yield of 6 μmol (75% yield). Ligation of 4.5 μmol of peptide to 45 mg (0.52 μmol) of MESNA-activated, truncated R2 and subsequent purification yields 20 mg (0.23 μmol) of full-length homodimeric 3, 5-F 2 Y-R2. SDS-PAGE and ESI-MS analyses confirm incorporation of 3, 5-F 2 Y.

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.