Ühemolekulaarsed uuringud näitavad kolmanda polümeraasi funktsiooni replisoomis looduse struktuurne ja molekulaarbioloogia

Ühemolekulaarsed uuringud näitavad kolmanda polümeraasi funktsiooni replisoomis looduse struktuurne ja molekulaarbioloogia

Anonim

Õppeained

  • Bakterid
  • Vabastav
  • Struktuuribioloogia

Abstraktne

Escherichia coli replisoom sisaldab kolme polümeraasi, ühte rohkem kui on vaja kahe lähteahela paljundamiseks. Kasutades ühemolekulilisi uuringuid, paljastame kolmanda polümeraasi kaks eelist. Esiteks on dipolümeraasi replisoomid mahajäänud ahelate sünteesimisel ebaefektiivsed, jättes üheahelalised lüngad, samas kui tripolümeraasi replisoomid täidavad ahelaid peaaegu lõpuni. Teiseks on tripolümeraasi replisoomid palju protsessiootilisemad kui dipolümeraasi replisoomid. Need omadused põhjustavad bakterite replisoomide ootamatu kolme polümeraasi struktuuri.

Peamine

40 aasta jooksul on eeldatud, et replisoomid sisaldavad kahte DNA polümeraasi, üks iga ahela kohta replikatsioonikahvlis 1, 2 . Kuid hiljuti on näidatud, et E. coli replikaas Pol III * sisaldab kolme Pol III südamikku 3 . Lisaks sellele on slimfield-mikroskoopia abil hiljuti toetatud tripolüraasi (TriPol) replisoomi in vivo , mis näitas, et E. coli replikatsioonikahvlid sisaldavad kolme Pol III südamikku, mitte kahte 4 .

Bakterite replisoomi kolme polümeraasi struktuuri ette nägemata jätmine on tingitud kahe valgu, τ ja γ kodeeriva E. coli dnaX geeni iseärasustest. Valk τ on täispikk saadus ja y on kärbitud translatiivse kaadrivahetusega 5 . C-otsa C-terminaalsed järjestused seovad Pol III tuuma (ja DnaB helikaasi), kuid kärbitud y ei seo kumbagi valku. E. coli klambrilaadur sisaldab DnaX valgu kolme koopiat ja seega eeldati, et see sisaldab kahte τ ja ühte γ, et saada 'klassikaline' dipolümeraasi replisoom, mis selgitab ka seda, miks E. coli tekitab y (st seondumise vältimiseks) tarbetu kolmanda Pol III tuuma). Kõigi alaühikute üheaegne segamine annab aga Pol III * kolme τ ja kolme Pol III südamikuga, jättes välja y 3 . Lisaks näitab dnaX mutatsioon, et γ pole E. coli elujõulisuse jaoks vajalik, samas kui τ on hädavajalik 6 . Eeldame, et E. coli toodab y-d, moodustades ainult y-tüüpi klambrilaaduri, mis koondab β-klambrid DNA-le kasutamiseks teiste ensüümide kõrval peale Pol III.

Miks peaks replisoom sisaldama kolme polümeraasi, kui replitseeruda on ainult kaks DNA ahelat? Selle küsimuse lahendamiseks kasutasime ühe või molekulisise sisemise peegelduse fluorestsentsmikroskoopiat, et jälgida kas kahte või kolme polümeraasi sisaldavate E. coli replisoomide käitumist (DiPol III * saab kokku panna, sundides ühte γ vahetama ühe τ-ga). Panime kokku DnaB helikaasi, DiPol III * või TriPol III * ja β-klambri 5'-biotinüleeritud 100-meerisel rull-DNA-l, et moodustada TriPoli ja DiPoli replisoomid (vt joonis 1a ja täiendavad meetodid) 7 . Seejärel kinnitasime replisoomi-DNA kompleksi voorakus oleva lipiidse kaksikkihi külge. Seondumata valgud pesti ära ja hüdrodünaamiline vool võimaldas replisoomi-DNA kompleksidel migreeruda kaksikkihis ja akumuleeruda mööda difusioonibarjääri 7, 8 . Replikatsiooni käivitas puhver, mis sisaldas dNTP-sid ja NTP-sid.

Image

a ) Üksimolekulaarsete katsete skeem. Selguse huvides on illustreeritud ainult DiPoli replisoomi. ( b ) DNA produktid, mis pärinevad kas DiPol (vasakul) või TriPol (paremal) replisoomist, kasutades 250 nM primaasi. Kahe tüüpilise DNA produkti lõpp-punktid on tähistatud nooleotstega. c ) DNA pikkuse jaotuse histogrammid. Numbrid tähistavad analüüsitud molekulide koguarvu ( N ) ühekordse eksponentsiaalse sobivuse täpsust ± pool. Hallid tulbad tähistavad DNA ahela pikkusi alla 15 kb, millest ei võetud valimit, kuna neid varjas difusioonibarjääri laius. Vasakul, DiPoli replisoomid, paremal, TriPol replisoomid. ( d ) DiPoli ja TriPoli replisoomide protsessitavus, kui näidatud polümeraas on olemas või puudub puhvervoos.

Täissuuruses pilt

Valtsringi replikatsioonis saab vast moodustatud juhtiv ahel mahajääva ahela sünteesi malliks, moodustades duplekssaba, mis koosneb värskelt sünteesitud juhtivatest ja mahajäänud ahelatest. Meie uuringus kinnitati duplekssaba difusioonitõkke kohal ja replikatsioon andis kasvava DNA kardina, mida visualiseeriti reaalajas kasutades fluorestsents-interkalaatorit YO-PRO-1 (joonis 1b ja täiendavad videod 1 ja 2 ). Primaas, β ja SSB sisalduvad puhvris, kuna neid on mahajäänud ahela sünteesi ajal 9 korduvalt vaja. Puhvervoolust jätsime välja Pol III * ja DnaB helikaasi, nii et kui üks neist valkudest eralduks immobiliseeritud DNA-st, eemaldataks need vooluga ja selle konkreetse DNA molekuli kasv lõppeks.

DiPoli ja TriPoli replisoomide DNA produktide võrdlusel selgus, et TriPoli replisoom sünteesib palju pikemaid DNA tooteid kui DiPoli replisoom (joonis 1b). Ligikaudu 2000 DNA molekuli kvantitatsioon igas reaktsioonis näitas, et TriPoli replisoomide saadused on peaaegu kaks korda pikemad kui DiPoli replisoomide produktid (vastavalt 84, 9 ± 6, 8 kilobaasi (kb) versus 48, 5 ± 2, 1 kb, joonis 1c). Me järeldame, et kolmanda polümeraasi olemasolu suurendab märkimisväärselt replisoomi protsessioossust.

Vaatasime, kas TriPol-i replisomeerse protsessitiivsuse suurenemine võrreldes DiPoli-i töödeldavusega on tingitud TriPoli kolmest τ-alaühikust (võrreldes kahe τ-alaühikuga DiPol-is), mis seovad DnaB helikaasi 10 ja võivad seega stabiliseerida Pol III * ja / või DnaB helikaasi kahvel. Selle kindlaksmääramiseks kordasime katseid, kuid lisasime puhvervoolu kas TriPol III * või DiPol III *. Kui puhvervoos on Pol III *, peaks replikatsiooni lõpetama ainult DnaB dissotsiatsioon, kuna dissotsieerunud Pol III * võib lahusest asendada teise Pol III * -ga. Seega, kui DnaB stabiliseerub TriPol III * abil, tuleks jälgida pikemaid tooteid kui DiPol III * korral. Tegelikult andis TriPol III * või DiPol III * lisamine puhvervoogudesse pikemaid DNA tooteid, kuid TriPoli replisoomi produktid olid siiski palju pikemad kui DiPol produktid, mis näitab, et TriPol III * stabiliseerib DnaB rohkem kui see stabiliseerib DiPol III * (joonis fig. . 1d). Arvestades, et kolmas polümeraas tõstab kahvelil Pol III südamiku efektiivset kontsentratsiooni, võib TriPil'i suurenenud protsessitavusel DiPoli suhtes olla abiks varupolümeraasiga, mis asendab dissotsieerunud polümeraasi (juhtival või mahajäänud ahelal) ja jätkab kahvli progresseerumist.

Pikemad DNA-tooted võivad tekkida ka siis, kui TriPoli replisoom liigub kiiremini kui DiPoli replisoom. Kahvli kulgemise määra määramiseks töötasime välja helmestel põhineva testi, kasutades minirullimisringi, mis sisaldab mõlemal ahelal ainult kolme dNMP-d, võimaldades meil konkreetselt jälgida juhtiva ahela kasvu ja määrata replisoomi kiirus. Panime kas DiPoli või TriPoli replisoomid 5 'biotinüleeritud minirulliku ringi DNA-sse, kinnitasime DNA streptavidiini magnetiliste helmestega ja pesime seejärel helmed, et eemaldada seondumata valgud enne replikatsiooni alustamist (vt skeemi joonisel 2a). Meie tooteanalüüs näitas, et DiPoli ja TriPoli replisoomid edenesid samal kiirusel (joonis 2b). Seega tulenevad TriPoli replisoomide poolt valmistatud pikemad DNA molekulid TriPoli suuremast protsessitavusest DiPoli replisoomide suhtes, mitte kahvli kõrgemast progresseerumise kiirusest. Aruande koostamise ajal täheldati teises uuringus tulenevalt teisest uuringust DiPoli ja TriPoli replisoomide erinevusi toote pikkuses 11 .

Image

a ) helmestel põhineva testi skeem; DiPoli replisoomi on illustreeritud lihtsuse huvides. ( b ) Dipooli ja Tripoli replisoomid replitseerivad DNA-d sarnaste kiirustega. Vasakul, reaktsioonide 0, 8% aluselise agaroosgeeli analüüsi autoradiogramm, kasutades kas Tripol III * (20 nM) või DiPol III * (80 nM); DnaG primaasi kontsentratsioon oli 200 nM. Paremal, DNA pikkuse ja aja graafik. ( c ) helmepõhistes reaktsioonides saadud vasaku, juhtiva ja mahajäänud ahela replikatsioonisaadused, mis eraldati denatureerivas agaroosgeelis, kasutades 320 nM DnaG primaasi. Õige, juhtiva ja mahajäänud ahela sünteesi kvantitatiivsus, normaliseeritud vastavalt TriPol-i replisoomi produktidele.

Täissuuruses pilt

Meie töö näitab, et helmestel põhinevad testid nõuavad neli korda rohkem DiPol III * kui Tripol III *, kuna täheldasime pidevalt vähem üldist DNA sünteesi, kasutades DiPol versus TriPol replisomeid (täiendav joonis 1). Tõenäoliselt on selle põhjuseks DiPol III * madalam stabiilsus replikatsioonikahvis, mille tagajärjel eraldub DNA ulatuslike pesemisetappide ajal. DiPol III * madalam stabiilsus on kooskõlas DiPoli madalama protsessitiivsusega, võrreldes TriPoli replisoomidega (vt joonis 1).

Järgnevalt uurisime kahte replisoomi erinevuste osas mahajäänud ahela sünteesis. Nendes katsetes lisasime pärast pesemisetappe DNA lõksu, et veenduda, et ükski dissotsieerunud polümeraas ei seo valtsringi substraati. Üllatusime, et erinevused DNA sünteesis DiPoli ja TriPoli replisoomi vahel olid mahajäänud ahelal isegi suuremad kui juhtival ahelal (joonis 2c). See tulemus eeldab, et DiPoli replisoomid jätavad üheahelalise DNA (ssDNA) lüngad mahajäänud ahelasse. DiPoli replisoom ei pruugi Okazaki fragmentide pikendamist lõpule viia või võib see puududa praimeri kasutamises. Hüpoteesi kontrollimiseks, et DiPoli replisoomid jätavad mahajäänud ahelale lünki, uurisime mikroskoobi all tähelepanelikult DNA tooteid. Interkalaator YO-PRO-1 seob ainult kaheahelalist DNA-d (dsDNA), nii et ssDNA lüngad ilmuvad dsDNA fluorestsentssegmentide vahel tumedate piirkondadena. Meie katselise seadistuse pikslite eraldusvõime vastas umbes 600 aluspaari. Seetõttu ei peegelduks vähem kui 600 aluspaari pikkuseid ssDNA-lünki tumedate pikslitena, mis nõuavad nende pikslite intensiivsuse analüüsimiseks kaudseid meetodeid. Sellegipoolest täheldasime mõnda ssDNA lünka, mis olid piisavalt suured, et ületada ühte või mitut pikslit (joonis 3a). Need otseselt täheldatud ssDNA lüngad olid DiPoli replisoomi kasutamisel viis korda levinumad kui TriPoli replisoomi kasutamisel (täiendavad joonised 2 ja 3). Kuna need lüngad olid TriPoli replisoomi kasutamisel väikesed ja harvad, muutisime tingimusi, eelistades pikemaid Okazaki fragmente ja seega sagedamini esinevaid lünki, võimaldades teha täpsemaid mõõtmisi DiPoli ja TriPoli replisoomide võrdlemiseks.

Image

a ) DiPoli ja TriPoli replisoomide käigus toodetud DNA-toodete suurendusvaade; heledad ja tumedad piirkonnad vastavad dsDNA segmentidele ja ssDNA lünkadele. b ) Võrdlev histogramm, mis näitab lünkade (roheline) ja tühikuteta (lilla) DNA ahelate protsenti protsentides. c ) Histogrammid, mis näitavad lõhe pikkuse jaotust (μm) DiPoli (punane) ja TriPoli (sinine) replisoomide abil. ( d ) TriPoli ja DiPoli replisomeeriva tegevuse mudel. Pol III südamikud on esindatud parempoolsete kätena; koos β-klambriga (punane), klambrilaaduriga (tumeroheline), DnaB helikaasiga (sinine heksameer), primaasiga (heleroheline) ja SSB-ga (lilla). Τ-subühiku C-terminaalseid domeene (IV ja V) illustreeritakse liigendatud joontena, mis vahendavad ühendusi DnaB helikaasi ja Pol III südamikega. Klammerlaaduri χψψ alaühikud on selguse huvides ära jäetud. TriPoli replisoom kujutab kahte Pol III südamikku, mis pikendavad korraga kahte Okazaki fragmenti, ehkki TriPoli replisoomi saab kasutada ka muul viisil (vt tekst). Vasakpoolne illustratsioon kujutab ühte mahajäänud Pol III, mis pikendab RNA praimerit (punane), et saada DNA ahel (kollane), ja teine ​​mahajäänud Pol III tuum pikendab DNA (sinist), et täita ssDNA tühimik.

Täissuuruses pilt

Siiani kirjeldatud katsed viidi läbi kasutades 250 nM primaasi, mis genereerib 1–2 kb Okazaki fragmente, samas kui primaasi kontsentratsiooni langetamine 4 nM-ni annab> 20 kb kb Okazaki fragmente 9 . DNA-produktide uurimisel 3 nM primaasi abil ilmnesid arvukad ssDNA-lüngad, mis tekkisid DiPoli replisoomis (59, 2% DNA molekulidest), võrreldes TriPoli replisoomiga (ainult 7, 2% molekulidest) (joonised 3a, b ja täiendavad videod 1 ja 2) . Samuti analüüsisime lõhe suuruse jaotust (joonis 3c). See näitas veelgi selgemat erinevust DiPoli ja TriPoli replisoomide vahel. Analüüsitud 640 DNA ahelast (joonis 3b) jätsid DiPoli replisoomid 731 tühimikku, samas kui TriPoli replisoomid jätsid vaid 78 tühikut. Lisaks ei olnud TriPol III * parandatud materjalis pikki lünki. SsDNA lünkade nukleotiidide suurust on keeruline kindlaks teha, kuna ssDNA on seotud SSB-ga ja selle kontuuri pikkus on valesti määratletud ja erineb dsDNA-st ja ssDNA-st. Seetõttu esitame pilu pikkuse mikronites (joonis 3c).

SsDNA-lünkade pikkuse ja arvu märkimisväärne vähenemine näitab, et TriPol-replisoom koos lisapolümeraasiga viib tõhusama mahajäänud ahelaga sünteesi kui DiPol-i replisoom. Võib küsida, kas primaas on TriPol-i replisoomi korral aktiivsem. Sel juhul võivad praimitud saidid olla DiPoli replisoomide jaoks kaugemal üksteisest ja tekitada seega pikemaid Okazaki fragmente ja / või ssDNA lünki. Meie varasemas uuringus märgiti DiPoli versiooni TriPoli replisoomide poolt toodetud Okazaki fragmentide pisut pikemaid osi, mis viitab sellele, et primaas on TriPoli replisoomi 3 korral mõnevõrra aktiivsem. Kuid erinevus on liiga väike, et seletada selles aruandes täheldatud DiPoli ja TriPoli replisoomide suurt erinevust ssDNA lõhedes.

Et tagada, et meie vaadeldud lüngad olid tõepoolest ssDNA, viisime läbi mitu kontrollkatset. Ühes kontrollkatses peatasime puhvervoo, mille tulemuseks on DNA taaskeerumine, siis taaskäivitasime voolu, et DNA uuesti venitada (Supplementary Video 3). Mõlemad dsDNA piirkonnad (fluorestsents) ja vahed (mittefluorestsentsid) taaskeerusid ja pikendasid uuesti koos, toetades arusaama, et vahed ja dsDNA asuvad ühel pideval DNA molekulil. Teiseks kasutasime YO-PRO-1 asemel fluorestsents-SSB-d. Kui lüngad olid ssDNA, peaksime jälgima fluorestsentsi SSB, mis on seotud DiPoli replisoomsete toodetega. See oli tõepoolest nii (täiendav video 4). Kuna mõned SSB-d seostuvad lipiidide kaksikkihiga mittespetsiifiliselt, peatasime puhvervoo ja DNA-s olev SSB keris ootuspäraselt tagasi. Lisaks kasutasime puhvervoogudes liigset Pol III *, mis peaks kõik ssDNA lüngad täitma ja eemaldama ning need lüngad tõepoolest kadusid (täiendav joonis 3). Tagamaks, et meie tulemusi ei mõjuta hüdrodünaamilise voolu poolt DNA-le avaldatud 1, 5-pN jõud (100 μL min −1 ), kordasime katseid kahel madalamal voolukiirusel, 30 μL min −1 ja 10 μL min −1., mis vastab vastavalt ~ 0, 4 pN ja ~ 0, 1 pN jõududele. Need madalamad jõud ei muutnud ssDNA lünkade levikut (täiendav joonis 4).

Üks ssDNA lünkade seletusi on Okazaki fragmentide, mida nimetatakse signaali vabastamiseks 11, 12, 13, 14, 15, aeg-ajaline enneaegne lõpetamine. Signaali vabastamise mehhanismi mõjutavad tegurid pole hästi teada. Bakteriofaagide T4 ja T7 replisoomid, mis arvatakse sisaldavat ainult kahte polümeraasi, kasutavad replikatsiooni ajal signaali vabastamise mehhanismi sageli 13, 15 . Võib-olla võimaldab E. coli rakuline replisoom kahel kolmest polümeraasist pikendada mahajäänud ahela fragmente ja vähendada signaali eraldumise sagedust. T4-süsteemi EM-uuring näitas, et umbes 6% DNA molekulidest on kahvliharul kolm polümeraasi 16 . Mõned meie vaadeldud lüngad olid üsna pikad ja nende põhjuseks võib olla RNA praimerite ebaefektiivne kasutamine DiPoli replisoomi poolt kui signaali vabastamine. TriPoli replisoom koos täiendava DNA polümeraasiga võib RNA praimereid tõhusamalt hõivata. Tõepoolest, TriPoli kõik kolm Pol III südamikku võivad olla samaaegselt aktiivsed 3 . In vivo uuring näitas, et ainult kaks polümeraasi funktsioneerivad samal ajal 4, seega pole kõigi kolme polümeraasi samaaegse kasutamise sagedus kindel.

Võib osutuda ebavajalikuks toota replikoomi kolmanda Pol III-ga, et täita DiPoli replisoomi poolt jäetud ssDNA lünki (joonis 3d), arvestades, et need lüngad võiksid kahvlihaaval lihtsalt täita muud polümeraasid, milles E on ohtralt coli , sealhulgas ülitäpse Pol I (400 koopiat raku kohta) 1 . Teisest küljest sisaldavad E. coli bakterid ka madala madala täpsusega Pol II (40 koopiat raku 17 kohta ) ja väga madala täpsusega Y-perekonna Pol IV translesioonpolümeraasi (250 koopiat raku 18 kohta ) kõrge tase. Seega suurendab kolme ülitäpse Pol III südamikku sisaldav TriPoli replisoom selle hõreda ensüümi efektiivset kontsentratsiooni (10–20 molekuli raku kohta). Kokkuvõtlikult osutavad meie tähelepanekud järeldusele, et kahvliharjas asuv kolmas polümeraas võiks olla pigem norm kui erand. Meie arvates on põnev kindlaks teha, kas seda leidu saab üldistada ka eukarüootsetes süsteemides.

Käesolev uuring näitab, et TriPoli replisoomil on DiPoli replisoomi suhtes kaks selget eelist: suurenenud protsessitavus ja suurenenud tõhusus mahajäänud ahelate sünteesil. Töötlevam ja tõhusam replisoom on eriti oluline raku jaoks, mis peab olema võimeline raku kiireks dubleerimiseks, et konkureerida ja ellu jääda intensiivse selektiivse rõhu all teisi organisme ületada, samal ajal replitseerides selle genoomi ühest päritolust.

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav tekst ja arvud

    Täiendavad joonised 1-4 ja täiendavad meetodid

Videod

  1. 1

    Täiendav video 1

    Replikatsioon teostatakse Dipoli replisoomide abil. Näide filmist, mis kujutab mini-veereva ringi substraadi seotud seotud juhitava / mahajäänud ahela replikatsiooni reaalajas vaatlust E. coli Dipoli replisoomide abil. Hüdrodünaamilise voolu jõud surub DNA-lipiidide kompleksi klaaspinnale söövitatud difusioonibarjääriks ja kontsentreerib arvukalt DNA molekule siin näidatud vaatevälja. Nähtava ala laius voolu suunas on 73 μm (vastab 220 kb) ja voolu suund on ülalt alla. Fluorestsentsvärvi Yo-Pro1 abil visualiseeritud üksikuid DNA molekule venitatakse puhvervooluga (100 μl / min) ja need kuvatakse kogu sisemise peegeldusfluorestsentsi (TIRF) mikroskoopia abil. Filmi lõpu poole puhvervool peatatakse, lastes kiududel kerida, seejärel alustatakse uuesti puhvervoolu. Film sisaldab umbes 7 '30 ″ katseandmeid, mis on edastatud kiirusega 20 kaadrit sekundis (algsete andmete saamine on 1 kaadrit sekundis 100 ms särituse korral kaadri kohta).

  2. 2

    Täiendav video 2

    Replikatsioon teostati Tripoli replisoomide abil. Videol on kujutatud Tripoli replisoomide replikatsioonireaktsiooni salvestus. Film sisaldab umbes 5 '30 ″ eksperimentaalseid andmeid, mille kiirus on 20 kaadrit sekundis (algsete andmete kogumine on 1 kaadrit sekundis 100 ms särituse korral iga kaadri kohta).

  3. 3

    Täiendav video 3

    Duplekspiirkondi sisaldavad DNA molekulid sisaldavad lünki samal molekulil. Videol on kujutatud salvestus replikatsioonireaktsiooni lõpus DiPoli replisoomi abil. Puhverlahuse vool peatatakse, seejärel taaskäivitatakse, lastes DNA ahelatel venitada ja seejärel tagasi pöörduda lähtepunkti.

  4. 4

    Täiendav video 4

    Fluorestsents-SSB kasutamine ssDNA tuvastamiseks DNA-toodetes. Videol on kujutatud kolme järjestikust salvestust DiPoli replisoomide erinevatest DNA produktidest, milles reaktsioonid sisaldasid fluorestsentsmärgisega SSB-d. Kolme järjestikust salvestust on lihtne tuvastada, kuna neil on erinevad mõõtmed. Videod näitavad, et DNA-tooted sisaldavad fluorestsentsmärgisega E. coli SSB-d (koos Oregon Green488 maleimiidiga). Dupleks-DNA-d ei visualiseerita, kuna Yo-Pro1 on nende katsete jaoks puhvervoost välja jäetud. Eristamaks DNA-ga seotud SSB-d SSB-st, mis seondub mittespetsiifiliselt vooluraku pinnaga, peatatakse puhvervool ja taaskäivitatakse, et jälgida DNA ahelate taaskeerumist. DNA-ga seotud fluorestsents SSB taastub ja laieneb sünkroonselt puhvri voolu muutustega (samas kui mittespetsiifiliselt seotud SSB ei muuda positsiooni).