Rsv vahendab pseudomonas aeruginosa seostumist tsüstilise fibroosi ja normaalsete epiteelirakkudega | laste uuringud

Rsv vahendab pseudomonas aeruginosa seostumist tsüstilise fibroosi ja normaalsete epiteelirakkudega | laste uuringud

Anonim

Abstraktne

Tsüstilise fibroosiga kopsuhaigusel on tavaliselt ägenemiste ja remissioonide käik, mis viitab sellele, et välised tegurid, näiteks viirusnakkused, võivad seda kulgu mõjutada. Kliinilised andmed näitavad sünergismi respiratoorse süntsütiaalviiruse (RSV) ja Pseudomonas aeruginosa nakkuste vahel tsüstilise fibroosi (CF) kopsuhaiguse korral. Uurisime RSV nakkuse mõju P. aeruginosa nakkumisele IB3-1, HEp-2 ja A549 epiteelirakkude monokihidega in vitro . Epiteelirakkude RSV-nakkus, samuti RSV ja P. aeruginosa samaaegne lisamine nakatamata rakkudele tugevdas tugevalt epiteelirakkude pseudomonaalset kleepumist. Suurenenud kleepumine varieerus varasema RSV-nakkuse korral 1, 2–8, 2-kordselt ja samaaegse lisamise korral 1, 7–16, 1-kordselt. Vaatasime RSV otsest seondumist P. aeruginosa'ga ja RSV blokeerimine hepariiniga kõrvaldas mõju suurenenud kleepumisele. See viitab sellele, et RSV võib toimida sideainena P. aeruginosa ja epiteelirakkude vahel. Kokkuvõtteks võimendab RSV hingamisteede epiteelirakkude P. aeruginosa nakatumist. See soovitab spetsiifiliste viiruse-bakteri koostoimete rolli CF-kopsuhaiguse ägenemises, millel võib olla oluline mõju ennetamisele ja ravile.

Peamine

CF-le on iseloomulik krooniline põletik, bakterite kolonisatsioon ja kopsu korduvad nakkused, mille tulemuseks on kopsufunktsiooni pöördumatu halvenemine ja varajane surm. Pseudomonas aeruginosa on CF-i üks olulisemaid bakteriaalseid patogeene. Hingamisteede krooniline nakatumine P. aeruginosa'ga kiirendab pöördumatut kopsukahjustust (1). Puudulik mukotsiliaarne transport ja antipseudomonaalne kaitse, spetsiifiline seondumine asialoGM-1 retseptoritega ja püsiv põletik mängivad tõenäoliselt CF-patsientide kroonilises pseudomonaalses kolonisatsioonis rolli (2). Lisaks konstitutiivsele põletikulisele seisundile on CF-kopsuhaigusel tavaliselt ägenemiste ja remissioonide kulg. See viitab sellele, et seda kulgu mõjutavad välised tegurid, nt viirusnakkused. Ehkki viirusnakkuste levimus näib olevat CF-patsientide ja tervete kontrollide puhul võrdne (3, 4), on CF-patsientidel tõenäolisem alumiste hingamisteede infektsioon, millel on rohkem ja pikaajalisemaid sümptomeid (3, 5, 6). Nende erinevuste taga olevaid mehhanisme ei selgitata.

Viiruste ja bakterite vahelist sünergismi hingamisteede epiteeli nakkuste esilekutsumisel on kirjeldatud nii in vitro (7–9) kui ka in vivo (10, 11). Kaudsete tõendite kohaselt võib hingamisteede viirusinfektsioonid, eriti RSV, hõlbustada esialgset pseudomonaalset kolonisatsiooni ja püsivat CF-nakkust. Spekuleerime, et hingamisteede viirusnakkuste ja pseudomonaalsete kolonisatsioonide sünergismil on oluline roll CF kopsuhaiguse patogeneesis. Seetõttu uurisime, kas RSV-nakkus soodustab P. aeruginosa nakkumist inimese hingamisteede epiteelirakkudega ja proovisime selgitada mõnda selle aluseks olevat mehhanismi.

MATERJALID JA MEETODID

Rakukultuurid.

Inimese tsüstilise fibroosi IB3-1 bronhirakud (JHU-52), HEp-2 inimese nina-neelu kartsinoomirakud (CCL-23) ja inimese A549 II tüüpi pneumotsüütide kartsinoomi rakud (CCL-185) saadi ameerika tüüpi kultuurikollektsioonist (ATCC)., Manassas, VA). Rakususpensioonide varusid hoiti vedelas lämmastikus temperatuuril –180 ° C. Rakke 24- või 96-augulistel mikrotiiterplaatidel (Costar, Cambridge, MA) kultiveeriti CO 2 inkubaatoris kuni kokkusulamiseni temperatuuril 37 ° C Iscove'i modifitseeritud Dulbecco söötmes (IMDM, Invitrogen, Carlsbad, CA), mis sisaldas 5% FCS-i (Hyclone) Laboratories, Logan, TÜ) ja gentamütsiin, 0, 01 mg / ml (Invitrogen). Rakke kasutati katseteks vahemikus 10 kuni 25 passaaži.

Bakterid ja märgistamine.

Erinevate CF-ga patsientidelt koguti kaks mükoidi (Pa01 ja Pa02) ja kaks mittemucoidset (Pa03 ja Pa04) kliinilist P. aeruginosa tüve. Kaks muud tüve saadi ATCC-st, 39342 (mucoid) ja 15692 (nonmucoid). Baktereid hoiti mikropankades (Pro-Lab Diagnostics, Austin, TX) temperatuuril –70 ° C. Enne testimist kasvatati baktereid vere-agariplaatidel (Trypticase Soja agar 5% lambaverega, BD Biosciences, San Diego, CA) temperatuuril 37 ° C, nakatatud Todd-Hewitti puljongisse (Difco, Detroit, MI), millele oli lisatud 0, 5% pärmiekstrakt ja seda loksutati üleöö temperatuuril 37 ° C.

Bakterid koguti tsentrifuugimisega kiirusel 3270 x g . Graanuleeritud baktereid pesti kolm korda PBS-ga (Cambrex, Verviers, Belgia) ja sadestati tsentrifuugimisega 5 minutit 9300 x g juures. Tsütomeetrilisteks katseteks suspendeeriti bakterid 0, 1 M naatriumkarbonaatpuhvris, pH 9, 0, ja reguleeriti spektrofotomeetril kontsentratsioonini 109 bakteri / ml (OD 660 nm = 1, 0). Bakterid märgistati värskelt küllastunud FITC lahusega (10 mg / ml DMSO; Merck, Darmstadt, Saksamaa) lõppkontsentratsioonini 0, 5 mg / ml ja inkubeeriti 1 tund temperatuuril 4 ° C. FITC-sidumise efektiivsus, mõõdetuna FACS-is, varieerus sõltuvalt bakteritüvest 76 kuni 92% märgistatud bakterite vahel. Pärast kolm korda pesemist PBS-ga suspendeeriti bakterid 2, 5% PBS 2+ / BSA-s (Ca 2+ 0, 15 mM, Mg 2+ 0, 5 mM, rikastatud 2, 5% BSA-ga (Instruchemie, Hilversum, Holland)) lõppkontsentratsioonini 2, 0 x 108 CFU / ml (OD 660 nm = 0, 25) otseseks kasutamiseks või 4, 0 × 108 CFU / ml (OD 660 nm = 0, 5) samaaegseks lisamiseks RSV-ga.

Viirusevarud.

RSV serotüüpi A (ATCC VR 1302) kasvatati HEp-2 ühekihilistel kihtidel, nagu eelnevalt kirjeldatud (15). Alikvoodid, mis sisaldasid 3, 0 × 106 PFU / ml, hoiti temperatuuril –180 ° C vedelas lämmastikus.

Liimimisanalüüs.

Liimimiskatsed viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatule (15). RSV-nakkuse katsete jaoks kasvatati ühekihilised kihid 3–4 päeva jooksul ühinemiseks; katseteks RSV ja P. aeruginosa samaaegse lisamisega, sealhulgas hepariini blokeerimise ja filtreerimisega, kasvatati ühekihilised kihid kahe päeva jooksul ühinemiseks. Sööde eemaldati rakulistest ühekihilistest kihtidest ja lisati 50 ui FITC-märgistatud baktereid. Pärast tsentrifuugimist kiirusel 160 x g (IEC Centra 3C; IEC, Needham Heights, MA) 10 minutit, inkubeeriti plaate toatemperatuuril 30 minutit. Üldfluorestsentsi (TF) mõõdeti fluorestsents-mitme süvendiga plaadilugejaga (CytoFluor II; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) erutusega 485 nm juures ja emissiooniga 530 nm, kolm lugemit süvendi kohta. Seejärel pesti süvendeid neli korda PBS2 + -ga, et eemaldada mittekleepuv P. aeruginosa, ja pärast 50 μL PBS2 + lisamist mõõdeti uuesti kleepuvate bakterite fluorestsentsi määramiseks (adhesiooni fluorestsents = AF). Lõplik kleepumine arvutati järgmiselt: kleepumine = AF / TF x 100 (%).

Monokihtide viirusnakkus.

IB3-1, HEp-2 ja A549 monokihtide RSV-nakkus indutseeriti nagu eelnevalt kirjeldatud (15). Rakke ja seerialahjendusi (log 3, 0–4, 8) 50 μl RSV suspensiooni või IMDM-i kontrollina inkubeeriti 96 süvendiga mikrotiiterplaatidel temperatuuril 37 ° C CO 2 inkubaatoris. Erinevate RSV lahjenduste tsütopatoloogiline toime (CPE) ja järelejäänud ühekihiline protsent määrati valgusmikroskoobiga pärast iga nakkumistesti.

RSV seondumine P. aeruginosa'ga.

Võrdseid koguseid märgistamata baktereid (4, 0 × 108 CFU / ml) ja RSV suspensiooni (vastavalt 3, 0 × 106 PFU / ml ja 5, 0 x 107 PFU / ml) või 0, 5% PBS / BSA-d koos inkubeeriti kontrollina 30 minutit min inkubaatoris temperatuuril 37 ° C. Pärast kaks korda 5-minutist pesemist ja tsentrifuugimist 9300 x g juures lisati 25 μl FITC-märgistatud MAb-d RSV-glükoproteiin F vastu (Imagen Kit for RSV, Glostrop, Taani) ja inkubeeriti 30 minutit temperatuuril 4 ° C, millele järgnes kaks pesemine ja suspensioon PBS-is. FACScan voolutsütomeetris analüüsiti 10 000 bakteri fluorestsentsi, väljendatuna positiivsete bakterite protsendina.

RSV ja P. aeruginosa samaaegne lisamine.

Võrdsetes kogustes FITC-märgistatud baktereid (4, 0 x 108 CFU / ml) ja RSV suspensiooni (3, 0 x 106 PFU / ml) või 0, 5% PBS / BSA-d inkubeeriti kontrollina koos 30 minuti jooksul temperatuuril 37 ° C, et saada keeruline. See segu (50 ui) lisati 2-d konfluentsele ja mitte RSV-ga nakatunud ühekihilisele 96-augulisele mikrotiiterplaadile. Neid inkubeeriti toatemperatuuril 30 minutit pärast tsentrifuugimist kiirusel 160 x g 10 minutit. Liimimist mõõdeti ülalkirjeldatud viisil. Hepariini mõju uurimiseks lisati enne bakterite lisamist ühekihilistele kihtidele 100 IE / ml naatriumhepariini lahust. Hepariiniga töödeldud monokihte inkubeeriti 30 minutit 37 ° C juures CO 2 inkubaatoris. Seejärel eemaldati hepariini lahus, lisati baktereid ja mõõdeti kleepumist ülalkirjeldatud viisil.

RSV suspensiooni filtreerimine ja puhastamine.

Algselt kultiveeritud RSV suspensiooni tsentrifuugiti läbi 100 kD nitrotselluloosifiltri (Microcon 100 kD filter; Millipore Corporation, Bedford, MA) ja RSV virioonideta filtraati kasutati samaaegsete lisamiskatsete korramiseks. Puhastatud RSV valmistati polüetüleenglükooli (PEG) sadestamise teel.

Skaneeriv elektronmikroskoopia.

RSV-ga nakatunud ja nakatamata HEp-2 rakke kasvatati fibrinogeeniga kaetud klaasist katteklaasidel 24-augulistel mikrotiiterplaatidel ühinenud monokihideks. Lisasime nakatunud ja kontroll-ühekihilistele kihtidele 50 μl märgistamata P. aeruginosa (Pa01) = 2, 0 × 108 bakterit / ml (OD 660 nm = 0, 25) või nakatamata ühekihilistele kiududele inkubeeritud P. aeruginosa ja RSV suspensiooni ning inkubeeriti 30 minutit pärast tsentrifuugimist (10 minutit 160x g juures ). Plaate pesti neli korda PBS-ga ja fikseeriti 10 minuti jooksul toatemperatuuril 2% glutaaraldehüüdiga (Merck) 0, 1 M fosfaatpuhvris, pH 7, 4. Monokihid dehüdreeriti järk-järgult 80% etanooliga 10 minutit toatemperatuuril, seejärel 99, 9% etanooliga 10 minutit toatemperatuuril. Seejärel lisati igale proovile 10 minuti jooksul heksametüüldisilasaani, 15 ui (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Šveits). Pärast kuivatamist liimiti proovid süsinikupõhise liimiga (CCC-liim, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA). Proovid titaaniga piserdatud (Sputter Coater 208HR, Cressington Scientific Instruments Ltd., Watford, Suurbritannia) ja neid uuriti skaneeriva elektronmikroskoobiga FEI XL30SFEG (Royal Philips Electronics, Eindhoven, Holland).

Statistika.

Tsütomeetrilised fluorestsentsi adhesioonikatsed viidi läbi kolm korda ja igas katses kasutati seitset süvendit sama töötluse kohta. Tulemused on väljendatud keskmisena ± SEM. RSV – P. aeruginosa sidumis- ja RSV-filtreerimiskatsete andmed pärinevad kahest tüüpilisest eksperimendist ja neid väljendatakse keskmise ± SD-na. Kõik need katsed viidi läbi kahes eksemplaris. Kõik võrdlused viidi läbi t- testiga statistilise programmiga SPSS for Windows 12.0.2 (SPSS Inc., Chicago, IL). Väärtust p <0, 05 peeti nende võrdluste jaoks oluliseks.

TULEMUSED

RSV-nakkuse mõju P. aeruginosa kleepumisele.

Testiti erinevate P. aeruginosa tüvede in vitro nakkumist inimese hingamisteede epiteelirakkudega RSV-nakkusega või ilma, et hinnata viirusnakkuse mõju pseudomonaalsele kleepumisele. P. aeruginosa nakkumine nakatamata hingamisteede epiteelirakkudega varieerus iga tüve ja rakutüübi osas. Maksimaalne nakkumine IB3-1 rakkudega leiti RSV-ga nakatava annuse log 3, 35 korral RSV-nakkuse kolmandal päeval, HEp-2 ja A549 rakkude suhtes neljandal päeval RSV-ga nakatavate annuste log vastavalt 3.70 ja 3.18 korral (andmed pole näidatud). See hingamisteede epiteelirakkude RSV-nakkus põhjustas järjekindlalt kõigi P. aeruginosa tüvede maksimaalse nakkumise pärast 30-minutist inkubeerimist nendesse rakkudesse (IB3-1 d3, HEp-2 ja A549 d 4), võrreldes nakatamata epiteelirakkudega ( Joonis 1). Võrreldes RSV puudumisega, varieerus see erinevate tüvede ja rakutüüpide vahel 1, 2-8, 2-kordselt. See iga Pseudomonas'e tüve maksimaalne suurenenud adhesioon pärast RSV-nakkust, võrreldes RSV-ga, oli oluline kõigi tüvede ja kõigi rakutüüpide puhul ( p <0, 05), välja arvatud tüved Pa01 ja Pa04 A549 rakkudel. RSV kontsentratsioonid, mis ületavad log3, 35 IB3-1, log 3, 7 HEp-2 ja log 3, 18 A549 korral (joonis 2), põhjustasid monokihtide kaotuse tsütopatoloogilise mõju tõttu d 3 (IB3-1) ja d 4 (HEp- 2 ja A549), mõõdetud Pseudomonas'e kogu nakkuvuse vähenemisega. Lisaks leidsime, et P. aeruginosa tugevdatud kleepumine sõltub RSV annusest kõigis kolmes rakutüübis (joonis 2), vastavalt d 3 (IB3-1) ja d 4 (HEp-2 ja A549).

Image

P. aeruginosa tüvede kleepumine RSV-ga nakatunud IB3-1 ( A ), HEp-2 ( B ) ja A549 ( C ) ühekihilistesse kihtidesse ( tahked tulbad ) võrreldes nakatamata ühekihiliste kihtidega ( lahtised tulbad ), mõõdetuna tsütomeetrilises fluorestsentsanalüüsis. Andmed on esitatud kolme katse keskmisena ± SEM; igas katses kasutati seitset süvendit ravi kohta. t test ( p <0, 05), * mitteoluline.

Täissuuruses pilt

Image

Tsütomeetriliselt mõõdetud P. aeruginosa tüve Pa01 kinnitumine RSV-st annusest sõltuvalt nakatamata ( lahtised tulbad ) ja RSV-ga nakatunud IB3-1 ( A ), HEp-2 ( B ) ja A549 ( C ) ühekihilistesse kihtidesse ( tahked tulbad ) fluorestsentsanalüüs. Kuvatakse andmed kolmest representatiivsest katsest ± SD, mis on tehtud seitsmekordseks.

Täissuuruses pilt

RSV seondumine P. aeruginosa'ga.

Hüpoteesime, et suurenenud pseudomonaalsete adhesioonide põhjuseks võib olla seondumine viiruse poolt indutseeritud ülesreguleeritud rakumembraani valkudega või rakumembraanil ekspresseeritud viiruse glükoproteiinidega. Esmalt testisime, kas RSV ja Pseudomonas bakterid saavad teineteisega vahetult seostuda. Pseudomonaalset suspensiooni võrreldi RSV ja P. aeruginosa suspensiooniga. RSV annusega 3, 0 × 106 PFU / ml seondus otse kõigi P. aeruginosa tüvedega, varieerudes vahemikus 0, 34% kuni 1, 67% (keskmine, 0, 94 ± 0, 58 SD) RSV glükoproteiin F-positiivseid baktereid. Lisaks põhjustas RSV suurenenud annus 5, 0 × 107 PFU / ml annusest sõltuva ja RSV ja P. aeruginosa suurenenud seondumise. See varieerus vahemikus 4, 7% kuni 9, 97%, keskmine, 6, 58 ± 2, 09 SD (andmeid pole näidatud).

RSV ja P. aeruginosa samaaegse lisamise mõju.

RSV rolli edasiseks uurimiseks pseudomonaalsete adhesioonide võrdlemisel võrdlesime ainult P. aeruginosa kleepumist RSV-ga koos inkubeeritud P. aeruginosa nakkuseta epiteelirakkudega. Ainuüksi P. aeruginosa nakkumine nakatumata hingamisteede epiteelirakkudega, mida kasvatati kahe päeva jooksul ühinemiseks, varieerus iga tüve ja rakutüübi osas. Koosinkubeeritud RSV – P. aeruginosa kompleks tingis P. aeruginosa suurenenud kleepumise hingamisteede epiteelirakkudesse, võrreldes ainult P. aeruginosaga (joonis 3). See suurenenud adhesioon varieerus erinevate tüvede ja rakutüüpide vahel 1, 7-16, 1-kordselt ja oli oluline kõigi tüvede ja kõigi rakutüüpide osas ( p <0, 05).

Image

Nakatumata IB3-1 ( A ), HEp-2 ( B ) ja A549 ( C ) ühekihiliste kihtide ( tahked ribad ) lisamisega RSV-ga samaaegselt lisatud P. aeruginosa kleepumine, tsütomeetriliselt mõõdetuna ainult P. aeruginosaga ( lahtised tulbad ) fluorestsentsanalüüs. Andmed on esitatud kolme katse keskmisena ± SEM; igas katses kasutati seitset süvendit ravi kohta. Oluline erinevus kõigis rakuliinides ja kõigi tüvede korral ( t- test, p <0, 05).

Täissuuruses pilt

RSV filtraadi ja puhastatud RSV suspensiooni mõju.

P. aeruginosa suurenenud nakkumine nakatamata epiteelirakkudega, kui neid lisada samaaegselt RSV-ga, võib olla tingitud sellest, et RSV toimib sideainena bakterite ja epiteelirakkude vahel või alternatiivselt RSV suspensiooni põletikuliste vahendajate poolt, mis kutsub esile kaasatud rakumembraani valkude ülesreguleerimise. pseudomonaalses järgimises. Nende kahe võimaluse uurimiseks inkubeerisime P. aeruginosa kas filtreerimata RSV suspensiooni või RSV filtraadiga. RSV filtraat sisaldas kõiki komponente, kaasa arvatud algsest RSV kultuurist pärit põletikuvahendajaid, välja arvatud RSV-virioonid, keerutades läbi filtri. Sarnaseid kleepumiskatseid korrati puhastatud RSV suspensiooniga ilma põletikuvahendajateta. Joonis fig 4 näitab, et nii originaalsed kui ka puhastatud RSV suspensioonid andsid sama suurenenud pseudomonaalse kleepumise vastavalt 30, 7% ± 0, 8 SD ja 33, 0% ± 1, 12 SD. Filtraat ei põhjustanud üldse suurenemist (3, 8% ± 0, 5 SD), võrreldes RSV-ga (5, 6% ± 0, 4 SD).

Image

Algne ja PEG-ga sadestatud, puhastatud RSV suspensioon andis tüve Pa01 suurenenud kleepumise IB3-1 ühekihilisele kihile võrreldes kontrollrühmaga, samas kui RSV vaba filtraadi nakkumine ei suurenenud. Näidatud on andmed kahest tüüpilisest eksperimendist ± SD, mis tehti kahes eksemplaris.

Täissuuruses pilt

Hepariini poolt põhjustatud glükoproteiini G blokeerimise mõju seondumisele.

RSV seondumist peremeesrakkudega vahendab glükoproteiin G, mida hepariin võib spetsiifiliselt blokeerida. Uurimaks, kas koosinkubeeritud RSV – P. aeruginosa kompleksi tõhustatud seondumine mitteinfektsioossete epiteelirakkudega oli vahendatud RSV glükoproteiin G abil, eeltöödeldi rakke hepariiniga. Hepariin ise ei mõjutanud P. aeruginosa nakkumist mitteinfekteeritud rakkudega (andmeid pole näidatud). Joonisel 5 on näidatud, et nakatamata rakkude eeltöötlus hepariiniga põhjustas koosinkubeeritud RSV – P. aeruginosa kompleksi tugevdatud adhesiooni peaaegu täieliku blokeerimise, mis oli oluline ( p <0, 05) kõigi testitud tüvede puhul. See blokeerimine sõltus hepariini annusest ja samasugust hepariiniga parema kleepumise blokeerimist leiti HEp-2 ja A549 rakkudes (andmeid pole näidatud).

Image

IB3-1 rakkude eeltöötlemine hepariiniga ( blokeeritud tulbad ) andis koosinkubeeritud RSV – P. aeruginosa kompleksi ( tahked tulbad ) tugevdatud adhesiooni peaaegu täieliku blokeerimise, võrreldes ainult P. aeruginosaga ( lahtised tulbad ) ja mõõdetuna tsütomeetriline fluorestsentsanalüüs. See tõus on oluline kõigi tüvede puhul ( t- test, p <0, 05). Andmed on esitatud kolme katse keskmisena ± SEM; igas katses kasutati seitset süvendit ravi kohta.

Täissuuruses pilt

Visualiseerimine skaneeriva elektronmikroskoopia abil.

Kuna FITC-märgistatud bakterite fluorestsentsi abil mõõdetud kleepumine on kaudne ja võimalik, et üsna tundetu meetod, visualiseerisime skaneeriva elektronmikroskoopia uuringute abil varasema RSV-nakkuse ja RSV samaaegse lisamise P. aeruginosaga mõju kleepumisele. P. aeruginosa inkubeerimisel ilma RSV-ga ilmnesid vaid mõned epiteelirakkudesse kleepunud bakterid (joonis fig 6 B ). Haardumise olulist suurenemist täheldati, kui RSV-ga nakatunud epiteelirakkudele lisati P. aeruginosa , järgides peamiselt RSV-nakkuse põhjustatud süntsütiat (joonis 6, C ja D ). Seevastu täheldati ühtlasemat jaotust, kui P. aeruginosa ja RSV lisati samaaegselt nakatamata epiteelirakkudele, suurenes see jällegi märkimisväärselt, võrreldes kleepumisega RSV puudumisel (joonis 6, E ja F ).

Image

Hep-2 rakkude pseudomonaalse kleepumise visuaalseks muutmiseks skaneeriva elektronmikroskoopia abil (× 4000/7500) kuvatakse P. aeruginosata nakatamata rakud ( A , × 4000), P. aeruginosa nakkuseta ( nooled ) nakatamata rakud ( B , × 4000) ), suurtes kogustes P. aeruginosa, mis kinnitub peamiselt RSV-ga nakatunud rakkude sünkütiale ( nooled ) ( C , × 4000; D , 7500) ja suurtes kogustes P. aeruginosa, mis kleepuvad ühtlasemalt pärast koosinkubeeritud RSV ja P samaaegset lisamist aeruginosa nakatumata rakkudesse ( E , × 4000; F , 7500).

Täissuuruses pilt

ARUTELU

Meie uuring näitab, et nii inimese hingamisteede epiteelirakkude RSV-nakkus kui ka koosinkubeeritud RSV ja P. aeruginosa samaaegne lisamine nakatamata epiteelirakkudele tugevdab tugevalt P. aeruginosa nakkumist nendesse rakkudesse. Seda näidati nii laboratoorsete kui ka kliiniliste bakteritüvede ja mitut tüüpi rakutüüpide korral. Lisaks täheldasime RSV otsest seondumist P. aeruginosaga , mis viitab sellele, et RSV võib toimida sideainena P. aeruginosa ja epiteelirakkude vahel. Spetsiifiline blokeerimine hepariiniga kõrvaldab P. aeruginosa suurenenud adhesiooni, mis viitab sellele, et see P. aeruginosa seondumine rakkudega toimub RSV glükoproteiini G. kaudu. Skaneeriv elektronmikroskoopia näitab RSV-ga nakatunud epiteelirakkude pseudomonaalse nakkumise mustri silmatorkavat erinevust koos inkubeeritud RSV ja P. aeruginosa samaaegse lisamisega nakatamata rakkudele, mis viitab sellele, et suurenenud kleepumise mehhanismid on võimalikud.

Hingamisteede epiteelirakkudele pseudomonaalsete kleepumiste RSV-indutseeritud võimendamise leiu seletamiseks on mitmeid potentsiaalseid mehhanisme. Bakterid võivad seostuda viiruse poolt indutseeritud ja ülesreguleeritud rakumembraanivalkudega ning indutseeritud viiruse glükoproteiinidega nagu glükoproteiin F, G ja neuraminidaas nakatunud rakkude pinnal (16). Lisaks näitame, et RSV toimib tõenäoliselt sideainena hingamisteede epiteelirakkudega pseudomonaalse seondumise korral.

Meie andmed pakuvad mitu otsust sellise otsese ühendamismehhanismi kohta. Koosinkubeeritud RSV ja P. aeruginosa samaaegne lisamine suurendab bakterite seondumist RSV-ga nakatumata ühekihiliste kihtidega. RSV ja P. aeruginosa samaaegse lisamise ajal on epiteelirakkude membraanidel raku- või viirusvalkude ekspressioon või ülesreguleerimine või põletikuliste vahendajate ülesreguleerimine vähem tõenäoline, kuna koosinkubeeritud inkubatsiooni lisamise vahel on suhteliselt lühike ajavahemik bakterid ja virioonid ning nakkuse hindamine. Lisaks näitavad filtreerimiskatsed, et RSV võimendav toime Pseudomonase kleepumisele on tingitud ainult RSV virioonidest ja mitte RSV suspensioonis sisalduvatest muudest toodetest, näiteks põletikulistest vahendajatest, mis on toodetud RSV kultuuri ajal. Lisaks demonstreerime otsest seondumist RSV ja P. aeruginosa vahel annusest sõltuval viisil.

Me pakume, et seda sidumismehhanismi saab vahendada P. aeruginosa seondumise kaudu glükoproteiin G-ga, mis teadaolevalt ekspresseerub RSV pinnal (16). Hingamisrakkude eeltöötlus hepariiniga, mis interakteerub glükoproteiin G-ga (17), blokeerib koosinkubeeritud RSV – P. aeruginosa kompleksi parema kleepumise peaaegu täielikult. Hepariini mittespetsiifiline blokeerimine, nt põletikuliste vahendajate pärssimine, on lühikese ajavahemiku tõttu vähem tõenäoline.

Skaneeriv elektronmikroskoopia kinnitab fluorestsentsanalüüside tulemusi, näidates P. aeruginosa vähest nakkumist hingamisteede epiteelirakkudele RSV puudumisel ja tugevalt tugevdatud pseudomonaalse adhesiooni viiruse juuresolekul. Lisaks näitab see bakterite nakkumise mustri silmatorkavat erinevust. Kui P. aeruginosa kleepub pärast epiteelirakkude RSV nakatumist peamiselt süntsütiasse, siis tugevalt suurenenud adhesioon jaotub ühtlasemalt RSV ja P. aeruginosa samaaegse lisamisega ka nakatamata rakkudele. See võib viidata sellele, et RSV – P. aeruginosa kompleks võib seonduda mis tahes epiteelirakkudega, samal ajal kui ainuüksi P. aeruginosa kleepumist soodustab seondumine, arvatavasti viiruse poolt indutseeritud glükoproteiinidega, mis ekspresseeruvad pärast RSV nakatumist süntsütias.

Käesolev uuring on esimene, mis teatas, et RSV-nakkus võib suurendada P. aeruginosa nakkumist hingamisteede epiteelirakkudega in vitro . See vastab varasematele kliinilistele tähelepanekutele, et Pseudomonas'e esialgset koloniseerimist võivad hõlbustada hingamisteede viirusnakkused, eriti RSV (12–14). Lisaks võib viirusinfektsiooni seostada antipsudomonaalsete antikehade suurenemisega CF-patsientidel, kellel on vahelduv või krooniline pseudomonaalne kolonisatsioon, eriti RSV-nakkuse korral (14). Need leiud on lisaks kooskõlas mitmete uuringutega, mis näitavad bakterite, näiteks Haemophilus influenzae ja Staphylococcus aureus , paremat kleepumist epiteelirakkudele pärast viirusinfektsiooni in vitro (9, 18, 19) ja in vivo (20, 21). Kuid viiruste ja P. aeruginosa vahelise sünergismi kohta infektsioonide esilekutsumisel on vaid vähe eksperimentaalseid andmeid. Ramphali jt uurimuses . (26), P. aeruginosa kleepub hiire hingetorusse ainult siis, kui on viirusnakkuse käes. Seki jt. (27) näitasid, et gripi infektsioonil on oluline roll surmaga lõppeva pneumokoki kopsupõletiku esilekutsumisel kroonilise P. aeruginosa nakatunud hiirtel. Hiljuti avaldasid Stark jt. (24) leidis P. aeruginosa vähenenud kliirensi kopsudest pärast RSV-nakkust mitte-CF hiirtel. Ehkki P. aeruginosa on CF-i kõige olulisem bakteriaalne patogeen, ei tundunud RSV ja P. aeruginosa vaheline sünergism hingamisteede epiteelirakkude nakatamisel käesolevas uuringus CF-spetsiifiline. Me ei täheldanud järjepidevaid erinevusi IB3-1 (CF) rakkude ja HEp-2 või A549 (mitte-CF) rakkude vahel, kuid ei kasutatud isogeenseid rakuliini.

Meie uuringul on piiranguid. Meie in vitro andmed ei kajasta tingimata in vivo olukordi ja veel tuleb kindlaks teha teiste viiruste roll P. aeruginosa nakkumisel . Kuid me kasutasime mitut rakutüüpi ja nii kliinilisi kui ka laboratoorseid bakteritüvesid, mille järjepidevad leiud parandasid adhesiooni. P. aeruginosa kleepumine ilma RSVta varieerub erinevates katsetes sarnastes rakutüüpides, kuid monokihid kasvatati sõltuvalt eksperimendist vastavalt 2 või 3–4 päeva jooksul ühinemiseks. Spetsiifiliste bakteritegurite esilekutsumine võib olla veel üks mehhanism, mis mõjutab nakkumist, kuid see jäi käesoleva uuringu käsitlusalast välja.

Meie leiud RSV-indutseeritud pseudomonaalsete kleepumiste tugevnemisest üldiselt võivad olla kliinilises plaanis huvitavad. P. aeruginosa on selektiivne ja oluline patogeen CF-is. Värsked andmed CF hiirte kohta rõhutavad RSV nakkuste olulisust kopsuhaigestumuse korral CF-is (25). Võib soovitada, et viirusnakkused nagu RSV hõlbustavad bakterite koloniseerimist, nt P. aeruginosa puhul . Lisateave CF-kopsuhaiguse viiruste ja bakterite vahelise sünergismi kohta võib anda tulemuseks uusi terapeutilisi strateegiaid CF-patsientide prognoosi parandamiseks. Kui meie in vitro tulemusi saab in vivo kinnitada, võib soovitus, et viirusnakkused võivad mängida rolli bakterite kolonisatsioonis ja kopsu CF ägenemises, tähendada kehtivate ravistrateegiate kohandamist ja uute võimaluste väljatöötamist. Näiteks võib hepariiniga nebuliseerimine RSV-nakkuse korral vähendada bakterite koloniseerimise ja nakatumise riski. Lisaks sellele rõhutatakse viirusnakkuste ennetamist, nt aktiivse või passiivse immuniseerimisega. Viiruse inhibiitoreid võidakse kasutada viirusinfektsiooni varases faasis, antibiootikumravi või viirusinfektsiooni ajal profülaktikaks. Huvitavaid võimalusi võivad pakkuda ka muud spetsiifilised viiruse-bakteri interaktsiooni blokaatorid.

Kokkuvõtlikult võib öelda, et see on esimene teade, et hingamisteede epiteelirakkude RSV-nakkus ning RSV ja P. aeruginosa samaaegne lisamine nakatamata epiteelirakkudele tugevdavad tugevalt P. aeruginosa in vitro kleepumist. Selles protsessis toimib RSV tõenäoliselt sideainena. Hepariin näib olevat võimeline blokeerima RSV-d ja kõrvaldama selle tõhustatud bakterite adhesiooni. See kinnitab soovitust, et viirusnakkused võivad mängida rolli bakterite kolonisatsioonis ja kopsu CF ägenemises. Kui neid tulemusi saab in vivo kinnitada, võib sellel olla oluline mõju kopsuhaiguse CF ravile.

Sõnastik

CF

tsüstiline fibroos

FACS

fluorestsents-aktiveeritud rakusorteerija

RSV

respiratoorne süntsütiaalviirus