Vähenenud sperma kvaliteet kroonilise prostatiidiga patsientidel, mis kutsuvad esile apoptootilise valgu omi / htra2 vabanemise spermatosoididest | eesnäärmevähk ja eesnäärmehaigused

Vähenenud sperma kvaliteet kroonilise prostatiidiga patsientidel, mis kutsuvad esile apoptootilise valgu omi / htra2 vabanemise spermatosoididest | eesnäärmevähk ja eesnäärmehaigused

Anonim
  • See artikkel on tagasi tõmmatud 29. novembril 2007

Abstraktne

Kroonilise prostatiidi ja viljakuse vahelist seost on aastaid vaieldud. Mitmed rühmad on näidanud nakatumist ja eesnäärme antigeenide vastane autoimmuunne vastus võib kahjustada sperma kvaliteeti ja viljakust. See uuring viidi läbi hüpoteesi kontrollimiseks, et Omi / HtrA2-indutseeritud apoptoos kroonilises prostatiidis võiks olla täheldatud kliinilise kasu aluseks olev mehhanism. Omi / HtrA2 seriinproteaas on tuuma poolt kodeeritud mitokondriaalne valk, mida saab pärast apoptoosi stiimulite vabastamist mitokondritest tsütosooli, indutseerides apoptoosi kaspaasist sõltuvatel ja sõltumatutel viisidel. Hõlmatud oli 41 patsienti, kellel diagnoositi krooniline prostatiit. Kontrollideks olid terved normaalsed isikud. Inimese spermatosoidid spermas puhastati Percolli gradienditehnika abil, et eraldada seemneplasma ja muud ümarad rakud. Kroonilise proteatiidiga patsientide spermatosoidide sperma kontsentratsiooni, liikuvuse, morfoloogia, proinflammatoorsete tsütokiinide, Omi / HtrA2 mRNA ja valgu taset mõõdeti vastavalt. Nendel prostatiidiga patsientidel tuvastati seemneplasmas märkimisväärselt suurenenud põletikuvastaste tsütokiinide tase. Omi / HtrA2 mRNA ja valgu tase oli prostatiidi põdevatel meestel oluliselt kõrgem kui normaalsetel meestel. See uuring näitab, et kroonilise prostatiidiga patsiendid muudavad sperma kvaliteedinäitajaid, Omi / HtrA2 mRNA-d ja spermatosoidide valgu taset olulisel määral. Spekuleerime, et kaasnev põletikuline protsess võib mõjutada meeste viljakust proapoptootilise valgu Omi / HtrA2 vabanemisega.

Sissejuhatus

Krooniline prostatiit on tavaline diagnoos, kuid haiguse etioloogia ja patogeneesi kohta mõistetakse väga vähe. 1, 2 Kroonilise prostatiidiga meestel on episoodiline ja taastuv seisund, mida iseloomustavad vaagnavalu, ärritavad tühjenemisnähud ja mõju seksuaalfunktsioonile. 3 Haiguse sümptomid viitavad infektsioonile eesnäärmes ja bakteriaalsed infektsioonid esinevad 5–10% patsientidest. Kuid paljude aastate jooksul kogutud tõendusmaterjal ei ole suutnud veenvaid tõendeid selle kohta, et märkimisväärne osa meestest, kellel ilmnevad kroonilise prostatiidi sümptomid, põhjustavad sümptomeid mõned nõudlikud organismid. Hiljuti teatasid mitmed rühmad, et eesnäärme antigeenide vastane autoimmuunne vastus ja sellega seotud põletikuline protsess võivad mängida olulist rolli kroonilise prostatiidi patogeneesis. 4, 5, 6 seostatud kroonilise prostatiidiga, peamiselt nakkusliku päritoluga, autoimmuunsuse ja põletikulise protsessiga, millega kaasnevad kõrvalekalded sperma kvaliteedis ja talitluses, 7 võib meeste viljakust halvendada ejakulatsiooni ajal spermarakkudega kokku puutunud eesnäärme sekretsioon või põletiku otsene mõju. munandil ja epididüümil pole selle molekulaarne mehhanism täielikult teada. Omi / HtrA2 on tuumaga kodeeritud mitokondriaalne seriinproteaas, mis võib pärast apoptoosi stiimulite (nt tuumori nekroosifaktor (TNF)), kasvufaktori kahanemise, põletikufaktorite, DNA-d kahjustavate ainete, kiirituse ja muu sellise vabanemist mitokondritest tsütosooli tsütosooli eralduda, apoptoosi esilekutsumine kaspaasist sõltuvatel ja sõltumatutel viisidel. 8 Selles uuringus analüüsisime rühma kroonilise prostatiidiga patsiente, et uurida, kas sperma madalamal kvaliteedil, peamiselt põletikuliste tegurite mõjul, põhjustatud Omi / HtrA2 vabanemine avaldab mingit mõju meeste viljakusele.

materjalid ja meetodid

Patsiendid

Kaasasime 41 patsienti (keskmine ± sd vanus: 38, 62 ± 7, 65 aastat, vahemik 18–49) ja 15 kontroll-vabatahtlikku (vanus: 30, 45 ± 4, 83 aastat, vahemik 24–45) Shanghai Jiaotongi ülikooli sidusettevõtte kuuenda rahvahaigla uroloogia osakonnast meie uuring. Tavalised isikud vastasid küsimustikule ja neil polnud anamneesis urogenitaalseid sümptomeid, instrumente ega operatsioone. Nad läbisid sama hindamise kui patsiendid. Patsiendid ja kontrollid olid nõus annetama vereproove ja spermat; nad ei olnud 4 nädalat enne uuringut ega selle ajal võtnud antibiootikume, mittesteroidseid põletikuvastaseid ravimeid ega steroide. Vasektoomia läbinud vabatahtlikud jäeti spetsiaalselt välja. Krooniline sümptomaatiline prostatiit diagnoositi juhul, kui anamneesis on olnud 3 kuud vaagna- või suguelundite valu või mõlemat, mis on seotud tühjenemise ja / või seksuaalfunktsiooni häiretega ning eesnäärme valuliku digitaalse rektaalse uuringuga. Kõik patsiendid läbisid standardse hindamise, sealhulgas rektaalse digitaalse uuringu, mikroskoopilise uuringu ning uriini ja sperma kultiveerimise. Nakkusliku ja mittenakkusliku kroonilise prostatiidiga patsientide eristamiseks viidi uriinis ja spermas läbi tavapäraseid ja mittekonventsionaalseid bakterikultuure. Võime tuvastada teadaolevate eesnäärme patogeenide (nt Escherichia coli ; Staphylococcus aureus ; Klebsiella sp; Chlamydia trachomatis ; Candida albicans ; Trichomonas sp) nakatumise kroonilise prostatiidi põdevatel patsientidel 41 patsiendil ja seetõttu nimetasime selle rühma A-rühmaks ( II tüüpi NIH prostatiit). B-rühma vanuserühmas urogenitaalhaiguseta vabatahtlikel, keda kasutati kontrollrühmana, ei esinenud nakkusetekitajat spermas ega uriinis (rühm B, n = 12).

Sperma analüüs

Pärast 2–7-päevast seksuaalset karskust koguti spermaproovid masturbeerimise teel otse steriilsesse anumasse. Samal visiidil saadi ka spermaproovid ja veri. Kliinilise sperma standardne analüüs viidi läbi vastavalt Maailma Terviseorganisatsiooni (1999) kriteeriumidele. Spermaanalüüs koosnes proovimahu, seemnerakkude tiheduse (kontsentratsiooni), progresseeruva liikuvuse, elujõulisuse (eosiini välistamine), morfoloogia (Maailma Terviseorganisatsioon (1992)) klassifikatsioonist ja Krugeri klassifikatsioonist, pH-st ning tsitraadi ja fruktoosi kontsentratsiooni määramisest. Tsitraati ja fruktoosi mõõdeti vastavalt eesnäärme ja seemnepõiekeste funktsioonitestidena. Leukotsüütide ja muude rakkude identifitseerimine viidi läbi peroksüdaasi tsütokeemilisel meetodil. Tulemusi väljendati 1 x 106 leukotsüütidena ml kohta. Spermamembraani funktsionaalse terviklikkuse hindamiseks kasutati hüpoosmootse turse (HOS) testi, nagu eelnevalt kirjeldatud (Maailma Terviseorganisatsioon, 1999).

Tsütokiinid seemneplasmas

TNF- α ja interleukiini (IL) -1 β testiti seemneplasmas, kasutades kaubanduslikult saadavat kemiluminestsentsi immunomeetrilise analüüsi komplekti (Immulite; DPC, Los Angeles, CA, USA). Test viidi läbi vastavalt tootja juhistele automaatanalüsaatoris (Immulite). Tsütokiini sisaldus väljendati ühikutes pg / ml vastavalt standardkõveratele, mis olid vahemikus 1, 7 kuni 1000 pg / ml TNF- α ja 1, 5 kuni 1000 pg / ml IL-1 β .

Spermaproovid

Spermaproovid saadi A- ja B-rühma meestelt. Sperma koguti masturbeerimise teel pärast 3-päevast seksuaalset karskust ja lasti vedelduda 30–60 minutit toatemperatuuril. Spermaanalüüs viidi läbi vastavalt WHO (Maailma Terviseorganisatsioon, 1999) juhistele. Valitud sperma elujõulisuse hindamiseks kasutati eosiin-nigrosiini värvimist ja sellest uuringust jäeti välja proovid, milles oli üle 5% surnud spermatosoide. Sperma morfoloogia hindamiseks kasutati Diff-Quik värvimist. Normozoospermiline (seemnerakkude kontsentratsioon 20 × 10 6 / ml, A ja B motoorika kokku 50%, sperma normaalne morfoloogia 30%, n = 12) ja prostatiidi sperma (sperma kontsentratsioon 20 × 106 / ml, kokku Uuringuks valiti liikuvusaste A ja B 30%, sperma normaalne morfoloogia 30%, n = 41). Spermatozoonid puhastati Percolli gradienditehnika abil (neli kihti: 47, 5, 57, 76 ja 95%), et eraldada seemneplasma ja eemaldada ka teised ümarad rakud. Pärast tsentrifuugimist (20 minutit 400 g , 25 ° C juures) koguti spermatosoidid liidesest 57–76% ja 95% aluskihist ning pesti seejärel kaks korda fosfaadiga puhverdatud soolalahusega. Pestud spermatosoide hoiti RNA analüüsiks temperatuuril -80 ° C. Valitud sperma puhastamise tuvastamiseks uuriti proove mikroskoobi all. Ülejäänud ümaraid rakke ei täheldatud. Selle uuringu kiitis heaks haigla eetikakomitee ja kõik osalejad allkirjastasid nõusoleku vormi, mis lubab nende spermaproove uuringus kasutada.

RT-PCR test

Puhastatud spermatosoididest saadud kogu RNA ekstraheeriti TRIzol reagendiga (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kaks mikrogrammi kogu RNA-d transkribeeriti pöördtranskriptsioonisüsteemiga (Promega, Madison, WI, USA). Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) viidi läbi pöördtranskriptsiooni (RT) produktide 5 μl , 2, 5 RÜ Taq DNA polümeraasi, 10x PCR puhvriga 5 μl , 25 m M MgCl2 4 μl , 10 m M dNTP 1 μl. ja 50 pmol päri- ja pöördpraimerit lõppmahuga 50 μl . Praimer Omi / HtrA2 (senss-5′-TCCTTTGCCATCCCTTCT-3 ′, antisenss-5′-TCTGTCTCGGTGCCCTCA-3 ′) ja glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH, senss-5′-TGGGTGTCG -GCTGGCGCTGAGTACGTCGT-3 ') sünteesis Shanghai Shenggong Company (Shanghai, Hiina). PCR tingimused olid järgmised: esmane denatureerimine temperatuuril 94 ° C 5 minutit, seejärel 30 tsüklit temperatuuril 95 ° C 30 sekundit, 55 ° C 45 sekundit, 72 ° C 90 sekundit ja 72 ° C 10 minutit. PCR-i tooteid analüüsiti, kasutades Rapid Agarose Gel elektroforeesi süsteemi (Wealtec CORP, Sparks, NV, USA) 2, 0% agaroosgeelides 0, 5 x TBE (Tris.baas, boorhape, EDTA) puhvris (1 tund 70 V juures). Omi / HtrA2 ja GAPDH PCR produktid olid 450 ja 604 aluspaari. Bändide intensiivsust mõõdeti tarkvaraga Dolphin (Wealtec CORP, USA). Suhtelised väärtused arvutati Omi / HtrA2 densitomeetriliste signaalide jagamisel sisestandardi GAPDH abil saadud signaaliga.

Western blot analüüs

Western blot jaoks homogeniseeriti Percolli puhastatud spermatosoidid radioimmunosadestamise proovipuhvris (10 mmol / l Tris-HCl, pH 8, 0, 10 mmol / l EDTA, 0, 15 mol / l NaCl, 1% NP-40, 0, 5% naatriumdodetsüülsulfaat (SDS). ), 1 μg / ml aprotiniini, 1 mmol / l fenüülmetüülsulfonüülfluoriid). Homogenaati selgitati tsentrifuugimisega 15 000 g juures 15 minutit ja valgu kontsentratsioon homogenaatides määrati valgu Bio-Rad testiga (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Homogenaatvalgu alikvoodid (30 μg ) eraldati katkendliku 8% SDS-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga. Eraldatud valgud puhuti elektroblottides polüvinülideenfluoriidmembraanile, kasutades tank-blotmissüsteemi 200 mA juures 2 tundi. Pärast mittespetsiifiliste seondumiskohtade blokeerimist rasvavaba kuiva piimaga TBST puhvris (5 mmol / l Tris-HCl, pH 7, 4, 136 mmol / l NaCl, 0, 1% Tween 20) 1 tund toatemperatuuril, inkubeeriti blotte üleöö temperatuuril 4 ° C kitse anti-Omi / HtrA2 antikeha 1: 100 lahjendusega (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA). Seejärel pesti blotte kolm korda TBST puhvriga, inkubeeriti 2 tundi toatemperatuuril mädarõika peroksidaasiga seotud kitse küülikuvastase immunoglobuliiniga G (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA) lahjendusega 1: 5000 ja pärast edasist pesemist, immunoreaktiivsed valgud visualiseeriti kemoluminestsentsi abil. (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) ja kvantifitseeriti densitomeetria abil, kasutades tarkvara Dolphin (Wealtec CORP, USA).

Statistika

Andmed väljendati keskmisena ± sem. Statistiline analüüs viidi läbi, kasutades vastavalt Fisheri väikseima erinevusega testi või Kruskall-Wallis testi. P <0, 05 peeti statistiliselt oluliseks.

Tulemused

Kroonilise prostatiidiga patsientide proovides sperma kvaliteet ja põletikulised tsütokiinid

Et uurida, kas eesnäärme autoimmuunvastusest tuleneva põletikulise seisundi ja erinevate seemneparameetrite vahel võib olla korrelatsioon, viisime uuritavate patsientide rühmades läbi sperma analüüse. Tulemused on esitatud tabelis 1. Kahe uuritava rühma ejakulaatide pH-s ja ruumalas olulisi erinevusi ei leitud (tabel 1). Eesnäärme ja seemnepõiekeste markerite (vastavalt sidrunhape ja fruktoos) hindamisel näisid sidrunhappe tase A-rühmas märkimisväärselt vähenenud koos prostatiidi kliiniliste sümptomitega. Kui analüüsisime TNF- α ja IL-1 β taset nende patsientide seemneplasmas, näitasid rühma A proovid nende tsütokiinide olulist tugevnemist seemneplasmas (tabel 1). Sperma liikuvus näib olevat vähenenud, ehkki mitte märkimisväärselt, A- ja B-rühma patsientide proovides (tabel 1).

Täissuuruses tabel

Omi / HtrA2 mRNA testi tulemuseks on prostatiit

RT-PCR abil tuvastati inimese ejakuleeritud spermatosoidides Omi / HtrA2 mRNA ekspressioon (joonis 1a). Sisekontrolliks kasutati GAPDH mRNA-d (joonis 1a). Omi / HtrA2 mRNA ekspressioon oli prostatiidiga meestel oluliselt madalam kui kontrollmeestel (joonis 1b, P <0, 01).

Image

a ) Omi / HtrA2 ja GAPDH ekspressioon prostatiidi põdevate meeste (rada 1) ja kontrollmeeste (rada 2) seemnerakkude seemnerakkudes. Omi / HtrA2 ja GAPDH PCR produktid olid vastavalt 450 ja 604 aluspaari. ( b) PCR-tooted visualiseeriti ultraviolettvalguses, pildistati ja kvantifitseeriti tarkvara Dolphin abil. Tulemused väljendati Omi / HtrA2 ja GAPDH signaali intensiivsuse suhtena (keskmine ± sem, n = 20). GP130 ekspressioon oli astenozoospermilistel meestel oluliselt madalam kui normozoospermilistel meestel ( ** P <0, 01).

Täissuuruses pilt

Omi / HtrA2 valgu testi tulemuseks on prostatiit

Omi / HtrA2 valgu ekspressiooni ejakuleeritud spermatosoidides kinnitas ka Western blot (joonis 2a). Jällegi oli Omi / HtrA2 ekspressioon kontroll-meestel oluliselt madalam kui prostatiidiga meestel ( P <0, 01, joonis 2b), mis oli kooskõlas RT-PCR tulemustega.

Image

a ) Omi / HtrA2 Western blot analüüs ejakuleeritud spermatosoidides prostatiidi meeste (rada 1) ja kontrollmeeste (rada 2) vahel. ( b ) Omi / HtrA2 ekspressioon oli kontroll-meestel oluliselt madalam kui prostatiidi põdevatel meestel (keskmine ± sem, n = 10, ** P <0, 01).

Täissuuruses pilt

Arutelu

Krooniline prostatiit on meeste Urogenitaalsüsteemis väga levinud haigus. Kuid kroonilise prostatiidi ja viljakuse suhe on aastaid olnud vastuoluline. 7, 9, 10, 11 Mõnedes aruannetes on kroonilist prostatiiti seostatud sperma kvaliteedi kõrvalekallete ning sperma morfoloogiliste ja motiilsuse muutustega, peamiselt nakkusliku päritoluga või eesnäärme antigeenide autoimmuunse lümfoproliferatiivse vastusega. 4, 7, 12 Seevastu mõned rühmad ei leidnud erinevusi sperma kontsentratsioonis, motoorika protsendis ega morfoloogias kroonilise prostatiidi, prostatodyniaga patsientide ja kontrollrühma vahel. 13, 14 Üks võimalikke seletusi vastuolulistele leidudele võib olla see, et krooniline mittebakteriaalne prostatiit hõlmab heterogeenset patsientide rühma. Üldine seletus pole aga täielikult mõistetav. Hiljuti avaldasid Motrich jt. 4 on näidanud, et kroonilise prostatiidiga patsiendid, kellel on rakuline autoimmuunne vastus eesnäärme antigeenidele, muudavad sperma kvaliteedinäitajaid olulisel määral, nad arvavad, et eesnäärme antigeenide vastane autoimmuunne vastus ja sellega kaasnev põletikuline protsess võivad mõjutada meeste viljakust. On teatatud, et negatiivne mõju sperma liikumisele, elujõulisusele, HOS-testile ja pea külgsuunalisele nihkele on ilmne pärast spermarakkude inkubeerimist TNF- α ja Iinterferoon- γ-ga , pealegi ilmneb negatiivne mõju sperma liikumisele kohe, kui 30 minut pärast spermarakkude inkubeerimist TNF- α-ga . 15 TNF ja IL-1 põhjustavad teadaolevalt tuumafaktori- KB aktiveerimist ja põhjustavad raku hävimisega kataboolsete tegurite suurenenud ekspressiooni. Meie katse näitas ka, et kroonilise prostatiidiga patsientidel esines märkimisväärselt kõrgenenud TNF- α ja IL-1 sisaldus seemneplasmas ja halvem sperma kvaliteet kroonilise prostatiidiga patsientidel, mis seostub viljatusega. Teisest küljest reguleeriti vastavalt proapoptoosifaktori Omi / HtrA2 ekspressiooni, mida TNF- α ja IL-1 vabastavad. Näib, et Omi / HtrA2 võib mängida keskset rolli kroonilise prostatiidi tekkes.

Omi / HtrA2 on tuumaga kodeeritud mitokondriaalne seriinproteaas, mis toimib mitokondrite lahtituleku stresside andurina. Mnd2-hiirte hiirtel põhjustab Omi / HtrA2 proteaasi aktiivsuse vähenemine mitokondrite lagunemist, neuronite degeneratsiooni ja surma. 16 On näidatud, et kord tsütoplasmas soodustab Omi / HtrA2 kaspaasi aktiveerimist ja raku apoptoosi, seondumisel imetajate kaspaasi inhibiitori IAP bakuloviiruse apoptoosi inhibiitoriga (IAP). 17 Omi / HtrA2 sidumine tõrjub IAP kaspaasidest välja, pärssides kaspaasi aktiivsust pärssivat toimet. 18 Samuti on tõendeid selle kohta, et interaktsioon IAP-dega ei ole ainus Omi / HtrA2 põhjustatud rakusurma seotud mehhanism, kuna tsütosoolis lokaliseeritud Omi / HtrA2 seriini proteaasi aktiivsus on kaspaasist sõltumatu rakusurma põhjustamiseks piisav. 19 Omi / HtrA2 ekspressioon ja vabanemine mitchrondialist, mis on peamiselt seotud rakuväliste apoptoosi signaalidega. Kuna IL-1 β ja TNF- α kuuluvad tsütokiinide perekonda, mis on seotud mitmesuguste ägedate ja krooniliste haigustega, püstitasime hüpoteesi, et Omi / HtrA2 võimendab IL-1 β ja TNF- α vastust spermas; selle tulemusel langeb sperma ellujäämise määr. Eesnääre eritab komponente, mis on seotud seemneplasma üldise antioksüdantse võimega (TAC), ning tasakaal seemneplasmas leiduvate reaktiivsete hapnikuühendite (ROS) ja TAC vahel on sperma säilimiseks oluline. 20 Pasqualotto jt. 13 teatasid, et kroonilise mitteinfektsioosse prostatiidiga (koos leukotsütospermiaga või ilma) patsientide TAC oli kontrollrühmaga võrreldes oluliselt madalam. Teisest küljest on dokumenteeritud ROS-i kahjulik mõju sperma kvaliteedile 21 ja vähenenud eesnäärme sekretoorset funktsiooni võib seostada sperma apoptoosi tugevnemisega. ROS-il on ka potentsiaalne võime indutseerida Omi / HtrA2 vabanemist.

Kokkuvõtteks selgitame välja võimaliku molekulaarse mehhanismi põletikuliste tsütokiinide (TNF- α , IL-1 β ) ja Omi / HtrA2 vahel kroonilises prostatiidis. Põletikulise protsessi poolt indutseeritud proapoptoosi Omi / HtrA2 ülesreguleerimine võib tõsiselt kahjustada sperma kvaliteeti ja mõjutada seetõttu viljakust. Niisiis, Omi / HtrA2 moodustab pöördelise signaali molekuli apoptoosi radades, mida kroonilised prostatiidid põhjustavad proinflammatoorsete tsütokiinide IL-1 ja TNF poolt, ning võivad esindada olulist terapeutilist märklauda.