Harvaesinevat funktsiooni kaotuse scn5a varianti seostatakse lidokaiini põhjustatud vatsakeste virvendusega | farmakogenoomika ajakiri

Harvaesinevat funktsiooni kaotuse scn5a varianti seostatakse lidokaiini põhjustatud vatsakeste virvendusega | farmakogenoomika ajakiri

Anonim

Õppeained

  • Arütmiad
  • Farmakogeneetika
  • Haruldased variandid

Abstraktne

Inimese genoom sisaldab üle 4 miljoni variandi saiti, võrreldes referentsgenoomiga, sealhulgas haruldaste järjestuste variantidega, millel on potentsiaal avaldada suuri fenotüüpseid efekte, näiteks vastuvõtlikkus ravimi toksilisusele. Esitame SCN5A geeni haruldase mittesünonüümse (p.A1427S) variandi tuvastamise ja funktsionaalse iseloomustamise, mida seostati lakkamatu ja surmava ventrikulaarse tahhükardia ja fibrillatsiooniga pärast lidokaiini manustamist ägeda müokardiinfarktiga patsiendile. Variants, mis asub kõrgelt konserveerunud domeenis, mis erineb ennustatud lidokaiini sidumissaidist, vähendas naatriumikanali maksimaalset voolutihedust. Kogu eksoomi ja kogu genoomi sekveneerimise andmete suureneva kättesaadavuse korral oleks võimalik SCN5A-s tuvastada ja iseloomustada haruldasi variante, mis võivad eelsoodumuseks olla surmavad vatsakeste arütmiad.

Sissejuhatus

Inimese genoom sisaldab üle 4 miljoni variandi saiti, võrreldes referentsgenoomiga, sealhulgas ainulaadsed ja haruldased DNA järjestuse variandid, millel võivad olla suured fenotüüpsed efektid. 1 Hiljutine tehnoloogia areng võimaldab tuvastada igas genoomis funktsionaalseid variante, mis võivad olla kliiniliselt olulised.

Lidokaiini, 1B klassi ainet, kasutatakse sageli esmavaliku arütmiavastase ravimina vatsakeste rütmihäirete ravis ägeda müokardi infarktiga (AMI) patsientidel. Lidokaiin ja selle analoogsed ained on samuti tõhus anesteetikum, mida tavaliselt kasutatakse valu leevendamiseks. Tavaliselt manustatavates annustes on lidokaiin suhteliselt ohutu arütmiavastane ja anesteetiline aine. Lidokaiini manustamist on siiski seostatud ka vatsakeste arütmiate esilekutsumise või levimisega, tavaliselt Brugada sündroomi taustal. 2, 3, 4 Lidokaiini diaboolselt vastandlike toimete molekulaarne alus, mis on tõhus arütmiavastane toime arütmiavastasele ravimile, jääb suuresti teadmata, kuid selle põhjuseks on ioonkanaleid kodeerivate geenide geneetilised variatsioonid. 2, 3

Esitame SCN5A geeni funktsionaalse kadumise variandi tuvastamise ja iseloomustamise, mis kahjustas naatriumi voolutihedust ja mida seostati lakkamatu ja surmava ventrikulaarse tahhükardia / virvendusega (VT / VF) pärast lidokaiini manustamist AMI-ga patsiendile.

Materjalid ja meetodid

Selle uuringu kiitis heaks piirkondlik institutsionaalne hindamisnõukogu ja see viidi läbi vastavalt Maailma Meditsiiniühingu eetikakoodeksile (Helsingi deklaratsioon). Uuringu läbiviimiseks saadi asjakohane teadlik nõusolek.

AMI diagnoosimine

AMI diagnoosimine tehti kindlaks tavapäraste meetodite järgi valu rinnus, elektrokardiograafilised muutused ja vere biomarkerid.

Geneetiline skriinimine

Genoomne DNA ekstraheeriti perifeerse vere lümfotsüütidest. Kandidaadigeenide kõiki eksone ja eksoni-introni piire amplifitseeriti polümeraasi ahelreaktsiooni abil, amplikonid puhastati SAP-EXON I puhastusmeetodiga ja sekveneeriti mõlemas ahelas kapillaaride sekveneerimise teel. Lisaks sekveneeriti sama meetodiga 200 sama etnilise taustaga tervet kontroll-isikut.

Kohapealne mutagenees ja transfektsioon

Inimese metsiktüüpi SCN5A cDNA amplifitseeriti polümeraasi ahelreaktsiooni abil ja klooniti pcDNA3.1 + vektorisse (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Varieeruva nukleotiidi sisestamiseks viidi läbi saitidele suunatud mutagenees, kasutades selleks GeneTailor saitidele suunatud mutageneesi süsteemi (Invitrogen Corp). Kloonid sekveneeriti täielikult mõlemal ahelal, et tagada mutatsiooni olemasolu ja polümeraasi ahelreaktsiooni abil sisse viidud muude asenduste puudumine.

Rakuline elektrofüsioloogia

HEK 293 rakud transfekteeriti metsiktüüpi või mutantsete SCN5A konstruktidega, kasutades Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen) vastavalt tootja juhistele. Membraani voolu mõõdeti täisrakulise plaastriklambri abil võimendiga EPC 10 (HEKA instrumendid, Bellmore, NY, USA). Pipetilahus sisaldas (mmol l- 1 ): CsF 110, CsCl20, HEPES 10, NaF10, EGTA10 (pH 7, 35, kohandatud CsOH-ga). Vannilahus koosnes (mmol 1-1 ): NaCl 145, KCl4, HEPES 10, MgCl2 1, 0, CaCl2 1, 8, glükoosist 10 (NaOH-ga reguleeritud pH 7, 35). Salvestused tehti toatemperatuuril. Pingest sõltuvad naatriumvoolud, mis registreeriti erinevatel membraanipotentsiaalidel vahemikus –80 kuni 60 mv 10 mv juurdekasvuga 50 ms, hoidepotentsiaal oli –120 mv. Püsiseisundi aktiveerimist hinnati naatriumi tippvoolude mõõtmise teel. Juhtivus G ( v ) arvutati järgmise valemi abil: G ( v ) = I / ( V m - E rev ) ( I : tippvoolud, V m : membraani potentsiaalid, E rev : mõõdetud pöördepotentsiaalid). Püsiseisundi inaktiveerimist hinnati eelimpulss-protokolli abil, mis varieerub membraani potentsiaalidel vahemikus –140 kuni –50 mv 500 ms, millele järgneb depolariseerimine –20 mv-ni 20 ms. Stabiilse oleku ja püsiseisundi inaktiveerimise andmed sobitati Boltzmanni võrrandiga.

Andmete registreerimine ja statistika

Kõik signaalid saadi sagedusel 20 kHz tarkvara Patchmaster (HEKA Instruments) abil. Andmeid analüüsiti Fitmasteri, Sigmaplot 10.0 ja EXCEL-i andmete töötlemisega. Tulemused on esitatud keskmisena ± keskmise standardviga (sem). Keskmisi väärtusi ja sem võrreldi T- testiga.

Tulemused

Lidokaiiniga seotud VT / VF

56-aastane naine, kellel on teadaolevalt esinenud kolme veresoonkonna pärgarteritõbe ja mille vasaku vatsakese normaalne väljutusfraktsioon on 60%, kellel on ST-segmendi tõus AMI (joonis 1a). Ta keeldus invasiivsetest sekkumistest ja teda raviti hepariini, aspiriini, klopidogreeli, metoprolooli, benazepriilvesinikkloriidi, isosorbiidmononitraadi ja fluvastatiiniga. Tal olid polümorfsed ventrikulaarsed ektoopilised löögid ja püsimata VT episoodid (joonis 1b). Rutiinsed vereanalüüsid, sealhulgas seerumi kaltsiumi, magneesiumi ja kaaliumi sisaldus, olid normaalsed. Talle manustati intravenoosselt 50 mg boolusdoosi lidokaiini. Kolme minuti jooksul pärast lidokaiini manustamist tekkis patsiendil lakkamatu polümorfne VT / VF ja ta suri. Ta ei kaevanud valu rinnus ega stenokardiataolisi sümptomeid ega olnud enne lõplikku sündmust uusi EKG kõrvalekaldeid ega südame troponiini I seerumi taseme tõusu.

Image

Lidokaiiniga seotud ventrikulaarne tahhükardia / virvendus. ( a ) 12-lülitusega elektrokardiogramm vastuvõtul, näidates patoloogilisi Q-laineid, ST-segmendi tõusu, intraventrikulaarset juhtivuse viivitust ja normaalset QTc-d. b ) Eletkrokardiogramm, mis näitab polümorfse VT / VF episoodi. ( c ) Elektroferogramm, mis näitab cN1427G> T transversiooni (nool, antisenss-ahel) SCN5A geenis. ( d ) p.A1427S variandi asukoha skemaatiline esitus SCN5A valgus.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

SCN5A mutatsiooni tuvastamine

KCNQ1 , KCNH2 , KCNE1 , KCNE2 ja SCN5A geenide järjestamine tõi kaasa uudse c.4279 G> T transversiooni identifitseerimise SCN5A geenis, mis kodeerib SCN5A valku, naatriumikanali α-subühikut (joonis 1c). Mutatsioon vastab p.A1427S (koodoni G CT / T CT) muutusele valgus (joonis 1c). Variant mõjutab SCN5A valgu kõrgelt konserveerunud domääni (joonis fig 1d). Variant puudus 200 tervel inimesel, kes olid pärit samast etnilisest taustast ja NHLBI GO Exome Sequencing Project andmebaasis. Selle variandi (rs200034939 või rs199473244) sagedus '1000 genoomis - inimese geneetilise variatsiooni sügavas kataloogis' oli <0, 01 (//browser.1000genomes.org/).

Muud potentsiaalselt patogeenset varianti ei tuvastatud.

Rakkude elektrofüsioloogia

Terve rakuga plaastri klambri uuringud näitasid metsiktüüpi ja mutantse SCN5A valgu ekspressioonil HEK293 rakkudes piigi voolutiheduse märkimisväärset vähenemist (joonised 2a ja b). Naatriumvoolu püsikiiruse inaktiveerimine ei muutunud (joonis 2c). Muteeriv variant näitas ka tippjuhtivuse pingesõltuvuse parempoolse nihke positiivset potentsiaali (joonis 2d).

Image

Mutatsiooni funktsiooni kaotamise mõju naatriumvoolu tihedusele. a ) Voolu-pinge suhted metsiktüüpi (WT) ja p.A1427S variandi korral. b ) Naatriumvoolu maksimumväärtus WT ja p.A1427S mutatsioonide korral. ( c ) WT ja p.A1427S mutatsioonide püsiseisundi inaktiveerimine, normaliseeritud voolud joonistati graafikuna membraani potentsiaalide funktsioonina. ( d ) WT ja p.A1427S mutatsiooni tippjuhtivuse pinge sõltuvus graafikust, normaliseeritud piigi juhtivus joonistati membraani potentsiaalide suhtes. * P <0, 01 võrreldes WT-ga. # P <0, 05 võrreldes WT-ga.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Arutelu

Juhtum kirjeldab lidokaiini diaboolselt vastandlikke mõjusid, alates arütmiavastasest ravist kuni pahaloomuliseks arütmia tekitajaks müokardi isheemia ja harvaesineva funktsiooni kaotuse variandi juuresolekul SCN5A geenis. P.A1427S variant asub SCN5A valgu III domeeni III rakuvälise linkeri S5-S6 juures. Mõjutatud domeen on pingestatud naatriumikanali alfa-subühikute perekonna liikmete ja kanadest inimesteni väga konserveerunud (joonis 1d). Lidokaiin blokeerib naatriumivoolu naatriumikanali pingeandurite muutmisega, mis on peamiselt seotud kanali aktiveerimisega. 5, 6 See efekt viib kanali avanemiseni ja põhjustab lidokaiini sidumissaitide allosteerilise sidumise pingeanduritega, mille moodustavad S4 segmendid domeenides III ja IV. 5, 6 p.A1427S variant asub väljaspool ennustatud lidokaiini seondumiskohta 7 ja avaldab selgelt eristatavat mõju värava sulgemisele ja vahepealsele inaktiveerimisele. Eeldatavasti rõhutavad need toimed lidokaiini blokeerivat toimet naatriumikanalitele.

SCN5A geeni mutatsioonid põhjustavad Brugada ja Pika QT sündroomi. 8, 9 leiti, et lidokaiin paljastab SCN5A geeni liitpolümorfismiga patsiendil Brudada sündroomi elektrokardiograafilise mustri. 2 Meie patsiendil ei esinenud Brugada ega pikkade QT-sündroomide elektrokardiograafilisi mustreid. Samuti ei olnud tal vatsakeste tahhüarütmiate esinemist. Seega näitavad leiud SCN5A variantidega seotud uut fenotüüpi.

Enne lidokaiini manustamist olid patsiendil polümorfsed ventrikulaarsed ektoopilised löögid ja püsimata VT episoodid. Seega, vaatamata p.A1427S variandi funktsionaalsele toimele, mis on kooskõlas lidokaiini elektrofüsioloogiliste mõjudega, VT / VF-episoodi ajalise seosega lidokaiini manustamisega ja leidude bioloogilise usaldusväärsusega, ei saa me välistada VT / VF-i õnnetut esinemist. müokardi isheemia korral sõltumata lidokaiini manustamisest. Ehkki patsiendil polnud isegi terminaalsele ajale eelnenud aktiivse isheemia tunnuseid, ei saanud vaikiva müokardi isheemia rolli lidokaiini põhjustatud VT / VF-i püsimisel p.A1427S juuresolekul välistada. Seega eeldab pahaloomuliste vatsakeste rütmihäirete tekkimist see, kas SCN5A variant üksi muude vastuvõtlikkusfaktorite puudumisel või lidokaiini anesteetikumi manustamisel eeldab pahaloomulisi vatsakeste arütmiaid. Neist puudustest hoolimata suurendavad leiud teadlikkust ravimite võimaliku arütmilise toime kohta südame elektrofüsioloogiliste omadustega geenides esinevate haruldaste variantide olemasolul.

Me järeldame, et harvaesinevad funktsiooni kaotuse missense SCN5A variandid võivad müokardi isheemia korral eeldada lidokaiini manustamist VT / VF-i suhtes. Need leiud annavad ülevaate haruldaste ja funktsionaalsete variantide võimalikust kliinilisest mõjust isiklikule genoomile.