Rac3 on rohkem kui tuumaretseptori aktiivsuse suurendaja: vananemise peamiseks pärssimise inhibiitoriks | rakusurm ja haigus

Rac3 on rohkem kui tuumaretseptori aktiivsuse suurendaja: vananemise peamiseks pärssimise inhibiitoriks | rakusurm ja haigus

Anonim

Õppeained

  • Vananemine
  • Tuumaretseptorid
  • Senescence
  • Kasvaja supressorvalgud

Abstraktne

Retseptoriga seotud koaktyvaator 3 (RAC3) on tuumaretseptori koaktyvaator, mida tavaliselt tuumorites üleekspresseeritakse ja millel on tsütoplasmas ja tuumas onkogeensed funktsioonid. Ehkki osana oma onkogeensetest toimetest tuvastati see varem apoptoosi ja autofagia inhibiitorina, on selle ekspressioon vajalik pluripotentsuse ja embrüonaalsete tüvirakkude enesearenemise säilitamiseks. Selles töös uurisime selle rolli raku vananemises. Leidsime, et RAC3 üleekspressioon mittetuumoraalsetes HEK293 rakkudes pärsib vesinikperoksiidi või rapamütsiini indutseeritud enneaegset vananemist. Mehhanism hõlmab mitte ainult nende stiimulite varakult põhjustatud autofagia pärssimist vananemisteel, vaid ka rakutsükli supressorite p53 / p21 ja pikaealisuse promootorite FOXO1A, FOXO3A ja SIRT1 taseme tõus ja tuuma lokaliseerimine. Lisaks leidsime, et telomeraasi aktiivsuse säilitamiseks on vajalik RAC3 üleekspressioon. Kasvajalistes HeLa rakkudes pärssis selle aktiivsust replikatiivset vananemist indutseeriv RAC3 kahanemine. Lisaks näitasime, et in vivo on RAC3 tase maksas reguleeritud vanuses võrreldes noorte rottidega, samas kui p21 tase on tõusnud, korreleerudes vananenud kudede eeldatava vananeva rakusisaldusega. Sarnast RAC3 alanemist täheldati inimese loote WI-38 rakkude enneaegses ja replikatiivses vananemises ning hepatotsüütide HepG2 rakuliini enneaegses vananemises. Kokkuvõttes näitavad kõik need tulemused, et RAC3 on vananemise inhibiitor, mille allareguleerimine eakatel inimestel võib olla tõenäoliselt kasvaja supressioonimehhanism, vältides kahjustatud DNA-ga riskantsete vanade rakkude klonaalset laienemist.

Peamine

Retseptoriga seotud koaktyvaator 3 (RAC3) identifitseeriti algselt tuumaretseptori koaktyvaatorina 1 ja see on p160 tuumaretseptori koaktyvaatori perekonna liige. 2 Ehkki seda kirjeldati kõigepealt rinnanäärmetuumorites üleekspresseeritud molekulina, 3 oli selle rolli avastamine NF-κB (aktiveeritud B-rakkude tuumafaktori κ- kerge ahela võimendaja) koaktivaatorina 4 koos mõnede täiendavate tsütoplasmaatiliste funktsioonidega mis ei ole seotud selle histooni atsetülaasi aktiivsusega 5, 6 ja tuumori 3, 7, 8, 9, 10 üleekspressiooniga , tegi see molekul onkogeeniks.

Replikatiivne vananemine toimub normaalsete rakkudega loomulikult pärast kindlaksmääratud arvu replikatsioonitsüklit, esiteks telomeeride lühenemise tagajärjel igas rakutsüklis, kuna küpsetel diferentseerunud somaatilistel rakkudel puudub telomeraasi aktiivsus. 11 Kuid seda pöördumatut seiskumist võivad põhjustada ka mitmed täiendavad stressistimulaatorid, näiteks onkogeeni aktiveerimine, DNA kahjustus, kasvu stimuleerivate signaalide samaaegne kombinatsioon koos rakutsükli pärssijate ja mitokondrite efektoritega. 12, 13, 14, 15, 16, 17 Seda viimast protsessi, mida nimetatakse enneaegseks vananemiseks, võib indutseerida mitte ainult somaatilistes rakkudes, vaid ka tüvirakkudes, kus telomeraas jääb aktiivseks. 15, 18, 19, 20

Seetõttu on vananemine protsess, mis on otseselt seotud vananemisega. 16, 21 Tegelikult on vananenud kudedes suurenenud vananevate rakkude arv ja vähenenud tüvirakkude arv, mis säilitavad kogu oma enesearenemise ja diferentseerumise potentsiaali. 15, 18, 19, 22 Vananemisprotsessiga kaasnev vananevate rakkude suurenemine on kahjustatud DNA kogunemise tagajärg kogu elu jooksul, kuna telomeer lüheneb, genotoksiline stress ja dieet. 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 Imetajate transkriptsioonifaktorid FOXO (kahvlikarbi O transkriptsioonifaktor) ja nende ortoloogid C. elegans'is ja D. melanogasteris on seotud pikaealisusega. 29 See on vajalik normaalseks reageerimiseks oksüdatiivsele stressile ja seda reguleerib negatiivselt AKT fosforüülimine, mida saab aktiveerida insuliini / insuliinilaadse kasvufaktori (IGF) abil. Tegelikult pärsib see translatsioonijärgne modifikatsioon selle transaktiveerumist ja soodustab tuumaeksporti. Siiski on ka täiendavaid translatsioonijärgseid modifikatsioone, mis suurendavad nende tegevust; selline on Sirtuin 1 (SIRT1) deatsetüülimise juhtum. 28, 30, 31

Senestsents on normaalne bioloogiline strateegia, mida rakud ellujäämiseks kasutavad, vältides kahjustatud DNA-d kandvate rakkude klonaalset laienemist ning protsess on seotud vananevate kudede regeneratiivse potentsiaali kaotamisega. 13 Seetõttu võivad vananemine, nagu apoptoos või autofagia, kõik olla tuumori supressioonimehhanismid. 13, 32, 33, 34

Lisaks meie varasematele järeldustele RAC3 inhibeeriva rolli kohta apoptoosi 5, 35 ja autofaagiat mõjutades on mõned hiljutised tööd näidanud, 36 et RAC3 ekspressioon on vajalik tüvirakkude pluripotentsuse ja iseenda uuenemise säilitamiseks. 37, 38, 39 RAC3 kadu või alareguleerimine on seotud tüvirakkude diferentseerumisega küpseks rakutüübiks, 37 kus telomeraasi aktiivsus eeldatavasti vaigistub. Ehkki kasvajate RAC3 üleekspressiooni eest vastutavad mehhanismid pole tänaseni selged, näitasime hiljuti, et põletikuline vastus võib RAC3 geeni ekspressiooni ülesreguleerida. 40 Kuid RAC3 ja aktiivse telomeraasi üleekspressioon leitakse tavaliselt ainult tüvirakkudes ja tuumorites, kuid mitte küpsetes normaalsetes kudedes, viidates võib-olla seostele mõlema molekuli vahel, mis on seotud vananemise pärssimisega.

Seetõttu, kuna RAC3 on molekul, mille üleekspressioon aitab kaasa kasvaja arengule, pärssides apoptoosi ja autofaagiat, otsustasime uurida selle tõenäolist rolli raku vananemises.

Tulemused

Vesinikperoksiid või rapamütsiin kutsub esile HEK293 rakkude vananemise

Imetajate rapamütsiini sihtmärk (mTOR) osaleb kasvu ja metabolismi kontrollimisel mitmete transduktsioonisignaalide kaudu. 24, 41, 42 Sarnaselt vesinikperoksiidiga (H 2 O 2 ), 43 võib see sõltuvalt ravimi kontsentratsioonist ja rakutüübist esile kutsuda apoptoosi, vananemist või autofaagiat. 36 Seetõttu uurisime kõigepealt iga sellise stiimuliga raviks vajalikku annust ja aega, et indutseerida HEK293 rakkudes vananemist.

Me täheldasime, et rakkude proliferatsioon stimulatsiooni ajal 0, 15 mM H202 (joonis 1a) või 50 nM rapamütsiiniga (joonis 1b) 6 päeva jooksul oli < 40%, võrreldes rakkudega, mida ei olnud mõlemat ravita. Pärast 3-päevast kultiveerimist ravi puudumisel püsis rakkude arv peaaegu sarnane algusajaga, 6-päevalise väikese suurenemisega ja erines oluliselt kontrollrakkude kasvust (joonis 1c). Lisaks püsis rakkude ellujäämine kogu eksperimendi vältel> 90%, mis ei näidanud muutusi raku elujõulisuses (joonis 1d) ega pro-kaspaas-3 taset vastusena stiimulitele, kinnitades konkreetselt apoptoosi puudumist, samas kui märgati selgelt vananemismärgist p21 (joonis 1e).

Image

Senestsentsi indutseerimine vesinikperoksiidi või rapamütsiiniga (Rapa) HEK293 rakkudes. Diagrammiribadel on näidatud rakkude arvu suurenemise protsent 6. päeval pärast töötlemist (pt) H2O2 ( a ) või Rapa ( b ) erinevate kontsentratsioonidega; vohamist kontrollkeskkonnas, 150 μM H2O2 ja 50 nM RAPA ( c ). Trüpaansinisega värvimisega määratud rakusurma indutseerimine (valitud kontsentratsioonide järgi) väljendatakse ellujäämise protsendina võrreldes kontrollkeskkonnaga ( d ). Apoptoosi puudumine ja vananemise esilekutsumine määrati pro-kaspaas-3, kaspaas-3 ja p21 taseme abil Western blot ( e ) ning suurte tuumade + rakkude (nooled näitavad suuri tuumasid) ja SA β -Gal + rakkude abil ja neid väljendati järgmiselt: protsenti. Kujutised positiivseks värvimiseks on näidatud paremal. Alumisel paneelil on täpsustatud tähistatud alad SA β -Gal värvimiseks ( f ). Rakutsükli analüüs viidi läbi FACS ( g ) abil. Diagrammiribad näitavad kolme sõltumatu katse keskmist ± SD. ** P <0, 01, # P <0, 05; võrreldes kontrolliga

Täissuuruses pilt

Seejärel analüüsisime tüüpilisi vananemismarkereid, tuumade suurenemist ja vananemisega seotud β- galaktosidaasi (SA β- Gal) induktsiooni 44, 45 (joonis 1f). Mõlemad pildid ja diagrammiriba näitavad selgelt 6-päevase H2O2 või rapamütsiiniga töötlemise järel rakkude olulist suurenemist, millel on suured heterokromaatilised tuumad ja positiivne SA β- gaalaktiivsuse suhtes. Kõik need tulemused korreleeruvad rakutsükli analüüsiga saadud tulemustega, kus kas H202 või rapamütsiin kutsusid esile Gl-arreteeritud rakkude suurenemise (joonis 1g).

RAC3 üleekspressioon pärsib H 2 O 2 - või rapamütsiini põhjustatud vananemist

HEK293 rakud ekspresseerivad tavaliselt RAC3 piiratud koguseid. 5, 36 Uurisime RAC3 üleekspressiooni mõju vananemisel.

Nagu on näidatud joonisel 2a, vähendas RAC3 üleekspressioon märkimisväärselt H2O2 või rapamütsiini poolt indutseeritud suurte ja heterokromaatiliste tuumadega rakkude arvu ning positiivsete SAp-gaal-värvitud rakkude arvu. RAC3 üleekspressiooni transfekteerimisega kinnitati Western blot analüüsi ja kvantitatiivse reaalaja PCR abil (qRT-PCR; joonis 2d). Seetõttu pärsib RAC3 üleekspressioon mõlema stiimuli indutseeritud vananemist.

Image

RAC3 pärsib vesinikperoksiidi või rapamütsiiniga (Rapa) töötlemise esilekutsumist. Tühja (EV) või RAC3 ekspresseeriva vektori (RAC3) abil stabiilselt transfekteeritud HEK293 rakke inkubeeriti 150 μM H202 või 50 nM Rapaga ja 24 tunni pärast vahetati söödet, kuni rakud koguti 6 päeva pärast ravi (pt). Sensentsi hinnatakse suurte tuumade + rakkudega (nooled näitavad suuri tuumasid) ( a ) ja SA β- Gal + rakkudega ning seda väljendatakse protsentides ( b ). 24 tunni pt monodansüülkadaveriini (MDC) järgi värvitud autofaagiat väljendatakse sulgudes protsendina ( c ). RAC3 üleekspressiooni kontrolliti Western blot ja qRT-PCR ( d ) abil ning p21 modulatsioon määrati qRT-PCR ( e ) abil. ** P <0, 01 võrreldes tühja vektoriga

Täissuuruses pilt

Varem näidati, et autofaagia on indutseeritud vananemisprotsessi ajal ja hõlbustab seda. 46 Lisaks on RAC3 üleekspressioon autofagia inhibiitor. Joonis 2c näitab, et nii H2O2 kui ka rapamütsiin kutsusid esile happeliste vesiikulite suurenemise, mis ühildub autofagosoomidega, kuid RAC3 üleekspressioon näitab selget pärssivat toimet. Seetõttu võib autofagia pärssimine olla üks mehhanisme, mille kaudu RAC3 üleekspressioon pärsib enneaegset vananemist.

Lisaks autofagia ja vananemise vahelisele ristkõnele näitab joonis 2e, et pärast 6-päevast ravi rapamütsiini või H2O2-ga kutsusid nad esile p21 mRNA suurenemise, kuid RAC3 üleekspressioon blokeeris selle täielikult. Seda inhibeerivat toimet täheldati ka rapamütsiini põhjustatud p16 suurenemise korral (joonis 3a).

Image

RAC3 reguleerib vananemis- ja vananemismarkerite ekspressiooni ja raku alamrakkude paiknemist. p53, p21 ja p16 ekspressiooni ja lokaliseerimist hinnati IFI poolt 6 päeva pärast ravi ( a ). Täiustatud pilt, mis näitab p53 lokaliseerimist EV või RAC3 transfekteeritud rakkudes ( b ). Tuuma- või tsütoplasmaatilise p53 üldtasemed, mis määrati kindlaks Western blot analüüsi abil ja suhtelised densitomeetrilised ühikud arvutati suhtena tubuliini või lamina B1-ga. Tulpides on näidatud keskmine ± SD ** P <0, 01; võrreldes EV ( c ). FOXO1A, pFOXO1A (s256), SIRT1 ja FOXO3A ekspressiooni ja lokaliseerimist hinnati Western blot ( d ) või IFI abil 6 päeva pärast FOXO1A, pFOXO1A ja SIRT ( e ) töötlemist

Täissuuruses pilt

P53 osas ei olnud pärast rapamütsiini (joonis 3a) ega H2O2 (joonis 3c) stimuleerimist olulisi muutusi üldkoguses täheldatud, kuid kõrge RAC3 sisalduse korral lokaliseerus p53 valdavalt tsütoplasmas (joonis 3b). ), nagu kinnitas Western blot (joonis 3c).

Seetõttu võivad p53 või p53 – p21 raja aktiveerimise pärssimine olla täiendavad mehhanismid, mille kaudu RAC3 üleekspressioon väldib vananemist.

Seejärel uurisime RAC3 üleekspressiooni rolli pikaealisuse promootorite, FOXOs ja SIRT1 suhtes.

Nagu võis oodata, kutsub RAC3 üleekspressioon esile AKT aktiivsuse suurenemise, 5 ja seda suurendab rapamütsiini stimuleerimine (joonis 3d).

FOXO1A on selle kinaasi sihtmärk, mille fosforüülimine soodustab selle inaktiveerimist ja edasist lagunemist. RAC3 üleekspressiooni puudumisel täheldasime, et rapamütsiiniga töötlemine suurendab fosforüülitud FOXO1A taset (joonis 3d: rada 2 versus 1), ehkki rapamütsiiniga töötlemisel ei olnud selle valgu üldkoguse selget vähenemist võimalik tuvastada. Kuid RAC3 üleekspressiooni korral koos rapamütsiini stimuleerimisega või ilma selleta on FOXO1A üldkoguse selge vähenemine koos fosforüleeritud vormi samaaegse suurenemisega (joonis 3d: rajad 3 ja 4). Kuigi antikeha a-FOXO1A ei suutnud selle valgu looduslikku fosforüülimata tuumavormi tuvastada kaudse immunofluorestsentsi (IFI) abil ja a-pFOXO1A tunnustas peamiselt looduslikku fosforüleeritud tuumavormi, näitab joonis 3e selgelt pFOXO1A ratsionaalset suurenemist ja vähenenud kogust kogu valgu sisaldus (tsütoplasma, mida ei fosforüülitud ülemisel paneelil, pluss tuuma fosforüülitud madalamal paneelil) RAC3 üleekspressiooni all.

Kuid ka SIRT1, FOXO1A aktiivsuse positiivne modulaator, mille ekspressiooni suurendas rapamütsiin, oli samuti pisut tugevnenud (joonis 3d) ja lokaliseerus eelistatavalt tuumas (joonis 3e), kui RAC3 oli üleekspresseeritud. Need tulemused korreleeruvad FOXO3A ekspressiooni korral täheldatud tulemustega, mille inhibeerimine rapamütsiiniga töötlemisel pöördus RAC3 üleekspressiooni poolt tagasi (joonis 3d).

Seetõttu viitavad meie tulemused sellele, et suurenenud FOXO3A ja SIRT1 võivad olla mehhanismid, mille abil RAC3 üleekspressioon pärsib vananemist.

RAC3 ekspressioonitasemed on vananemisel alareguleeritud

Vanades kudedes on tavaliselt suurenenud vananevate rakkude arv ja see on nii replikatiivse kui ka enneaegse vananemise tagajärg. 22

Hüpoteesime, et võib-olla võiks RAC3 mängida seda kaitsvat antisenestsentsi rolli noortel inimestel. Sel juhul eeldatakse RAC3 ekspressiooni erinevat taset kudedes vanusest ja noorest indiviidist. Leidsime, et vanade rottide maksal on RAC3 ekspressioon vähem kui noortel ja sellega kaasneb rakutsükli supressori p21 (joonised 4a ja b) parendatud ekspressioon, mis korreleerub ootuspäraselt suurenenud vananevate rakkude arvuga. Veelgi enam, joonisel 4c on näidatud, et SA β- gaali aktiivsus ja suurte tuumade sisaldus on vanemas hepatotsüütides suurenenud, ja joonisel 4d on kujutatud vanade hepatotsüütide suurenenud SA β- gaalse positiivse värvumise pilte, mis korreleerusid suurenenud p21 ja p16 ning vähenenud RAC3-ga ekspressioon tuvastati maksa sektsioonides läbi viidud immunofluorestsentsi abil.

Image

RAC3 vananemisel. RAC3 ja p21 ekspressioonitasemed, mis on määratud Western blot ja qRT-PCR meetodil noorte ja vanade rottide maksas, on näidatud ( a ) suhtelise densitomeetrilise ühikuna ( b ). Diagrammiribadel on näidatud noorte ± ja vanuste rottide hepatotsüütide keskmine ± SD-positiivne SA β -Gal ja suured tuumad ( c ), * P <0, 05 võrreldes noorega. Pildid SA β -Gal hepatotsüütide värvimisest ja RAC3, p21 ja p16 IFI-st maksa lõikudes. Diagrammiribad näitavad fluorestsentsi intensiivsust suvaliste ühikutena (AU), mis on määratud vähemalt 200 lahtrist ( d )

Täissuuruses pilt

Seetõttu, ehkki mehhanismid, mis selle muutusega vananemisel põhjustavad, pole teada, võivad RAC3 kõrgemad tasemed noortel inimestel avaldada vananemist pärssivat rolli, mis siis kaob.

RAC3 ekspressioon on enneaegses ja replikatiivses vanemuses alareguleeritud

Kõigi meie uuringute valideerimiseks, mis käsitlevad RAC3 rolli enneaegses ja replikatiivses vananemises, viisime läbi täiendavad katsed, kasutades mudeliks inimese loote rakuliini WI-38, mis siseneb primaarkultuurina loomulikult replikatiivsesse vananemisse pärast mitut passaaži. Hoolimata sellest eelisest, pole need rakud parim mudel stabiilsete või kõrge efektiivsusega transfektsioonide läbiviimiseks, üleekspresseerides RAC3 homogeensusel. Vastupidiselt HEK293 rakkudele ekspresseerivad varased passaažid selle koaktivaatori tuvastatavaid tasemeid.

Nagu on näidatud joonisel 5, on need rakud tundlikud rapamütsiini või H202-indutseeritud enneaegse vananemise suhtes. Pärast 6-päevast töötlemist arreteeriti nad selgelt (joonis 5a) ja see korreleerus suurenenud positiivse SAp-Gal värvimisega (joonis 5b) ja laienenud tuumadega (joonis 5c). Huvitav on see, et vananevate rakkude arvu kasv korreleerus RAC3 ekspressiooni allareguleerimisega (joonis 5d).

Image

RAC3 on enneaegses ja paljunevas vanuses alareguleeritud. Kolme sõltumatu katse keskmine tulemus + proliferatsiooni SD kontrollkeskkonnas, 150 μM H2O2 ja 50 nM rapamütsiini (Rapa; a ). Diagrammiribad näitavad keskmist + SD positiivset SA β- Gal ( b ) ja suuri tuumasid ( c ), * P <0, 05 võrreldes noorega. RAC3 ekspressioon määrati Western blot analüüsi abil Rapa-raviga või ilma 6 päeva jooksul ( d ). RAC3 ekspressioon WI-38 noortes ja vanades passaažides määrati qRT-PCR ( e ) abil. Diagrammiribad näitavad mRNA ekspressiooni logiga transformeeritud väärtuste keskmist + SD GSE47739 andmepangast, platvormilt GPL6244 Affymetrix (Santa Clara, CA, USA) ( f ). * P <0, 01 ja ** P <0, 05, võrreldes kontrolliga

Täissuuruses pilt

Pidades silmas asjaolu, et WI-38 rakkudes indutseeritud enneaegsel vananemisel on RAC3 algselt reguleeritud, uurisime seejärel, kas nende rakkude replikatiivsel vananemisel oleks võimalik saavutada sarnane alaregulatsioon. Seetõttu võrdlesime RAC3 mRNA taset noorelt võrreldes vanade vananevate passaažidega.

Joonisel 5e on näidatud, et RAC3 ekspressioon oli vanade passaažide ajal oluliselt allareguleeritud, kui rakud vananevad.

Need tulemused on kooskõlas in vivo täheldatud tulemustega , mis viitavad sellele, et kuigi vananemisega kaasneb vananevate rakkude arvu suurenemine, kaasneb sellega ka RAC3 alareguleerimine.

Seejärel uurisime, kas RAC3 vananemise aeglustumine võiks olla kõige üldisem nähtus, mida tavaliselt leidub teistes vananemise bioloogilistes mudelites. Seetõttu viisime läbi bioinformaatika analüüsi hoidla avalike mikrotasandite andmepankadest. 47 töötleisime projekti GEO registreerimisnumbriga GSE47739 kaheksa proovi, millest neli vastavad inimese hepatotsüütide HepG2 rakuliini H2O2 põhjustatud vananemisele (0, 5 mM 60 minuti jooksul) ja ülejäänud neli on töötlemata kontrollrakuliinid . Joonisel 5f on toodud nendest andmetest saadud tulemused. Nagu on näidatud sellel joonisel, on RAC3, p21 ja p16 mRNA ekspressioonimustri erinevused vananevate või kontrollrakkude vahel sarnased, mis saadi meie mudelites. Need katsed näitavad selgelt, et p21 ja p16 suurenemisega vananevates rakkudes kaasneb RAC3 vähenenud ekspressioon.

Seetõttu on RAC3 molekul, mis reguleerib rakutsükli supressorite ja pikaealisuse promootorite signaalimist, kuid on vananemise ajal alareguleeritud; seetõttu ei tohiks välistada nende võimalikku rolli paljunemisjärgse vananemise vältimisel.

Kui telomeraas on tüvi- ja tuumorirakkudes aktiivse rakkude surematuse võtmetegur, võib RAC3 kõrge sisaldus olla mõlemat tüüpi rakus. Seetõttu analüüsisime, kas RAC3 võib olla vajalik tegur surematuse säilitamiseks, mõjutades võib-olla telomeraasi aktiivsust. Nendes katsetes kasutasime telomeraasi aktiivsusega rakuliini nagu HeLa, surematu kasvaja rakuliin, mis üleekspresseerib RAC3 (joonis 6a).

Image

RAC3 koputamine kutsub esile tuumori immortaliseeritud rakkude vananemise. RAC3 hävimist kinnitati qRT-PCR ja Western blot-i abil segatud (SC) - ja siRNA-RAC3-ga transfekteeritud HeLa rakkudes ( a ). SiRNA-RAC3 või SC-ga transfekteeritud HeLa rakkude proliferatiivne vastus. ** P <0, 01, võrreldes SC ( b ) -ga. SA β -Gaalaktiivsus ja suurte tuumade kujutised ( c ). Telomeraasi aktiivsust väljendatakse siRNA-RAC3 või SC-ga transfekteeritud HeLa rakkudes suvaliste telomeraasiühikute (TAU-de )na. Tulpides on näidatud keskmine ± SD; P <0, 01; võrreldes SC ( d )

Täissuuruses pilt

Ehkki tuumori HeLa rakud ei saa spontaanseid replikatiivseid vananemisi, leidsime, et siRNA-ga transfekteerimisel põhjustab RAC3 koputus väiksema replikatsiooni kiiruse võrreldes kontroll-skrambleeritud-transfekteeritud rakkudega (joonis 6b).

Seejärel analüüsisime RAC3 allareguleerimise põhjustatud replikatiivse vananemise võimalikku induktsiooni. Leidsime, et vähenenud replikatsioonikiirusega kaasnesid tüüpiliste vananemismarkerite suurenemine: positiivne SAp-gaalaktiivsus ja suured tuumad (joonis 6c). Lisaks sellele reguleeriti alla telomeraasi olulist kõrget aktiivsust (joonis 6d).

Need katsed viitavad sellele, et selles kasvaja rakuliinis on RAC3 ekspressiooni kõrge tase vajalik, et säilitada selle igavese kasvu omadused. Ehkki telomeraasi aktiivsuse vähenemine võib olla RAC3 puudumise otsene tagajärg, kuna võib-olla oleks seda vaja selle ensüümi positiivse regulaatorina, ei saa välistada veel ühte täiendavat protsessi, mida mõjutab RAC3 puudumine ja mis kutsub esile telomeraasi vananemise ja alareguleerimise.

Arutelu

Oleme varem näidanud, et RAC3 on nii apoptoosi 5, 35 kui ka autofagia inhibiitor. 36 Kuigi apoptoos hõlmab rakusurma, ei juhtu autofaagia alati. Tegelikult hõlmab protsess raku esmakordset ellujäämist kahjustatud organellide või valesti volditud valkude eemaldamise kaudu. Midagi sarnast juhtub vananemisega, millega kaasneb pöördumatu rakutsükli peatamine. Kuigi see protsess võib varakult aidata kaasa kasvaja arengu vältimisele, on varem tõestatud, et vananevad rakud on mitme kasvufaktori allikad, mis paradoksaalsel kombel võivad aidata kaasa kasvaja progresseerumisele ümbritsevates kudedes. 13, 48, 49 Tõepoolest, vananevate rakkude tuumaarhitektuur näitab mõningaid ümberkorraldusi, mis on seotud geeni ekspressioonimustri muutumisega. 44

Apoptoos, autofaagia ja vananemine on protsessid, mis osalevad normaalses arengus, diferentseerumises ja kõigis homöostaatilistes bioloogilistes vastustes, millel on ühine silmatorkav tuumori arengu pärssimine. 50 Huvitav on see, et kokkuleppel meie varasemate leidudega 5, 35, 36 ja käesoleva töö tulemustega on RAC3 inhibeerinud kõiki neid protsesse. Kuigi need võivad olla onkogeeni jaoks eeldatavad tegevused, on RAC3 eriline. Tegelikult ei vaja RAC3 onkogeenina toimimiseks mutatsioone. Tavaliselt avaldub see normaalsetes kudedes madalal tasemel ja kasvaja potentsiaal sõltub ainult selle üleekspressioonist. RAC3 on vajalik tuumaretseptorite ja transkriptsioonifaktorite kaasaktiveerijana ning mitmed tõendid lisaks väljalülitatud loomadega tehtud katsetele on näidanud, et selle ekspressioon on vajalik normaalseks kasvuks, arenguks, metaboolseks ja immuunvastuseks. 3, 4, 40, 51, 52 Seetõttu ja kuigi paradoksaalsel kombel on RAC3 määratletud kui onkogeen, sõltuvad selle kahjulikud või kasulikud rollid tõenäoliselt ainult selle tasakaalustatud ekspressioonitasemest konkreetses füsioloogilises kontekstis ja vanuses.

Hiljuti näidati, et tüvirakkude pluripotentse potentsiaali säilitamiseks on vajalik RAC3. 38, 39 Lisaks on selgelt näidatud, et see molekul on kõigis normaalsetes kudedes piiravaks teguriks ja üleekspresseeritud ainult selliste patoloogiliste seisundite korral nagu kasvajad. 36 Vaatamata madalatele ekspressioonitasemetele normaalsetes kudedes näitavad meie tulemused, et need ei ole kogu elu jooksul püsivad ja staatilised. Sellega seoses oleme varem näidanud, et RAC3 ekspressioonitasemed on põletikulise vastuse kontrolli all. 40 Lisaks leidsime selles töös, et nad on vananenud kudedes alareguleeritud, millega kaasneb p21 - tüüpilise vananemisnäitaja - suurenemine. Seetõttu võib mõõduka RAC3 ekspressiooni kadumine vanadel inimestel olla somaatiliste tüvirakkude arvu ja kvaliteedi vähenemise tagajärg. Teisisõnu, võib-olla on somaatilised tüvirakud RAC3 peamine allikas, mida avastatakse noorte blottide ja vanade isendite Western blot-uuringus.

Olenemata RAC3 allikast, näitavad meie tulemused, et see mängib rolli nii genotoksiliste stiimulite nagu H 2 O 2 kui ka metaboolse anduri raja inhibiitorite indutseeritud enneaegse vananemise pärssimisel kui rapamütsiin. Kooskõlas RAC3 üleekspresseerivate tulemustega peaks selle peamine kaitsev toime ilmnema kasvajarakkudes, kus selle ekspressioon on maksimaalne. Lisaks näitavad meie järeldused kasvaja rakuliini HeLa kohta, et RAC3 ekspressiooni kõrge tase on vajalik normaalse pideva kasvu ja telomeraasi aktiivsuse säilitamiseks, samas kui selle kadu muudab selle liini tundlikuks replikatiivse vananemise suhtes. Sellega seoses, kuigi on teada, et HPV inaktiveerib p53 HeLa rakkudes, 53 on tõendeid, et p53 olek ei ole otseselt seotud telomeraasi aktiivsusega iseenesest ja et telomeraasi aktiveerimine võib toimuda kas rakkudes, kus puudub täielikult p53, või rakkudes, mis omavad funktsionaalset p53. 19 Lisaks on samuti tõestatud, et p53 represseerimine telomeraasi (telomeraasi pöördtranskriptaas (TERT)) ekspressiooni katalüütilise subühiku suhtes on vahendatud p21 poolt. 54, 55 Lisaks on varem tõestatud, et TERT-i transkriptsioon on NF-κB sihtmärk. 17, 23 Teisest küljest, nagu näitasime, korreleerub kõrge RAC3 kõrge ekspressioon p21 alareguleerimisega in vitro ja in in vivo viisil, mis võiks vähendada TERT-i ekspressiooni. Seetõttu, kuna p53 ekspressiooni muutused RAC3 ekspressiooni suhtes ei ilmnenud, võisime spekuleerida, et p21 inhibeerimine RAC3 üleekspressiooni poolt võib olla telomeraasi aktiivsust mõjutav võimalik mehhanism, sõltumata p53-st. Lisaks sellele võiks telomeraasi aktiivsuse pärssimist RAC3 puudumisel seletada vähemalt selle molekuli normaalseks transkriptsiooniks vajaliku NF-KB B-kaktivaatori kaotamisega. Lisaks ei saanud loobuda RAC3 täiendavatest funktsioonidest, mis on seotud nii telomeraasi aktiivsuse reguleerimisega kui ka Tomerest sõltumatu telomeeri pikenemisega. 24 Seega võib blokeeritud telomeraasi tingimustes kromosoomikahjustus ja sellest tulenev geneetiline kaotus vallandada vananemise isegi immortaliseeritud rakuliinil. 56 Kuigi signaali edastamine p53 kaudu on vajalik replikatiivse vananemise esilekutsumiseks pärast telomeeri lühenemist ja DNA kahjustusi, võib see hõlmata ka p16 / CDK / Rb rada. HeLa rakkudel on inaktiivne p53, kuid retinoblastoomi valgu (Rb) ekspressioon on normaalne ja seetõttu võib RAC3 antisenestsentsne roll mõjutada seda viimast rada p16 inhibeerimise kaudu, blokeerides seega selle rakutsükli supressori pärssivat mõju Rb inaktiveerimisele . 57

Normaalsetest kudedest küpsed diferentseeritud rakud ei väljenda telomeraasi aktiivsust. Siiski võib somaatilistes tüvirakkudes vaja minna selle koaktivaatori mõõdukat või kõrget taset, võib-olla selleks, et säilitada selle telomeraasi aktiivsus ja pluripotentne potentsiaal. Seetõttu võiks RAC3 mõõdukas tase küpsetes somaatilistes rakkudes kaitsta neid noorte rakkude enneaegsest vananemisest. Võib hüpoteesida, et RAC3 alareguleerimine koos telomeeride lühenemisega eakatel inimestel võib aidata kaasa tundlikkuse suurenemisele erinevate vananemisstiimulite suhtes, vananevate rakkude arvu suurenemisele ning elundite ja süsteemide üldisele rikkele, mis tavaliselt kaasneb vananemisega. 13, 28 Kindlasti viitavad meie tulemused sellele, et RAC3 võib ise olla vananemisvastane tegur. Leidsime, et see moduleerib selles protsessis tugevalt osalevate molekulide taset, edendades pikaealisust nagu FOXO-d ja sirtuiinid. Mõlemad reguleerivad otseselt või kaudselt geenide ekspressiooni ja molekulide aktiivsust, mis on seotud desinfektsiooni ja pikaealisusega. 28, 30, 31

Selles töös analüüsiti kahte enneaegse vananemise mudelit, kasutades rapamütsiinina mTOR raja inhibiitorit ja stiimulitena oksüdeerijat H2O2. Meie tulemused näitavad, et RAC3 üleekspressioon reguleerib FOXOde ekspressioonitasemeid ja aktiivsust (joonis 3).

Tuumas juhib FOXO1A pikaealisust edendavate geenide transkriptsiooni. 29, 30 Siiski on vähemalt kaks mehhanismi, mis reguleerivad selle subtsellulaarset lokaliseerimist ja aktiivsust. Üks neist on negatiivne kontroll, mis hõlmab AKT poolt fosforüülimist seriini 256 juures, mis pärsib selle DNA seondumist ja soodustab tuumaeksporti. 29, 30 Teine on positiivne kontroll, mis suurendab selle transkriptsioonilist aktiivsust deatsetüülimise kaudu SIRT1 abil. 30, 31 Ehkki RAC3 üleekspressioon suurendab AKT aktiivsust (joonis 3), nagu me varem teatasime, 5 ja see võib viidata FOXO1A transkriptsioonilise aktiivsuse negatiivsele kontrollile, täheldati ka FOXO3A ja SIRT1 samaaegset suurenemist. Lisaks sellele reguleerib SIRT1 geeni p53 allareguleerimine, mis represseerib selle ekspressiooni, kui see on seotud promootoriga. Ent kui FOXO3A lokaliseerub tuumas, seob see p53, vältides selle pärssivat toimet SIRT1 geeni ekspressioonile. 29 Kindlasti leidsime selles töös, et RAC3 üleekspressioon suurendab ka FOXO3A ekspressiooni. Seetõttu toetavad meie tulemused kõik RAC3 üleekspressiooni antisenssentsi ja vananemisvastast rolli (joonis 7).

Image

RAC3 reguleerib rakkude vananemist ja vananemist. Rapamütsiin võib indutseerida vananemist, pärssides mTOR-rada (1a), mis kutsub esile autofaagiat (1b), soosib p53 transaktivatsiooni (1c) ja SIRT1 aktiivsust (1d). Vesinikperoksiid suurendab oksüdatiivset stressi (2a), indutseerides varases staadiumis autofagia kaudu vananemist, aktiveerides p53 (2c) ja selle translokatsiooni tsütoplasmast tuumasse (2d). Kui see on kohal, indutseerib see lisaks apoptootilistele geenidele ka rakutsükli peatamise ja vananemisega seotud geenide ekspressiooni, nagu p21, ja surub maha SIRT1 ekspressiooni (2e). p53-sõltumatut p21 ekspressiooni võib indutseerida ka reaktiivsete hapnikuühendite (ROS) või mTOR-i pärssimisega tundmatute mehhanismide abil (2f). ROS indutseerib ka FOXO3A transaktivatsiooni (2g), reguleerides positiivselt SIRT1 ja teiste elusolevate geenide ekspressiooni, näiteks mangaani superoksiidi dismutaas (MnSOD; 2h). RAC3 pärsib autofaagiat (3a) ja p21 aktiveerimist, hõlmates p53 tuuma translokatsiooni (3b) või p53-sõltumatute mehhanismide (3c) blokeerimist. RAC3 võimaldab FOXO3A tuuma rikastamist tundmatu mehhanismi kaudu (3d); suurendab AKT ekspressiooni, aktiivsust (3e) ja tuuma translokatsiooni (3f). FOXO1A fosforüleerimine seriinis 256 Akti poolt soodustab selle inaktiveerimist ja tuumaeksporti (3 g), samas kui SIRT1 deatsetüülimine suurendab selle aktiivsust (3 tundi). Lõpuks võib RAC3 tundmatu mehhanismi abil suurendada hTERT aktiivsust (3i), vältides telomeeri lühenemist (3j) ja p53 aktiveerimist (3k)

Täissuuruses pilt

Lõpuks, nõustudes meie järeldustega ja selle uue kontseptsiooniga RAC3 kui onkogeeni kohta ainult siis, kui see on üleekspresseeritud, võib selle allareguleerimine eakatel inimestel tõenäoliselt olla tuumori supressormehhanism, vältides riskantsete vanade rakkude kloonilist laienemist, millel on kogu elu jooksul kogunenud piisavalt kahjustatud DNA-d . Võib järeldada, et lisaks onkogeenile võib RAC3 pidada vajalikuks molekuliks, mis kontrollitud ekspressiooni korral tagab normaalse kasvu ja arengu.

Materjalid ja meetodid

Rakud ja loomad

Inimese embrüonaalset neeru HEK293, madala RAC3 ekspressiooniga mittetuumoraalset rakuliini, inimese loote WI-38 ja kõrgendatud RAC3 ekspressiooniga kasvaja HeLa rakuliini kultiveeriti DMEM-i kõrge glükoosisisaldusega (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA) millele on lisatud 10% veiseloote seerumit (FBS) (Natocor, Córdoba, Argentina), penitsilliini (100 Ü / ml) ja streptomütsiini (100 mg / ml) ning hoitakse temperatuuril 37 ° C niisutatud atmosfääris 5% CO 2 -ga.

Loomkatsed viidi läbi vastavalt laboratoorsete loomade hooldamise ja kasutamise juhendile, mille avaldas USA Riiklik Terviseinstituut ja mille on heaks kiitnud meie loomaeetikakomitee. Emased Wistari rotid osteti Buenos Airese ülikoolist (Buenos Aires, Argentiina) ja neid hoiti meie loomaaias toidu ja veega ad libitum . Noorte rottide (4 nädala vanused) ja vanade rottide (48 nädala vanused) maksad samast pesakonnast koguti ja neid kasutati valguekstraktide saamiseks. RAC3 ja p21 ekspressioon määrati Western blot meetodil.

Ekspressioonivektorid ja transfektsioon

HEK293 rakud transfekteeriti CaCl2 meetodil 90% efektiivsusega pCMX-RAC3, 5 või pCMX (tühi vektor (EV)) ja valiti stabiilsed kloonid, mis RAC3 üleekspresseerivad või millel on RAC3 piiravad kogused, kasutades 0, 5 μg / ml neomütsiini.

HeLa rakke transfekteeriti, kasutades Lipofectamine 2000 (Natocor), segatud kontrolli (SC) ja pSilencer-RAC3 plasmiidiga (siRNA-RAC3), mis on varem välja töötatud meie laboris. Valiti 36 stabiilset klooni, kasutades puromütsiini 0, 5 μg / ml.

RAC3 ekspressioonitasemed määrati qRT-PCR abil, nagu eelnevalt kirjeldatud. 58

Rakukultuur ja stiimulid

Rakud plaaditi madala tihedusega (50 000 rakku / ml) ja inkubeeriti optimaalse kontsentratsiooni standardiseerimiseks 24 tundi hiljem H2O2 (Sigma, Buenos Aires, Argentina), rapamütsiini (Sigma) või kontrollkeskkonna erinevate kontsentratsioonidega. kutsuda esile genotoksiline vananemine. 24 tunni pärast asendati sööde H202 või rapamütsiiniga värske söötmega ja 6 päeva pärast töötlemist (pt) hinnati proliferatsiooni või vananemist.

Proliferatsioon ja vananemine

Rakkude proliferatsiooni hinnati kristallviolettvärvimise ja kvantifitseerimise abil, mõõtes kontroll- ja töödeldud rakkude neelduvust 570 nm juures 0, 3 ja 6 pt päevadel, ja tulemusi väljendati proliferatsiooni protsendina (standardiseerimise ajal) või proliferatsioonikõverana (hinnati kui korda võrreldes päevaga 0). Sensentsus määrati kontroll- ja töödeldud rakkudes 6. päeval pt-ga, kasutades SAp-Gal testi või Hoechst 33342 (Sigma) värvimist ja suurte tuumade 44, 45 kvantifitseerimist (arvestades vähemalt kolm korda suuremat kui rakupopulatsiooni sööde). SA β- Gal + rakkude või suurte tuumade + rakkude protsent määrati, lugedes fluorestsentsmikroskoopia abil vähemalt 200 rakku slaidi kohta (Olympus BX51, Miami, FL, USA). Autofhagyia määrati kontroll- ja töödeldud rakkudes 24 tunni pt juures, kasutades monodansüülkadaveriini (MDC), et tuvastada happelised vesiikulid, nagu eelnevalt kirjeldatud. 36

Vananemise ja vananemisega seotud valkude määramine

EV- ja RAC3-ga transfekteeritud HEK293 rakud fikseeriti 6. päeval pt-s ja immunofluorestsentstehnika viidi läbi primaarsete antikehade abil p53, p21, p16, FOXO1A, pFOXO1A (ser256) ja SIRT1 ning nende vastavate sekundaarsete antikehade vastu ning neid jälgiti fluorestsentsmikroskoopiaga (Olympus BX51). P21 analüüsi korral kvantifitseeriti fluorestsentsi intensiivsus NIH ImageJ tarkvara abil (Bethesda, MD, USA) ja väljendati suvaliste fluorestsentsi intensiivsuse ühikutena. Mõnel juhul viidi samasugused katsed läbi SC või siRNA-RAC3-ga transfekteeritud HeLa rakkudes.

Samuti koguti rakud alates 6. päevast pt ja tehti üldvalgu ekstrakt, et analüüsida Western blot analüüsi abil. Mõnel juhul viidi tuuma- ja tsütoplasmaatilised ekstraktid läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatule. 58 suure kaaluga valke (RAC3, FOXO, SIRT1) eraldati 8% SDS-PAGE, samas kui keskmise ja väikese massiga proteiinid (tubuliin, p53, AKT, p21) eraldati 15% SDS-PAGE. Valguproovid blotteeriti PVDF membraanile. Pärast inkubeerimist vastavate primaarsete ja sekundaarsete antikehadega töötati blotid välja tugevdatud kemoluminestsentsiga (New England Nuclear, Boston, MA, USA).

Kõigi katsete jaoks määrati NIH ImageJ tarkvara abil suhtelised densitomeetrilised ühikud (RDU) ja muudeti tubuliiniks. Tubuliini kasutati ka tuumaekstrakti tsütoplasmaatilise saastatuse kõrvaldamiseks; Lamina B1 kasutati analüüsitud riba relativiseerimiseks tuumaekstraktis. Kõik antikehad saadi firmast Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), välja arvatud anti-Lamin B1 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA; NBP1-19804).

Telomeraasi aktiivsuse test

SC- või siRNA-RAC3-ga transfekteeritud HeLa rakupelletid resuspendeeriti CHAPS-i lüüsipuhvris (1000 rakku / ml) ja inkubeeriti 30 minutit jääl. Pärast tsentrifuugimist kiirusel 16 000 x g 20 minutit temperatuuril 4 ° C külmutati supernatandi alikvoodid kiiresti ja hoiti temperatuuril -80 ° C. Ekstraktide valgu kontsentratsioon määrati DC valgu testiga (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Telomeraasi aktiivsus määrati SYBR Green RQ-TRAP testiga, kasutades hallituse proteiinisüsaate. See test põhineb protokollil, mida on kirjeldanud Wege jt. 59

FACS

Test viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud. 60 Lühidalt, pärast erinevat töötlemist pesti 2x106 rakke kaks korda PBS-ga ja inkubeeriti öö läbi temperatuuril 4 ° C 50 μg / ml propiidiumjodiidi lahuses (0, 1% naatriumtsitraat, 0, 1% Triton X-100). Proove analüüsiti FACSCanto II voolutsütomeetriga (BD, San Jose, CA, USA) tarkvaraga FACSDiva.

Statistiline analüüs

Kõigil juhtudel viidi läbi vähemalt kolm sõltumatut katset. Tulemused väljendati keskmisena ± SD. Katsetingimuste erinevuste olulisus määrati ANOVA ja Tukey-Krameri mitmekordse võrdlustesti abil paarimata vaatluste jaoks.

Liitumised

Geeniekspressiooni omnibus

  • GSE47739

Sõnastik

CDK

tsükliinist sõltuv kinaas

EV

tühi vektor

FOXO

kahvlikarbi O transkriptsioonitegur

KUI MA

kaudne immunofluorestsents

IGF

insuliinitaoline kasvufaktor

MDC

monodansüülkadaveriin

mTOR

imetajate rapamütsiini sihtmärk

NF-KB

tuumafaktori κ aktiveeritud B-rakkude kerge ahela võimendaja

pt

ravi järel

qRT-PCR

kvantitatiivne reaalajas PCR

RAC3

retseptoriga seotud koaktivaator 3

Rb

retinoblastoomi valk

RDU

suhteline densitomeetriline ühik

SA β- Gal

vananemisega seotud β- galaktosidaas

SC

rüselus

SIRT

vaikse teabe regulaator (sirtuiinid)

TERT

telomeraasi pöördtranskriptaas