Pentoksüfülliin pärsib tlr- ja põletikuliste in vitro põletikuliste tsütokiinide tootmist inimveres, suurendades vastsündinute tõhusust ja tõhusust | laste uuringud

Pentoksüfülliin pärsib tlr- ja põletikuliste in vitro põletikuliste tsütokiinide tootmist inimveres, suurendades vastsündinute tõhusust ja tõhusust | laste uuringud

Anonim

Õppeained

  • Kliiniline farmakoloogia
  • Tsütokiinid
  • Põletikulised haigused
  • Neonatoloogia

Abstraktne

Taust:

Toll- sarnase retseptori (TLR) vahendatud põletik võib kaasa aidata vastsündinute sepsisele, mille jaoks täiendavaks raviks on kandidaat pentoksüfülliin (PTX), mis on fosfodiesteraasi inhibiitor, mis tõstab rakusisest cAMP-d. Kirjeldasime PTX-i põletikuvastast toimet TLR-vahendatud põletikuliste (tuumorinekroosifaktor (TNF) ja interleukiin (IL) -1β) ning proresolution (IL-6 ja IL-10) tsütokiinide tootmisele inimese vastsündinu ja täiskasvanu veres.

Meetodid:

Vastsündinud nööri ja täiskasvanu verd töödeldi enne LPS (TLR4 agonist), R848 (TLR7 / 8 agonist) või LPS / ATP (põletikulise aktiveerimise) stimulatsiooni ajal, ajal või pärast seda PTX-iga (50–400 µmol / l). Tsütokiine mõõdeti multiplekstestiga (supernatandid), rakusiseseid tsütokiine ja signaaliülekande molekule voolutsütomeetria abil ja mRNA-d kvantitatiivse reaalaja PCR abil.

Tulemused:

Kas lisatud 2 tundi enne, samaaegselt või 2 tundi pärast TLR-i stimulatsiooni, pärssis PTX TLR-vahendatud tsütokiini tootmist kontsentratsioonist sõltuval viisil, suurendades vastsündinu vere efektiivsust ja tõhusust, vähendades rakusiseseid TNF-i ja IL-1β suhtelise suhtega IL-10 ja IL-6 säilitamine. PTX vähendas TLR-vahendatud TNF mRNA-d, suurendades samal ajal IL-10 mRNA-d. Vastsündinu plasmafaktorid aitasid kaasa vastsündinud vere PTX põletikuvastasele toimele, mis ei sõltunud lahustuvast TNF retseptori kontsentratsioonist, p38 MAPK fosforüülimisest ja IĸB lagunemisest.

Järeldus:

PTX on tugev ja efektiivne TLR-vahendatud põletikuliste tsütokiinide inhibiitor vastsündinu nabanööri veres ja paljutõotav vastsündinu põletikuvastane aine.

Peamine

Vastsündinu põletikuline vastus perinataalsetele infektsioonidele on seotud suurenenud suremuse ja suurema haigestumusega nagu sepsis, bronhopulmonaarne düsplaasia (BPD) ja tserebraalparalüüs (1, 2). Kortikosteroididel, praegusel vastsündinute valitud põletikuvastasel ravil, on märkimisväärne lühiajaline (nt insuliiniresistentsus) ja pikaajaline (nt kasvu piiramine ja neurodepressiooni puue) kahjulik mõju ( 4). Seega on vastsündinute põletiku raviks rahuldamata kliiniline vajadus kortikosteroidide tõhusate põletikuvastaste alternatiivide järele, millel oleks vähem kahjulik toime.

Ksantiini derivaat pentoksifülliin (PTX) on potentsiaalne põletikuvastane aine. PTX pärsib konkureerivalt fosfodiesteraase erinevates rakkudes ja kudedes, suurendades seeläbi rakusisest cAMP-i, teist messengerit, mis toimib proteiinkinaasi A kaudu, et suruda maha põletikuelsete vahendajate geenitranskriptsiooni, sealhulgas tuumorinekroosifaktorit (TNF) (5, 6). Tänu oma TNF-vastasele aktiivsusele on PTX uuritud loomadel ja täiskasvanutel ning vastsündinutel, et leevendada selliseid põletikulisi seisundeid nagu sepsis, BPD, askooniumi aspiratsioon ja hüpoksiline isheemiline entsefalopaatia (7, 8, 9, 10, 11). Täiskasvanute PTX-i kõrvaltoimete hulka kuuluvad seedetrakti ja kesknärvisüsteemi sümptomid, samas kui terapeutiliste annuste korral on täiskasvanutel olulisi kõrvaltoimeid harva (www.pdr.net/drug-summary/Pentoxifylline, www.fda.gov). Ehkki hiljutised aju- ja / või võrkkesta hemorraagiad on täiskasvanutel vastunäidustused (www.pdr.net/ravimikokkuvõte / fentoksüfülliin), ei ole PTX-ga ravitud septilistel enneaegsetel vastsündinutel intraventrikulaarset hemorraagiat ega veritsevat diateesi täheldatud (7, 12). Hiljutises Cochrane'i ülevaates jõuti järeldusele, et PTX kasutamine vastsündinu sepsise korral antibiootikumide lisana võib vähendada kõigi põhjuste suremust ilma kahjulike mõjudeta (12).

Kuigi esialgsed uuringud näitavad, et PTX võib olla kasulik põletikuvastase ainena in vivo , on selle toimimisest ja mustrituvastuse retseptori radade ulatusest, mida see võib pärssida, veel palju õppida. PTX-i tegevuse põhjalikum kirjeldus seoses (i) teetaolise retseptori (TLR) ja / või põletikulise vahendusega vahendatud tsütokiini induktsiooniga ja (ii) selle suhtelise tõhususe ja efektiivsusega vanusega võib aidata seda paljulubavat edasist arengut põhjustajaks, eriti kuna sepsise kliinilised omadused on vanusega väga erinevad (13). Kooskõlas vastsündinud leukotsüütide tundlikkusega cAMP-telje pärssimise (14) ja endotoksiini teadaoleva signaalimise kaudu TLR4 kaudu, püstitasime hüpoteesi, et PTX võib vähendada TLR-vahendatud tsütokiini tootmist vastsündinutel suurema efektiivsusega võrreldes täiskasvanutega. Nakkusest põhjustatud vastsündinute põletiku mudeliks stimuleerisime vastsündinu nabaväädi ja täiskasvanute perifeerset täisverd TLR4 (LPS või endotoksiin), TLR7 / 8 (R848, imidasokinololiin, mis kutsub esile vastsündinud monotsüütides täiskasvanute põletikulisi tsütokiine) (15), või kombineeritud TLR ja põletikulised aktivaatorid, sealhulgas R848 (15) ja (LPS ja ATP). Selle lähenemisviisi eeliseks on vastsündinud vereplasmas ja erütrotsüütides looduslikult esinevate põletikuvastaste tegurite säilitamine (14, 16, 17), modelleerides seega täpsemini patofüsioloogiliselt olulisi seisundeid (18). Lisaks laiendas meie uuring ka uuritud kaasasündinud signaalimisteede ringi PTX-i tundlikkuse osas, sealhulgas TLR7 / 8 rada, mis on oluline bakteriaalsete ja viiruslike üheahelaliste RNA-de tuvastamiseks (19, 20). Neid täisvereanalüüse kasutades võrdlesime PTX-i mõju TLR-vahendatud tsütokiinide mRNA ekspressioonile, rakusisesetele tsütokiinidele ja supernatandi tsütokiini kontsentratsioonidele nabaväädiveres ja täiskasvanute perifeerses veres. Sellega seotud mehhanismide uurimiseks uurisime vastsündinu plasma moduleerivat mõju PTX ja dibutürüül (db) -cAMP põletikuvastasele toimele. Meie avastused näitasid, et PTX, mida võimendavad vastsündinu plasmafaktorid ja sõltumatult p38 mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) fosforüülimisest või inhibeerivast ĸappa B (IĸB) lagunemisest, pärssis põletikulise tsütokiini vabanemist suurema efektiivsuse ja tugevusega vastsündinul, säilitades samas endogeense interleukiini (IL) ) -6 ja IL-10 tootmine. PTX võib seega pakkuda paljulubavat alternatiivset põletikuvastast ravi vastsündinute põletikuliste seisundite ennetamiseks ja / või raviks.

Meetodid

Katsealused ja inimese vere kogumine

Platsenta nabaväädivere ja täiskasvanute perifeerse venoosse vere kogumine kiideti heaks Stony Brooki ülikooli (Stony Brook, NY) institutsionaalse ülevaate nõukogu poolt ja osalevatelt isikutelt saadi kirjalik teadlik nõusolek. Stony Brooki ülikooli meditsiinikeskuses keisrilõike teel sünnitatud tervislikud vastsündinud vanuses 38–41 rasedusperioodi ilma sünnituseta ja dokumenteeritud emakasisese nakkuseta olid kõlblikud. Emakasisese infektsiooni puudumist määratleti kui kliinilise koorioamnioniidi, loote membraani rebenemise 12 tunni jooksul, mekooniumiga värvitud amnionivedeliku, varase alguse sepsise kliiniliste või laboratoorsete tunnuste või ema või vastsündinu sepsise kultuuriga tõestatud puudumise puudumist. Kliiniliseks koorioamnioniidiks loeti ema temperatuuri ≥37, 8 ºC sünnitusel või kuni 2 tundi pärast sünnitust ja kahte või enamat järgmistest tunnustest: emaka hellus, mädane või ebameeldiva lõhnaga tupest väljumine, ema või loote tahhükardia või ema leukotsütoos (21). . Nööriverd koguti kohe pärast platsenta manustamist naatriumhepariini tuubidesse, mis sisaldasid 15 ühikut / ml hepariini (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), platsenta looteküljel asuvate veenide punktsiooni teel, kasutades steriilset tehnikat, nagu eelnevalt kirjeldatud (22). ).

Välistamiskriteeriumid hõlmasid juba olemasolevaid haigusseisundeid, nagu diabeet ja autoimmuunhaigused, ning raseduse komplikatsioone, sealhulgas preeklampsiat, loote kromosomaalseid või peamisi kaasasündinud anomaaliaid, emakasisese kasvu piiramist, asfiksiat ja immuunvastust potentsiaalselt mõjutavaid eluohtlikke ema- või lootehaigusi. Stony Brooki ülikooli värvati terved täiskasvanud vereloovutajad vanuses 18 kuni 55 aastat. Isiku registreerimisel koguti osalejaga vestluse teel kõlblikkuse kontrollimiseks põhilisi demograafilisi, meditsiinilisi ja sünnitusabiandmeid. Välistamiskriteeriumid koosnesid mis tahes meditsiinilistest seisunditest, mis võivad mõjutada katsealuste immuunvastust, nagu rasedus, diabeet, vähk või autoimmuunhaigus, ja mis tahes nakkused viimase kuu jooksul.

Vereproovide in vitro stimulatsioon ja ravi

Proove hoiti toatemperatuuril ja töödeldi 2 tunni jooksul. Veri lahjendati 1: 1 steriilse eelsoojendatud (37 ° C) Roswelli pargi mälestusinstituudiga (RPMI) 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) ja 96-süvendilise koekultuuri igasse süvendisse lisati lõppmaht 200 μl. töödeldud ümarapõhjalised polüstüreenplaadid (Becton Dickinson). Proove töödeldi PTX (Tocris, Minneapolis, MN) või vehiiklikontrolliga, stimuleeriti TLR agonistidega ja kultiveeriti temperatuuril 37 ° C niisutatud inkubaatoris 5% C02 juures. TLR4 stimuleerimiseks kasutati LPS (LPS E. coli O111-st: Ultrapuhas B4, InveivoGen, San Diego, CA), TLR7 / 8 stimuleerimiseks R848 (InvivoGen) või LPS, millele järgnes 5 mmol / l ATP (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) 20 minutit põletikulise induktsiooni jaoks. Pärast valmimist tsentrifuugiti proove in situ kiirusega 500 g 10 minutit toatemperatuuril. Umbes 120 μl supernatanti ühe süvendi kohta koguti hoolikalt, ilma rakupellette häirimata, ja hoiti kuni analüüsimiseni temperatuuril –80 ° C. Kõigis kultuurikatsetes ja immuunanalüüsides kasutati dubleeritud tehnilisi kordusi, samas kui reaalajas PCR katsed viidi läbi kolmes korduses. Erinevate doonorite vereproove kasutavate iseseisvalt tehtud katsete arv oli iga katse jaoks näidatud. TLR-agonisti stimuleerimise optimaalne kestus erinevate katseprotseduuride jaoks määrati eelnevate kineetiliste uuringutega.

Tsütokiini kontsentratsiooni mõõtmine kultuuri supernatantides

Supernatandi tsütokiini kontsentratsioonid määrati Bio-Plex Pro magnetiliste multiplekside testidega (Bio-Rad, Hercules, CA) ja neid analüüsiti Bio-Plex 200 süsteemis tarkvaraga Bio-Plex Manager 5.0 (Bio-Rad). Tsütokiini kontsentratsioone väljendati protsentides võrreldes ainult TLR agonistidega, määratuna 100%.

Reaalajas PCR

Pärast erütrotsüütide lüüsi eraldati kultiveeritud täisverest kogu RNA, kasutades QIAamp RNA Blood Mini komplekte (Qiagen, Valencia, CA). Genoomne DNA eemaldati RNaasivaba DNaasiga (Qiagen). Kasutati pöördtranskriptsiooni suure mahtuvusega cDNA pöördtranskriptsiooni komplekte (Life Technologies, Foster City, CA). Reaalajas PCR viidi läbi kasutades TaqMan geeni ekspressioonitesti (Life Technologies). Genoomse DNA ekspressiooni võimaluse minimeerimiseks valiti eksoniühendusi katvad sondid alati, kui neid on tootjalt saadaval. Kõigi geeniekspressioonianalüüside korral genoomse DNA amplifikatsiooni puudumise kinnitamiseks ei kasutatud pöördtranskriptsiooni kontrolli. Beetaktiin toimis normaliseerimise kontrollina ja multipleksiti kõigisse reaktsiooniaukudesse. Majapidamisgeeni ja sihtgeenide mittesekkumise tagamiseks tehti kõigi geeniekspressioonitestide testimine esiteks, võrreldes nende amplifikatsiooni efektiivsust ühekordse plex-analüüsina nende amplifikatsiooni efektiivsusega, kui see oli multipleksitud majapidamisgeeniga. Reaktsioonid viidi läbi StepOne Plus reaalajas PCR-süsteemil (Life Technologies), kasutades TaqMan Fast Advanced Master Mix (Life Technologies). Andmeid analüüsiti delta-delta lävetsükli (ΔΔC T ) meetodil (23).

Voolutsütomeetria

Proovid valmistati Cytofixi / tsütopermi fikseerimise / permeabiliseerimise komplektiga (BD Biosciences, San Jose, CA) koos (TNF, IL-6 ja IL-10) või ilma (IL-1β) Brefeldin A lisamisega. Pärast eeltöötlemist PTX-ga või vehiikli kontroll 2 tundi, stimuleeriti proove TLR agonistidega ja kasvatati 6 tundi temperatuuril 37 ° C 5% C02- s . Pärast pinna värvimist kasutati punaste vereliblede lüüsi FACS Lysing Solution (BD) abil. Pärast fikseerimist ja permeabiliseerimist värviti proovid monoklonaalsete antikehadega (PE-Cy7-konjugeeritud hiire anti-TNF / kloon MAb11, PE-konjugeeritud hiire anti-IL-6 / kloon AS12, APC-konjugeeritud roti anti-IL-10 / klooniga JES3). -19F1, PE-konjugeeritud hiire anti-IL-1 / kloon AS10) või neile vastavad isotüübi kontrollid. Proove analüüsiti LSR Fortessa voolutsütomeetril (BD). Kompensatsioonhelmeid (BD Comp Beads, BD) kasutati ühevärvilise positiivse ja negatiivse kontrollina. Monotsüüdid sunniti CD45 + / CD14 + rakkudena hajutama nii edasi kui ka küljelt (PerCP-Cy5.5-konjugeeritud hiire anti-CD45 / kloon 2D1, FITC-konjugeeritud hiire anti-CD14 / kloon M5E2). Iga seisundi kohta saadi 10 000 monotsüüdi andmed ja neid analüüsiti tarkvaraga Kaluza versioon 1.3 (Beckman Coulter, Jersey City, NJ). Pärast isotüübi kontrollide lahutamist määrati kõigi monotsüütide geomeetriline keskmine fluorestsentsi intensiivsus.

Proovid p38 MAPK fosforüülimise ja kogu IĸB mõõtmiseks eeltöödeldi PTX või vehiiklikontrolliga 2 tundi ja stimuleeriti 15 minuti jooksul TLR agonistidega, millele järgnes viivitamatu punaliblede lüüs ja fikseerimine, kasutades Lyse / Fix Bufferit (BD). Pärast permeabiliseerimist Permi puhvriga II (BD) värviti proovid samaaegselt sobivate pinna- ja rakusiseste antikehadega (AF647-konjugeeritud hiire anti-p38 (pT180 / pY182) / kloon 36 või AF647-konjugeeritud hiire anti-IĸBa / kloon 25 / IĸBa) / MAD-3).

Hemotsüütide eraldamine ja resuspensioon homoloogilises ja heteroloogses plasmas

Nagu eelnevalt kirjeldatud (14), eraldati vastsündinute ja täiskasvanute hemotsüüdid plasmast pärast tsentrifuugimist 1000 g juures toatemperatuuril 10 minutit. Plasmaproove puhastati täiendavalt tsentrifuugimisega 3000 g juures 10 minutit. Hemotsüüte pesti kolm korda Hanki puhverdatud soolalahuses ja resuspendeeriti autoloogses või heteroloogses plasmas.

Endotoksiinide testimine

Kõiki immuunmodulaatoreid ja TLR agoniste, välja arvatud LPS, kontrolliti endotoksiinivabadena (<0, 1 EU / ml) Limulus amebotsüütide lüsaadi testiga (Charles River, Wilmington, MA).

Statistiline analüüs

Iga tsütokiini supernatandi ja rakusisese kontsentratsiooni võrdlemiseks katsealuste rühmade vahel kasutati lineaarseid segamudeleid annuse ja ravivastuse andmete saamiseks. Kovalentsusstruktuur ravimi kontsentratsioonide vahel subjektil modelleeriti ühendisümmeetriana. Järelejäänud normaalsuse tagamiseks võib tsütokiinide väärtusi ja ravimi kontsentratsioone logi järgi muuta. Geeniekspressiooni andmete jaoks kasutati lineaarset segamudelit, et iga geeni ΔΔ C T väärtusi eraldi analüüsida. Kovalentsus katsealuse kahe ajapunkti vahel modelleeriti struktureerimata variatsioonina ja ajahetkel erinevate stimulatsioonide ja töötluste kovariatsioon modelleeriti ühendisümmeetriana. Analüüsideks kasutati SAS 9.3 (SAS Institute, Cary, NC) statistilist tarkvara ja tulemuste graafikute koostamiseks GraphPad Prism versiooni 6.01 (tarkvara GraphPad, San Diego, CA). Selle uuringu uurimusliku iseloomu tõttu ei rakendatud mitut katsete kohandamist (24). Kõik statistilised testid olid kahepoolsed ja leide peeti oluliseks P <0, 05 juures.

Tulemused

Võrreldes täiskasvanute verega, näitas vastsündinute veri vähenenud LPS-i indutseeritud TNF, kuid kõrgendatud IL-10 tootmist

Kooskõlas varasemate avaldatud aruannetega (25, 26) näitas vastsündinud veri LPS-i indutseeritud TNF-i vähenenud produktsiooni, kuid võrreldav IL-6, IL-1β ja R848-indutseeritud TNF-i tootmisega täiskasvanu verega. Seevastu LPS-, R848- ja LPS / ATP-indutseeritud IL-10 kontsentratsioonid olid vastsündinud veres kõrgendatud ( joonis 1 ). Need tulemused näitavad, et meie in vitro täisvere analüüsisüsteem modelleeris vastsündinute puhul kirjeldatud tüüpilise vanuse ja TLR-raja mudeli (27).

Image

Eristatav TLR- ja / või põletikulise toimega tsütokiinide tootmine inimese nabanööri ja täiskasvanu veres. Tervete vastsündinute ( n = 10) ja perifeerse vere ( n = 10) nabaväädi verd, lahjendatud 1: 1 RPMI 1640-ga, stimuleeriti 10 ng / ml LPS, 1 μg / ml R848 või LPS, millele järgnes 5 mmol / l ATP 20 minutit põletikulise induktsiooni jaoks. Proove kultiveeriti 6 tundi temperatuuril 37 ° C 5% C02- s . Keskmine (± SEM) supernatant (a) TNF, b) IL-1β, c) IL-6 ja (d) IL-10 kontsentratsioon vastsündinutel (

Image
) ja täiskasvanud (
Image
). T-testides kasutatud rühmade võrdlustes ilmnesid olulised erinevused: * P <0, 05, ** P <0, 01 ja P <0, 001. ATP, adenosiintrifosfaat; IL, interleukiin; RPMI, Roswelli pargi mälestusinstituut; TNF, tuumori nekroosifaktor; TLR, teemaksulaadne retseptor.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

PTX-i inhibeeritud vastsündinu veres suurema efektiivsuse ja tõhususega TLR-vahendatud põletikuline tsütokiinide tootmine

Välja arvatud mõõdukas basaalse IL-1β inhibeerimine kõrge kontsentratsiooni korral (400 umol / l), ei mõjutanud üksi lisatud PTX tsütokiini tootmist stimuleerimata inimese veres (vt lisajoonis S1 veebis). Kui lisati 2 tundi enne TLR-i stimuleerimist, siis PTX pärssis TLR agonisti vahendatud põletikulisi tsütokiine kontsentratsioonist sõltuval viisil. Kasutades lineaarseid segamudeleid, avaldas PTX LPS-i indutseeritud TNF-i inhibeerimist võrreldes IL-1β-ga oluliselt suuremat ja TLR4 (LPS) inhibeerimist oluliselt suuremat kui TLR7 / 8 (R848) põhjustatud TNF-i vastsündinu või täiskasvanu veres ( joonis 2a, Lisajoonis S2 veebis). Kooskõlas meie hüpoteesiga näitas PTX vastsündinul märkimisväärselt suuremat LPS-, R848- ja põletikulise põhjustatud TNF-i produktsiooni pärssimist võrreldes täiskasvanu verega ( joonis 2a, tabel 1 ) ning R848-indutseeritud IL-1β ja IL-6 suuremat inhibeerimist. tootmine vastsündinud veres (vt lisa joonis S2 veebis). Enamik vastsündinud proove näitas TLR-vahendatud TNF suuremat inhibeerimist kõigis ravimi kontsentratsioonides (vt lisajoonis S3 veebis). LPS-i indutseeritud TNF-i produktsiooni inhibeeriva kontsentratsiooni 50 (IC50) PTX-i inhibeeriva kontsentratsiooni (ICP) hindamiseks kasutati mittelineaarset tugevat sobivust (GraphPad Prism), mis vastsündinutel oli 49, 8 µmol / l ja täiskasvanute veres 93, 5 µmol / l.

Image

PTX pärssis TLR- ja / või põletikulise toimega vahendatud TNF-i tootmist, mille efektiivsus vastsündinute veres oli suurem. Nööri ( n = 10) ja täiskasvanu verd ( n = 10), lahjendatud 1: 1 RPMI 1640-ga, eeltöödeldi PTX-iga või vehiikli kontrolliga 2 tundi. Proove stimuleeriti 10 ng / ml LPS, 1 μg / ml R848 või LPS-ga, millele järgnes 5 mmol / l ATP 20 minutit põletikulise aktiveerimise jaoks, ja kasvatati 6 tundi temperatuuril 37 ° C 5% C02- s . Mõõdeti supernatandi tsütokiini kontsentratsioonid ja tulemusi väljendati protsentides võrreldes ainult TLR agonistidega, määratuna 100%. a ) TLR-vahendatud TNF keskmised (± SEM) kontsentratsioonid vastsündinutel (

Image
) vs täiskasvanu veri (•) vastusena ekvimolaarsele PTX-le. Andmeid analüüsiti lineaarsete segamudelitega ja näidati olulisi erinevusi vastsündinute ja täiskasvanute proovide vahel ekvimolaarses PTX kontsentratsioonis: * P <0, 05, ** P <0, 01 ja P <0, 001. b) vastsündinu TNF-IL-10 keskmised (± SEM) kontsentratsiooni suhted (
Image
) ja täiskasvanute proovid (•), mis on joonistatud PTX kontsentratsiooni alusel. Võrreldes vastavate töötlemata vastsündinute ja täiskasvanute kontrollproovidega (vastavalt hallid ja mustad punktiirjooned) oli näidatud PTX-iga ravitud vastsündinu (hallid märgid) ja täiskasvanud (mustad märgid) vere suhte olulist langust TNF-IL-10 suhtes. ATP, adenosiintrifosfaat; IL, interleukiin; RPMI, Roswelli pargi mälestusinstituut; PTX, pentoksüfülliin; TNF, tuumori nekroosifaktor; TLR, teemaksulaadne retseptor.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Täissuuruses tabel

PTX vähendas TLR-vahendatud TNF-i kõigil testitud kontsentratsioonidel vastsündinu ja täiskasvanu veres ( tabel 1 ), ehkki suurema efektiivsusega vastsündinutel ( joonis 2a ). Kui LPS / ATP ja R848 põhjustatud IL-1β vabanemise pärssimine saavutati täiskasvanute veres ainult kontsentratsioonidega ≥ 100 µmol / l, siis PTX vähendas LPS-, R848- ja LPS / ATP-indutseeritud IL-1β kõigil testitud kontsentratsioonidel sealhulgas vastsündinu veres 50 umol / l ( tabel 1 ). See näitab, et PTX inhibeerib vastsündinul suurema toimega TLR agonisti vahendatud IL-1β. Kui PTX vähendas LPS-, R848- ja LPS / ATP-indutseeritud IL-6-d kõigil vastsündinu proovides testitud kontsentratsioonidel, ei mõjutanud see R848-indutseeritud IL-6 täiskasvanute veres ( tabel 1 ).

PTX vähendas TLR-vahendatud TNF-IL-10 kontsentratsiooni suhet vastsündinu ja täiskasvanu veres

PTX pärssis LPS-, R848- ja LPS / ATP-indutseeritud IL-10 tootmist vastsündinud veres, kuid vähendas ainult R848-indutseeritud IL-10 täiskasvanu vere suuremates kontsentratsioonides ja suurendas tegelikult LPS-i ja LPS / ATP-indutseeritud IL-d -10 täiskasvanute proovides ( tabel 1 ). PTX inhibeeris eelistatavalt TLR-vahendatud TNF-i võrreldes IL-10 tootmisega, nii et PTX netoefekt pidi vähendama LPS-, R848- ja LPS / ATP-indutseeritud TNF-IL-10 kontsentratsiooni suhet mõlemas vastsündinu ja täiskasvanu veri ( joonis 2b ).

PTX selektiivselt inhibeeritud TLR-vahendatud rakusisesed põletikulised tsütokiinid vere monotsüütides

Vastsündinud monotsüüdid näitasid LPS-i indutseeritud rakusisese TNF ekspressiooni oluliselt madalamat ekspressiooni kui täiskasvanud rakud ( joonis 3a ), mida R848 puhul ei ilmnenud (vt lisajoonist S4a võrgus). Eeltöötlus PTX-ga vähendas LPS- ( joonis 3b ) ja R848-indutseeritud (vt täiendav joonis S4b võrgus) rakusisest TNF-i ja IL-1β vastsündinud ja täiskasvanute monotsüütides, kuid ei mõjutanud rakusiseseid IL-6 ja IL-10.

Image

PTX lisamine täisverele inhibeeris LPS-i indutseeritud monotsüütilist rakusisest TNF-i ja IL-1β. Nööri ( n = 5) ja täiskasvanu verd ( n = 5), lahjendatud 1: 1 RPMI 1640-ga, eeltöödeldi 200 umol / l PTX-iga või vehiiklikontrolliga 2 tundi. Proove stimuleeriti 10 ng / ml LPS-ga ja kasvatati 6 tundi temperatuuril 37 ° C 5% C02-s Brefeldin A juuresolekul (TNF, IL-6 ja IL-10) või puudumisel (IL-1β). Pärast mitmevärvilist värvimist voolutsütomeetria jaoks, nagu on kirjeldatud peatükis Meetodid , saadi M45 andmed CD45 + / CD14 + monotsüütide kohta, mis olid suletud eel- ja külghajumisega. a ) vastsündinu LPS-indutseeritud rakusiseste tsütokiinide MFI (± SEM) väärtused (pärast isotüübi kontrollide lahutamist) (

Image
) vs täiskasvanud monotsüüdid (
Image
). ( b ) PTX mõju LPS-i indutseeritud rakusisesele TNF-le ja IL-1β-le vastsündinul (
Image
) ja täiskasvanud monotsüüdid (
Image
), mis on näidatud kui rahaloomeasutuste voldi muutused võrreldes stimuleerimata kontrollidega. ( c ) ja ( d ) MFI representatiivne histogramm LPS-i indutseeritud rakusisese TNF korral CD45 + / CD14 + ( c ) vastsündinud ja ( d ) täiskasvanud vere monotsüütides PTX juuresolekul või puudumisel. Andmeid analüüsiti lineaarsete segamudelitega ja märgiti olulised erinevused: * P <0, 05, ** P <0, 01, P <0, 001. ATP, adenosiintrifosfaat; IL, interleukiin; MFI, keskmine fluorestsentsi intensiivsus; RPMI, Roswelli pargi mälestusinstituut; PTX, pentoksüfülliin; TNF, tuumori nekroosifaktor.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

PTX-i mõju TLR-vahendatud tsütokiini tootmisele vastsündinu ja täiskasvanu veres oli ajastust sõltumatu

Järgmisena otsustasime, kas viivitatud PTX-i lisamine tuvastatud põletikule, võrreldes eelravi või samaaegse manustamisega, oleks ikkagi efektiivne. Joonis fig 4a näitab proovi stimuleerimise ja ravi järjestust ning kestust. PTX (50 või 200 umol / l) vähendas LPS- ja R848-indutseeritud TNF, IL-1β ja IL-6 kontsentratsiooni vereproovides, mida töödeldi 2 tundi enne, samaaegselt või 2 tundi pärast TLR-i stimuleerimist ( joonis 4b, c ), ehkki vähenenud efektiivsusega ja potentsiga hilinenud ravi korral. PTX-i viivitus 4 tundi kaotas aga selle põletikuvastase toime R848-indutseeritud tsütokiinide tootmisele ja vähendas oluliselt LPS-i indutseeritud tsütokiinide pärssimist (vt lisajoonis S5 veebis).

Image

PTX pärssis tsütokiini tootmist vastsündinute ja täiskasvanute veres, olgu siis lisatud enne TLR-i agonisti stimuleerimist, ajal või pärast seda. Vastsündinu ( n = 5) ja täiskasvanu verd ( n = 5), lahjendatud 1: 1 RPMI 1640-ga, stimuleeriti 10 ng / ml LPS või 1 μg / ml R848. Proove töödeldi vehiiklikontrolli või 50 või 200 umol / l PTX-ga, lisati kas 2 tundi enne, samaaegselt või 2 või 4 tundi pärast TLR-i stimuleerimist. Pärast LPS või R848 lisamist kultiveeriti proove veel 6 tundi. Supernatandi tsütokiine väljendati protsentides võrreldes ainult TLR agonistidega, määratuna 100%. Viivitatud raviproovide korral lahutati põletikuvastase ravi alguses mõõdetud tsütokiinide kontsentratsioonid vastavatest viivitatud raviproovidest, et mitte alahinnata hilinenud ravi mõju. ( a ) Stimuleerimise ja ravi järjestus ja kestus (põletikuvastane ravi PTX-iga: - - põletikuline stimulatsioon LPS või R848 abil: - - -). PTX ajastuse ja kontsentratsiooni (keskmine ± SEM) mõjud (PTX puudub:

Image
, 50 μmol / l PTX:
Image
, 200 μmol / l PTX:
Image
) vastavalt b ) LPS- ja ( c ) R848-indutseeritud tsütokiinide produktsioonist vastsündinu ja täiskasvanu veres. Iga tsütokiini ja stimulatsiooni iseseisvaks analüüsimiseks viidi läbi lineaarne segamudel. Kovalentsusstruktuur PTX kontsentratsioonide vahel subjektil modelleeriti struktureerimata dispersioonina ja sama kontsentratsiooni ajapunktide kovariatsioonistruktuur modelleeriti ühendisümmeetriana. Näidati olulisi erinevusi ajapunktide vahel: * P <0, 05, ** P <0, 01, P <0, 001. PTX-ga töödeldud proovide tsütokiini produktsiooni olulist langust, mis arvutati log-muundatud toore pg / ml väärtuste põhjal, näidati kui §. PTX, pentoksüfülliin; RPMI, Roswelli pargi mälestusinstituut; TLR, teemaksulaadne retseptor.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Vastsündinu plasmafaktorid suurendasid LPS-i indutseeritud TNF produktsiooni pärssimist PTX-iga

Et teha kindlaks, kas inimese vastsündinud nabanööri vereplasma erinev koostis võib aidata kaasa PTX-i kindlale põletikuvastasele toimele, suspendeeriti vastsündinud ja täiskasvanute hemotsüüdid autoloogses või heteroloogses plasmas ( joonis 5a ), nagu eelnevalt kirjeldatud (14). Nagu on näidatud joonisel 5b, tugevdas vastsündinu plasma LPS-i indutseeritud TNF produktsiooni pärssimist vastsündinutel, kuid mitte täiskasvanute hemotsüütides. Seevastu ei vastsündinute ega täiskasvanute plasmafaktorid moduleerinud db-cAMP TNF-i supresseerivaid toimeid ( joonis 5c ). LPS-vahendatud lahustuvad TNF-i retseptorid I (TNF-RI) ja II (TNF-RII), kuigi esinevad vastsündinutel oluliselt kõrgemates kontsentratsioonides kui täiskasvanu veres (vt lisajoonis S6a Internetis), ei muutunud vastusena suurenevale PTX kontsentratsioonile ( vaata lisajoonist S6b võrgus).

Image

Lahustuvad tegurid vastsündinu plasmas suurendasid PTX-i TNF-i pärssivat toimet. ( a ) Hemotsüüdid eraldati tsentrifuugimisega nöörist või täiskasvanu plasmast ja pesti kolm korda Hanksi puhverdatud soolalahuses. Vastsündinu või täiskasvanu hemotsüüdid resuspendeeriti 100% autoloogses või heteroloogses plasmas. Proove eeltöödeldi 2 tundi PTX, db-cAMP või vehiiklikontrolliga, stimuleeriti 10 ng / ml LPS-ga ja kultiveeriti 6 tundi, millele järgnes supernatantide kogumine tsütokiini mõõtmiseks. Vastsündinute ja täiskasvanute kohordi ja ravi iseseisvaks analüüsimiseks viidi läbi lineaarne segamudel. Põletikuvastane kontsentratsioon modelleeriti pideva muutujana. Kovariatsiooni struktuur subjektil esinevate homoloogiliste ja heteroloogsete proovide vahel modelleeriti struktureerimata variatsioonina ja sama homoloogse ja heteroloogse proovi dooside kovariatsioonistruktuur modelleeriti ühendisümmeetriana. LPS-i indutseeritud TNF keskmiste kontsentratsioonide võrdlusena vastusena ekvimolaarsele PTX-le või db-cAMP-le homoloogsetes ja heteroloogsetes proovides kasutati t- teste ( * P <0, 05, ** P <0, 01, P <0, 001), samas kui F- testid võrdlesid nende üldised ravivastuse kõverad. ( b ) ja ( c ) illustreerivad vastavalt PTX ja db-cAMP kontsentratsioonist sõltuvat mõju LPS-i indutseeritud TNF-i produktsiooni (keskmine ± SEM) pärssimisele vastsündinutel (

Image
) ja täiskasvanute homoloogsed (•) ja vastsündinud (
Image
) ja täiskasvanute heteroloogsed (
Image
) vere protsent, ainuüksi LPS-stimuleerimise korral määratletakse kui 100%. LPS-i indutseeritud TNF produktsiooni inhibeerimine PTX poolt homoloogsetes vs heteroloogsetes vastsündinutes ( F- test: P <0, 05) ja täiskasvanute veres ( F- test: NS), LPS-i indutseeritud TNF produktsiooni inhibeerimine db-cAMP abil homoloogsetes vs. heteroloogne vastsündinu ( F- test: NS) ja täiskasvanu veri ( F- test: NS). PTX, pentoksüfülliin; TNF, tuumori nekroosifaktor; TLR, teemaksulaadne retseptor.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

PTX vähendas TLR agonistidest indutseeritud TNF mRNA-d, parandades samal ajal IL10 mRNA-d täisveres

TLR agonistid indutseerisid põletikulisi tsütokiine, tuumafaktori ĸappa B (NFĸB) - ja IĸB-ga seotud geene kodeerivate mRNA-de ekspressiooni, samas kui TLR-geeni ekspressioon vähenes ja IL-10 mRNA püsis muutumatuna (vt lisa tabelit S1 veebis). PTX allapoole reguleeritud TLR agonisti ja põletiku poolt indutseeritud TNF mRNA ja suurendas oluliselt IL-10 mRNA 1 ja 2 tunniga ( joonis 6, täiendav tabel S2 veebis). TLR-agonisti indutseeritud pro-IL-1β ja IL-6 mRNA suurenesid mööduvalt vastusena PTX-le ( joonis 6, täiendav tabel S2 veebis). Märkimist väärib see, et PTX inhibeeris LPS-i või R848-indutseeritud TLR, NFĸB või IBBa ekspressiooni vähe või üldse mitte (vaata lisajoonist S7 võrgus ja lisatabelit S2 võrgus).

Image

PTX vähendas selektiivselt LPS-i indutseeritud põletikulist TNF mRNA-d täisveres, suurendades samal ajal põletikuvastase IL-10 geeni ekspressiooni. Nööri ( n = 5) ja täiskasvanu verd ( n = 5), lahjendatud 1: 1 RPMI 1640-ga, eeltöödeldi 200 μmol / l PTX või vehiikli kontrolliga 2 tundi ja kultiveeriti 1 tund ( a ) või 2 tundi ( b). ) 10 ng / ml LPS juuresolekul. Kogu RNA eraldati täisverest, pöördtranskribeeriti ja mRNA suhteline ekspressioon (keskmine ± SEM) vastusena PTX-le, võrreldes ainult LPS-iga, defineerituna 100%, määrati ΔΔC T väärtuste põhjal reaalajas PCR-ga. Vastsündinu ja täiskasvanu proovide tulemused ühendati ( n = 10). Näidati olulisi erinevusi LPS-iga stimuleeritud proovide vahel, mida oli eelnevalt töödeldud või mitte PTX-iga: * P <0, 05, ** P <0, 01, P <0, 001. IL, interleukiin; RPMI, Roswelli pargi mälestusinstituut; PTX, pentoksüfülliin; TNF, tuumori nekroosifaktor; TLR, teemaksulaadne retseptor.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

PTX ei muutnud p38 MAPK fosforüülimist ja IĸBa lagunemist vastsündinud ja täiskasvanud monotsüütides

Vastsündinud monotsüüdid näitasid vähenenud LPS- ja R848-indutseeritud kogu IĸBa (vt täiendav joonis S8a veebis). Kui LPS ja R848 kutsusid esile vastsündinud ja täiskasvanud monotsüütides p38 MAPK fosforüülimise ja kogu IĸBa lagunemise, siis PTX lisamine neid parameetreid ei muutnud (vt lisajoonis S8b võrgus).

Arutelu

Meie uuring iseloomustas PTX võimet moduleerida TLR-vahendatud tsütokiini tootmist inimese vastsündinud ja täiskasvanu täisveres, mida on testitud in vitro . Vastsündinute põletikku juhib osaliselt TLR-i signaalimine ja see võib aidata kaasa peremehe kaitsele nakkuste eest (27, 28, 29, 30). TLR-vahendatud tsütokiinide esilekutsumine võib siiski kaasa aidata ka patoloogiale ja haigustele, sealhulgas varase elu põletikulistele haigustele nagu sepsis, BPD ja perinataalne ajukahjustus (31, 32, 33). PTX, mittespetsiifiline fosfodiesteraasi inhibiitor, mis vähendab põletikuliste tsütokiinide transkriptsiooni, on paljulubav põletikuvastane kandidaat vastsündinutele. Tuginedes meie varasematele aruannetele vastsündinud leukotsüütide tundlikkuse kohta cAMP-telje pärssimise suhtes (14), püstitasime hüpoteesi, et PTX võib vähendada TLR-vahendatud tsütokiini tootmist suurema vastsündinute efektiivsusega võrreldes täiskasvanutega.

Kooskõlas eelnevate uuringutega märkisime ära vähenenud LPS- ja LPS / ATP-indutseeritud, kuid kõrge R848-indutseeritud TNF ja TLR-vahendatud IL-10 produktsiooni nabanööri veres (25, 26). Meie uuringus kasutati kogu nabaväädi verd, et uurida PTX-i mõju vastsündinute põletikulisele tsütokiini tootmisele. Meie in vitro uuringu olulisuse suurendamiseks kasutati PTX-i kliiniliselt olulistes kontsentratsioonides (34). Näiteks oli 60 mg / kg / päevas PTX-i manustamine pideva intravenoosse infusioonina 12 tunni jooksul kolme järjestikuse päeva jooksul septilistes enneaegsetes vastsündinutes hästi talutav ja selle tulemuseks oli seerumi mõõdetud kontsentratsioon 51, 7 ± 18, 1 µmol / l PTX (34). Kooskõlas meie leidudega on täiendava PTX kliinilistes uuringutes vastsündinu sepsise korral kasutatud PTX annuseid 30–60 mg / kg / päevas (8, 12), mis on seotud seerumi TNF kontsentratsiooni olulise vähenemisega (8).

Näitasime, et PTX pärssis LPS- ja R848-indutseeritud TNF-i ja R848-indutseeritud IL-1β ja IL-6 tootmist inimese vastsündinul efektiivsemalt ja tõhusamalt kui täiskasvanu veri. LPS-i indutseeritud TNF PTX inhibeerimine oli oluliselt suurem kui R848, see viitab stiimulist sõltuvatele põletikuvastastele vastustele. NFĸB raja (TNF) PTX pärssimine oli samuti suurem kui põletikulise raja (IL-1β) pärssimine. Lisaks vähendas PTX LPS-, R848- ja LPS / ATP-indutseeritud TNF-IL-10 kontsentratsiooni suhet vastsündinu ja täiskasvanu veres kõigil testitud PTX kontsentratsioonidel. Need leiud on kooskõlas LPS-i või PHA-indutseeritud põletikuvastaste tsütokiinide ja IL-10 varem teatatud diferentsiaalse regulatsiooniga PTX ja db-cAMP abil (35, 36). Meie uuring laiendas tulemusi PTX tsütokiini regulatsiooni kohta TLR7 / 8 ja põletikuliste radade suhtes. Ehkki PTX inhibeeris vastsündinute ja täiskasvanute proovides LPS-i indutseeritud IL-10 ja R848-indutseeritud IL-10 tootmist, tegi see seda vähemal määral kui TNF-i produtseerimise suunas, vähendades netofunktsiooni TNF-i-IL-ni. 10 suhe. Tõepoolest, PTX-i suurenenud TLR-vahendatud IL-10 mRNA ekspressioon oleks selle selgitusega kooskõlas. Ehkki me ei täheldanud IL-10 suurenemist PTX-i (50–400 µmol / l) stimuleerimata veres, teatati, et PTX väga kõrge kontsentratsioon (1 mmol / l) suurendab IL-10 täiskasvanute veres (36). PTX võib seega stimuleerivalt ja kontsentratsioonist sõltuvalt parandada IL-10 tootmist.

Meie leiud rakusiseste tsütokiinide kohta monotsüütides olid kooskõlas täisvere supernatandi tsütokiini tulemustega. PTX vähendas TLR-vahendatud rakusiseseid TNF ja IL-1β vastsündinute ja täiskasvanute monotsüütides, samal ajal kui IL-6 ja IL-10 ei muutunud, kinnitades selle aine erinevat mõju põletikuvastasele ja põletikuvastasele tsütokiini tootmisele (35).

PTX vähendas tõhusalt vastsündinute ja täiskasvanute veres põletikulisi tsütokiine, kui neid kasutada enne, samaaegselt või 2 tundi pärast TLR-i stimuleerimist. Selles ulatuses, milles meie in vitro andmed peegeldavad tingimusi, mis võivad olla olulised in vivo , võib seda ainet seega kasutada nii profülaktiliselt kui ka terapeutiliselt põletiku raviks. PTX-i võimaliku kasuliku mõju hindamiseks põletikule ja haigustele on vaja teha katseid in vivo , nii loomsepsise mudelites kui ka kliinilistes uuringutes inimestega.

PTX vähendas TLR agonisti ja põletiku põhjustatud TNF mRNA-d, parandades samal ajal IL-10 mRNA-d. See viitab sellele, et PTX avaldab oma toimet pro- ja põletikuvastaste tsütokiinide transkriptsiooni modifitseerimise kaudu, mis on kooskõlas tema cAMP-sõltuva põletikuvastase rajaga (5, 6, 35).

Vastsündinud monotsüüdid näitasid vähenenud LPS- ja R848-indutseeritud IĸBa fosforüülimist võrreldes täiskasvanud rakkudega, nagu eelnevalt kirjeldatud (37). Kui LPS ja R848 suurendasid nii p38 MAPK fosforüülimist kui ka IĸBa lagunemist vastsündinud ja täiskasvanud monotsüütides, siis PTX neid parameetreid ei muutnud. See viitab sellele, et PTX avaldab oma immunomoduleerivat toimet kas allavoolu ja / või neist põletikulistest radadest sõltumatult.

Kooskõlas vastsündinute plasma varem avaldatud põletikuvastase toimega (16), peegeldades osaliselt adenosiini (14) panust, viitavad meie katsed, et vastsündinu plasma tugevdas LPS-i indutseeritud TNF-i produktsiooni pärssimist vastsündinutel, kuid mitte täiskasvanute hemotsüütides. Seevastu ei vastsündinute ega täiskasvanute plasma ei moduleerinud db-cAMP TNF-i pärssivat toimet, viidates sellele, et vastsündinu plasma võib tugevdada PTX-i põletikuvastast toimet kas ülesvoolu või rakusisest cAMP-st sõltumatult.

Lahustuvad tsütokiini retseptorid, mis toimivad endogeensete põletikuvastaste faktoritena, on perinataalsel perioodil nabanööri ja vastsündinu veres suurenenud (16, 38). Meie leiud kõrgenenud lahustuvate retseptorite TNF-RI ja TNF-RII sisalduse kohta vastsündinu vereplasmas on kooskõlas nende aruannetega. Kuid lahustuvad TNF-retseptorid ei vastutanud PTX-i suurema põletikuvastase toime eest vastsündinud veres.

Meie in vitro katsed viidi läbi täiskasvanute täisvere ja tervete vastsündinutega, kes olid ilma põletikuta ja ilma sünnituseta. Edaspidistes uuringutes tuleks uurida põletikuvastast toimet PTX suhtes veres, mis on saadud täiendavalt kliiniliselt olulistest sihtpopulatsioonidest, sealhulgas vaginaalselt manustatud vastsündinutelt (kuna sünnitus võib mõjutada põletikulist reaktsiooni ja selle modulatsiooni PTX-i poolt), emakasisese infektsiooni ja põletikuga kokku puutunud vastsündinutest, septilistest vastsündinutest, ja vastsündinud sündisid enneaegselt. Lisaks võiks kaaluda proove muudest anatoomilistest sektsioonidest, mida tavaliselt mõjutavad liialdatud põletikulised reaktsioonid, näiteks hingetoru aspiraadiproovid ventileeritud vastsündinutelt (39).

Kokkuvõtlikult võib öelda, et meie uuringus kasutati PTX-i põletikuvastase toime iseloomustamiseks TLR-i ja / või põletikulist agonistidega stimuleeritud kogu nabaväädi verd. Näitasime, et PTX pärssis TLR-vahendatud põletikuliste tsütokiinide tootmist inimese vastsündinu kõrgema efektiivsuse ja tõhususega võrreldes täiskasvanu verega, säilitades suhteliselt IL-10 vastused. R848 aktiveeritud aktiivsus TLR7 / 8 raja kaudu vallandatud põletikuliste reaktsioonide suhtes näitab potentsiaalset kasulikkust bakteriaalsete RNA-d sisaldavate bakternakkuste põhjustatud põletiku vastu, mis võib esile kutsuda tugeva põletiku TLR7 / 8 (20) kaudu, aga ka üheahelaliste viiruste, näiteks HIV ja gripp (19). PTX avaldas põletikuvastast toimet, kui seda kasutati profülaktiliselt või samaaegselt põletiku stimuleerimiseks või kui seda manustati kestva põletiku korral. PTX, mis toetab vastsündinute Th2 tsütokiini mustrit, mida iseloomustab madal TNF, kuid kõrge IL-10 ja IL-6 (26, 27), võib seega pakkuda lootustandvat põletikuvastast ravi vastsündinutele ja hiljuti on tõepoolest tehtud suuremaid kliinilisi kliinilisi uuringuid selles populatsioonis algatatud (8). Kui meie in vitro uuringud peegeldavad PTX mõju in vivo , võib see olla eriti efektiivne vastsündinu nakkuse põhjustatud põletiku vähendamisel. Tõepoolest, meie kogemus teiste põletikuvastaste ainete, näiteks bakteritsiidset läbilaskvust suurendava valgu, mis in vivo neutraliseerib endotoksiini, in vitro hindamisel toetab selle analüüsisüsteemi ennustamisvõimet (40). Lõpuks viitavad vanusega raviainete eristatavad põletikuvastased toimed, nagu on näidatud meie eksperimentaalses mudelis musterituvastuse retseptori agonistidega stimuleeritud vastsündinu ja täiskasvanute verega, mida ravitakse PTX-iga, et selle valdkonna translatsioonilises arengus tuleks arvestada immuunsusega.

Finantstoetuse avaldus

ES-i laborit toetavad rahaliselt Little Angel Fund NICU tugirühm, Selden, NY, ja Pediaatria osakonna sisemiste toetuste programmi osakond, Stony Brooki lastehaigla ja Stony Brooki ülikooli meditsiinikool, Stony Brook, NY. OL-i laborit toetab USA riiklike tervishoiuinstituutide (NIH) toetus R01AI100135-01 ja selle administratiivsed lisad, samuti riiklike allergia ja nakkushaiguste instituutide (NIAID) adjuvandide avastamise programmi leping nr HHSN272201400052C. Rahastavad organid ei mänginud mingit rolli uuringu kavandamisel, andmete kogumisel, analüüsimisel ja tõlgendamisel, käsikirja kirjutamisel ja käsikirja avaldamiseks esitamise otsuses.

Avalikustamine

Autorid kinnitavad, et uuritavates toodetes pole rahalisi sidemeid ega huvide konflikte, mida avalikustada.

Täiendav teave

Wordi dokumendid

  1. 1

    Täiendav joonis S1

  2. 2

    Täiendav joonis S2

  3. 3

    Täiendav joonis S3

  4. 4

    Täiendav joonis S4

  5. 5

    Täiendav joonis S5

  6. 6

    Täiendav joonis S6

  7. 7

    Täiendav joonis S7

  8. 8

    Täiendav joonis S8

  9. 9

    Lisalaud S1