Kloroplastide kontaktivaba rakusisene seondumine in vivo | teaduslikud aruanded

Kloroplastide kontaktivaba rakusisene seondumine in vivo | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Biofüüsika
  • Optiline manipuleerimine ja pintsetid

Abstraktne

Kontaktivaba rakusisest seondumist ja kontrollitavat manipuleerimist kloroplastidega in vivo demonstreeriti optilise kiudondi abil. 980-nm laserkiire käivitamine kiusse, mis asetati umbes 3 μm kõrgemale elustaime ( Hydrilla verticillata ) lehe pinnast, võimaldas mitmesugusel arvul kloroplastide stabiilset sidumist, samuti nende paigutamist ühemõõtmelisteks ahelateks ja kahemõõtmelised massiivid lehe sees, ilma et see kahjustaks kloroplasti. Lisaks transporditi moodustunud kloroplasti ahelaid kontrollitavalt elusate rakkude sees. Katsetulemuste selgitamiseks arvutati kloroplastidele avaldatud optiline jõud. See meetod pakub paindlikku meetodit rakusisese organellide interaktsiooni uurimiseks kõrgelt organiseeritud organellide ja organellide vahelise kontaktiga in vivo mittekontaktsel viisil.

Sissejuhatus

Rakusisesed organellide interaktsioonid mängivad olulist rolli raku aktiivsuse säilitamises, samuti raku lagunemises ja surmas 1, 2, 3 . Organellide otsene interaktsioon, nagu organellide tihe kokkupuude, mida tuntakse organellide membraaniga kokkupuutumiskohtadena, võib hõlbustada organellide kommunikatsiooni, koordineerida raku funktsioone ja tagada ioonide ( nt Ca 2+ ) ja lipiidide läbipääs organellide vahel 4, 5, 6, 7 . Kloroplastid on taimerakkudes tüüpilised organellid, mis on olulised fotosünteesiks ja taimegeenide inseneriks, seega sõltub kogu elu maa peal kloroplastidest 8, 9 . Kloroplastide otsese kontakti uurimisel on võimalik tuvastada fotosünteesi ja kloroplasti signalisatsiooni eest vastutavad mehhanismid 10 . Selle protsessi dünaamilise olemuse tõttu tsütoplasmaatilise voolavuse tõttu on elusrakkudes olevate organellide otsest kontakti raske uurida. Seda küsimust saab lahendada, uurides organellide kasutamist in vitro 11 või kasutades standardset keemilist fikseerimist ja kõrgsurvefaasis fikseerimist, et luua raku sees staatiline keskkond 12 . In vitro uuringud ei pruugi siiski bioloogilisi aktiivsusi kajastada täpselt keskkonna keerukuse ja variatsiooni tõttu in vivo 13 . Lisaks kahjustavad fikseerimistehnikad rakke ja ei suuda elusate rakkude loomulikus olekus tagada 14, 15 . Organellide koostoime täpsem uurimine on väga soovitav kontaktivaba meetod, mida saab kasutada organellide in vivo manipuleerimiseks ja sidumiseks ilma kahjustusteta. Elarakkude pildistamine ja fluorestsentsvalkude sildid pakuvad kasulikke vahendeid organellide koostoime uurimiseks 10, 16 . Need meetodid vajavad siiski keerukaid seadmeid ja täiendavaid silte.

Optilised manipulatsioonid, mis on saadud ühekiire optilistest püünistest, mida nimetatakse optilisteks pintsettideks, võivad olla sobivad meetodid mitteinvasiivsete ja kontaktivabade organellidega manipuleerimiseks. Optiline manipuleerimine on välja töötatud võimsa vahendina 17 ja seda on edukalt rakendatud bioloogiliste proovide, näiteks rakkude 18, viiruste 19 ja DNA 20, manipuleerimiseks. Samuti on teatatud üksiku molekuli 21, organellide 22, 23, osakeste 24, 25 ja punaste vereliblede 13 optilisest manipuleerimisest in vivo või elusrakkudes. Lisaks on osakesed kinni püütud ja seotud langevate valgusväljade ümberjaotumisega osakeste 26, 27, 28, 29 abil . Ehkki optiline manipuleerimine on osutunud kasulikuks rakusiseste organellide püüdmiseks taimerakkudesse ja seentesse 23, 30 , 31, pole rakusiseste organellide massiivi järjestatud in vivo mustrimist siiani saavutatud. Tavalistest optilistest pintsettidest, mis põhinevad optilisel mikroskoobil, keskendudes suure numbrilise avaga objektiivi ja suuremahulise optilise süsteemi vaba ruumi laserkiirele, on muutunud võimsateks tööriistadeks ühe ja mitme osakese manipuleerimiseks. Tavapäraste optiliste pintsettide abil kasutatavad meetodid, näiteks holograafilised optilised pintsetid, saavad ka suurema kiirguse 17, 32 genereerimiseks manipuleerida suurema hulga osakestega ja orgaanilise valguse ruumilise valguse modulaatoriga. Optilistel pintsettidel on siiski mõned piirangud, mis tulenevad nende keerukatest ja kallitest juhtimisseadmetest (galvaanilised peeglid, akustilisoptilised deflektorid, ruumilise valguse modulaatorid) ja optilistest süsteemidest (mikroskoobi objektiivid). Õnneks on kiudoptilistel optilistel pintsetidel 33, 34, 35 tõestatud sobivus bioloogiliseks manipuleerimiseks ja optiliseks sidumiseks 28, 36, 37 . Võrreldes optiliste pintsettidega on optiliste kiudude sondid (OFP-d) miniatuursemad, käepärasemad ja hõlpsamini kasutatavad. Selles uuringus käsitleme mittekontaktilist optilist meetodit kloroplastide rakusiseseks sidumiseks ja elusas taimelehes kloroplasti ahelate moodustamiseks OFP abil.

Tulemused

Joonis 1 näitab eksperimentaalset seadistamist. Lühidalt asetati taimeleht tasasele klaasile. Elujõulisuse säilitamiseks sukeldati leht vette ja kogu taim mähiti niiskesse puuvillasse. Kiu kitsenev ots asetati taimelehe kohale ja seda manipuleeriti kuueteljelise mikrolülituse (SAM) abil täpsusega 50 nm. Kiudondi ja lehe vahelist kaugust saab SAM-iga kontrollida. Katseprotsessi jälgimiseks kasutati 100 × mikroskoobi objektiivi (Union, HISOMET II-DH II), mille numbriline ava oli 0, 73, piltide ja videote jäädvustamiseks aga arvutiga ühendatud CCD kaamerat. PC-ekraani vaateväljas on kogu suurendus 1000x. Proovi valgustati proovi põhjast lambi abil.

Image

Kiudoptiline sond (OFP) ühendati 980 nm laineallikaga ja ots asetati taimelehe kohale. Punased nooled piki kiudu tähistavad tala levimissuunda. Kiud kaeti klaasist kapillaariga ja manipuleeriti kuueteljelise manipulaatoriga. Protsesside eksperimentaalseks vaatluseks kasutati mikroskoopi, piltide ja videote jäädvustamiseks aga arvutiga ühendatud CCD-kaamerat.

Täissuuruses pilt

Joonis fig 2a näitab OFP skemaatiliselt taimelehe kohal, mille kiu tipu ja lehe vahel on umbes 3 μm vahe kloroplastide optiliseks sidumiseks taimerakus. Joonisel fig 2a kujutatud sümbol näitab selles katses kasutatud sukeldatud vesiroosid, Hydrilla verticillata , mida tavaliselt kasutatakse kloroplastide vaatlemiseks ja uurimiseks. Nagu on näidatud joonisel 2b, kiududesse lastud laseriga lainega 980 nm, püüti mesofülli rakkudes olevad kloroplastid kinni ja seoti omavahel, millele järgnes kloroplastide ahela moodustamine. Tuleb märkida, et kasutati 980-nm laserit, kuna enamikul elusmaterjalidel on selle lainepikkuse 38, 39 madal neeldumine.

Image

a ) OFP skeem on aslants, mis asetatakse taime lehe kohal laseriga lainepikkusel 980 nm. Sildil on klaasklaasil elav taim ( Hydrilla verticillata ). ( b ) Klooroplastide optilise sidumise skeem taimerakus näitab Fg ja F koostöö tulemusel kloroplastide rida, mis on optilises teljes piiratud ja üksteisega seotud. c ) Katses kasutatud OFP optiline mikroskoopiakujutis, mis näitab järsult kitsenevat kuju läbimõõduga, mis vähenes 5, 1 μm-lt 700 nm-ni 6, 1 μm-ni x- suunas. OFP koonusnurk a oli 74 °. d ) Taimeraku kloroplasti eestvaade. e ) Klooroplasti külgvaade taimerakus. f ) Taimerakkude ( Hydrilla verticillata ) neeldumisspekter nähtava ja lähedase infrapuna lainepikkustel. g ) simuleeritud optilise energia voolu jaotus. Parempoolne paneel on normaliseeritud energiavoolu jaotus fookustasandil ( x = 15, 2 μm) y- suunal. h ) normaliseeritud energiavoolu jaotus piki OFP-telge x- suunas, kui y = 0 μm. i ) Kloroplastile x- suunas avaldatav optiline jõud ( F x ) sõltuvalt kaugusest D OFP lõpuni. Sees on F x arvutamise skeem.

Täissuuruses pilt

Joonis fig 2c näitab OFP optilist mikroskoopiapilti, mis valmistati kaubandusliku üherežiimilise optilise kiu kuumutamisel ja joonistamisel. Kiu tipu kuju saab muuta, juhtides tõmbekiirust. OFP läbimõõt vähenes järk-järgult 8, 0-lt 5, 7 μm-ni pikkusega 20, 6 μm, seejärel vähenes järsult 5, 1 μm-lt 700 nm-ni 6, 1 μm-ni. OFP kitsenurk oli α = 74 °. Joonis fig 2d on elava taime kloroplasti optiline mikroskoopiline eestvaade, joonis fig 2e on külgvaade. Kloroplast oli ellipsoidne, pea- ja kõrvaltelje läbimõõdud olid vastavalt 2, 3 ± 0, 1 μm ja 1, 2 ± 0, 1 μm. Joonis fig 2f näitab taimerakkude neeldumisspektrit. Sellel joonisel saadud tulemused näitavad, et 980 nm valguse neeldumine oli 8%, mis oli pisut suurem kui 1064 nm valguse neeldumine (6%). Seega sobivad mõlemad kaks lainepikkust taimerakkudes optiliseks koputamiseks.

OFP optilise sidumisvõime näitamiseks simuleeriti OFP-st normaliseeritud optilise energia voolu jaotuse väljundit lõplike elementide meetodil, kasutades Comsol Multiphysics 4.4 ja see on näidatud joonisel 2g. Simulatsioonis seati 980-nm laseri võimsus 35 mW-ni ning OFP ja vee murdumisnäitajad seati vastavalt 1, 44 ja 1, 33. Tänu järsult kitsenevale kujule on laserikiir fokuseeritud kiudotsa otsa lähedale. Joonisel 2h on näidatud energiavoolu jaotus piki OFP-telge x- suunas ( y = 0). Kõige tugevama valgustugevusega fookustasapind oli x = 15, 2 μm ( st 6, 8 μm kiu tipust eemal). Joonise 2h parempoolsel paneelil on optilise energia vool fookustasandil ( x = 15, 2 μm) y- suunal. Täislaius poole maksimaalse väärtuse korral (FWHM) oli 1, 8 μm, mis oli võrreldav kloroplastide suurusega, nii et neid oleks võimalik OFP optilisel teljel piirata. Joonis 2i näitab arvutatud optilisi jõude ( Fx ), mis avaldatakse kloroplastile mööda OFP-telge teljekauguse D funktsioonina OFP-i lõpuni. Fx koosneb gradiendijõust F g , mis püüab kloroplastid kõrge intensiivsusega piirkonna poole, ja hajumisjõust F s, mis juhib kloroplastid valguse levimise suunal. Kloroplastide liikumiskiirus ( V ) määratakse optilise jõu ( F x ) ja Stokese'i tõmbejõu ( F tõmbe ) tasakaaluga, seetõttu saab optilist jõudu F x arvutada vastavalt Stokesi seadusele 40 :

Image

kus μ on taimeraku tsütoplasmaatiline viskoossus, mis toatemperatuuril on hinnanguliselt 3, 0 × 10 –2 Pa · s (vt üksikasju lisainformatsioonis) ja d v on määratletud kera läbimõõduga koos sama maht kui ellipsoidaalsel kloroplastiga. D v = 1, 8 ± 0, 1 μm mõõdetud väärtus. Ja K on kuju tegur 43 :

Image

kus S on kloroplasti pindala. Selles katses kasutatud kloroplastide puhul on hinnanguline K 1, 15 ± 0, 09.

Tsütoplasmaatilise voogesituse tekitatud voolav jõud mõjutab arvutatud optilise jõu tulemusi. Selles uuringus rakendati voolavuse mõju minimeerimiseks kahte meetodit. (1) Kuna tsütoplasmaatiline voog toimus lahtri keskosas peamiselt y- suunas, valiti see sektsioon optilise jõu mõõtmiseks x- suunas. (2) Katse viidi läbi rakus suhteliselt aeglase tsütoplasmaatilise voo kiirusega (keskmine kiirus alla 0, 4 ± 0, 1 μm / s). Neile kahele meetodile tuginedes oli voolav jõud optilise jõu suhtes x- suunas üsna väike ja sellel polnud tulemustele ilmset mõju.

Nagu on näidatud joonisel 2i, on piirkonna D <9, 5 μm (R1) korral Fx > 0, mis näitab, et F s on suurem kui F g . Seega lükatakse selle piirkonna kloroplastid OFP-st eemale. Kloroplasti puhul 9, 5 μm < D <17, 8 μm (R 2 ), F x <0, mis näitab, et selles piirkonnas on domineeriv jõud Fg ja kloroplastid jäävad lõksu. D > 17, 8 μm (R 3 ) korral F x > 0, mis näitab, et selles piirkonnas asuvad kloroplastid tõukavad minema. Kui D > 20, 9 μm, väheneb F x valguse intensiivsuse languse tõttu järk-järgult, suurenedes D.

OFP-sse lastud 980 nm laserkiirega olid OFP optilise telje kõrval olevad kloroplastid kinni ja piiratud teljega põikisuunalise F g abil ( y- suunas). Seejärel seoti kloroplastid tihedalt ja moodustasid pikisuunalise Fg abil x- suunas kloroplastide ahela ( x- suunas). Joonised 3a – d näitavad taimerakkudes moodustatud kolme, nelja, viie ja kuue kloroplasti ahelaid vastavalt optilise sisendvõimsusega P = 30, 35, 42 ja 50 mW. Nagu on näidatud joonisel 3c, oli teise ja kolmanda kloroplasti vahel vahe Dg = 4 μm, kuna kaks esimest kloroplasti jäid Fg kinni ja viimased kolm tõukasid Fs minema. Joonis fig 3e näitab kloroplastide ahelasse lõksu jäänud suurima kloroplastide arvu ja sisendi optilise võimsuse suhet. Tulemused näitavad selgelt, et kloroplastide arv ahelas tõukejõu piirkonnas (R 3 ) suureneb optilise sisendjõu suurenemisega optilise jõu suurenemise tõttu. Püügipiirkonnas (R 2 ) täheldati aga suurimaid kloroplastiarveid, mille optiline võimsus suurenes, kui P <45 mW. Kui P > 45 mW, siis kloroplasti suurim arv enam optilise võimsuse suurenemisega ei muutunud ja kloroplasti maksimaalne arv oli kuus. Püügipiirkonna suurusel oli maksimaalne väärtus, mis optilise võimsuse suurenemise korral ei muutunud. Tuleb märkida, et püüdmispiirkonda saab laiendada, suurendades OFP koonusnurka α. Joonis 3f näitab kahe kloroplasti (tähistatud A ja B) trajektoori taimerakus. Enne seondumist liikusid kloroplastid A ja B tsütoplasmaatilise voolavuse ja Browni liikumise tõttu vastavalt keskmiselt 1, 3 ± 0, 2 ja 1, 0 ± 0, 1 μm / s. OFP püüdmispiirkonda liikudes püüti kaks kloroplasti kinni ja seoti 980 nm laseriga võimsusega 25 mW umbes 20 s. Sidumisasendid kõikusid vastusena keskkonna kõikumistele ja Brownide liikumisele. Edasised katsed näitasid, et kloroplastid A ja B liikusid pärast laser väljalülitamist sidumisasendist eemale keskmise kiirusega vastavalt 1, 3 ± 0, 1 ja 1, 0 ± 0, 1 μm / s.

Image

( ad ) Kolme, nelja, viie ja kuue kloroplasti ahela optilised mikroskoopiakujutised, mis on moodustatud vastavalt P = 30, 35, 42 ja 50 mW optilisel sisendvõimsusel. Skaalariba on 5 μm. e ) ahelatesse kinni jäänud kloroplasti arvud ( N ) optilise sisendvõimsuse funktsioonina. f ) Taimeraku kahe kloroplasti trajektoor. Silt näitab kahe kloroplasti seostumist. Asukohaandmeid saadi iga 2 s järel.

Täissuuruses pilt

Moodustunud kloroplastide ahelat saab OFP liigutamisega rakkudes paindlikult transportida. Joonis fig 4 näitab kloroplastide ahela transporti y- suunas. T = 0 juures moodustati kambri keskele nelja kloroplastiga ahel, mille optiline võimsus oli 35 mW ja mis oli OFP optilisel teljel stabiilselt piiratud põiki Fg (joonis 4a). Liigutades OFP-d y- suunas keskmise kiirusega 3, 4 ± 0, 2 μm / s, veeti kett 10, 3 μm- y suunas 3, 0 sekundi jooksul (joonis 4b). Seejärel transporditi kett OFP liigutamisega + y suunas. Lisaks sellele veeti ahelat 9, 5 μm + y suunas 2, 8 sekundi jooksul keskmise kiirusega 3, 4 ± 0, 1 μm / s (joonis 4c). Katse näitas ka seda, et transportimisel ei pääsenud ahelast kloroplastid. Stabiilse kloroplastide ahela säilitamiseks transpordiprotsessis, optilise võimsusega 35 mW, on OFP maksimaalne liikumiskiirus ( V m ) 7, 5 ± 0, 2 μm / s. Kuna optiline jõud suureneb optilise võimsuse suurenemisega, võib optilise võimsuse suurendamisega saavutada suurema V m . Näiteks optilise võimsuse 60 mW korral saavutas maksimaalne liikumiskiirus V m 13, 1 ± 0, 2 μm / s. Joonis fig 4d näitab transporditud vahemaad, joonis fig 4e aga näitab keti liikumiskiirust liikumisaja funktsioonina t t optilise võimsusega 35 mW. Oluline on märkida, et põiksuunaline ( y- suunas) tsütoplasmaatiline voog põhjustas raku transportimise ajal keti optilise telje ümber pöörlemise.

Image

( ac ) keti optilised mikroskoopiakujutised y-suunalise transpordi ajal. Skaalariba on 5 μm. ( a ) t = 0, moodustati kambri keskele nelja kloroplastiga ahel, mille optiline võimsus oli 35 mW. ( b ) t = 3, 0 s, ahelat transporditi 10, 3 μm suunas - y . ( c ) t = 5, 8 s, ketti veeti 9, 5 μm + y suunas. d ) vahemaa, mille jooksul kett liikus y- suunas aja funktsioonina Δ t , optilise võimsusega 35 mW. Maksimaalne liikumine 10, 3 μm toimus Δt = 3, 0 juures. e ) ahela kiirus y- suunas funktsioonina Δ t.

Täissuuruses pilt

Kuna välja töötatud meetod näitas olevat võimeline indutseerima kloroplastide transporti, laiendati ühemõõtmelist organellide-organellide kontakti kahemõõtmelisele (2D) organellide-organellide kontaktile, sidudes kaks kloroplastide rida. Joonised 5a1 ja 5b1 näitavad 2D organellide-organellide kontaktprotsessi, joonised 5a2 ja 5b2 aga eksperimentaalseid mikroskoopia pilte. Laskmisega 980 nm laserkiirega, mille optiline võimsus on 35 mW, moodustati kõigepealt OFP otsa lähedale nelja kloroplastiga ahel (joonis 5a) ja seejärel liigutati ahel teistele kloroplastidele lähenemiseks, liigutades OFP koos keskmine kiirus 3 ± 0, 2 μm / s. Esimese ahela kõrval olevad kloroplastid püüdsid põiki Fg ( y- suunas) kinni ja moodustasid esimese ahela lähedal teise ahela. Selle tulemusel seoti kaks ahelat üksteisega ja moodustus 2D kloroplastide massiiv (joonis 5b). Joonised 5c1 ja 5c2 näitavad, et kaks kloroplastirea numbrit N = 4 ja 10 moodustati kaks kloroplasti rida, mille optiline võimsus oli vastavalt 30 ja 45 mW. 2D organellide ja organellide kontakti stabiilsuse määramiseks tsütoplasmaatilise voogesituse ajal viidi läbi täiendav katse 2D kloroplastide massiivi hoidmiseks kloroplastiga N = 6. Tulemused näitasid, et 2D kloroplastide massiivi hoiti stabiilselt üle 10 min, kuni laser lülitati välja tsütoplasmaatilise voo kiirusel 0, 9 ± 0, 1 μm / s. Kollased punktid joonisel 5c tähistavad kloroplasti keskmeid, mis moodustasid rööpküliku.

Image

( a, b ) 2D organelle-organelle kontaktprotsessi skemaatilised ja mikroskoopilised kujutised. c ) Kaks rida kloroplaste, millel on erinev arv kloroplasti.

Täissuuruses pilt

Arutelu

Kloroplasti transport on teadaolevalt elusate taimerakkude looduslik nähtus, mis võimaldab kloroplastide ümberjaotumist, mis võib parandada fotosünteesi tõhusust ja vältida tugeva valguse põhjustatud kahjustusi. Tavaliselt võtab see protsess elavates rakkudes üle tunni 44 . Klooroplastide kiiret ja tõhusat ümberjaotamist saab saavutada, kasutades välja töötatud optilist meetodit, et juhtida kloroplastide kontrollimist elusate rakkude sees. Lisaks saab siin kirjeldatud meetodit kasutada kloroplastide transportimiseks kokkupuutel teiste organellidega nagu mitokondrid ja endoplasmaatiline retikulum, et võimaldada uurida ristkõnesid kloroplastide ja teiste organellide vahel.

Klooroplastide hästi reguleeritud massiive saaks moodustada välja töötatud meetodi abil. Huvitav on see, et sellised hästi reguleeritud biomaterjalide massiivi struktuurid on looduses olemas 45 . Rakkude ja rakkude kontakti uurimiseks on kasutatud mikromustrilistel materjalipindadel asuvaid kunstlikult hästi reguleeritud rakumassiive 46 . Sarnaselt võiks organellide ja organellide vahelist kontakti, eriti teabe ja materjali vahetust organellimembraanide kontaktkohtade kaudu, uurida, optiliselt muundades elavate rakkude hästi reguleeritud 2D kloroplastide massiive, kasutades seda optilist meetodit.

Selle meetodi rakendamiseks in vivo on oluline, et rakk oleks rakusisese organellide kontakti uurimisel elujõuline. Taimerakkude elujõulisuse testimiseks viidi in vivo läbi veel üks katse. Tsütoplasmaatiline voogesitus näitab tervena elavat rakku ja raku elujõulisuse kontrollimiseks saab kasutada kloroplastide liikumist, mis tulenes tsütoplasmaatilisest voogesitusest 47 . Korduvad eksperimentaalsed vaatlused näitasid, et taimerakkude elujõulisust ei mõjutanud kiirgus 20 minuti jooksul optilise võimsusega 65 mW. Ehkki kloroplaste kasutati objektidena optilisel sidumisel ja organellide-organellide kokkupuutel, oleks kontaktivaba meetod efektiivne ka teiste rakusiseste osakeste puhul, mille murdumisnäitaja on suurem kui ümbritseval keskkonnal, näiteks mitokondrid ja kromosoomid.

Tuleb märkida, et optiline jõud oli katsetes ligikaudne. Optiliste jõudude täpne mõõtmine in vivo on keerukas keeruka keskkonna tõttu elusrakkudes. Need väljakutsed hõlmavad raskusi tsütoplasma viskoossuse ja elastse komponendi mõju hindamisel tsütoplasmas. Täpsemalt, komponentide keeruline ruumiline jaotus elusrakkudes muudab tsütoplasmaatilise viskoossuse täpse mõõtmise in vivo palju keerulisemaks. Seetõttu hinnati meie katsetes konkreetsete rakkude mitmeid parameetreid ( nt korrelatsiooni pikkus ξ ) eelnevalt kirjeldatud mudeli 42 põhjal . Lisaks on tsütoplasma teadaolevalt viskoelastne tsütoskeleti filamentide (antud juhul aktiini) olemasolu tõttu, mis takistavad organellide liikumist. Selle küsimuse lihtsustamiseks eeldati käesolevas uuringus, et tsütoplasma on Newtoni vedelik. Optilise jõu täpsemal mõõtmisel tuleks arvestada tsütoplasma elastse komponendi mõjuga. Aktiini mõju välistamiseks viidi läbi täiendav katse, milles aktiin depolümeriseeriti ja kloroplasti kiiruse ja optilise jõu mõõtmiseks peatati tsütoplasmaatiline voogesitus. Täpsemalt, aktiin depolümeriseeriti, sukeldades lehti 5 μM latrunkuliin B lahusesse 9 minutiks temperatuuril 25 ° C. Joonisel 6 on näidatud kloroplasti kiirus x- suunas sõltuvalt kloroplasti ja optilise kiudondi vahelisest kaugusest enne ja pärast aktiini depolümeriseerimist. On näha, et kiiruse tulemused enne aktiini depolümeriseerimist ja pärast aktiini depolümeriseerimist on pisut erinevad. Kuna optiline jõud on võrdeline kiirusega, ei olnud optilisele jõule ilmset mõju. Sellest tulenevalt võib järeldada, et elastsel komponendil pole tulemustele ilmset mõju ja katsetes domineeris optiline jõud. Tuleb märkida, et väikese kiiruse suurenemise pärast depolümerisatsiooni võis põhjustada vähenenud tsütoplasmaatiline viskoossus 48 .

Image

Kloroplasti liikumise kiirus x- suunas sõltuvalt kloroplasti ja optilise kiudondi vahelisest kaugusest enne ja pärast aktiini depolümeriseerimist. Punased nooled piki raku seina sisemuses näitavad tsütoplasmaatilise voolavuse suunda.

Täissuuruses pilt

Järeldus

Kokkuvõtlikult demonstreerisime optilist meetodit kloroplastide kontaktivaba rakkudevahelise seondumise indutseerimiseks in vivo, kasutades kiudoptilist sondi. Käivitatud optilise võimsusega vahemikus 30 kuni 50 mW lainepikkusel 980 nm moodustusid elavates taimerakkudes stabiilsed kloroplasti ahelad kloroplasti arvuga 2 kuni 6. Veelgi enam, kloroplasti ahelaid saab kontrollitavalt rakkudes transportida ja moodustada erineva kloroplasti numbriga 2D kloroplasti massiivideks. Taimerakkude elujõulisust hinnati ka pärast optilise võimsuse suurendamist 65 mW-ni ja rakkude allutamist 20-minutisele kiirgusele. Katsed näitasid, et meetod ei mõjutanud rakkude elujõulisust. See mitteinvasiivne ja kontaktivaba organellide sidumise ja manipuleerimise meetod on kasulik in vivo bioloogilistes ja biokeemilistes uuringutes, eriti rakusiseste organellide vahelise signaaliülekande ja kommunikatsiooni uurimiseks organellide ja organellide organiseeritud kontakti kaudu.

Lisainformatsioon

Kuidas seda artiklit tsiteerida : Li, Y. et al. Kloroplastide mittekontaktiline rakusisene seondumine in vivo . Sci. Rep. 5, 10925; doi: 10.1038 / srep10925 (2015).

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.