Nanokurkumiini – pürrokinoliini preparaat hoiab ära hüpertroofiast põhjustatud patoloogilised kahjustused, leevendades hüpoksilistes tingimustes kardiomüotsüütide mitokondrite stressi | eksperimentaalne ja molekulaarne meditsiin

Nanokurkumiini – pürrokinoliini preparaat hoiab ära hüpertroofiast põhjustatud patoloogilised kahjustused, leevendades hüpoksilistes tingimustes kardiomüotsüütide mitokondrite stressi | eksperimentaalne ja molekulaarne meditsiin

Anonim

Õppeained

  • Südame hüpertroofia
  • Prognostilised markerid

Abstraktne

Selles uuringus uuritakse nanokurkumiini (NC) ja pürrokinoliinkinooni (PQQ) sisaldava nanokurkumiini preparaadi terapeutilist toimet hüpertroofiseeritud primaarsete vatsakeste kardiomüotsüütide (HVCM) leevendavale hüpoksia põhjustatud stressile hüpoksilistes tingimustes, nagu on kinnitatud Sprague-Dawlis. kroonilise hüpobaarse hüpoksia (cHH) põhjustatud parema vatsakese hüpertroofia (RVH) rotimudel. Varasemate leidude põhjal analüüsisime siin NCF-i kaitseefektiivsuse paranemist mitokondrite kahjustuste vastu. Elektronide transpordiahela komplekside tegevust analüüsiti mitokondriaalse homöostaasi peamise operatsioonikeskusena koos mitokondrite biogeneesi, redoksfunktsiooni, rasvhapete oksüdatsiooni, bioenergeetilise defitsiidi ja rakkude ellujäämise võtmegeenide ja valkude markeritega. NCF-i täiendus tagab tsütokaitse hüpoksiast põhjustatud hüpertroofia ja kahjustuste eest nii in vitro kui ka in vivo mudelites, säilitades mitokondrite homöostaasi paremini kui ainult NC ja PQQ. Selles uuringus pakutakse NCF-i kasutamist potentsiaalse kandidaatmolekulina kaitseks tõusuteel esinevate kõrgmäestiku põhjustatud halvatuste eest.

Sissejuhatus

Pikaajaline hüpoksiast põhjustatud hüpertroofia võib põhjustada patoloogilisi kahjustusi kardiomüotsüütides, mis ilmnevad kahjustatud mitokondriaalse homöostaasi kujul. 1, 2, 3, 4 Mitokondrite optimaalset toimimist reguleerib rangelt tuumagenoomi transkriptsiooniline kontroll, mis kodeerib mitokondriaalseid regulatiivseid valke, sealhulgas neid, mis on vajalikud elektronide transpordiahela ( jne ) toimimiseks. Kompleksid I – V. 5 Kuid nende peamiste regulatiivsete valkude ja komplekside funktsioonid on stressi tingimustes ohustatud ja põhjustavad tsütokahjustusi, soodustades liigset vabade radikaalide leket (kompleksid I ja III), 6 metaboolset tasakaalustamatust (kompleksid II ja IV) 7 ja bioenergeetilist defitsiiti ( V kompleks). 8 Uuringud on näidanud kahjustatud jne lähedasi seoseid. Kompleksid südame-veresoonkonna kahjustuste osas. 2, 9 Siiski jääb ebaselgeks, kas hüpoksiline stress soodustab hüpertroofeerunud kardiomüotsüütide mitokondrite kahjustamist.

Südame hüpertroofia modulatsioonis osaleb mitu molekulaarset rada. Akt / Gsk-3β-vahendatud signaalimine on muu hulgas peamine modulatsioonitee. Akt ja Gsk-3β on vastavalt südame hüpertroofia positiivsed ja negatiivsed regulaatorid. 10 Akt fosforüülimine ja aktiveerimine on otseselt seotud südame hüpertroofia moduleerimisega, kontrollides signaalikaskaadi allavoolu. 11 Seevastu Gsk-3β fosforüülimine soodustab selle deaktiveerimist ja moduleerib veelgi hüpertroofiat. 12 Uuringud on näidanud, et Akt fosforüülimine ja aktiveerimine soodustavad Gsk-3β de-fosforüülimist, mis omakorda soodustab südame hüpertroofiat. Paljud uuringud on näidanud, et stressist põhjustatud Gsk-3β aktiveerimine ja sellest tulenev südame hüpertroofia esilekutsumine on kahjulikud. Lisaks on Gsk-3β aktiveerimine otseselt seotud hüpertroofia primaarsete transkriptsiooniregulaatorite, see tähendab GATA-4, reguleerimisega. 13 Samamoodi on NFKB oluline redoksitundlik transkriptsiooni regulaator, mida on vaja mitmesuguste rakuliste funktsioonide, näiteks rakkude kasvu, ellujäämise ja põletiku, säilitamiseks. NFKB signaalide (NFKB-p65 / RelA) kanooniline rada on kardiomüotsüütide hüpertroofia võimaliku regulaatorina hästi välja selgitatud. 15 Uuringud on näidanud, et NFKB ekspressioon on oluline kardiomüotsüütide hüpertroofilise kasvu soodustamiseks. 16 NFKB stabilisaatorite funktsionaalsete üksuste või inhibiitorite funktsioonide kustutamisele tuginevad väljalülitatud uuringud on embrüonaalses arengujärgus surmavad ja võivad stressi korral mõjutada südame düsfunktsiooni. 17, 18 Lisaks agonistidele, liganditele ja endotoksiinide vahendatud NFKB signaali tekkele on mitokondriaalsed reaktiivsed hapniku liigid (ROS) ka rakulises patoloogias üliolulised NFKB aktiveerimise kaudu, programmeeritud rakusurma reguleerimise kaudu. 19, 20, 21, aga seos hüpoksiast põhjustatud NFKB aktiveerimise ja selle võimaliku mõju vahel mitokondriaalsele homöostaasile hüpertroofeerunud kardiomüotsüütides jääb teadmata.

Looduslike bioaktiivsete ühendite kasutamine soodustab stressi all toimuvat homöostaasi minimaalsete soovimatute mõjudega. Sellega seoses oleme varem näidanud, et nanotiseeritud kurkumiin (NC) leevendab hüpoksia stressi nii in vitro kui ka in vivo. 3, 4, 22, 23 Hüpoksiline stress põhjustab normaalsetele füsioloogilistele funktsioonidele mitmeid füsioloogilisi kahjustusi. 24 Lisaks sõltub kardiomüotsüütide normaalne toimimine kriitiliselt optimaalsest hapnikuvarustusest. Seega on hüpoksiast põhjustatud kahjustuste kaotamiseks endiselt vajadus ülitugevate bioaktiivsete terapeutiliste ühendite järele. Seetõttu püstitasime hüpoteesi, et terapeutiliste bioaktiivsete ühendite kombinatsioon võib näidata potentsiaalset strateegiat hüpoksiast põhjustatud mitmetahulise patoloogilise kahjustuse vähendamiseks. Kõrge toiteväärtusega looduslik polüfenoolne, redoksifaktor ja antioksüdantne ühend - pürokinoliinkinoon (PQQ) on potentsiaalne kandidaat kardiomüotsüütide hüpoksiast põhjustatud kahjustuste parandamiseks. 25 PQQ suudab reguleerida bioloogilisi funktsioone, 26 sealhulgas mitokondriaalset biogeneesi, 27 redoksfunktsiooni 28, 29 ja reproduktiivtervist. 30 Seetõttu soovitame NC terapeutiliste omaduste täiendavaks parandamiseks kasutada nanokurkumiini preparaati (NCF), mis koosneb NC-st ja PQQ-st potentsiaalse kandidaatmolekulina hüpertroofiseeritud kardiomüotsüütide hüpoksiast põhjustatud stressi leevendamiseks.

materjalid ja meetodid

Ülimalt puhtad, molekulaarse kvaliteediga kemikaalid, sealhulgas PQQ (D7783), saadi firmalt Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA) või nagu on teisiti öeldud. Antikehad osteti firmast SantaCruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA, või nagu on teisiti öeldud. Nanokurkumiin (osakeste keskmine suurus 200 nm, zeta potentsiaal −131 mV) saadi lahke kingitusena professor Santosh Karilt (KIIT ülikool, Odisha, India).

Uuringu ülesehitus

Uuring kavandati NCF kaitsefektiivsuse paranemise ettevalmistamiseks, iseloomustamiseks ja hindamiseks hüpoksiast põhjustatud hüpertroofia in vitro ja in vivo mudelites. Siin analüüsisime hüpoksilise stressi mõju homöostaasi mitokondrite regulaatorite muutustele ja selle mõju jne komplekside funktsioonidele. Samuti hindasime NF KB aktiveerimise mõju hüpoksiast põhjustatud hüpertroofia molekulaarsele regulatsioonile. Katseloomade ja rakukultuuri uuringud viidi läbi kaheksas katserühmas, see tähendab normoksia vehiiklikontrollides (NVC), normoksiaks pluss nanokurkumiini (N + NC), normoksiaks pluss PQQ (N + PQQ), normoksiaks pluss nanokurkumiini ravimvormis (N + NCF)., hüpoksia kandja kontroll (HVC), hüpoksia pluss nanokurkumiin (H + NC), hüpoksia pluss PQQ (H + PQQ) ja hüpoksia pluss nanokurkumiini preparaat (H + NCF). Kandjana kasutati steriilset, neutraalset fosfaatpuhverdatud soolalahust (PBS). Kõiki tulemusi võrreldi NC või PQQ-ga ravitud loomadega, et võrrelda NCF terapeutilise potentsiaali paranemist hüpoksilistes tingimustes.

NCF ettevalmistamine ja iseloomustamine

NCF-i ettevalmistamise ja iseloomustamise üksikasjalik kirjeldus on lisatud lisamaterjalis.

Rakukultuur, kokkupuude hüpoksiaga ja valkude eraldamine

HVCM rakke hoiti normoksia või hüpoksia tingimustes, nagu eelnevalt kirjeldatud. 3 Tuuma- ja tsütoplasmaatilised valguekstraktid ning valguhinnangud valmistati vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetodile. 4

NCF in vitro imendumise ja toksilisuse analüüs

NCF suspendeeriti steriilses PBS-is ja suspensioon stabiliseeriti ultrahelitöötluse abil 15 minutit temperatuuril 4 ° C (Sonics Vibra Cell, Sonic and Materials, Inc., Newtown, CT, USA, pulsitsükkel 9 s, amplituud 40%). . NCF raku omastamist hinnati meetodil, mida on kirjeldanud Kunwar jt. 31 Lühidalt, HVCM rakke kasvatati konfluentsuseni 96-augulistel mustadel plaatidel ja inkubeeriti 24 tundi 100 μM NCF-ga. Kasvusööde eemaldati ja rakke pesti kaks korda PBS-ga. Spektrofluoromeetriline analüüs (FLUOStar Omega, BMG Labtech, Ortenberg, Saksamaa) viidi läbi NCF raku omastamise hindamiseks (ergastuslainepikkus / emissiooni lainepikkus, see tähendab, λ ex / λ em, mida loetakse NC-i korral 360/420 nm ja 360 / P60Q jaoks 460 nm). NCF omastamise suurenemist näidati protsentuaalse muutusena võrreldes normoksia vehiikli kontrollrakkudega.

In vitro tsütotoksilisuse analüüsi üksikasjaliku kirjelduse leiate lisamaterjalist.

Rakkude elujõulisus ja hüpertroofia

Üksikasjaliku kirjelduse leiate lisamaterjalist.

Mitokondriaalsete kahjustuste analüüs HVCM-rakkude hüpoksilistes tingimustes

Mitokondriaalse membraani potentsiaali hüpoksiast põhjustatud muutusi (ψm) analüüsiti mitokondriaalse kahjustuse näitena MitoLight Apoptosis Detection Kit abil (APT242, Millipore, Billerica, MA, USA) ja pildid saadi (× 40), kasutades fluorestsentsmikroskoopi ( IMAGER.M2, AxioCam MRc5, Carl Zeiss, Oberkochen, Saksamaa). Lisaks analüüsiti tsütokahjustuse kinnitamiseks HVCM rakkudes rakulist oksüdatiivset stressi hüpoksilistes tingimustes. Mitokondrite redokstasakaalu hinnati, hinnates MnSOD (mangaani-superoksiidi dismutaas) aktiivsust ja ROS-i leket, nagu eelnevalt kirjeldatud. 4, 32

Immunotsütofluorestsents

Üksikasjaliku kirjelduse leiate lisamaterjalist.

Katseloomad ja eetikaalane avaldus

Kõigis katsetes kasutati vanusega sobivaid täiskasvanud isaseid Sprague-Dawley rotte (220 ± 10 g) (6–8 nädalat). Katseloomi peeti instituudi katseloomade hoiukohas puhastes puurides ning neil oli võrdne juurdepääs veele ja tavalisele toidukraamile (Lipton India Ltd., West Bengal, India), hoides normaalset 12-tunnist valguse ja pimeduse tsüklit temperatuuril 28 ± 2 ° C. temperatuur ja suhteline õhuniiskus (55 ± 2%). Kõik katsed kiitis heaks India valitsuse institutsionaalne loomade eetikakomitee vastavalt loomkatsete kontrolli ja järelevalve komitee (27/1999 / CPCSEA).

In vivo mürgisuse hindamine

Subkuutne toksilisus rottidel, millele oli lisatud 2000 mg kg – 1 päevas NCF-i, po 28 päeva jooksul, järgiti OECD juhiseid. Loomi jälgiti hoolikalt kehakaalu, karusnaha tekstuuri ja käitumise muutuste ning nahainfektsioonide tekke suhtes. Pärast katse lõppu tapeti loomad ketamiini (80 mg kg –1 kehamassi) ja ksülasiini (10 mg kg –1 kehamassi) üledoosi teel, nagu eelnevalt kirjeldatud. 23 Veri võeti vasaku vatsakese punktsiooni abil ja seejärel tehti sellele kohe vere-gaasi sisalduse analüüs i-STAT analüsaatori abil (Abott, IL, USA) ja hematoloogilise profiiliga (MS-4 Autoanalyzer, Melet Schloesing Laboratory, Osny, Prantsusmaa). Pärast vere võtmist fikseeriti loomad maksa, südame ja kopsude histopatoloogilisteks analüüsideks 4% neutraalses paraformaldehüüdis (PFA).

NCF farmakokineetiline hindamine Sprague-Dawley rottidel

Üksikasjaliku kirjelduse leiate lisamaterjalist.

Morfomeetriline analüüs ja RVH

Parema vatsakese hüpertroofia (RVH) morfomeetriline analüüs viidi läbi, analüüsides Fultoni indeksit (RV / LV + S ja RV / BW) ja histopatoloogilist hindamist Massoni trikroomiga värvimise teel, nagu eelnevalt kirjeldatud. 22 kodade natriureetilise faktori (ANF) (ab108797, Abcam, Cambridge, Suurbritannia) ja aju natriureetilise peptiidi (BNP) (ab108816, Abcam) ringlevat taset hinnati südame hüpertroofia markeriteks, kasutades müügilolevaid ELISA komplekte; testid viidi läbi vastavalt tootja juhistele. ANF-i kudede jaotust uuriti hüpertroofia markerina immunohistokeemia abil ja muutusi kudede arhitektuuris analüüsiti immunofluorestsentsvärvimisega, kasutades a-aktiini / DAPI. CHH-indutseeritud RVH valideerimine viidi läbi hüpertroofia, see tähendab Akt / Gsk-3β-vahendatud signaaliülekande kaskaadi, peamise molekulaarse raja analüüsimisel. 33

Kopsuvaskulaarse arhitektuuri ja morfomeetria muutused pärast cHH kokkupuudet tehti PFA-ga fikseeritud kopsukoes H&E värvimisega. Koelõike visualiseeriti mikroskoopiliselt kopsuarteri mediaalse seina paksuse suurenemise ja kopsuveresoonte arhitektuuri muutuste osas. 34

Südame mitokondrite eraldamine ja funktsionaalne analüüs

Oksüdatiivse fosforüülimise (OXPHOS) masinate kahjustuste hindamiseks viidi läbi täielike jms komplekside kvantitatiivsed analüüsid. Lühidalt eraldati mitokondrid HVCM rakkudest (Mitochondria Isolation Kit, 89879, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) ja neile viidi läbi kompleksi I (AAMT001, Millipore), II ja III kompleksi (ab109905, Abcam), kompleksi IV ( ab109911, Abcam) ja kompleks V (AAMT005, Millipore) tegevused, kasutades müügil olevaid komplekte.

In vitro leidude valideerimiseks eraldati parempoolsetest vatsakestest mitokondrid (Mitochondria Isolation Kit, 89801, Thermo Fisher) ja neile määrati mitokondrite jms komplekside kvantitatiivne hindamine Western blot analüüsi abil (Total OxPhos Complex Kit, 458099, Invitrogen, Waltham, MA), USA). I – V kompleksi tegevuste analüüs viidi läbi nagu eespool mainitud. Lisaks muutused mitokondrite biogeneesi peamiste regulaatorite (mtTFA, Nrf1, Nrf2 ja PGC1α) geeni- ja valgu ekspressioonitasemes, rasvhapete metabolism (PPARa / β / γ), redoksfunktsioon (Nox-2, Cox-2), bioenergeetilist funktsiooni (UCP-2, UCP-3) ja raku proliferatsiooni (Bcl2 / Bax) uuriti vastavalt polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) ja Western blot abil.

Poolkvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon

Üksikasjaliku kirjelduse võib leida lisamaterjalist ja praimerite loetelu lisatabelist T1.

Immunoblotanalüüs

Üksikasjaliku kirjelduse leiate lisamaterjalist.

Statistiline analüüs

Andmed on väljendatud keskmisena ± standardhälbed (sd) iga katserühma kohta, mis on tehtud kolmes korduses. Tulemusi analüüsiti statistilise olulisuse osas, kasutades ühesuunalist ANOVA. Väärtusi peeti statistiliselt olulisteks väärtustel * P 0, 05 vs NVC, ** P 0, 01 vs NVC, # P 0, 05 vs HVC ja ## P 0, 01 vs HVC. Mitteolulisi muudatusi on kujutatud kui NS.

Tulemused

NCF iseloomustus

NCF FTIR spekter näitas selgitavat muutuvate piikide keerulist väljanägemist PQQ (sisaldades mitut sidet, sealhulgas NH ja CN rühmad) ja kurkumiini signaali tippude omadustena.

NCF FTIR spekter näitas laiade ja teravate tippude eristatavaid mustreid vahemikus 650 kuni 4000 cm −1 . Selgelt teravate piikide ilmumine 648 ja 1028 cm- 1 juures näitas vastavalt CH-painde ja CN-sirutuse olemasolu. 35 Tugev tipp 1280, 7 cm- 1 juures näitas CH-vagu struktuuri. 36 Tugevate piikide järjestikune ilmumine 1371, 3 ja 1431, 1 cm- 1 juures näitas vastavalt CH3 ja CC sidemete venitavat vibratsiooni. Laiade piikide 1633, 6 cm – 1 ja tugeva piigi 1587 cm – 1 ilmumine kujutas CC ja NH paindekonstruktsioonide venitatavaid vibratsioone. 35 Lai piik vahemikus 2800 kuni 3000 cm- 1 kujutas HC = O olemasolu: CH paindub koos CH venitustega. Kurkumiini jaoks olid iseloomulikud tipud vahemikus 3500–3750 cm – 1, tugeva piigiga 3631 ja 3745 cm – 1, mis osutasid OH-i vibratsiooni rõngaskonstruktsioonides 35 (joonis 1a).

Image

Nanokurkumiini preparaadi (NCF) FTIR analüüs ( a ) koos SEM ja TEM ( b ) ning NCF plasma retentsiooni kineetika rottidel ( c ).

Täissuuruses pilt

DLS-analüüs näitas NCF-iga järjepidevalt NCF-i füüsikalis-keemiliste omaduste paranemist Zeta potentsiaali, osakeste suuruse, elektroforeetilise liikuvuse ja juhtivuse osas. NCF zeta potentsiaal oli –50, 3 mV (–30 mV NC-s), keskmise osakese suurusega 1955 nm (NC-s 212 nm). NCF elektroforeetiline liikuvus ja juhtivus olid vastavalt -3, 941 μm cm V −1 s −1 (−2, 348 μm cm V −1 s −1 NC-s) ja 0, 404 mS cm −1 (0, 0359 mS cm −1 NC-s) ( Tabel 1). Sarnaselt olid SEM- ja TEM-piltides nähtavad NCF-i osakeste homogeensed populatsioonid (joonis 1b). DLS-analüüs näitas kindlasti negatiivset Zeta potentsiaali, millel on tõhus elektroforeetiline liikuvus ja juhtivus, mis on tõendiks NCF-i kõrge biostabiilsuse kohta. Seda järeldust kinnitati täiendavalt NCF-i farmakokineetilise hinnanguga (joonis 1c), mis näitas pikka elaniku keskmist aega, mis viitab selgelt NCF-i paremale biosaadavusele ja biostabiilsusele (tabel 2).

Täissuuruses tabel

Täissuuruses tabel

Toksilisuse analüüs

NCF oli füsioloogiliselt ohutu ega põhjustanud HVCM rakkudes toksilisust. HVCM-rakkudel ei olnud mingeid tuumade või DNA kahjustuste tunnuseid ja nad säilitasid normaalse rakujagunemise (täiendav joonis S1). HVCM-rakkudes ei täheldatud olulisi muutusi LDH aktiivsuses ega raku elujõulisuses (lisajoonis S1). Sarnaselt olid füüsilise väljanägemise, kehakaalu ja käitumisharjumuste ning veregaasi sisalduse ja hematoloogiliste parameetrite näitajad normaalseks NCF-iga täiendatud loomadel, võrreldes kontrollloomadega (täiendavad tabelid T2 – T4). Võrreldes normaalsete loomadega NCF-ga täiendatud loomadel ei täheldatud elutähtsate elundite (südame, kopsude ja maksa) kliiniliselt olulist kahjustust (lisajoonis S2).

NCF tagab hüpoksiliste tingimuste korral tsütokaitse

Hüpoksia stress vähendas HVCM rakkude elujõulisust (langes 20% -ni võrreldes NVC-ga). Hüpoksia vahendatud rakusurma kinnitati kaspaas-3, -7 aktiveerimisega FACS abil ja seda kinnitati täiendavalt TUNEL-testiga. HVCM-rakkudes (lisajoonis S3) täheldati märkimisväärset NCF-i omastamist hüpoksilistes tingimustes. Ravi NCF-iga (500 ng ml −1 ) parandas märkimisväärselt rakkude elujõulisust (97%) võrreldes NC- ja PQQ-ga töödeldud rakkudega hüpoksilistes tingimustes võrreldes HVC-ga (vastavalt 76% ja 69%). Neid järeldusi kinnitades vähendas kaspaas-3, -7 aktivatsioon ja TUNEL-i positiivsus NCF-iga töödeldud rakkudes veelgi raku elujõulisuse paranemist hüpoksilistes tingimustes võrreldes NC- ja PQQ-ga töödeldud rakkudega (täiendav joonis S3).

NCF kaitseb hüpoksiast põhjustatud hüpertroofia eest

Hüpertroofia esilekutsumine oli HVCM-rakkudes ilmne hüpoksilistes tingimustes, mida näitas morfomeetriline analüüs (35%) ja FITC-leutsiini (63%) ja fenüülalaniini omastamise suurenemine (seda kinnitas ANF-i suurenemine) (85%) ja BNP (93%) võrreldes NVC rühmaga (joonis 2a – d). Rakkude suuruse (30%) ja FITC-leutsiini (23%) ning fenüülalaniini (24%) omastamise oluline langus ennustas hüpertroofia vähenemist NCF-ga täiendatud rakkudes hüpoksilistes tingimustes võrreldes HVC rühmaga (joonis 2a-d). Oluline on see, et PQQ-ravi parandas tõhusalt rakkude elujõulisust, kuid ei suutnud näidata hüpertroofilist toimet.

Image

Nanokurkumiini preparaadi (NCF) mõju hüpoksiast põhjustatud hüpertroofiale inimese vatsakeste kardiomüotsüütide (HVCM) rakkudes. Rakkude suuruse suurenemine (× 40) ( a, b ) koos kodade natriureetilise faktori (ANF) ja aju natriureetilise peptiidi (BNP) tasemega ( c ) kujutas hüpertroofilist kasvu. FITC-leutsiini ja FITC-fenüülalaniini omastamise suurenemine kinnitas veel hüpoksiast põhjustatud hüpertroofiat ( d ). NCF-i täiendus moduleeris efektiivselt hüpoksiast põhjustatud hüpertroofiat in vitro . Andmeid väljendatakse keskmisena ± sd. Väärtusi peeti statistiliselt olulisteks väärtustel * P 0, 05 vs NVC, ** P 0, 01 vs NVC, # P 0, 05 vs HVC ja ## P = 0, 01 vs HVC. Mitteolulisi muudatusi on kujutatud kui NS. Skaalariba, 20 μm.

Täissuuruses pilt

Sarnaselt ilmnes cHH-indutseeritud RVH loomadel RV / LV + S ja RV / BW sisalduse enam kui neljakordse suurenemise tõttu (joonis 3b). Mõlemat tüüpi kollageeni ja kudede ANF ja α-aktiini ekspressioonitaseme samaaegne suurenemine kinnitas hüpertroofilist kasvu koos maatriksi ümberehituse, st 1. tüüpi kollageeni ( Col1a1 ja Col3a1) müokardi markerite suurenenud geeniekspressioonitasemega (kuni 1, 8) volditud) ja 3 maatriksmetallopeptidaasiga (MMP) 2 ja 9 (kuni 3, 3-kordsed), võrreldes normoksia kontrollloomadega (joonis 3c – g). ANF-i (2, 3-kordne) ja BNP-i (5, 3-kordne) ringleva taseme tõus kinnitas loomadel cHH-indutseeritud RVH-d (joonised 3a ja c). Loomade ravi NCF-iga vähendas efektiivselt RV / LV + S (1, 2-kordne) ja RV / BW (0, 7-kordne) sisaldust, samal ajal vähendades kollageeni kogunemist, ANF-i ekspressiooni ja α-aktiini taset. Neid leide kinnitati ANF-i (1, 17-kordne) ja BNP (1, 63-kordne) ning Col1a1 ja Col3a1 (kuni 1, 6-kordne) ja MMP (kuni 3, 1-kordne) ekspressioonitasemete olulise langusega NCF-ga täiendatud loomad võrreldes vehiikuliga töödeldud loomadega cHH all.

Image

Tüüpilised arvud näitavad nanokurkumiini preparaadi (NCF) lisamise mõju rottide cHH-indutseeritud RVH-le. Krooniline HH-vahendatud RVH ilmnes loomadel südame suuruse suurenemise, kollageeni kogunemise (nooled), Fultoni indeksi ja histopatoloogilise värvumise tõttu (× 40) ( a, b ). Skeleti α-aktiini ja kodade natriureetilise faktori (ANF) koeekspressioonitasemed tõusid hüpertroofilise kasvu tõttu ( b ). ANF ​​ja aju natriureetilise peptiidi (BNP) ringlevad tasemed kinnitasid lisaks rottidel cHH-indutseeritud RVH-d ( c ). Akt-Gsk signaaliülekande fosforüülimine ja aktiveerimine soodustas hüpertroofilist kasvu rottidel hüpoksilistes tingimustes ( d, e ). Müokardi maatriksi ümberkujundamise markerite ( Col1a1 ja Col3a1 koos MMP2 ja 9 ) ( f, g ) muutused geeniekspressioonitasemes erinevates katserühmades. Andmed on väljendatud keskmisena ± SD NCF-i täiendatud modulatsiooniga kroonilise hüpobaarse hüpoksia (cHH) põhjustatud parema vatsakese hüpertroofia (RVH), mis on parem kui nanokurkumiini (NC) ja pürrokinoliinkinooniga (PQQ) töötlemine. Väärtusi peeti statistiliselt olulisteks väärtustel ** P 0, 01 vs NVC, # P 0, 05 vs HVC ja # P 0, 01 vs HVC. Mitteolulisi muudatusi on kujutatud kui NS. Skaalariba, 10 μm.

Täissuuruses pilt

NCF-i efektiivsuse paranemist kinnitati veelgi Akt / Gsk-3β-signaalide raja põhjal. cHH soodustas p-Gsk-3β / Gsk-3β ülesreguleerimist ja p-Akt / Akt sisalduse alareguleerimist (joonis 3d ja e). NCF-i täiendus näitas märkimisväärset p-Akt / Akt ja p-Gsk-3β / Gsk-3β ( P 0, 05) sisalduse taastumist võrreldes NC-ga töödeldud rakkudega hüpoksilistes tingimustes, näidates selgelt NCF-i suurenenud kardio-kaitseefektiivsust cHH-ga .

cHH-indutseeritud RVH loomadel suurenenud kopsutakistuse tõttu

Kopsuveresoontes tehti cHH all diskreetsed morfomeetrilised ja arhitektuursed muutused. H&E värvimine roti kopsudes näitas kopsupõhja veresoonte ümberkujunemist. Alveoolid olid välimuselt hajutatud, arvuliselt vähem ja suurusega (joonis 4a). Kopsuarteri valendik paistis kitsamaks ja kopsuarteri (PA) mediaalne sein lihases, soodustades seeläbi vastupidavust verevoolule. Kokkupuude cHH-ga põhjustas PA mediaalse seina paksuse (WT) suurenemise, mis suurenes katseloomadel NVC-ga võrreldes 132% ( P = 0, 01) (joonis 4). Oluline on see, et NCF-ga täiendatud loomadel ilmnes WT järsk langus (2, 8%) ( P = 0, 01) ja veresoonte arhitektuuri säilimine võrreldes HVC-ga (2, 8%) (joonis 4a ja b). Võrreldes HVC kontrollidega vähenes WT vastavalt NC-ga ja PQQ-ga täiendatud loomades vastavalt 16% ja 42% ( P = 0, 01). Need kvalitatiivsed ja kvantitatiivsed andmed viitavad sellele, et kopsuveresoonte resistentsus suurenes cHH all PA kitsendamise tõttu. Siin toodud tulemused tõendavad, et NCF-i täiendamine indutseeris kopsuveresoonkonna loomade morfomeetrilist ja funktsionaalset modulatsiooni cHH all paremini kui ainult NC ja PQQ.

Image

Joonis, mis näitab muutusi kopsu histoloogias erinevates katserühmades ( a ), nagu näitasid morfoloogilised muutused alveolaarruumides (Al, punane) ja bronhioolides (Br, punane). Histopatoloogiline värvumine (× 40) näitas kopsuarterite (PA, punane) ja mediaalse seinapaksuse (WT) suurenemist HVC rühmades, samas kui nanokurkumiini preparaadi (NCF) täiendus näitas märkimisväärset langust võrreldes HVC, NC ja PQQ ( b ). Andmeid väljendatakse keskmisena ± sd. Väärtusi peeti statistiliselt olulisteks väärtustel ** P 0, 01 vs NVC ja ## P 0, 01 vs HVC. Skaalariba: 10 μm.

Täissuuruses pilt

NCF kaitseb hüpoksiast põhjustatud stressi eest, säilitades mitokondrite funktsiooni

Hüpoksiline stress soodustas HVCM rakkude kahjustusi, purustades mitokondriaalse membraani potentsiaali (ψ m ), soodustades seeläbi mitokondrite kahjustuste vahendatud apoptoosi (joonised 5a ja b). Liigne ROS-i leke ja vähenenud MnSOD-aktiivsus kinnitasid veelgi HVCM-rakkude hüpoksia vahendatud mitokondriaalset kahjustust (lisajoonis S4). Lisaks põhjustas HVCM-rakkude ja näriliste südamete kokkupuude cHH-ga kompleksi I – V vähenenud aktiivsust, kujutades mitokondrite peamiste funktsionaalsete üksuste kahjustusi (joonis 5c – i). Andmed vastavad eelnevalt kirjeldatud kahjustustele näriliste luustiku lihastes jne . 37 Nendele leidudele lisaks leidsime, et Nox-2 ja Cox-2 ekspressioonitasemed tõusid cHH-ga, mis viitab vastavalt I ja IV kompleksi funktsioonidele (joonis 6a – d ja lisajoonis S5A – H) koos vähenenud ekspressioonitasemetega. jne näriliste südamete kompleksid (joonis 6e ja f). PPARa / β / γ, mtTFA, Nrf1, Nrf2 ja PGC1α vähenenud tasemed näitavad selgelt häiritud mitokondriaalset biogeneesi, samas kui UCP-2 ja UCP-3 vähenenud tasemed näitavad selgelt vähenenud bioenergeetilist efektiivsust, mis on tingitud kompleksi V halvenenud funktsioonist hüpoksia korral tingimusi.

Image

Joonis, mis näitab mitokondrite homöostaasi muutusi hüpoksilistes tingimustes. Inimese vatsakeste kardiomüotsüütide (HVCM) rakud kogesid apoptootilist rakusurma hüpoksia vahendatud membraanipotentsiaali kahjustuste tõttu (× 40) ( a, b ), mis kujutab mitokondrite homöostaasi kahjustusi. Hüpoksia põhjustatud modulatsioonid mitokondriaalses elektronide transpordiahelas ( jne ). Komplekside aktiivsus ( c - g ) oli ilmne ka in vitro ja in vivo. ( h, i ) cHH-indutseeritud modulatsiooni mõju oksüdatiivse fosforüülimise regulaatoritele. Andmeid väljendatakse keskmisena ± sd. Väärtusi peeti statistiliselt olulisteks väärtustel ** P 0, 01 vs NVC, # P 0, 05 vs HVC ja ## P 0, 01 vs HVC. Mitteolulisi muudatusi on kujutatud kui NS. Skaalariba, 10 μm.

Täissuuruses pilt

Image

Joonis, mis näitab geenide ja valkude ekspressiooni muutusi mitokondrite homöostaasi regulaatorites: kroonilise hüpobaarse hüpoksia (cHH) vahendatud langused mitokondrite biogeneesi regulaatorites (mtTFA, Nrf1, Nrf2 ja PGC1α) ( a ), redoksfunktsioon (Nox-2 ja Cox-2) ( b ), rasvhapete reguleerimine (PPARa / β / γ) ( c ) ja rakkude ellujäämine (Bcl2, Bax) ( d ) ilmnesid nii geeni kui ka valgu ekspressiooniuuringutes. Väärtusi peeti statistiliselt olulisteks väärtustel ** P 0, 01 vs NVC, # P 0, 05 vs HVC ja ## P = 0, 01 vs HVC. Mitteolulisi muudatusi on kujutatud kui NS.

Täissuuruses pilt

Ravi NCF-iga märkimisväärselt taastunud jne. Komplekside aktiivsuse tase on nii in vitro kui ka in vivo parem kui ainult NC või PQQ korral (joonis 5c – g). Parem reguleerimine ψm ilmnes NCF-ga töödeldud HVCM rakkudes hüpoksilistes tingimustes, võrreldes NC või PQQ või vehiikliga (joonised 5a ja b). Oluline on see, et mitokondrite biogeneesi ja funktsionaalse kontrolli markerid (PPARα / β / γ, mtTFA, Nrf1, Nrf2 ja PGC1α) koos bioenergeetilise efektiivsuse (UCP-2, -3) ja rakkude ellujäämise markeritega (Bcl2, Bax) ), taastati NCF-ga töödeldud loomadel tõhusamalt kui ainult NC-ga ja PQQ-ga ravitud loomadel, võrreldes cHH-ga kandjaga (joonis 6a – d ja lisajoonis S5A – H). NCF-ga täiendatud loomadel ilmnes kompleksi I – V ekspressioonitaseme taastamine koos nende tegevusega paremini kui mõlema ravi korral eraldi (joonis 5h ja i). Need andmed näitavad kokku NCF mitokondriaalse kaitseefektiivsuse olulist paranemist kardiomüotsüütides, võrreldes NC ja PQQ-ga.

NCF-i täiendus hoiab ära NFKB-p65 aktiveerimise hüpoksilistes tingimustes

NFKB-p65 aktiveerimise ja tsütoplasmaatilise aktiveerimise rakuline aktiveerimine ja tsütoplasmaatiline akumuleerumine algas juba 6 tundi pärast hüpoksia algust ja saavutas haripunkti 24 tunniga (joonis 7a – g ning täiendavad joonised S6 ja S7) HVCM rakkudes. NFκB-p65 tuuma translokatsiooni täheldati siiski ainult rakkudes, mis olid 24 tunni jooksul hüpoksiaga kokku puutunud (joonis 7a-g).

Image

Tüüpiline joonis, mis näitab NFĸB aktiveerimist hüpoksilistes tingimustes: inimese vatsakeste kardiomüotsüütide (HVCM) rakud kogesid tsütoplasmaatilist NFĸB aktiveerimist juba 6 tundi pärast hüpoksia algust (x 100) ( a - d ), tuumade translokatsiooni täheldati alles 24 tunni pärast algus ( e, f ). Näriliste parempoolsed vatsakesed ja HVCM rakud näitasid NFĸB aktiveerimist kroonilise HH või hüpoksilise kokkupuute korral vastavalt 24 tunni jooksul ( g ). HVCM-rakkude ja rottide täiendamine nanokurkumiini preparaadiga (NCF) põhjustas NFĸB aktiveerimise märgatava vähenemise, millele järgnesid ainult NC ja PQQ. Skaalariba, 20 μm.

Täissuuruses pilt

Samamoodi kinnitasid meie in vivo leiud NHKB aktiveerimist parempoolsetes vatsakestes cHH all (joonis 7f ja g ning täiendav joonis S8). CHH-indutseeritud RVH patogeensuse kinnitamiseks rottidel võrdlesime NFKB kudede ekspressiooni ja muutusi mitokondriaalses jne. Komplekside aktiivsust koos histopatoloogiliste muutustega monokrotaliinist indutseeritud RVH eelnevalt loodud mudelis. 38 Monokrotaliini infusioon soodustas RVH, vähendas jne. Keerulised tegevused ja suurenenud NFkB ekspressioon parempoolsetes vatsakestes (joonis 8a – d). Need andmed koos kujutavad selgelt cHH-indutseeritud RVH-d ja kahjustuste vahendatud patogeensust roti südametes, mis sarnaneb monokrotaliinist indutseeritud RVH-i ja ebaõnnestumise varasemale mudelile. 39

Image

Võrdlev patogeensus krooniliste HH- ja monokrotaliin-indutseeritud RVH mudelite puhul: kroonilise HH- ja monokrotaliin (Mct) poolt indutseeritud RVH soodustas mitokondrite elektronide transpordiahela suurenemist ( jne ). Kompleksib I – V aktiivsuse taset ( a ). Mõlemad mudelid näitasid NFĸB tuumaakumuleerumist ja kudede ekspressiooni koos suurenenud kudede kollageeni kogunemisega (× 40) (nooled) ( b - d ). Andmeid väljendatakse keskmisena ± sd. Väärtusi peeti statistiliselt olulisteks väärtustel ** P 0, 01 vs NVC ja ## P 0, 01 vs HVC. Skaalariba, 10 μm.

Täissuuruses pilt

NCF treatment resulted in significant decreases in cytoplasmic and nuclear levels of NFκB-p65 compared with vehicle/NC/PQQ-treated cells and animals (Figure 7a–f), but NC and PQQ treatments failed. Collectively, the data demonstrate that cHH-mediated RVH and cardiomyocyte damage are dependent on NFκB-p65 activation, similar to monocrotaline-induced RVH (Figure 8b and c).

Arutelu

Cardiac hypertrophy appears as an initial adaptive response to hypoxia, but prolonged stress induces de-compensation and irreversible damage. The increase in systemic oxygen demand under hypoxic stress is well elucidated. 24 To meet this increased demand for oxygenated blood, the heart frequently pumps more blood toward the lungs to improve systemic oxygenation. The heart undergoes hypertrophy under this sustained workload, with special relevance to the right ventricle. 40 However, chronic hypoxic stress also promotes a decline in the oxygenation capacity of the lungs under chronic hypoxic stress due to excessive fluid retention, which causes an increase in the pulmonary resistance to the blood flowing from the right ventricles. However, to ensure an uninterrupted systemic blood supply, the hypertrophied right ventricle continuously pumps blood towards the lungs. Under this state of increased volume and pressure overload, the right side of the heart eventually undergoes de-compensation and suffers from pathological damage. 40, 41 Herein, we observed an increase in the pulmonary artery medial wall thickness and a decrease in the pulmonary artery lumen, which promotes an increase in the pulmonary resistance to blood flow. These changes might have led to sustained pressure and volume overload on the right ventricle, which eventually stimulated de-compensation in the chamber. 40, 41 Thus, the data in the present study provide evidence that the heart undergoes pathological damage due to de-compensation arising in the right ventricle that is secondary to the increased pulmonary vascular resistance. However, increased pulmonary resistance is directly associated with pulmonary hypertension; further investigations are needed to clarify the potential effects of cHH-induced hemodynamic changes on pathological RVH. 40, 41

In the present study, we found that severe damage to Complexes I–V clearly demonstrated that hypertrophied cardiomyocytes underwent mitochondrial stress under hypoxic conditions, both in vitro and in vivo . Previous studies have shown that stress-induced decreases in the functions of these Complexes are inseparably associated with cardiomyopathies and heart failure. 2, 9, 42, 43 However, to the best of our knowledge, this study provides the first report that chronic hypoxic stress promoted mitochondrial stress by impairing etc Complex activities in hypertrophied cardiomyocytes. Since optimal cardiomyocyte functioning relies on a constant supply of the optimum amount of oxygen, hypoxia-mediated oxidative stress might have contributed to such severe damage to the etc complex activities. The smooth flow of electrons through all five Complexes determines optimal cardiomyocyte function. 44 As hypoxic stress promotes severe oxidative damage, excessive free-radical leakage-mediated redox imbalances might have initiated the mitochondrial damaging events that further led to impairments in the etc Complex activities. Further, chronic hypoxic stress impaired not only mitochondrial regulators of cell-survival, redox-maintenance and metabolism, but severe damage to regulators of mitochondrial bio-genesis was also evident. Decreased expression levels of the etc Complexes along with their activities clearly demonstrate that impaired mitochondrial homeostasis remains a critical molecular event behind cHH-induced de-compensatory RVH and damage.

Further molecular investigation suggested that NFκB-p65 activation emerged as a potential regulator of hypoxia-induced hypertrophy, both in vitro and in vivo . Importantly, in vitro activation of NFκB-p65 and stabilization of IKKα/β were observed as early as 6 h following the onset of hypoxia. These data and our previous report strongly suggest that hypoxia-mediated onset of hypertrophy and activation of NFκB-p65 in HVCM cells seems to be synchronous events (6 h). 3 To ensure the role of NFκB-p65 activation in our animal model of RVH, we compared our findings with a previously established model of monocrotaline-induced RVH. Interestingly, monocrotaline-induced RVH was accompanied by NFκB-p65 activation and damage to etc Complex machinery, similar to our model of cHH-induced RVH. 45 These findings suggest that the pathological events arising in the cHH-induced model of RVH show pre-clinical similarity to a drug-induced model of RVH. However, since monocrotaline-induced RVH remains secondary to pulmonary hypertension, it is important to assess quantitative hemodynamic changes in pulmonary arterial pressure in a cHH-induced model of RVH. Collectively, the present study shows that hypoxic stress was sufficient to induce NFκB nuclear translocation and to initiate the transcriptional activation of downstream signaling genes, thus promoting hypertrophy and damage in rats. These damages appeared in the form of de-compensated RVH along with mitochondrial damage and demonstrate the transition of cardiomyocyte hypertrophy from an adaptive physiological state to a maladaptive pathological state.

This information and synchronous molecular events suggest that chronic hypoxia-mediated de-compensatory RVH appeared in animals in response to excessive pressure and volume overload, secondary to enhanced pulmonary vascular resistance. This de-compensation mediated pathological damage in the right heart by impairing etc Complexes. These data suggest that although stress-induced activation of NFκB is necessary for onset of hypertrophy, chronic stress-mediated sustained NFκB upregulation might have promoted de-compensation and pathological damage. 16 However, the exact molecular events behind NFκ-mediated pathology require further investigations.

NCF supplementation was highly effective in modulating hypoxia-induced hypertrophy compared with NC and PQQ alone, clearly depicting an improvement in the cyto-protective efficacy of NCF. Importantly, PQQ treatment showed an improvement in cellular viability under hypoxic conditions but failed to modulate hypertrophy. These findings suggest that though oxidative stress plays a crucial role in the pathogenicity of cardiac hypertrophy, other molecular events might collectively play key regulatory roles in promoting pathogenicity under hypoxic conditions. Similarly, NC supplementation showed modulations of hypertrophy and pathology but did not impart sufficient therapeutic regulation of mitochondrial health under hypoxic conditions. Together, these findings emphasize the inference that NCF supplementation could provide comprehensive therapeutic benefits under stress. NCF supplementation imparted simultaneous protection from cHH-induced damage to pulmonary architecture and damage to the right side of the heart. Robust improvements in etc Complex expression and activity levels with NCF treatment clearly demonstrate improvements in the therapeutic and cyto-protective potentials of NCF under hypoxic conditions compared with NC or PQQ alone. The data collectively suggest the potential efficacy of combinatorial therapeutics to combat multi-factorial pathologies mediated by hypoxic stress and further strengthen our hypothesis that combinatorial therapeutics might be an effective solution to hypoxia-mediated clinical problems.

Publisher's note

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

Täiendav teave

Wordi dokumendid

  1. 1

    Täiendav teave

    Supplementary Information accompanies the paper on Experimental & Molecular Medicine website (//www.nature.com/emm)