Mri kontrastaine gadoteridool suurendab raav1 jaotumist roti hipokampuses geeniteraapia

Mri kontrastaine gadoteridool suurendab raav1 jaotumist roti hipokampuses geeniteraapia

Anonim

Õppeained

  • Geeni kohaletoimetamine
  • Hipokampus
  • Viirusvektorid

Abstraktne

Kontrastaineid kasutatakse tavaliselt koos magnetresonantstomograafiaga (MRI), et jälgida molekulide jaotust ajus. Hiljutised meie laboris läbi viidud katsed on näidanud, et rekombinantse adeno-assotsieerunud viiruse serotüübi 5 (rAAV5) ja MRI kontrastaine gadoteridooli (Gd) samaaegne infusioon suurendab vektori transduktsiooni roti striaatumis. Selle uuringu eesmärk oli välja selgitada, kas gadoteridooli võib kasutada ka vahendina rAAV1 ja rAAV5 transduktsiooni efektiivsuse suurendamiseks roti hipokampuses. Näitame, et Gd / rAAV1-GFP, kuid mitte Gd / rAAV5-GFP samaaegne infusioon põhjustab transgeeni märkimisväärselt suuremat jaotumist nii süstitud poolkeras kui ka ajukoore kontralateraalses küljes ja külgnevates piirkondades piki süstimisradu. Samuti näitasime, et Gd / rAAV1-GFP koosinfusioonil ei ole hipokampuse funktsioonile kahjulikku mõju, mida hinnati ruumilise mälu moodustumise kahe testi abil. See töö näitab, et Gd saab kasutada meetodina AAV1 transduktsiooni efektiivsuse suurendamiseks hipokampuses loomkatsetes.

Sissejuhatus

Adeno-assotsieerunud viirus (AAV) on osutunud edukaks geeniteraapias paljude loomsete haigusmudelite korral ja seda kasutatakse praegu inimeste kliinilistes uuringutes mitmesuguste haigusseisundite, näiteks Leberi kaasasündinud amauroosi, hemofiilia, lihasdüstroofia, Parkinsoni tõve ja Alzheimeri tõve korral. haigus. 1 Rekombinantset adeno-assotsieerunud viirust (rAAV2) on kasutatud kõigis neuroloogiliste häirete geeniteraapia uuringutes, kuid selle levik ajus on diskreetne. 2, 3, 4 Vektori tiitri suurendamise meetodite väljatöötamine ja uudsete serotüüpide iseloomustamine on aidanud märkimisväärselt suurendada rAAV-i transduktsiooni efektiivsust erinevates kudedes. 5, 6, 7 Mitmete serotüüpide, sealhulgas hepariini ja mannitooli, või süsteemse mannitooli ja konvektsiooniga tõhustatud kohaletoimetamise efektiivsuse suurendamiseks on kasutatud mitmeid aineid. Ravimite reaalajas jaotumise jälgimiseks on kasutatud 8, 9, 10 magnetilise resonantstomograafia (MRI) kontrastaineid nagu gadoteridool (Gd), mis võimaldab visualiseerida leviku mahtu erinevate struktuuride vahel. Uuringud on näidanud, et selliseid aineid nagu Gd võib kasutada rAAV2 jaotumise jälgimiseks geeniteraapia primaatide mudelites. 11 Kuid muud uuringud on näidanud, et rAAV1 Gd-jälgitav kohaletoimetamine ennustab täpsemini selle viirusvektori levikut kui jälgitav koos süstimine rAAV2-ga. Need erinevused võivad tekkida seetõttu, et erinevad AAV-i serotüübid interakteeruvad kontrastainetega erinevalt (Osting et al. , Esitatud).

Oleme varem näidanud, et Gd suurendab märkimisväärselt rohelist fluorestsentsvalku (rAAV5-GFP) kodeeriva rAAV5 transduktsiooni efektiivsust roti striaatumis (Osting et al. , Esitatud). Siin tahtsime välja selgitada, kas rAAV1-GFP ja rAAV5-GFP transduktsiooni efektiivsust hipokampuses saaks parandada ka koosinfusiooni teel Gd-ga. Uuringud on näidanud, et Gd-ga infusioonil võib olla eriti kahjulik mõju olemasoleva neeruhaigusega patsientidele. 13 Teisest küljest on Gd kasutatud loommudelites ja inimkatsetes ilma toksilisuse tunnusteta. 14 Gadooniumi infusiooni mis tahes toksiliste mõjude hipokampuses diskonteerimiseks vaatlesime Gd / rAAV koosinfusiooni oletatavaid tsütotoksilisi mõjusid Morrise veelabürindi (MWM) ja objekti asukohamälu (OLM) ülesannete täitmisele. Näitame siin, et rAAV1, kuid mitte rAAV5 transduktsiooni efektiivsust suurendab kaasinfusioon Gd-ga märkimisväärselt ja et Gd-l pole kahjulikku mõju käitumisele.

Tulemused

Gd suurendab rAAV1-GFP, kuid mitte rAAV5-GFP jaotust roti hipokampuses

Rottidele süstiti ühepoolselt kas rAAV1-GFP või rAAV5-GFP, mida manustati kontrollina koos Gd või lakteeritud Ringeri lahusega. GFP-positiivse immunovärvimise kvantifitseerimist analüüsiti, kasutades iga hipokampuse poolkera densitomeetrilist analüüsi. RAAV1-GFP samaaegne infusioon koos Gd-ga (Gd / rAAV1) suurendas märkimisväärselt GFP jaotust hipokampuses võrreldes poolkeradega, millele süstiti laktaadiga Ringeri lahust (Ringers / rAAV1; joonised 1a ja b). Suure suurendusega pildid näitavad püramiidikihis rakukehades intensiivsemat GFP immunoreaktiivsust kui aksonaalsetes ja dendriitilistes projektsioonides, samas kui Gd / AAV1 näitab parenhüümis difuussemat värvumist (joonis 1a, ülemise paneeli sised). Keskmine optiline tihedus (OD) oli Gd / rAAV1 poolkerades 1, 5 korda suurem, kui võrrelda loomadega, kellele oli süstitud Ringers / rAAV1 (joonis 1b; P = 0, 0017). Samamoodi oli Gd / rAAV1 hipokampuse poolkerades keskmine lävendist kõrgem pindala (AAT) 2, 2 korda kõrgem kui Ringersi / rAAV1 ( P = 0, 002). Ja jaotusruumala (Vd) oli ka Gd / rAAV1 poolkerades oluliselt suurem (1, 8 korda kõrgem kui Ringers / rAAV1; P < 0, 0001). Samuti leidsime GFP jaotuse kasvu Gd / rAAV1 kontralateraalses süstimata poolkeras, võrreldes Ringersi / rAAV1-ga (joonis 1a). Oleme varem leidnud, et nii rAAV1 kui ka rAAV5 edastavad kontralateraalset poolkera järgmistel põhjustel: (1) GFP valgu anterograadne transport süstimata küljele, (2) viiruseosakeste transportimine tagasipoole kahepoolse poolkera rakukehadesse. 15 Näib, et Gd suurendab neid kahte tüüpi transporti süstitud poolkerast (joonised 1a ja c). Gd / rAAV1-ga süstitud loomadel ilmnes süstimata poolkera statistiliselt oluline OD suurenemine võrreldes Ringersi / rAAV1-ga süstitud loomadega (kaks korda, P = 0, 045). AAT ja Vd suurenemise suundumus leiti ka Gd / rAAV1 suhtes, võrreldes Ringersi / rAAV1 süstimata poolkeradega (joonis 1c; AAT, P = 0, 08, Vd, P = 0, 086). Lõpuks suurendas Gd ka transduktsiooni suurenemist süstitud kortikaalses poolkeras, mis on tõenäoliselt tingitud tagasivoolust infusioonikohas (joonis fig 1a).

Image

Gd suurendab AAV1, kuid mitte AAV5 transduktsiooni efektiivsust. ( a ) Tüüpilised lõigud illustreerivad GFP ekspressiooni rostrokaudaalset ulatust loomadel, kellele on süstitud rAAV1 (ülemised paneelid) või AAV5 (alumised paneelid), millele on lisatud infusiooni koos lakteeritud Ringeri lahusega (+ rõngad) või gadoteridooliga (+ Gd). Insetid näitavad seljaosa CA1 suurendust. b ) süstitud hipokampuse poolkerade densitomeetriline analüüs. c ) Kahepoolse süstimata poolkera densitomeetriline analüüs. Andmed tähistavad keskmist ± sem (Gd / rAAV1, n = 3; helinad / rAAV1, n = 3; Gd / rAAV5, n = 4; helinad / rAAV5, n = 4). *** P < 0, 005, ** P < 0, 005, * P < 0, 05. Histogrammiribade kohal olevad olulised indikaatorid näitavad võrdlust Lactated Ringeri kontrolliga. Skaalavardad = 1 mm.

Täissuuruses pilt

Vastupidiselt Gd / rAAV1 tulemustele ei mõjutanud Gd süstitud poolkera mõnd rAAV5 jaotumise määra. (Joonised 1a ja b; Gd / rAAV5 vs Ringers / rAAV5: OD, P = 0, 42; AAT, P = 0, 272 Vd, P = 0, 63). Ehkki Gd juuresolekul ei täheldatud transgeeni suurenenud jaotumist, kuvatakse Gd-rAAV5 hipokampuses GFP difuussemat värvumist rakukehades, aksonites ja dendrites, võrreldes Ringer / rAAV5-ga (joonis fig 1a, ülemise ja alumise paneeli sised). Süstimata poolkera jaotusomaduste osas erinevusi ei leitud, kui rAAV5 infundeeriti kas Gd või Lactated Ringeri lahusega (joonised 1a ja b OD, P = 0, 659; AAT, P = 0, 3270; Vd, P = 0, 4988).

Kokkuvõtteks võib öelda, et Gd samaaegne infusioon koos rAAV1-GFP-ga suurendab transgeeni jaotust süstitud hipokampuses ja ka kontralateraalses poolkeras. Teisest küljest ei mõjutanud see kontrastaine rAAV5-GFP jaotust.

Rakkude tropismi ja kudede tervise iseloomustamine pärast Gd koosinfusiooni

Selleks, et teha kindlaks, kas rAAV1 suurenenud jaotumine pärast Gd-koosinfusiooni oli tingitud raku tropismi muutumisest, viisime kahe katserühma koes immunohistokeemia, kasutades antikehi neuronaalse markeri NeuN või astrotsütaarse markeri GFAP vastu. On näidatud, et nii rAAV1 kui ka rAAV5 edastavad näriliste hipokampuses peamiselt neuroneid. 15 Leidsime, et rAAV1-GFP Gd kaasinfusiooni suurenenud jaotumine ei olnud tingitud raku tropismi muutumisest, kuna enamik GFP-d ekspresseerivatest rakkudest olid samuti NeuN-immunopositiivsed, samas kui ükski GFP-positiivne rakk ei olnud gliaalse fibrilaarhappe happeline valk ( GFAP) -positiivne (joonis 2a). Sarnased tulemused leiti ka rAAV5 ja Gd samaaegse infusiooni korral (andmeid pole näidatud). Need tulemused ei näita muutusi tropismis Gd juuresolekul.

Image

Gd samaaegne infusioon koos rAAV1-ga ei põhjusta muutusi tropis ega kahjulikku mõju kudede tervisele. ( a ) NeuN ja GFAP-ga märgistamine näitab, et Gd koosinfusioon ei muuda rAAV1 neuronaalset tropismi. Skaalariba = 25 μm. Nissli värvimine näitab, et Gd samaaegsel infusioonil kas rAAV1 ( b ) või rAAV5 ( c ) (ülemised paneelid) ei ole ilmseid rakukahjustusi. GFAP immunvärvimine ei põhjusta põletikku väljaspool nõela rada (keskpaneel). Ainult Gd ja rAAV5 infusioon põhjustas Iba I immuunreaktiivsuse suurenemise, mis näitab mikroglia aktivatsiooni süstitud hipokampuses ( c, alumine paneel). Skaalavardad = 1 mm. (sisetükid näitavad nõelajäljeala suurendust).

Täissuuruses pilt

Gd ja rAAV1 või rAAV5 koosinfusioonist tuleneva põletikulise protsessi analüüsimiseks vaatlesime rakukahjustuse ja põletiku markereid. Nissli värvimisel ei täheldatud süstitud hipokampuses ilmseid morfoloogilisi muutusi ega kudede kahjustusi. Täheldati ainult süsteraja lähedal asuvat piirkonda kudede kahjustuse korral, mis ei sõltunud ravist (joonis 2b, ülemine paneel). Astrotsütoosi uuriti GFAP immunohistokeemia abil. Gd / rAAV1 või Gd / rAAV5 süstitud poolkerades ei leitud levinud põletikku Ringersi / rAAV1 või Ringers / rAAV5 süstitud poolkerade suhtes (joonis 2b, keskmine paneel). Nõelajälje piirkonnas oli jällegi mõni väike astrotsütoos (mis on tavaline intraparenhüümsete süstide korral). Reaktiivne mikroglioos, mis määrati IbaI immunoreaktiivsuse järgi, esines ainult loomade hipokampuse poolkeras, kellele süstiti Gd / rAAV5 (joonis 2b, alumine paneel). Iba1 värvumise ilmne suurenemine Gd / rAAV5 hipokampuses ei erine oluliselt Ringer / rAAV5 hipokampusest Iba1 jaotumise mõõtmete osas süstitud poolkeras. (Gd / rAAV5 vs Ringers / rAAV5: OD, P = 0, 322; AAT, P = 0, 691 Vd, P = 0, 7157).

RAAV1-GFP ja Gd koosinfusioon ei mõjuta käitumist

Et näidata, et Gd saab kasutada funktsiooniuuringutes rAAV1 ülekande efektiivsuse ohutuks suurendamiseks, uurisime, kas Gd / rAAV1 mõjutas hipokampuse mälu. Oleme varem näidanud, et rAAV-GFP hipokampuse transduktsioon ei mõjuta negatiivselt näriliste ruumimälu. 16 loomale süstiti kahepoolselt kas rAAV1-GFP koos infusioonina koos Gd-ga või Lactated Ringeri ravimiga kontrollina. Gd-ga kaasnev infusioon ei mõjutanud MWM-i jõudlust. Mõlemad katserühmad õppisid peidetud platvormi asukohta sama kiirusega leidma; varjatud platvormikatsetes keskmine läbitud vahemaa ei erinenud rühmade vahel oluliselt (joonis 3a); P = 0, 96. Lisaks ei olnud sondikatse ajal rühmade vahel siht kvadrandis veedetud protsendi vahe erinev (joonis 3b); P = 0, 91. Samuti ei muutunud OLM-i ülesande täitmine rühmade vahel: Ringeri / rAAV1-ga süstitud loomad kulutasid 43% ja Gd / rAAV1-rühmad 46% uurimisajast objektile uudses asukohas (joonis 3c), P = 0, 75. Kokkuvõtteks ei leitud kahes sõltumatus ruumimälu testis Gd / rAAV1-GFP või Ringers / rAAV1-GFP süstitud rühmade vahel statistiliselt olulisi erinevusi. Need tulemused näitavad, et seda kontrastainet saab kasutada viiruse vektori leviku suurendamiseks roti hipokampuses, kahjustamata hipokampuse funktsiooni.

Image

RAAV1 ja Gd koosinfusioonil ei ole hipokampuse käitumises kahjulikku mõju. ( a ) Nii Gd / rAAV1-GFP kui ka Ringers / rAAV1 GFP loomad näitavad MWM-i treeningkatsete ajal põgenemiseks läbitud vahemaad sarnaselt. ( b ) Loomad veedavad samaväärse vahemaa kvadrandiplatvormis MWM-i proovivõtturi ajal. c ) Gd / rAAV1 ja Ringeri / rAAV1 loomade jõudluses OLM-i töös statistiliselt olulisi erinevusi ei ole. n = 7 Gd / rAAV1; n = 7 helinat / rAAV1.

Täissuuruses pilt

Arutelu

Meie uuringute tulemused näitavad, et Gd kaasinfusioon suurendab märkimisväärselt rAAV1 jaotust roti hipokampuses. Lisaks suurendas Gd viirusvektori transduktsiooni kontralateraalsesse, süstimata poolkerasse, mille tulemuseks oli difuusne ekspressioonimuster kui loomadel, kellele süstiti rAAV1-GFP ja Ringeri lahust. Teisest küljest ei mõjutanud rAAV5 jaotuspindala ja -mahtu Gd. See on vastupidiselt meie laboris tehtud varasematele uuringutele, mis näitasid rAAV5-GFP transduktsiooni märkimisväärset tugevnemist roti striaatumis pärast Gd koosinfusiooni (Osting et al. , Esitatud). Üks võimalik seletus võib olla see, et hipokampuse ja niudevahelised anatoomilised erinevused võivad kontrastaine juuresolekul mõjutada viirusvektori jaotust. 17 Üheskoos viitavad need erinevused sellele, et kontrastainete koosinfusiooni tingimused ja erinevad AAV-i serotüübid tuleb erinevate ajupiirkondade jaoks empiiriliselt kindlaks määrata.

Selle kaasinfusioonimeetodi kasutamiseks viirusvektori jaotuse ja transgeeni ekspressiooni parandamiseks tuleb näidata, et Gd-l ei ole uuritavale funktsionaalsele tulemusele kahjulikku mõju. Seetõttu uurisime kontrastaine võimalikke mõjusid ka kahes hipokampuse käitumise testis. MWM ja OLM testide tulemused näitavad, et rAAV1 ja Gd samaaegne infusioon ei põhjustanud ruumimälu kahjustusi. Seetõttu on selle konkreetse rAAV serotüübi koosinfusioon Gd-ga funktsionaalsetes uuringutes kasutamiseks ohutu viis rAAV1 transduktsiooni efektiivsuse suurendamiseks roti hipokampuses. Selle lähenemisviisi üks puudus on see, et viirusvektor jaotub ka väljaspool hipokampust, mille tulemuseks on transgeeni ekspressioon väljaspool huvipakkuvat piirkonda. Sõltumata sellest saab seda tööriista kasutada siis, kui on vaja suuremaid transgeeni ekspressioonipiirkondi. Paljudel juhtudel nõuab viirusvektorite ajusisene kohaletoimetamine süstimist mitmesse kohta. Sellest vajadusest kõrvalehoidmiseks on meie rühm ja teised välja töötanud meetodid rAAV jaotumise optimeerimiseks kesknärvisüsteemis. Nimelt hepariini koosinfusioon koos rAAV2-ga, 18 rAAV-i samaaegne infusioon mannitooliga intraparenhümaalsel või süsteemsel teel, 8., 9., 19. konvektsioonivõimelise kohaletoimetamise, 20, 21 või mannitooli ja konvektsiooni abil täiustatud manustamise kasutamine . 10 Siinkohal pakume ohutu alternatiivmeetodina rAAV1 ja Gd samaaegset infusiooni, et võimaldada sihtimist suurematesse ajupiirkondadesse, kus on vähem süstekohti, ja seega vähendada operatsiooni aega, mis on oluline muutuja, mida tuleb arvestada, eriti töötades neuroloogiliste häirete eakate või habraste loommudelitega. . 22, 23, 24

materjalid ja meetodid

Loomad

Sprague – Dawley rotid (3–5 kuud) peeti 2–3-aastastesse rühmadesse 12–12-valguse / pimeduse tsükli jooksul ning neile võimaldati juurdepääs toidule ja veele tasuta. Protokollid kiitis heaks Wisconsini Ülikooli Madisoni loomahoolduse ja kasutamise nõuandekomitee vastavalt USA rahvatervise poliitikaga kehtestatud suunistele inimhoolduse ja laboriloomade kasutamise kohta.

Viirusvektorite tootmine

Kirjeldatud on AAV-d ekspresseerivat GFP konstrukti. 9 AAV1 ja AAV5Viral vektoreid valmistati ja puhastati vastavalt eelnevalt kirjeldatule. 5 viiruse tiitrit määrati reaalajas PCR abil (AAV1-GFP = 5, 9 x 10 12 vektori genoomi ml kohta (vg ml −1 ); AAV5-GFP = 4, 8 x 12 vg ml −1 ). Gd (Prohance: Brako Diagnostics, Princeton, NJ, USA) lahjendati Ringeri lakteeritud lahuses töökontsentratsioonini: (mEq l −1 ) naatrium 130, kaalium 4, kaltsium 2, 7, kloriid 109, laktaat 28 ja osmolaarsus 273 mOsmol l - 1 pH 6, 5 (Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA).

Ajusisesed süstid

Kõik kirurgilised protseduurid viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud. Stereotaksilise raami abil tehti dorsaalsesse hipokampusesse 22 ühe- või kahepoolset süsti (Kopf Instruments Tujunga, CA, USA). Ühepoolsete süstide jaoks sai parem poolkera segu, mis sisaldas 1 μl Gd ja 1 μl viirusvektorit, kuni Gd kontsentratsioonini 1 mM. Kontrollloomad said 1 μl viirusvektorit ja 1 μl Ringeri laktaadilahust. Loomi infundeeriti Hamiltoni süstla kolbi kontrolliva infusioonipumbaga kokku 2 ul kiirusega 0, 5 μl min- 1, reguleerides täpselt süstimiskiirust. Nõel jäeti 1 minutiks paika, seejärel tõsteti 3 mm ja jäeti veel 4 minutiks enne ajust väljavõtmist. Hipokampuse koordinaadid olid AP = −3, 5, Lat = ± 2, 5, DV = -2, 6.

Immunohistokeemia

Kolm nädalat pärast ühepoolset vektorisüstimist või vahetult pärast käitumiskatsete lõpetamist kahepoolselt süstitud loomadega tuimastati katsealused Beutanaasia D-ga (150 mg kg- 1 intraperitoneaalselt, vajadusel koos toidulisanditega) ja perfuseeriti aordi kaudu 4% formaldehüüdiga (Sigma, St Louis, MO, USA) 0, 1 M fosfaatpuhvris. Krüoprotektsioon toimus fosfaatpuhvris koos 2% dimetüülsulfoksiidiga ja glütserooli kontsentreeritud astmetega. Poolkerad külmutati kuiva jääga ja lõiguti koronaaltasandil paksusega 45 μm ning lõigud viidi etüleenglükoolil põhinevasse säilituslahusesse ja pandi temperatuurini -20 ° C sügavkülmikusse, kuni need olid kasutamiseks valmis. Kogu töötlemine toimus toatemperatuuril, kui ei ole öeldud teisiti.

GFP ja Iba1 immunohistokeemia

Kõik lahused valmistati puhvriga, mis sisaldas fosfaatpuhverdatud soolalahust (PBS) koos 2% veise seerumi albumiiniga (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) ja 0, 1% saponiini GFP jaoks või 0, 3% Tritoni Iba1 jaoks. Kõiki sektsioone pesti, blokeeriti puhvris 20% normaalse seerumiga 45 minutit, inkubeeriti üleöö primaarses antiseerumis (GFP firmalt Novus Biologicals, 1:30 000; Iba1 ettevõttelt Wako Pure Chemical Industries, 1: 500) 1% normaalses seerumis. Pärast pesemist inkubeeriti sektsioone 3 tunni jooksul 1: 300 biotinüleeritud sekundaarses IgG-s (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), millele järgnes 1 tund avidiini-biotiini kompleksis (Standard Elite komplekt; Vector Laboratories). Lõplikuks visualiseerimiseks kasutati 0, 04% 3, 3 ′ -diaminobensidiini (tablettide kujul; Sigma, St Louis, MO, USA) ja 0, 01% H202 fosfaatpuhvris, pH 7, 4. Sektsioonid paigaldati alamklaasidele, dehüdreeriti läbi etanooli kontsentreeritud kontsentratsioonide, puhastati Histo-Cleariga (National Diagnostics, Charlotte, NC, USA) ja kaeti Eukittiga.

GFAP immunotsütokeemia: kõik lahused valmistati puhverlahusega, mis koosnes 2% normaalse seerumi, 2% lüsiini ja 0, 2% tritooniga PBS-ist (blokeeriv lahus). Sektsioone pesti, inkubeeriti üleöö blokeerimislahuses temperatuuril 4 ° C. Järgmisel päeval inkubeeriti lõike üleöö 4 ° C juures primaarses antiseerumis (GFAP firmalt DakoCytomation, Glostrup, Taani, 1: 5000). Pärast pesemist inkubeeriti sektsioone 1: 200 biotinüleeritud sekundaarses IgG-s 2 tundi, millele järgnes 1 tund avidiini-biotiini kompleksis (Standard Elite komplekt; Vector Laboratories).

Nissli värvimine: lõigud paigaldati alamklaasidele, dehüdreeriti läbi etanooli kontsentreeritud kontsentratsioonide, puhastati Histo-Cleariga, rehüdreeriti, leotati kresüülvioletse peitsiga, dehüdreeriti veel kord etanooli kontsentreeritud kontsentratsioonide abil, puhastati Histo-Cleariga ja kaeti Eukittiga.

Striataalse GFP immunoreaktiivsuse kvantifitseerimine

Densitomeetriline analüüs viidi läbi tarkvara NIH ImageJ abil. 26 pilti 10–12 (30 μm) koronaalsetest lõikudest 0, 56 mm kaugusel oleva roti kohta tehti digitaalkaameraga varustatud Nikon Nikon E600W mikroskoobi abil (Q Imaging Retiga 2000R; Nikon Instruments, Melville, NY, USA). Iga pildi lävi määrati funktsiooni MaxEntropy abil ja registreeriti osakeste arv pindalaga 5 kuni 75 ruutpikslit. OD jaoks kalibreeriti ImageJ astmelise tahvelarvuti abil, hallskaala väärtused teisendati OD ühikuteks, kasutades Rodbardi funktsiooni, ja registreeriti pikslites ala, mis ületas läve. Statistiline analüüs viidi läbi, kasutades Prism5 (Graphpad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) ja seda näidatakse keskmise ± semina. Statistilise olulisuse määramiseks viidi läbi kahepoolne, paarimata t- test.

Fluorestsents-immunohistokeemia

Kõik GFAP fluorestsents-immunotsütokeemia lahused valmistati puhverlahusega, mis koosnes 2% normaalse seerumi, 0, 2% Triton X-100 ja 2% lüsiiniga PBS-ist. Sektsioone pesti, inkubeeriti üleöö puhvris temperatuuril 4 ° C, inkubeeriti üleöö GFAP (DakoCytomation, 1: 1000) primaarses seerumis puhvris, pesti, inkubeeriti 1: 1000 fluorestsentsiga sekundaarses (Alexa Fluor 568 kitse anti-küüliku IgG; Molecular Probes), Life Sciences, Grand Island, NY, USA) 3, 5 tundi ja loputati PBS-ga. Sektsioonid paigaldati alamklaasidele ja kaeti pealt ProLong Gold antifade reagendiga (Molecular Probes).

Kõik NeuN fluorestsents-immunotsütokeemia lahused valmistati puhverlahusega, mis koosnes 0, 1% saponiini ja 2% veise seerumi albumiiniga PBS-ist, blokeeriti samas puhvris 20% normaalse kitseerumiga 45 minutit, inkubeeriti üleöö NeuN-i primaarses antiseerumis (EMD Millipore, Billerica, MA, USA, 1: 1000) 0, 1% normaalse kitseerumiga, pestakse puhverlahuses, inkubeeritakse 2 tundi 1: 500 Alexa Fluor 594 kitse hiirevastases IgG-s (Molecular Probes) PBS-is koos 0, 1% saponiini ja 2 % veise seerumi albumiini, loputatud PBS-ga ja kinnitatud ProLong Gold antifade-reagendiga.

Fluorestsentsmikroskoopiline kujutis tehti digitaalkaameraga (Q Imaging Retiga 2000R; Nikon Instruments) Nikon E600W Eclipse epifluorestsentsmikroskoobiga x60 planapokromaatilise objektiivi ja standardse fluorestseiini isotiotsüanaatfiltrikuubiga (fluorestseiini isotiotsüanaat; DM 465–495 nm). ; BA 515–555 nm) ja tetrametüülrodamiini isotiotsüanaadi filtrikuubik (tetrametüülrdamiini isotiotsüanaat; EX 528–553 nm; DM 565 nm; BA 600–660 nm). Fluorestsentskujutised saadi algse 36-bitise tooniskaala järgi ja salvestati 8-bitiste failidena. Pildid valmistati reprodutseerimiseks Adobe Photoshop CS 3-s (Mountain View, CA, USA). Tooniskaala, kontrasti ja tooni korrigeerimised ning sellele järgnev teravdamine ebatervisliku maski algoritmiga rakendati kogu kujutisele.

Käitumine

Kolm nädalat pärast süstimist tehti rottidele OLM-i ülesanne. Protokolli on varem üksikasjalikult kirjeldatud. 25 Lühidalt, rotte treeniti kahe identse objekti asukohas 6 minutit. OLM-i testimine toimus 24 tundi pärast koolitust. Testimiseks viidi üks objektidest teise kohta ja ruumimälu testiti, võrreldes uues asukohas objekti uurimiseks kulunud aega võrreldes tuttavas asukohas asuva objektiga. Kõik uuringud nii koolitus- kui ka testimispäevadel tehti videolinti kasutades videotracki tarkvara ViewPoint Life Sciences (Montreal, Kanada). Iga looma kohta registreeriti kogu aeg, mis kulus romaani ja tuttavate objektide uurimisele. Iga objekti jaoks registreeriti suhteline uurimisaeg (T, sekundites) ja see väljendati uudsuse skoorina: (T romaan / (T romaan + T tuttav ) × 100). Rottide käitlemise ja punktide määramise katsetas looma ravimeid pime katsetaja.

MWM-i ülesanne viidi läbi kaks päeva pärast OLM-i ülesannet. Protokolli on üksikasjalikult kirjeldatud 27 koos muudatustega. Loomi koolitati üheks päevaks MWM-i nähtavas versioonis, et loomad harjutataks ülesande täitmiseks ning ujumisvõime ja nägemisteravuse testimiseks. See koolitus koosnes neljast 90-sekundilisest katsest. Teisel päeval asendati nähtav platvorm uputatud, varjatud platvormiga. Loomi koolitati 5 päeva jooksul peidetud platvormi leidmiseks, kasutades ruumi ümbritsevaid ruumilisi näpunäiteid. Iga päev koosnes neljast katsest. Õppevõime mõõdupuuks registreeriti platvormi leidmise kaugus. 5. päeva viimase katsetuse (katse 20) lõpus platvorm eemaldati ja proovikatse tehti selleks, et määrata kogu aeg ja vahemaa loomade vahel, mis olid veedetud kvadrandis, mis varem sisaldas platvormi mälukatsena.

Kõik statistilised analüüsid tehti Prism 5 (Graphpad Software) abil. Statistilise olulisuse määramiseks OLM-i ülesandes viidi läbi kahepoolsed paarimata t- testid. MWM omandamise andmeid analüüsiti, kasutades dispersioonanalüüsi korduvat mõõtmist. Sondide prooviprotsendi protsendi analüüsimiseks platvormi kvadrandis kasutati dispersioonanalüüsi ühesuunalisena. Joonised näitavad keskmist ± sem