Mikrorõngad hobusevõrgus: nähtav seos tagumise levimusega | loodus annab ülevaate geneetikast

Mikrorõngad hobusevõrgus: nähtav seos tagumise levimusega | loodus annab ülevaate geneetikast

Anonim

Abstraktne

Homeoboxi (Hox) transkriptsioonifaktorid annavad selgroogsete embrüotele telje koordinaadid ees-taga (AP). Hoxi geene leidub klastrites, mis sisaldavad ka mikroRNA (miRNA) geene. Meie prognoositud miRNA sihtmärkide analüüs näitab, et Hoxi klastrisse manustatud miRNA-d sihivad eelistatavalt Hoxi mRNA-sid. Lisaks asuvad arvatavad Hoxi sihtgeenid valdavalt Hox miRNA lookuse 3'-küljel. Need tulemused viitavad sellele, et Hox miRNA-d aitavad represseerida rohkem eesmisi programme, tugevdades seeläbi tagumist levimust, mis on posteriori hierarhiline domineerimine Hoxi geeni eesmise funktsiooni ees, mida täheldatakse bilateriaanides. Sel viisil näib miRNA-vahendatud regulatsioon koondavat interaktsioone geeni ekspressiooni muudel tasanditel, veel mõnedel esivanematel, stabiliseeruva valiku võrgus.

Võtmepunktid

  • Hoxi geeniklastrid on lookused, mis kodeerivad mikroRNA-sid (miRNA-sid). Nende hulka kuuluvad: miR-10, mida leidub kogu Bilaterias; miR-196, leitud selgroogsetel; ja putukates leiduvat miR-iab4.

  • Hox miRNA-d sihivad eelistatavalt Hoxi transkriptsioonifaktorite mRNA-sid, tugeva kalduvusega suunata neid Hox miRNA lookuse 3'-küljel asuvatest lookustest.

  • Need sihtimiseelistused eeldavad, et Hox miRNA-d aitavad represseerida rohkem eesmisi programme, tugevdades seeläbi tagumist levimust, mis on posteriori hierarhiline kontroll Hox-i eesmise geeni funktsiooni üle.

Peamine

Bilateria piirkondliku anatoomilise identiteedi määrajatena on homeoboxi (Hox) geeniklastrid tugevalt evolutsiooniliselt piiratud, väikesed muudatused põhjustavad kehaplaanis põhjalikke muutusi 1, 2 . Puhastatud selektsioonist tulenevat säilimist illustreerib Hoxi transkriptsioonifaktorite homeoboxi motiiv, milles elimineeritakse 99, 7% mittesünonüümsetest mutatsioonidest, vastupidiselt inimese ja hiire geenipaaride juhusliku komplekti keskmisele 85% -lisele eemaldamise hinnangule 3 . Esivanemate bilateriaalsete Hox-geenidega võrreldes on selgroogsete komplekt märkimisväärselt piiratud klastrite korralduse, geenijärjekorra, orientatsiooni ja kompaktsuse osas 1 . Teisest küljest esinevad suured erinevused kõrgelt järjestatud selgroogsete moodustunud kobaratest väga erineva kehaplaaniga kladede genoomides - nagu okasnahal, kus kobar on kokku segatud 4, või urokordatuurides, kus see on lagunenud ja tsentraalsed geenid on kadunud 5, 6 . Hoxi regulatoorsete elementide looduslikke erinevusi on kasutatud lülijalgsete suguluses olevate liikide kehaosade morfoloogiliste erinevuste selgitamiseks. Selgroogsete hulgas võis seda tüüpi variatsioon (näiteks ülemaailmse tugevdaja võimendamine ekspressiooni juhtimiseks mööda sekundaartelge) võimaldada struktuuriliste uuenduste, sealhulgas tetrapoodilise jäseme 7, 8 väljatöötamist .

Iteratiivne kood piki AP-telge

Imetajate neli Hoxi klastrit kaardistavad eristatavad kromosoomid, suurusjärgus 100 kuni 200 kb, ja igaüks sisaldab 9 kuni 11 valku kodeerivat geeni, mis on hajutatud 13 paraloogse rühma vahel, kõik transkribeeritakse ühest DNA ahelast. Hoxi geeninomenklatuuris laskub paraloogide numeratsioon transkriptsiooni suunas, Hox1 paraloogid kaardistatakse iga klastri 3 'servaga (joonis 1a). Hoxi paraloogid saadi 3'-otsa kodeerivate järjestustega kõige tihedamalt seotud algse matriitsi tandem-dubleerimise teel. Arvatakse, et protoHox1 / 2 ja protoHox3 geenide paarikomplekt, mis esines varases metazoanis, dubleeris Hox ja paraHox eelkäijaid, millest igaüks koges hiljem täiendavat replikatsiooni 9 . Esivanemate chordate-klaster meenutas arvatavasti kõige enam vabalt elava mere urokordate amphioxus 10 ainulaadset ∼ 450 kb klastrit, millest lahutatakse selle kõige tagumine geen Hox14 , mis on tõenäoliselt urokordate värsispetsiifilise dubleerimise sündmus 11 . Sellest esivanemate prototüübist tekkisid selgroogsetes mitu klastrit suurema ringi dubleerimiste seeriana, mis hõlmas ümbritsevat genoomi.

Image

a | Hiire Hox klastrid. Sinine ja roheline joon näitavad represseerumist vastavalt mikroRNA-de (miRNA-de) miR-10 ja miR-196 abil. Kõik sihtmärgid on inimestel konserveeritud, välja arvatud Hoxd1 ja Hoxa4 (katkendjoon). b | Mudel Hox miRNA-de rolli kohta Hoxi koodi moduleerimisel. Hox miRNA-d paigutatakse embrüonaalse arengu skeemi piki segmenteeritud eesmist ja tagumist telge. Kõige eesmine segment näitab vaikimisi arendusolekut, mis täpsustatakse Hoxi avaldise puudumisel. Seda olekut muudavad miRNA-d, mis summutavad miRNA lookusest 3 ′ asuvate Hoxi geenide aktiivsust, tagumiste saatuste suunas. Teine eesmine segment on miRNA lookusest 3 ′ asuvate Hoxi geenide ekspressiooni eesmine ekspressioonipiir, mis täpsustavad varasemaid ja rohkem eesmisi saatusi. Hox miRNA-d summutavad nende 3'-Hoxi sihtmärkide tagumist ekspressiooni. Tagumistes domeenides toimivad nad paralleelselt 5 'Hoxi geenidega, et tugevdada 5' Hoxi funktsiooni hierarhiat. Hoxi miRNA ekspressiooni kõige tagumistes domeenides pakuvad miRNA-d hälbimatut või madalatasemelist ja eksperimentaalselt tuvastamatut transkriptsiooni tõrkekindel repressioon. Teise võimalusena võivad nad püsida stabiilsete liikidena pärast 3 'Hoxi sihtmärkide eemaldamist. Sihtmärgid ekspresseeritakse tavaliselt enne miRNA-sid ja seega on miRNA-vahendatud ekspressioonidomeenide modulatsioonil ka ajaline mõõde (pole näidatud).

Täissuuruses pilt

Hoxi geene ekspresseeritakse kõikides embrüonaalsetes idukihtides järkjärgulistes ja kattuvates domeenides piki eesmist-tagumist (AP) telge, mida nimetatakse ka rostrocaudal-teljeks, teravate eesmiste ja hajusate tagumiste piiridega 2 . Ekspressiooni eesmine piir on koht, kus transkriptsiooni tase on kõrgeim ja kus funktsiooni kaotuse fenotüübid on kõige ilmsemad, seega määratletakse see funktsionaalse domeenina 2, 12 . Geenijärjestus klastris korreleerub funktsionaalsete domeenide koordinaatidega piki AP-telge ja geeniekspressiooni suhtelise algusega selgroogsete mao ajal. Neid konserveerunud omadusi, mille kohaselt geene väljendatakse Hoxi klastri 3 'otsas varem ja tagurpidi ning rohkem 5' geene ekspresseeritakse hiljem ja edasi saba suunas, nimetatakse ruumiliseks ja ajaliseks kolineaarsuseks 2, 13, 14 . Hoxi geenide pesastatud ekspressioon viib moodulkoodini, mis täpsustab piki AP telge paiknevad ruumilised koordinaadid ja määrab piirkondlikud anatoomilised identiteedid 15, 16 .

Tundub, et Hoxi avalduse 17, 18 ruumilise ja ajalise koliinisuse eest vastutab keerukas globaalsete ja kohalike transkriptsiooniliste regulatsioonimehhanismide komplekt. Transkriptsioonijärgset regulatsiooni on täheldatud ka 19, 20, kuid sellele on vähem eksperimentaalset tähelepanu pööratud. See hõlmab regulatsiooni mikroRNA-de (miRNA-de) abil, mis on ∼ 22-nukleotiidseid (nt) mittekodeerivaid RNA-sid, mis juhivad valku kodeerivate geenide transkriptsioonijärgset repressiooni nende geenide sõnumitega sidumise teel, tavaliselt nende 3′UTRs 21 . Sihtmärgi äratundmisel on kõige olulisem miRNA 5 'piirkonnaga sidumine, eriti miRNA nukleotiididega 2–7, mida tuntakse seemnena. MiRNA konserveerunud sihtmärke saab ennustada valepositiivsete ennustuste taustal, otsides konserveeritud 7-nt vasteid seemnepiirkonnale 22, 23, 24, 25 . See lähenemisviis näitab, et üle kolmandiku imetaja valke kodeerivatest geenidest on olnud selektiivne rõhk, et säilitada miRNA-dega 23 sidumine. Neid suunatud sõnumeid represseeritakse kas translatsiooniliste repressioonide, mRNA destabiliseerimise või mõlema kaudu. Siin käsitleme teadaolevaid ja ennustatud Hox mRNA-de repressioone miRNA-de abil ja kuidas see miRNA-vahendatud repressioon on seotud Hoxi klastrite üldise reguleerimise ja funktsiooniga embrüonaalse arengu ja evolutsiooni ajal.

Hox miRNA-de ja nende sihtmärkide genoomne seotus

Vähemalt 30-l 39-st imetajast Hox 3′UTR on üks või enam konserveerunud kokkulangevust selgroogsete miRNA-dega, millest mitut on toetatud katseliselt. Nende hulka kuuluvad Hoxa7 , Hoxb8 , Hoxc8 ja Hoxd8 , millel on miR-196 konserveeritud sihtmärkidena eksperimentaalne tugi (viited 26, 27). Kana puhul on Hoxb8- l seemnetega vastav koht, kuid enamikul selgroogsetel on Hoxb8 ebatüüpiline miRNA sihtmärgina, kuna sellel puudub täiuslik seemnete sidumine ja sellel on ulatuslik komplementaarsus miR-196-ga, muutes selle miRNA-suunatud substraadiks. lõhustamine. Mir-196 ekspressioon on esijäsemes madalam kui tagajäsemes, kus miRNA toimib Hoxb8 inhibiitorina ja hoiab ära selle esilekutsumise ektoopilise retinoehappega 28 . Hoxc8-l , Hoxd8-l ja Hoxa7-l on kanoonilised seemnetulemused - saitide tüüp, mis vahendavad translatsioonilist repressiooni ja mRNA destabiliseerumist ilma miRNA-ga suunatud lõhenemiseta. Neid saite sisaldavad 3′UTR-fragmendid vahendavad reporterite represseerimist inimese kasvatatud emakakaelavähi (HeLa) rakkudes 26 . Sarnased katsed toetavad miR-10 abil Hoxd10 mRNA sihtimist inimese kultiveeritud mittemetastaatilise rinnavähi (SUM149) rakkudesse 29 . MiR-10 taseme muutmine sebrakala embrüodes põhjustab Hoxb1a ja Hoxb3a ekspressiooni, mõlemal on seemne vasted 3'UTRs 30 . Lisaks põhjustab funktsionaalsete miR-10 ja miR-196 blokeerimine tibude embrüodes ulatuslikke luustiku defekte, sealhulgas homeootilisi transformatsioone, mis on kooskõlas Hoxi geenide reguleerimisega nende kahe miRNA-dega (E. McGlinn, SY, DPB ja CJT, avaldamata tähelepanekud). Samuti toetavad katsed kärbestega Drosophila Hoxi geenide ennustatud mahasurumist miR-10 ja miR-iab miRNA-dega 31, 32, 33, 34, 48, sealhulgas funktsiooni kaotuse uuring, mis näitab, et miR-iab miRNA-de sihtmärk on Ultrabithorax ( Ubx ) repressioonideks tagumistes segmentides 31 .

Hoxi mRNA-de eelistav sihtimine . Nii miR-10 kui ka miR-196, kaks selgroogsete miRNA-d, mis on eksperimentaalselt seotud Hoxi mRNA-de sihtimisega, ekspresseeritakse geenperekondadest, mida kodeerivad ise Hoxi klastrites 26, 47 olevad järjestused (joonis 1a), mis viib küsimuseni, kas need kaks Hox miRNA-d võivad eelistatavalt olla suunatud Hox-i mRNA-dele. Konserveerunud miRNA saitide, mis sobisid 73 kõrgelt konserveeritud selgroogsete miRNA perekonnaga 23, 35, uurimisel selgus, et Hox 3′UTR-i kuuluvatest saitidest 15% sobis kahe Hox miRNA-ga. Veelgi enam, kui kaks Hox miRNA-d järjestati 73 miRNA perekonna seas esimeseks ja kolmandaks, kui arvestada Hox 3'UTR-i kuuluvate konserveerunud saitide osakaalu (tabel 1). Seega, ehkki Hoxi klastri kodeeritud miRNA-del on palju muid konserveerunud sihtmärke peale Hoxi geenide ja kuigi Hoxi mRNA-d sisaldavad teiste MIRNA-de sihtkohaid, näivad kaks Hoxi miRNA-d eelistatavalt Hoxi geene reguleerivat.

Täissuuruses tabel

See eelistatav sihtimine on seda silmatorkavam, et miRNA sihtmärkide prognoosid pole kaugeltki täiuslikud ja annavad kahtlemata palju valepositiivseid ja valenegatiivseid tulemusi. Meie analüüs, mis keskendus peamiselt 7–8-meetristele seemnetega sobitatud saitidele, mis langevad 3′UTR-i, oleks jätnud vahele mittekanoonilise sidumisega saidid või mujal sõnumis asuvad saidid. ORF-i kuuluvate alade tõhususest ja eelistatavast kaitsest on teatatud, kuid efektiivsus on umbes üks kümnendik 3′UTR-des täheldatud saitidest ning kodeerimisega kaasnev säilivus vähendab ennustamisspetsiifilisust, õigustades nende alade väljajätmist kaalumisest. 23, 35 . Saidid, millel pole seemnepiirkonnaga ideaalset sidumist, võivad ikkagi toimida, kui neil on ulatuslik sidumine miRNA 3 'piirkonnaga, mis võib kompenseerida seemnete sidumise ebakõla või mõhk. Tõepoolest, miR-196 sait Hoxb8 3′UTR-s on sellise 3'-kompenseeriva saidi hästi tuntud näide ning sarnased miR-196 saidid Hoxc8 ja Hoxd8 on välja pakutud 26 . Kuid eksperimendid, mis uurivad saidi katkemise mõju miRNA-mediteeritud repressioonidele, peavad veel selgitama selgroogsete mRNA-de täiendavaid 3'-kompenseerivaid saite, ehkki sellised katsed on toetanud lugematute seemnetega sobitatud saitide funktsiooni. Saidi kaitse süstemaatiline analüüs näitab, et täiendavad 3'-kompenseerivad saidid töötavad tõenäoliselt selgroogsetel, kuid need on haruldased ja moodustavad vähem kui kaks protsenti kõigist selgroogsete miRNA-de valikuliselt hooldatud saitidest (R. Friedman, KK Farh, CB Burge ja DPB, avaldamata tähelepanekud). 30-st kõige tõenäolisemast 3'-kompenseerivast saidist, mis on järjestatud 3'-sidumise kvaliteedi ja säilivuse ulatuse järgi, on ainsad kaks, mis Hox 3′UTR-i langevad, miR-196 saidid Hoxb8 (1. kohal) ja Hoxc8 (järjestatud 20 parimat). Need tulemused on kooskõlas katsetega, mis näitavad, et seemnete mittevastavust võimaldavate algoritmide abil ennustatud saitidel on halb tõhusus 35 . Nendele kaalutlustele tuginedes hõlmas meie analüüs kolme miR-196 3′-kompenseerivat saiti 26, kuid ei võtnud arvesse muid seemnetega sobimatuid saite. Sidumine miRNA 3 'piirkonnaga võib täiendada ka seemnetega sobivate saitidega, et suurendada saidi efektiivsust, kuid kuna sellest tulenev 3'-täiendav sidumine näib olevat haruldane ja suurendab saidi efektiivsust vaid tagasihoidlikult 35, ei võetud seda arvesse.

Sihtkohtade kaitse . Ehkki säilitamine pakub kasulikku teavet regulatiivse saidi funktsionaalse olulisuse kohta, pole kõigil miRNA-le reageerivatel mRNA-del saite säilinud. Mittekonserveerunud saidid vahendavad reporterianalüüsides sageli miRNA-st sõltuvat repressiooni ja enamikul sõnumitel, mis surutakse alla miRNA sisseviimisel, nagu ka enamikul neist, mis on depresseeritud, kui miRNA inhibeeritakse või elimineeritakse, on saite, mis ei vasta sihtmärgi ennustamiseks tavaliselt kasutatavatele säilituskriteeriumidele 35, 36, 37, 38, 39 . Kui nende miRNA-de vahendatud repressioonid oleksid ebaolulised, ei eeldataks, et saidid oleksid puhastava valiku all, ja see võib juhtuda mõnede konserveerimata sihtimisinteraktsioonide puhul. Mõnel juhul võivad leiukohad pakkuda hiljuti välja töötatud, kuid olulisi liinispetsiifilisi funktsioone või need võivad olla esivanemate regulatsiooni vorm, mis on küll valiku all, kuid on sellegipoolest kadunud (või mida pole võimalik joondada) ühes järgmistest: võrdlusliigid. Hoxi miRNA-de abil Hoxi mRNA-de potentsiaalse konserveerimata sihtimise leidmiseks uurisime sõltumatult viie esindusliku selgroogse genoomi - inimese, hiire, tibu, sebrakala ja puhviskala - Hox 3′UTR-e kanooniliste 7–8-meersete seemnetega sobivate saitide jaoks ( kasutatavate meetodite kohta vt 1. selgitus). Enam kui kolmandikul 3'UTR-ist oli miR-196 või miR-10 jaoks vähemalt üks ja kuni kuus kanoonilist kohta (joonis 1a; tabel 2). Ehkki säilitamiseks, 3′UTR-i kohalikuks joondamiseks ega sünteesiks ei olnud nende tuvastamiseks vaja, olid kõik saidid peale kolme ja kolm nii inimese kui ka hiire genoomis. Nendel kolmel juhul hinnati saidi ajalugu imetajate genoomi mitmete joondamiste uurimisega. Tundub, et Hoxa4 ja Hoxb13 on saanud näriliste ja primaatide suguluses ainulaadsed 7-meersed seemnevõistlused miR-196-ga. Hoxd1 on säilitanud 8- meerse saidi, mis vastab hiire miR-10 seemnepiirkonnale , kuid on kaotanud selle rotil ja primaatide sugukonnal. Opossumil, mis on põhiline euteerilistele imetajatele, kasvukohta ei ole, kuid kuuel teisel imetajal, kes on põhilised nii primaatidele kui ka närilistele, on 7-merine sait, mis vastab miR-10 seemnepiirkonnale. Mitmel juhul, sealhulgas hiire Hoxa4 ja Hoxa7 korral , mis näitavad tõendeid alternatiivse polüadenüleerimise kohta, on miRNA saidid pikemas isovormis ja võivad aidata kaasa isovormispetsiifilisele regulatsioonile. Me järeldame, et suurem osa Hox miRNA-de sihtimisest eksisteeris enne imetajate teket ja selle säilitamiseks on olnud kõrge selektiivne surve.

Kasutades Lewise et al . 23, ennustasime miR-10 ja miR-196 sihtmärke inimese, hiire, tibu, sebrakala ja Takifugu Hoxi klastrites, kehtestamata säilitusnõudeid. Sihtmärk sisaldas vähemalt ühte kanoonilist 7–8-merilist vastet miR-196-le (8-merine vaste, ACTACCTA; 7-merine vaste, ACTACCT ja CTACCTA) või miR-10 (8-merine vaste, ACAGGGA; 7-mer) vasted, ACAGGG ja CAGGGA) selle 3′UTR piires. Hõlmatud olid ka MiR-196 3′-kompenseerivad saidid, mis tuvastati Hoxb8 , Hoxc8 ja Hoxd8 UTR- ides 26 . Imetajatel defineeriti 3′UTR pikima RefSeq annotatsiooniga, välja arvatud Hoxb1 3′UTR, mida pikendati olemasolevast annotatsioonist tulenevalt kattuvate ESTde olemasolust ja säilimisest ümbritseva intergeense järjestuse kohal. Kanades määrati UTR-id imetajate ortoloogia abil, samuti EST-järjestused, ja teleostides määratleti UTR-id 2 kb järjestusena 3 'stoppkoodonini.

Täissuuruses tabel

Väljendus ja funktsioon kogu Bilaterias . Hoxi mRNA-de eelistatava sihtimise funktsionaalse olulisuse hindamisel Hox miRNA-de poolt on kasulik arvestada nende miRNA-de ekspressiooni ja arengut. Geenid mir-10 ja mir-196 transkribeeritakse samas orientatsioonis nagu valke kodeerivad geenid igas klastris ning neid ekspresseeritakse mustrina, mis lähendab Hoxi geenide iseloomulikku ekspressiooni, sealhulgas ekspressiooni eesmised piirid, mis on korrelatsioonis nende genoomse positsiooniga klaster 26, 27, 30, 40, 41 . Mõlemal miRNA perekonnal on kõrgeim ekspressioon närvitorus ja madalam ekspressioonitase pagasiruumi mesodermis, halvasti määratletud eesmised piirid ja lai tagumine ekspressioon läbi saba. Hiireembrüodes on miRNA ekspressiooni eraldusvõime täpsuse piiride määramiseks liiga madal. Kuid miRNA-de täheldatud ekspressioonidomeenid on kooskõlas mustritega, mida eeldatakse nende asukoha põhjal Hoxi klastrites. Näiteks Mir-196 ekspressiooni eeldatav eesmine piir oleks Hoxb9-ga (viide 27), mis Hox-klastris külgneb mir-196-ga, pisut tagumine. Hoxb9 ekspressioonil on paraksiaalse mesodermi eesmine piir kuni prevertebra 3 embrüonaalse päeva 9, 5 (E9.5) hiirtel, mida nihutatakse E12.5 abil kaudaalselt rindkere prevertebra 8 (viide 15). MiR-10 eesmine piir on kaudaalne külgneva geeni Hoxb4 transkriptide omaga või sellega samaväärne (viide 27), millel on ekspressioonipiir E10.5 hiirtel 20 paravertikaalses mesodermis prevertebra 2 juures.

Ekspresseerituna lookustest Hox4 ja Hox5 paraloogide vahel (joonis 1a) või Hoxd4 intronis (näiteks hiir miR-10b), on miR-10 bilateriaalsete miRNA-de tuumade hulgas, mille ortoloogid on putukatel 42, nematoodidel 43 ja planaria 44 . RNA-blot uuringud viitavad homoloogi võimalikule esinemisele merileti anemonis Nematostella vectensis , mis viitab sellele, et miR-10 järjestus võis olla enne cnidarian-bilaterian jagunemist 44, 45 . Nematoodide ortoloog, miR-57, jagab kooriku miR-10 seemnepiirkonda ja seega eeldab, et ta tunneb põhimõtteliselt samu saite. Kuid mir-57 ei asu Hoxi geenide hulgas ja sellel pole kanoonilist seemnepaarimist Caenorhabditis elegans Hoxi mRNA-dega. Geen Drosophila mir-10 on ebaharilik, kuna see tekitab juuksenõelu eelkäija mõlemast käest küpset, ilmselt funktsionaalset miRNA-d, mis laiendab sihtimisvõimalusi sellest lookusest 33, 46 . Veelgi enam, kärbse- mir-10 homoloogi nihkub üks nukleotiid oma 5'-otsas, millel on eeldatavalt sügav mõju sihtmärgi tuvastamisele, kuna see muudab ühte kahest 7-meersest saidist, mida see miRNA 46 tunneb. Sellele vaatamata sarnaneb kärbseseeni mir-10 geen selgroogsega kahest aspektist: seda leidub kärbsentennapeediakompleksi 47 ortoloogilises lookuses ja kärbeste mõlemal miR-10 miRNA-l on konserveeritud potentsiaal Hox-i mRNA-de sihtimiseks 33, 46 .

Teine Hox miRNA geen, mir-196 , mis asub Hox9 ja Hox10 paraloogide vahel kõigil muudel kui HoxD klaster (joonis 1a), näib olevat tekkinud hiljuti. Mir-196 puudumine selgroogsete koormatustest ja selle esinemine lõualuuta ninasilmas ja mitmetes selgroogsete kobarates viitavad päritolule selgroogsete ühises esivanemas, mis on juba klastri algse dubleerimise sündmuse eelne. Ehkki mir-196 homoloogid selgroogsetest väljaspool puuduvad, asub funktsionaalne analoog mir-iab-4 ortoloogilises kohas kärbseseene Bithoraxi kompleksis 26, 32 . DNA kummastki ahelast transkriptsiooni teel tekitab kärbes lookus kahte alternatiivset miRNA-d: miR-iab-4 ja miR-iab-4as (viide 33). Kummalgi neist lendorava miRNA-dest pole tuvastatav homoloogia miR-196 suhtes, kuid näib, et mõlemad on suunatud lähedalasuvatele Hoxi mRNA- dele 26, 31, 32, 33, 34, 48 .

Siht-mRNA lookuste asümmeetriline jaotus

Viies selgroogsete esindavas genoomis konserveerunud ja mittekonserveerunud saitide uuringus leidsime, et ennustatud sihtgeenid olid klastrites ebaühtlaselt jaotunud. Selle analüüsi jaoks käsitleti miRNA lookuseid genoomiliste piiridena ja Hoxi geenid jagati kahte rühma, sõltuvalt sellest, kummale poole seda piiri nad langesid (joonis 1a). Seega nimetati mir-196 lookuse jaoks Hox1–9 paralleele vaheldumisi 3 ′ või eesmisteks ja Hox10–13 paraloogid 5 ′ või tagumiseks. Sõltumata üksikute alade säilimisest, kuulus märkimisväärne enamus sihtmärgi 3′UTR geenidest geoloogides, mis paiknesid 3 ′ mir-196 lookust paiknevates paraloogilistes rühmades, seega rohkem esiosa ekspressioonipiire. Näiteks on inimestel miR-196 kümme 3 'sihtmärki, kuid 5' küljel asus ainult üks sihtmärk. Määratud 3 ′ piires asus enam kui pooled ennustatud sihtmärkidest miRNA lookuse vahetus läheduses, see tähendab Hox5–9 keskjoontes . Veelgi enam, miR-196 sihtmärgiks olnud 3 'Hox-geenide osakaal oli suurem kui 5' Hox-geenid, selgroogsete keskmiselt 38% 3 'geenidest ja 4% 5' geenidest (tabel 2). Sarnaselt on puuviljaseemnetel iab-4 lookuse miRNA- del potentsiaalne sihtmärgiks suunata allavoolu ja eesmiste geenide A ( abd-A ), Ultrabithorax ( Ubx ), Antennapedia ( Antp ) ja Sex-kammide 3′UTR-id ( Scr ) 32, 48, ehkki kärbestes on Hox-geenide arv statistilise olulisuse kontrollimiseks liiga väike. Need kalduvused selgroogsetel ja kärbestel tähendasid miR-iab-4 või miR-196 abil Hoxi geeni korduvat loogikat, milles need miRNA-d toimivad geenide represseerimiseks, mida ekspresseeritakse rohkem eesmistes domeenides.

Selgroogsetel leiti ennustatud sihtgeenide oluline juhuslik jaotus ka iidsemates Hoxi miRNA perekondades miR-10, mille Hox1–4 paraloogid määratleti kui 3 ′ mir-10 lookuse suhtes või selle ees ja Hox5–13 paraloogid 5 ′ suunas või tagapool mir-10 lookust. Mir-10 genoomiline asukoht klastrites ( Hox4 ja Hox5 vahel ) näitas, et sihtimiseks oli vähem 3 'Hoxi geene. Amphioxuses leiti seemnete vasted miR-10-ga Hox1 , Hox2 ja Hox5 3′UTR-ides. Ehkki selgroogsetel näib, et miR-10 sihib vähem Hoxi geene kui miR-196, näitas siht-lookuste genoomiline paigutus sama ühepoolset viltu. Nagu miR-196 puhul, ennustati miR-10 sihtmärkidena 3'-geenide suuremat osa 5'-geenidega võrreldes (selgroogsete keskmiselt 37% 3'-geenidest ja 8% 5'-geenidest; tabel 2). Seda suundumust ei täheldatud kärbeste puhul, kus miR-10 näib sihitavat ka 5 'ja veel tagumisi geene, näiteks kõhu B ( Abd-B ) ja Scr 46 . See viitab sellele, et muudetud ja laiendatud sihtmärk kärbestes, mis on tingitud miRNA nihutatud otsast ja miRNA kaasamisest juuksenõela teisest käest, viisid miR-10 sihtimise erinevuseni, mis on teravas kontrastis mustriga selgroogsete miR-10, selgroogsete miR-196 ja kärbse miR-iab-4 puhul täheldatud sihtimist.

Tagumine levimus

Koekspressiooni domeenides muudavad tagumised selgroogsete Hoxi geenide eesmised Hoxi geenid ebaoluliseks nendes piirkondades, kus nende ekspressioonimustrid kattuvad - nähtust nimetatakse tagumise levimusena 12, 16, 49 . Teisisõnu, tagumine ja 5 'geenid on eesmise ja 3' geeni suhtes epistaatilised 50 . Esmalt kirjeldati seda nähtust fenotüüpse mahasurumisena morfoloogiliste vaatluste põhjal, mis tehti kärbseseene vastses koos mutatsioonidega ekstra seksikombides ( esc ) lookuses 12, 50 . Sellised mutatsioonid inaktiveerivad polükombi rühma valkude repressoreid ja põhjustavad Hoxi ekspressiooni üldist depressiooni 12, 50 . Saadud esc- mutantide segmentide muster kajastab kõige tagumise toimega Hoxi geeni Abd-B aktiivsust, nii et pea-, rindkere- ja kõhu segment segunevad A8 fenokoopiaga, mis on kõige tagumine kõhu segment. Mutantsed esc- vastsed, millel puudub ka Abd-B, arenevad A4 segmentide kordamisega, mida tavaliselt määratleb abd-A , mis on teine ​​tagumine geen. Kõigi kõhu Hoxi geenide - Ubx , abd-A ja Abd-B - deletsioonidega mutantsed esc- vastsed arenevad rindkere lõikude kordamisega, mille tavaliselt määravad Scr ja Antp . Kui Scr ja Antp elimineeritakse lisaks kolmele kõhupiirkonna geenile, on esc- vastsetel kogu piirkonnas tsefaalsed segmendid. Seega on määratletud homöootilise geeni funktsiooni hierarhia 50 . Edasised katsed näitasid, et transkriptsiooniline ristregulatsioon ei ole fenotüüpse supressiooni peamine edasiviiv jõud. Hox-geenide eksperimentaalselt levinud ekspressioon promootorite all, mis teadaolevalt on transkriptsiooniliselt pöördumatud, põhjustab transformatsioone ainult geeni funktsionaalse domeeni ees olevates piirkondades. Näiteks surub rindkere Antp üldlevinud ekspresseerimise korral pea Hox-geene, mille tagajärjel muutuvad pea segmendid ümber rindkere identiteediks, mõjutamata seejuures kõhtu - siin suruvad Antp-i fenotüüpsed efektid Bithoraxi kompleksi geenid, näiteks kui Ubx 12, 51 .

Analoogseid tähelepanekuid on tehtud transgeensete selgroogsete embrüote puhul paljude Hoxi geenide osas. Näiteks Hoxd4 transgeeni viimine Hoxa1 promootori transkriptsiooni kontrolli alla põhjustab Hoxd4 ekspressiooni 52 eesmise piiri rostraalse nihke ( Hoxd4 ei ole miR-10 ega miR-196 ennustatud sihtmärk). Transgeensed embrüod näitavad kolju põhjas paiknevate kuklaluude tagumisi muutusi struktuurideks, mis näitavad segmenteeritud selgroo, eriti kahe esimese kaelalüli omadusi. Fenotüübid on siiski piiratud emakavälise ekspressiooni eesmise domeeniga, ehkki mujal embrüos on tase üleekspresseeritud või ektoopiliselt ekspresseeritud. Tagumise levimuse mudel selgitab homöootiliste fenotüüpide üldisi suundumusi, kusjuures funktsiooni kadumine viib sageli ekspressiooni rostraalpiiride eesmise teisenemiseni; Hoxi geeni puudumisel lubatakse nüüd funktsioneerida rohkem eesmise toimega geene, mida tavaliselt surutakse alla. Mudel kajastab ka muutusi, mis on tekkinud pärast Hoxi geeni funktsiooni või ektoopilise ekspressiooni suurenemist, mis põhjustab tavaliselt tagumisi transformatsioone endogeense domeeni eesmistes piirkondades, kus ektoopiline ekspressioon võib pärssida resideeruvate Hoxi geenide mõju.

Need kalduvused kehtivad üldiselt kärbeste puhul, kuid mitte alati selgroogsete puhul, kus reeglist kõrvalekalded ilmnevad, nagu ka muude defektide kui homeootiliste transformatsioonide korral (näide vt viide 53). Tundub, et Fly Hoxi geenid on sõltumatumate regulatsioonielementide kontrolli all ja neil on erinevad ekspressioonidomeenid, samas kui selgroogsetel Hox-geenidel on rohkem koordineeritud regulatsioon, koondamine paraloogide vahel ja suurem ekspressiooni kattuvus. Üldiselt näivad selgroogsed süsteemid tundlikumad Hoxi geeni ekspressiooni kvantitatiivsete erinevuste suhtes; nendes süsteemides määravad Hoxi koodi moodustavate Hoxi geenide suhted saatuse spetsifikatsiooni. Sellegipoolest muudavad 5'-kohal olevad Hoxi geenid reeglina rohkem eesmisi programme.

Hüpoteetiline esivanemate seisund . Funktsionaalne hierarhia, mida mõistetakse tagumise levimusena, näib olevat esivanemate Hoxi klastri säilinud omadus, mida täheldatakse isegi absoluutsete ruumiliste ja ajaliste kolineaarsuste või segmenteerumise puudumisel, nagu seda tehakse kõrgelt tuletatud nematoodide Hoxi klastri 54 korral . Hoxi põhiregulaatoritel on olemuselt geenijärjekorraga paralleelselt kasvav hierarhiline võime muuta üksteise poolt määratletud programme. See hierarhia võis olla omane varajase neofunktsionaliseerimise sündmustele, mis järgnesid algsele tandemgeenide dubleerimisele, mis eelnesid cnidarian-bilaterian lõhestamisele ja suurema klastri moodustumisele. Hüpoteetiline eubilateria embrüo võis ekspresseerida vähemalt paari ühendatud Hoxi geene, et polariseerida selle pikitelge 55 ja juhtida arengu ajal diferentseerumissündmusi, korrates geneetilisi programme. Selline väljendus viiks raku eesmiste saatuste täpsustamiseni varem kui tagumised. See tunnus on püsinud põhiliste putukate 56 ja kooride hulgas, kus segmentide rakke täpsustatakse järjestikku, eesmise ja tagumise progressiooniga. Sebrafishi embrüo kõige tagumine tagaaju rombomeeter täpsustatakse kõige varem - see protsess ei hõlma Hoxi ekspressiooni ja eristab seda vaikeseisundiks, mille kohaselt tagumised rombomeetrid taastuvad pärast Hoxi kofaktori funktsiooni 57 kõrvaldamist. Ongeneesi ajal võidakse sellist vaikeolekut muuta arengumoodulites, mis moodustatakse hierarhilise molekulaarse aktiivsuse tõttu hiljem või enam tagantjärele, luues seeläbi hulga võimalikke morfoloogilisi väljundeid. Võime olemasoleva programmi ümberlükkamiseks ja selle väljatöötamiseks kui uue arendusüksuse väljatöötamise mehhanismile võis olla edasiviiv jõud hox-geenide koopiate arvu suurendamiseks, millel on säilinud hierarhiline aktiivsus. Seega võib tagantpoolset levimust nimetada esivanemate Hoxi geenide peamiseks omaduseks, mis aitab arvestada nende edukat levimist loomade genoomides.

Kehtestatud hierarhiate tuletatud tugevdamine

Hierarhilist aktiivsust määravad molekulaarsed mehhanismid, ehkki valesti seletatavad, omistatakse ennekõike Hoxi transkriptsioonifaktorite 12 omadustele ja nende allavoolu suunatud eesmärkidele. Vähemalt mõnel juhul on tagumise toimega Hoxi valgud allavoolu funktsiooni täitmisel efektiivsemad kui eesmised, näiteks konkureerides promootori ühiste sidumissaitide või kofaktorite vahel 58 . Lisaks võivad tagumised Hoxi geenid avaldada domineerimist, suunates erinevate sihtgeenide ekspressiooni nii, et tagumine Hoxi võrk on funktsionaalselt domineeriv kui eesmine. Funktsionaalses domeenis hõlbustab geeni domineerimist absoluutse transkriptsiooni kõrgem tase. Lõpuks on olemas tõendid transkriptsioonilise ristregulatsiooni hierarhia kohta, tagumised geenid suunavad eesmiste geenide repressiooni 12 .

The conserved trend in the genomic distribution of the miRNA target genes within the Hox clusters, when considered together with transcriptional expression patterns that are due to spatial and temporal colinearity, indicates that the Hox miRNAs dampen protein output in more posterior regions of vertebrate Hox gene expression domains. Furthermore, Hox miRNAs function as delayed negative post-transcriptional regulators of their 3′ Hox targets. Thus, as suggested recently for individual examples 30, 48, the Hox miRNAs seem to have a striking general propensity to promote posterior prevalence (Fig. 1b). Regulation of Hox genes by miR-196 is a vertebrate innovation and thus a regulatory addition that appeared after the emergence of functional hierarchy. In vertebrates both Hox miRNAs seem to contribute to and reinforce the functional hierarchy among Hox genes, thus supporting the hypothesis that a multitude of molecular approaches are continuously selected for to retain this ancestral trait.

The retention of mir-10 and mir-196 within Hox clusters might be explained by their proximity to other coding genes and their regulatory elements, leading to a coordinated expression pattern of the miRNAs and their targets. The Hox clusters might possess properties that enable an active mechanism to avoid genomic rearrangements or insertions and deletions, thus maintaining synteny and overall compactness. Moreover, the presence of miRNAs at regular intervals within the clusters and among their targets results in a shared local DNA environment. This environment can produce coordinated reactions with equal response to non-specific perturbations affecting global transcription, thereby preserving constant transcript ratios. This shared response between the miRNAs and their targets might be among the driving forces to retain the miRNAs within the clusters. The conserved genomic landscape with its non-random distribution of seed matches in transcribed sequences might be indicative of a gradient of constraints on 3′UTR sequences, with faster mutation rates of 5′ genes coinciding with co-option into novel expression in derived cells. Hence, the relative depletion of seed matches among 5′ transcripts, and consequent freedom from the constraints of Hox miRNA repression, might have predisposed this group towards acquisition of secondary functions, consistent with the role of Hoxd9–13 expression in the establishment of the proximal–distal axis of the tetrapod limb.

Not all of the more anterior Hox genes have sites matching the Hox miRNAs (Fig. 1a; Table 2), further implying that other, possibly more ancestral, regulatory mechanisms predominate in establishing and maintaining posterior prevalence. Moreover, sites matching the Hox miRNAs, although more abundant than for most other specific miRNAs, constitute only 15% of the conserved 7–8-mer sites in Hox 3′UTRs. This ratio suggests that when considering Hox gene regulation by all the miRNAs, reinforcing posterior prevalence is less widespread than the broader, more generic role of miRNAs, which is to adjust protein output for many other purposes, thereby sculpting expression patterns with the complexity and precision that would be difficult to create using transcriptional regulation alone 59 . Indeed, the Hox miRNAs probably participate in these other functions in addition to their role in posterior prevalence, as they seem to have many non-Hox targets.

Conclusions

The ancestral acquisition of hierarchy among Hox genes has allowed for the specification of cellular identities along a regionalized AP axis by reiteration of a genetic programme with unidirectional modifications, and has been reinforced over time by multiple layers of interactions at many levels of gene expression. The contribution of miRNA-mediated repression to the posterior prevalence model adds a layer of regulatory interactions at the post-transcriptional level, which involves the conscription of only a few nucleotides in a region resistant to mutation. The additive layering of complementary regulation might enable a more stable outcome by limiting dependence on any one regulatory mode. Moreover, enlisting miRNA-mediated gene regulation allows for more complex regulatory output, with the consequent potential for the diversification of animal body plans. As more animals with mutations in the Hox miRNAs and their regulatory sites are generated, the functional consequences of these nodes in the Hox regulatory network will be demonstrated.

Sõnastik

Bilateria

Members of the animal clade that have bilateral symmetry - the property of having two similar sides, with definite upper and lower surfaces, and anterior and posterior ends. Bilaterians include chordates, arthropods, nematodes, annelids and molluscs, among other groups.

Non-synonymous mutation

A change in nucleotide sequence that alters the encoded amino acid.

Paralogous

The homology between two genomic segments in the same organism that arose from a duplication event.

Neofunctionalization

The process whereby a pair of duplicated genes becomes permanently preserved as one copy acquires mutations, conferring a new function.

Rhombomere

Each of seven neuroepithelial segments found in the embryonic hindbrain that adopt distinct molecular and cellular properties, restrictions in cell mixing, and ordered domains of gene expression.

Seotud lingid

LISAINFORMATSIOON

  • The Bartel laboratory
  • The Tabin laboratory
  • MicroRNA target predictions
  • RefSeq