Microrna122 on α-fetoproteiinide ekspressiooni peamine regulaator ja mõjutab hepatotsellulaarse kartsinoomi agressiivsust | loodusside

Microrna122 on α-fetoproteiinide ekspressiooni peamine regulaator ja mõjutab hepatotsellulaarse kartsinoomi agressiivsust | loodusside

Anonim

Õppeained

  • Rakkude signalisatsioon
  • Maksavähk
  • Meditsiinilised uuringud
  • miRNA-d
  • Selle artikli parandus avaldati 25. septembril 2012

Seda artiklit on värskendatud

Abstraktne

α-fetoproteiin (AFP) ei ole mitte ainult hepatotsellulaarse kartsinoomi (HCC) jälgimisel laialt kasutatav biomarker, vaid on ka kliiniliselt tunnustatud seostatav kasvaja agressiivse käitumisega. Näitame siin, et maksaspetsiifilise mikroRNA microRNA122 dereguleerimine on nii AFP tõusu kui ka bioloogiliselt agressiivsema fenotüübi põhjus HCC-s. Nende kahe mõju ühise keskse vahendajana tuvastame CUX1, mikroRNA122 otsese sihtmärgi. Kasutades transgeensete hiirte maksakudesid, milles mikroRNA122 on funktsionaalselt vaigistatud, ortotoopse ksenotransplantaadi kasvaja mudelit ja inimese kliinilisi proove, näitasime veel, et mikroRNA122 / CUX1 / microRNA214 / ZBTB20 rada reguleerib AFP ekspressiooni. Samuti näitame, et microRNA122 / CUX1 / RhoA rada reguleerib kasvajate agressiivseid omadusi. Me järeldame, et mikroRNA122 ja sellega seotud signaalvalgud võivad esindada elujõulisi terapeutilisi sihtmärke ja et seerumi AFP tasemed HCC patsientidel võivad olla HCC kudedes dereguleeritud rakusiseste mikroRNA122 signaalimisteede asendusmarkeriks.

Sissejuhatus

Hepatotsellulaarse kartsinoomi (HCC), mis on vähiga seotud suremuse kolmas levinum põhjus maailmas 1, esinemissagedus suureneb praegu 2 . Hiljutine avastus multikinaasi inhibiitori sorafeniibi tõhususe kohta kaugelearenenud HCC-ga patsientide ravimisel on tähendanud kliinilises juhtimises suurt läbimurret, ehkki on näidanud, et ellujäämise kasu on vähem kui 3 kuud 3 . Kaugelearenenud haigusega 4 patsientide jaoks pole praegu muud tõhusat ravi saadaval. Sellisena on arenenud HCC 5 ravimiseks pidevalt vaja välja töötada uudseid ravimeetodeid ja lähenemisviise.

Sihtotstarbeliste vähiteraapiate väljatöötamiseks peame kõigepealt kindlaks tegema sellele vähile omased aberrantselt reguleeritud molekulaarsed rajad. Kliiniliselt on oluline leida ka kasulikud ja mugavad asendusseerumi biomarkerid, mis kajastavad molekulaarsete radade aberratsioone nende ekspressiooni molekulaarsete mehhanismide tõttu, et tuvastada raku siseselt vabastatud signaalimisteed ja vabastada patsiendid invasiivsetest kliinilistest testidest.

Praegu on HCC jälgimisel kõige laialdasemalt kasutatav seerumi biomarker α-fetoproteiin (AFP) 6 . Ehkki AFP geeni ekspressiooni reguleerimine pole täielikult teada, on teada, et p53 (viide 7), β-kateniin 8 ja hiljuti tuvastatud tsingi sõrme valk, ZBTB20 (viide 9) on seotud. Lisaks sellele, kuigi kasvavad kliinilised tõendid näitavad, et AFP tõus on seotud agressiivsema tuumori fenotüübiga, mida iseloomustavad veresoonte sissetung, metastaasid ja halb diferentseerumine 10, 11, tuleb veel kindlaks teha, kas need kaks fenotüüpi esindavad midagi enamat kui juhuslikke epifenomene 12 .

MikroRNA-d (miRNA-d) on lühikesed üheahelalised mittekodeerivad RNA-d. Ehkki miRNA-sid tuvastati esmakordselt dokumendis Caenorhabditis elegans 13, ekspresseeritakse neid teadaolevalt enamikus organismides, taimedest kuni selgroogseteni 14 . Primaarseid miRNA-sid, millel on tüvisilmusestruktuurid, töödeldakse küpseteks miRNA-deks Drosha ja Dicer RNA polümeraasi III abil. Need küpsed miRNA-d seostuvad seejärel RNA-indutseeritud summutuskompleksiga ja saadud kompleks seostub otse sihtmärk-Messenger RNA-de 3'-mittetransleeritavate piirkondadega, et toimida translatsiooni ja geeni ekspressiooni pärssijatena. Seega vastutavad miRNA-d sõltuvalt sihtmärk-mRNA-dest mitmesuguste bioloogiliste funktsioonide, sealhulgas rakkude proliferatsiooni, apoptoosi, diferentseerumise, metabolismi, onkogeneesi ja onkogeense supressiooni kontrolli all hoidmise eest 15, 16, 17 .

MiRNA122 (miR122) on maksaspetsiifiliseim koespetsiifiline miRNA 18, kus see vastutab rasvhapete metabolismi 19, 20 ja ööpäevase rütmi 21 säilitamise eest . Nagu muude koespetsiifiliste miRNA-de 22 puhul näidatud, on miR122 ekspressioon teatatud kartsinoomide, eriti pahaloomuliste kasvajate puhul allapoole reguleeritud, ehkki need tulemused on vastuoluliste aruannete 23, 24, 25, 26 tõttu vaieldavad. MiR122 ekspressiooni bioloogiline tähtsus HCC-s molekulaarsel tasemel ei ole veel täielikult välja selgitatud.

Käesolevas uuringus uurisime microR122 rolli HCC-s, vaigistades seda nii inimese HCC rakkudes kui ka transgeenses hiiremudelis. Meie molekulaarne analüüs võimaldas meil määratleda keerulised regulatiivsed kaskaadid, mis on kliiniliselt tunnustatud seose aluseks AFP tõusnud taseme ja HCC-s agressiivsema fenotüübi vahel.

Tulemused

MiR122 vaigistatud HCC rakuliinide loomine

MiR122 allareguleerimise funktsionaalsete tagajärgede iseloomustamiseks HCC rakkudes viidi Huh7 ja PLC / PRF / 5 rakud stabiilselt läbi lentiviirusega, mis ekspresseerib RNA juuksenõelasid, mis tekitavad küpset antisenss-RNA-d, mis on mõeldud miR122 funktsiooni vaigistamiseks. Need rakud valiti nende miR122 ekspressiooni suhteliselt kõrge taseme 24, 27 alusel . RNA juuksenõelte järjestustesse lisati tahtlikult mitu ebakõla, et saada stabiilsemad mallid miR122 sidumiseks ja sekvesteerimiseks ning häirida miR122 osalemist RNA indutseeritud summutuskompleksiga seotud translatsiooni pärssimises (joonis 1a).

Image

( a ), miRZip122 konstruktsioon, mis annab funktsionaalse üheahelalise täispika antisenss-miRNA, mis on komplementaarne o miR122-ga, töödeldes tüve-silmuse-tüve molekulist ja transkribeerides põhiliselt aktiivse H1 RNA III promootorist. Üheahelalise antisenss-miR122 molekuli efektiivseks tootmiseks lisati mitu sobimatut nukleotiidi. ( b ) miR122 aktiivsuse uurimiseks kasutatud lutsiferaasi reporteri skemaatiline esitus. Tsütomegaloviiruse (CMV) promootori poolt juhitud jaanilibu lutsiferaasi geen sisaldab 3'-UTR-is kahte tandem-miR122-siduvat saiti (miR122-reageerivad elemendid; miR122-RE). ( c ) miR122 prekursori ekspressiooni (must riba) pärssiv mõju lutsiferaasi aktiivsusele kontroll- ja miR122 vaigistatud rakkudes. Testi väärtused normaliseeriti väärtustega, mis saadi rakkudest, mis olid transfekteeritud miRNA eelühendit mitte ekspresseeriva tühja vektori (valge riba) abil, mis seati väärtusele 1. Andmed tähistavad kolme sõltumatu eksperimendi keskmist ± SD, kasutades Huh7 rakke. * P <0, 05 ( t- test). Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke. ( d ) Kontroll (kindel joon) ja miR122 vaigistatud rakud (kriipsjoon) külvati tihedusega 2x104 rakku süvendi kohta. Pärast 24 ja 48 h inkubeerimist arvutati rakkude arv meetodites kirjeldatud viisil. Andmed tähistavad kolme sõltumatu eksperimendi keskmist ± SD, kasutades Huh7 rakke. Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke. ( e ) Näidatud on muutused Huh7 miR122 vaigistatud rakkude rakumorfoloogias. Nooled näitavad pseudopodiat. Kaalulatt, 50 μm. Sarnaseid fenotüüpe täheldati ka PLC / PRF / 5 rakkude kasutamisel. ( f ) Mitmete hepatotsüütide markerite ekspressiooni kontroll- ja Huh7 miR122 vaigistatud rakkudes hinnati poolkvantitatiivse RT-PCR abil. Näidatud on kolme sõltumatu eksperimendi tulemused, milles kasutati Huh7 rakke. Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke.

Täissuuruses pilt

MiR122 efektiivse vaigistamise kinnitamiseks transdutseeritud rakkudes analüüsisime miR122-siduvaid saite sisaldavate reporterite lutsiferaasi aktiivsust (mille funktsiooni pärsib miR122 üleekspressioon) (joonis 1b) miR122 vaigistatud ja kontrollrakkudes. Nagu eeldatud, pärssis miR122 prekursori üleekspressioon kontrollrakkudes lutsiferaasi aktiivsust (joonis fig 1c). Seevastu see summutav toime oli miR122 vaigistatud rakkudes märkimisväärselt vähenenud (joonis fig 1c), mis näitab, et miR122 oli tõesti funktsionaalselt vaigistatud.

MiR122 funktsiooni kaotamisest tulenevate bioloogiliste muutuste iseloomustamiseks analüüsisime järgmisena rakkude proliferatsiooni, morfoloogiat ja diferentseerumist miR122 vaigistatud rakkudes. Rakkude vohamise kiirused olid kontroll- ja vaigistatud rakkude vahel võrreldavad (joonis fig 1d); miR122 vaigistatud rakkudes ilmnes siiski suurem arv selgelt eristatavaid pseudopoodiaid (joonis 1e). Järgmisena, kuna miR122 ekspresseerub konkreetselt maksas, püstitasime hüpoteesi, et sellel võib olla roll hepatotsüütide diferentseerumises ja seetõttu uurisime mitmete hepatotsüütide markerite ekspressiooni poolkvantitatiivse RT-PCR abil. Me täheldasime AFP ekspressiooni suurenemist ja albumiini ekspressiooni väikest tõusu miR122 vaigistatud rakkudes, kuid teiste hepatotsüütide markerite, näiteks hepatotsüütide tuumafaktor 4a (HNF4α) ja α 1 -antitrüpsiini ekspressioonitasemed ei muutunud (joonis. 1f).

MiR122 vaigistatud HCC rakkudel on invasiivsem fenotüüp

Kuna miR122 vaigistatud rakkudes esines suurenenud arv pseudopodiaid, iseloomustasime järgnevalt fenotüüpe, mis on seotud bioloogiliselt agressiivsemate rakuomadustega. Leidsime, et aktiini polümerisatsioon ja pseudopodi moodustumine olid miR122 vaigistatud rakkudes märkimisväärselt suurenenud (joonis 2a). Pseudopodia arvu suurenemist kinnitas kvantitatiivne pseudopodia test (täiendav joonis. S1). Kuigi mesenhümaalse markeri α-silelihaste aktiini ekspressioonitasemed olid vaid pisut tõusnud, täheldasime epiteelmarkeri E-kadheriini ekspressiooni olulist langust miR122 vaigistatud rakkudes (joonis 2b). Lisaks muudeti miR122 vaigistatud rakkudes muude epiteeli-mesenhümaalsete üleminekumarkerite nagu fibronektiin, N-kadheriin, tigu ja Zeb1 ekspressiooni (täiendav joonis S1). Need leiud on kooskõlas arvamusega, et miR122 funktsiooni kaotamine põhjustab pahaloomulisemat fenotüüpi.

Image

( a ) Rakke töödeldi 12 tunni jooksul 2 ng ml- 1 TGF-β-ga ja aktiini filamente värviti Alexa Fluor 488-konjugeeritud faloididiiniga. Näidatud on kahe sõltumatu eksperimendi tulemused, milles kasutati Huh7 rakke. Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke. Kaalulatt, 50 μm. ( b ) α-silelihaste aktiini ja E-kadheriini mRNA-de ekspressioonitasemeid hinnati kvantitatiivse RT-PCR abil. Näidatud väärtused esindavad mRNA ekspressioonitasemeid eksperimentaalsetes rakkudes kontrollrakkude suhtes. Andmed tähistavad kolme sõltumatu eksperimendi keskmist ± SD, kasutades Huh7 rakke. * P <0, 05 ( t- test). Sarnased tulemused saadi ka PLC / PRF / 5 rakkude kohta. ( c ) Rakkude migratsiooni astet iseloomustati kriimustustesti abil. 24 ja 48 tunni jooksul pärast kriimustamist suurenes migreeruvate rakkude suhe miR122 vaigistatud rakkudes märkimisväärselt. Vasakul paneelil on esindavad pildid. Parempoolne paneel näitab nelja juhuslikult valitud välja lahtrite arvu tulemusi katse kohta. Andmed on esitatud kolme katse keskmisena ± SD, kasutades Huh7 kontrolli (kindel joon) ja miR122 vaigistatud rakke (kriipsjoon). * P <0, 001 ( t- test). Sarnased tulemused saadi ka PLC / PRF / 5 rakkude kohta. ( d ) Rakkude sissetungi astet uuriti rakkude sissetungimiskambrite abil. Värvitud sissetungitud rakkude esinduspildid (vasakul). Rakkude suhtelise sissetungi suhe pärast normaliseerimist rakkude sissetungi taseme kontrollimiseks (paremal). Andmed tähistavad kolme sõltumatu eksperimendi keskmist ± SD, kasutades Huh7 rakke. Skaalariba, 100 μm. * P <0, 01 ( t- test). Sarnased tulemused saadi ka PLC / PRF / 5 rakkude kohta. ( e ) Rho ja Rac1 aktiivsus määrati, võrreldes aktiivsete GTP-ga seotud RhoA (RhoA-GTP) ja Rac1 (Rac1-GTP) koguseid kontroll- ja miR122 vaigistatud rakkude vahel. Näidatud numbrid tähistavad suhtelisi väljendustaset. Võrdset koormust ripptestides kinnitati β-aktiini taseme analüüsiga rakulüsaatides. Näidatud on viie sõltumatu eksperimendi, mis kasutab Huh7 rakke, tüüpilised tulemused. Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke.

Täissuuruses pilt

Järgmisena viisime läbi kriimustuste ja sissetungide testid, et iseloomustada miR122 vaigistatud rakkude invasiivset fenotüüpi. Rakkude migratsiooni ja rakkude sissetungi kiirus suurenes märkimisväärselt miR122 vaigistatud rakkudes (joonis 2c, d). Kuna kontroll- ja miR122 vaigistatud rakkude proliferatsioonikiirused olid sarnased (joonis fig 1d), viitavad need tulemused kokkuvõttes sellele, et miR122 funktsiooni pärssimine HCC rakkudes võib põhjustada pahaloomulisusega seotud rakkude omaduste suurenemist.

Nende rakuliste fenotüüpide aluseks olevate molekulaarsete mehhanismide uurimiseks hindasime RhoA ja Rac1 aktiivsust, mis on väikesed GTPaasid, mis on tihedalt seotud raku migratsiooni ja sissetungiga 28 . Ehkki Rac1 aktiivsus oluliselt ei muutunud, suurenes RhoA aktiivsus miR122 vaigistatud rakkudes märkimisväärselt (joonis 2e), mis viitab sellele, et raku migratsiooni suurenemine ja invasioon miR122 vaigistatud rakkudes võib tuleneda suurenenud RhoA aktiivsusest.

AFR ekspressioon suureneb miR122 vaigistatud HCC rakkudes

Kui täheldasime AFP ekspressiooni suurenemist miR122 vaigistatud rakkudes (joonis fig 1f), otsisime järgmisena AFP kontsentratsiooni määramist kultuuri supernatantidest, kasutades ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA). AFP tase oli miR122 vaigistatud rakkude supernatandis kontrollkatsetega võrreldes umbes kolm korda kõrgem (joonis 3a). Kooskõlas selle vaatlusega tekitas AFP immunofluorestsentsvärvimine tugevama tsütoplasmaatilise signaali ja kvantitatiivne RT-PCR näitas AFP mRNA taseme kümnekordset tõusu miR122 vaigistatud rakkudes (joonis 3b, c).

Image

( a ) AFP kontsentratsioon söötmes määrati ELISA abil. Andmed tähistavad kolme sõltumatu eksperimendi keskmist ± SD, kasutades Huh7 rakke. * P <0, 01 ( t- test). Sarnased tulemused saadi ka PLC / PRF / 5 rakkude kohta. ( b ) AFP immunofluorestsentsvärv kontroll-tsütoplasmas ja miR122 vaigistatud Huh7-rakud. Kuvatakse värvitud rakkude representatiivsed pildid kolmest sõltumatust eksperimendist. Kaalulatt, 50 μm. ( c ) AFP mRNA kogused Huh7 kontroll- ja miR122 vaigistatud rakkudes määrati kvantitatiivse RT-PCR abil. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. * P <0, 05 ( t- test). Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke. ( d ) AFP mRNA stabiilsus Huh7 kontrolli (tahke joon) ja miR122 vaigistatud (kriipsjooneline) rakkudes määrati kvantitatiivse RT-PCR abil 6, 12 ja 24 tunni pärast pärast rakkude töötlemist 10 μl ml −1 aktinomütsiiniga D. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. Sarnaseid tulemusi täheldati ka PLC / PRF / 5 rakkude kasutamisel. ( e ) AFP promootori aktiivsust mõõdeti reportertestides, kasutades Huh7 rakke ja AFP promootori-lutsiferaasi konstrukti. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. * P <0, 05 ( t- test). Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke. ( f, g ) lutsiferaasi testid viidi läbi reporterplasmiidide abil, et mõõta p53 ( f ) ja β-kateniini ( g ) aktiivsusi. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke. ( h ) ZBTB20 valgu tase miR122 vaigistatud rakkudes. Näidatud on kolme sõltumatu eksperimendi tulemus, milles kasutati Huh7 rakke. Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke.

Täissuuruses pilt

AFP mRNA 3′-UTR ei sisaldanud ennustatud miR122 sihtjärjestusi, mis tuginesid miRNA sihtotsingumootorite, näiteks TargetScan (//www.targetscan.org) abil tehtud järjestuse analüüsidele, mis viitab sellele, et on ebatõenäoline, et miR122 reguleerib AFP-d otse väljendus. Seetõttu, et iseloomustada AFP suurenenud ekspressiooni põhjustatud mehhanisme miR122 vaigistatud rakkudes, hindasime kõigepealt AFP mRNA stabiilsust miR122 vaigistatud rakkudes. Nagu võis oodata, ei mõjutanud miR122 vaigistamine AFP mRNA stabiilsust, kuna mRNA kogus oli kontroll- ja miR122 vaigistatud rakkude vahel võrreldav 6, 12 ja 24 tunni jooksul pärast uue transkriptsiooni pärssimist töötlemisel aktinomütsiin D-ga (joonis 3d). AFP mRNA taseme tõus mRNA stabiilsuse muutuste puudumisel näitas, et AFP transkriptsioon suurenes miR122 vaigistatud rakkudes suurenenud AFP promootori aktiivsuse tagajärjel. AFP promootori aktiivsus oli miR122 vaigistatud rakkudes peaaegu neli korda suurem kui kontrollrakkudes, nagu hinnati reportertestiga (joonis 3e).

Kuna AFP promootori aktiivsust reguleerib osaliselt p53 (viide 7), hindasime p53 aktiivsust reporterkonstruktide abil. Kuid miR122 vaigistatud rakkudes p53 aktiivsuses muutusi ei tuvastatud (joonis 3f). Kuna on teatatud, et β-kateniini mutatsioon on seotud ka AFP ekspressiooni 8 ülesreguleerimisega, analüüsisime järgmiseks β-kateniini aktiivsust miR122 vaigistatud rakkudes. Sarnaselt p53-ga ei ilmnenud miR122 vaigistatud rakkudes võrreldes kontrollrakkudega muutusi β-kateniini aktiivsuses (joonis 3g).

Hiljuti teatati, et ZBTB20 toimib AFP transkriptsiooni 9 represseerijana. See tulemus viis meid hindama ZBTB20 valgu ekspressiooni miR122 vaigistatud rakkudes. Western blot analüüs näitas tõepoolest, et ZBTB20 ekspressioon oli miR122 vaigistatud rakkudes vähenenud (joonis 3h). Kuna ZBT20-l puudub ennustatud miR122 sihtjärjestuste olemasolu, mis põhinevad 3′-UTR arvutuslikel otsingutel, oli ka ebatõenäoline, et miR122 reguleerib otseselt ZBTB20 ekspressiooni. Need tähelepanekud viitavad sellele, et muud kaudsed mehhanismid võivad põhjustada ZBTB20 ekspressiooni vähenemist miR122 vaigistatud rakkudes.

CUX1 on fenotüüpide regulaator miR122 vaigistatud rakkudes

Uurimaks mehhanisme, mille abil miR122 reguleerib rakkude liikuvust, sissetungi ja AFP ekspressiooni, kasutasime arvutuslikke otsinguid potentsiaalsete miR122 sihtgeenide tuvastamiseks, millel on teadaolevad nende protsessidega seotud funktsioonid. Selle analüüsi tulemusel tuvastati lõigatud homeobox 1 (CUX1, tuntud ka kui CCAAT-nihestusvalk / lõigatud homeobox, CDP / Cux / Cut) kui suure tõenäosusega miR122 sihtkoht asub 3'-UTR-is ja täiuslik sobivad seemnejadades. CUX1 on transkriptsioonifaktor, mis reguleerib paljusid protsesse, sealhulgas rakutsükli kulg, kromosomaalne segregatsioon ja rakkude migratsioon 29, 30 . Kooskõlas ülalkirjeldatud miR122 vaigistamise mõjudega teatati, et CUX1 moduleerib rakkude liikuvust ja sissetungi, kontrollides RhoA aktiivsust 31, 32, 33 . Me täheldasime, et kuigi CUX1 mRNA tase püsis muutumatuna (joonis 4a), toimus miR122 vaigistatud rakkudes CUX1 p200 ja p110 isovormide püsiseisundi taseme oluline tõus (joonis 4b).

Image

( a ) CUX1 mRNA taset kontroll- ja miR122 vaigistatud rakkudes analüüsiti kvantitatiivse RT-PCR abil. Andmed tähistavad kolme sõltumatu eksperimendi keskmist ± SD, kasutades Huh7 rakke. ( b ) p200 ja p110 CUX1 valkude tase tõusis miR122 vaigistatud rakkudes võrreldes kontrollrakkudega. Näidatud on kolme sõltumatu eksperimendi tulemus, milles kasutati Huh7 rakke. Sarnased tulemused saadi ka PLC / PRF / 5 rakkude kohta. ( c ) CUX1 ja ZBTB20 valgu ekspressioon kahekordsetes CUX1 / miR122 knockdown Huh7 rakkudes. Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke. ( d ) AFP kontsentratsioonid söötme supernatantides määrati ELISA abil. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. * P <0, 01 ( t- test). Sarnaseid tulemusi täheldati ka PLC / PRF / 5 rakkude kasutamisel. ( e, f ) Rakkude sissetungi suhte muutus CUX1 löögi abil miR122 vaigistatud Huh7 rakkudes. Näidatud on värvitud sissetungijate rakkude tüüpilised kujutised ( e ). Rakkude suhtelise sissetungi suhe pärast normaliseerumist sissetungi taseme kontrollimiseks on näidatud ( f ). Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. Skaalariba, 100 μm. * P <0, 01 ( t- test). Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke.

Täissuuruses pilt

Uurimaks CUX1 ülesregulatsiooni panust miR122 vaigistatud rakkudes täheldatud AFP ekspressiooni ja invasiivsete omaduste suurenemisse, koputasime CUX1 valgu ekspressiooni, kasutades lentivirusi, mis ekspresseerivad CUX1 lühikese juuksenõelaga RNA-sid (shRNA-sid) (joonis 4c). Saadud kahekordse koputamisega rakkudes vähendati nii AFP valgu ekspressiooni rakukultuuri supernatandis kui ka rakkude sissetungi tasemele, mis sarnanes vanemlike Huh7 rakkude tasemega (joonis 4d-f).

CUX1 represseerib ZBTB20 ekspressiooni miR214 kaudu

Järgmisena hindasime, kas miR122 on suunatud otse CUX1 poole, konstrueerides lutsiferaasi reporterkonstrukti, millel oli osa CUX1 3′-UTR-ist, mis sisaldas oletatavat miR122 sihtkohta (joonis 5a). Kaastransfektsiooni katsed näitasid, et lutsiferaasi aktiivsust pärssis miR122 prekursorit ekspresseeriva plasmiidi üleekspressioon (joonis 5b). Seda pärssivat mõju hoiti ära, viies miR122 sihtkoha seemnejadadesse kaks joonemutatsiooni (joonis 5a, b), näidates, et miR122 on otseselt suunatud nendele järjestustele.

Image

( a ) miR122 mõju hindamiseks CUX1 ekspressioonile kasutati lutsiferaasi reporterit, mis kandis metsikut tüüpi CUX1 3′UTR piirkonda, mis sisaldas oletatavat miR122 sihtpunkti (Luc-CUX1-3′UTRwt). Spetsiifilisuse hindamiseks kasutati ka teist lutsiferaasi reporterit, millel olid kaks nukleotiidmutatsiooni (märgitud paksus kirjas) oletatavate miR122 sihtkohtade (Luc-CUX1-3′UTRmut) seemnejadades (tähistatud ristkülikuga) (Luc-CUX1-3′UTRmut). ( b ) Huh7 rakud transfekteeriti koos Luc-CUX1-3′UTRwt või Luc-CUX1-3′UTRmut ja kas tühja kontrollvektoriga (valge riba) või miR122 prekursori ekspressiooniplasmiidiga (must riba). Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. * P <0, 05 ( t- test). ( c ) CUX1 ja ZBTB20 ekspressioon 293 T-rakkudes, mis ekspresseerivad miR122 prekursorit. Positiivsete kontrollidena kasutati CUX1 p200 või p110 ekspressiooniplasmiididega ajutiselt transfekteeritud rakulüsaate. Näidatud on nelja sõltumatu katse tüüpilised tulemused. ( d ) ZBTB20 mRNA tase miR122 vaigistatud Huh7 rakkudes määrati kvantitatiivse RT-PCR abil. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke. ( e ) miR375 (vasakul) ja miR214 (paremal) taset miR122 vaigistatud Huh7 rakkudes analüüsiti kvantitatiivse RT-PCR abil. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. * P <0, 05 ( t- test). ( f ) Huh7 rakud transfekteeriti koos Luc-ZBTB20-3′UTR ja kas tühja kontrollvektoriga või miR214 prekursori ekspressiooniplasmiidiga. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. * P <0, 05 ( t- test). ( g ) ZBTB20 ekspressioon vähenes Huh7 miR214 üleekspresseerivates rakkudes. Positiivse kontrollina kasutati 293T rakulüsaati. Näidatud on nelja sõltumatu katse tüüpilised tulemused.

Täissuuruses pilt

Nende mõjude kinnitamiseks genereerisime 293T rakuliini, mis ekspresseerisid stabiilselt miR122-eellase konstrukti, transfekteerides rakke miR122 prekursorit ekspresseerivate lentiviirustega, mis on märgistatud rohelise fluorestsentsvalguga (täiendav joonis S2a). Nagu arvata võis, ei mõjutanud anti-miR122 konstruktsioon kontrolli 293T rakke miR122 ekspressiooni puudumise tõttu. Kuid miR122-vastane konstruktsioon suurendas märkimisväärselt lutsiferaasi aktiivsust 293T rakkudes, mis ekspresseerivad stabiilselt miR122-prekursorit, kinnitades, et miR122 kanti üle 293 T-rakkudesse (täiendav joonis S2b). Kooskõlas ülalkirjeldatud tulemustega näitasid need rakud CUX1, eriti p200 isovormi vähenenud ekspressiooni, ning näitasid ka ZBTB20 ekspressiooni tagasihoidlikku, kuid reprodutseeritavat suurenemist (joonis 5c). Need tulemused viitavad sellele, et miR122 reguleerib otseselt CUX1 valgu ekspressiooni, mis võib omakorda reguleerida ZBTB20 ekspressiooni.

Kuna CUX1 võib toimida transkriptsioonilise modulaatorina 29, püstitasime algselt oletuse, et CUX1 on ZBTB20 transkriptsiooni otsene regulaator. Kvantitatiivne RT-PCR analüüs näitas siiski, et ZBTB20 mRNA tasemed miR122 vaigistatud rakkudes olid kontrollidega võrreldes muutumatud (joonis 5d). Selgitamaks lahknevust ZBTB20 mRNA muutumatute tasemete ja valkude ekspressioonitasemete languse vahel miR122 vaigistatud rakkudes, otsisime miRNA-sid, mis võiksid potentsiaalselt sihtida ZBTB20 3′-UTR-i. Arvutuslike otsingute põhjal tuvastati miR214 ja miR375 kandidaatidena ZBTB20-regulatiivsete miRNA-dena. Ehkki miR375 tasemed miR122 vaigistatud rakkudes olid muutumatud (joonis 5e), suurenes miR214 ekspressioon märkimisväärselt (joonis 5e).

Hindamaks, kas miR214 oli otseselt suunatud ZBTB20 3′-UTR-ile, konstrueerisime ZBTB20 3′-UTR piirkonnaga lutsiferaasi reporteri, mis sisaldab oletatavat miR214 sihtkohta. Reporterianalüüsid näitasid, et miR214 prekursori üleekspresseerimine pärssis tõepoolest lutsiferaasi aktiivsust, mis viitab sellele, et miR214 on suunatud otse ZBTB20 3′-UTR ja pärsib selle ekspressiooni (joonis 5f). Kooskõlas nende leidudega näitasid miR214 prekursori stabiilselt üleekspresseeritud rakud ZBTB20 valgu ekspressiooni langust (joonis 5g).

MiR214 oletatavad promootorpiirkonnad sisaldavad mitut CUX1 seondumissaiti, nagu näitas transkriptsioonifaktorit siduva saidi otsingumootor MATCH (//www.gene-regulation.com). Skaneeriva kromatiini immunosadestamise (ChIP) eksperiment, millele järgnes reaalajas PCR, kasutades praimeripaaride seeriat, kinnitas, et CUX1 seondub miR214 promootori piirkonnas mitmete genoomsete saitidega (joonis 6a). Seetõttu püstitasime hüpoteesi, et CUX1 võib reguleerida miR214 transkriptsiooni. Selle arusaama kohaselt leidsime, et miR214 ekspressioon vähenes CUX1 knockdown Huh7 rakkudes (joonis 6b). CUX1 rolli miR214 transkriptsiooni aktivaatorina kontrolliti täiendavalt CUX1 mõnes teises rakuliinis alla löömise või üleekspresseerimise abil. MiR214 tasemed langesid pärast CUX1 konstitutiivset löömist shRNA-ga (joonis 6c). Seevastu p110 CUX1 ekspresseeriva vektoriga retroviiruslik nakatumine põhjustas miR214 suurenemist (joonis 6d). Neid leide kinnitati doksütsükliiniga indutseeritava CUX1 shRNA abil. Nagu varem täheldatud muude CUX1 transkriptsiooniliste sihtmärkide puhul (viited 30, 34), vähendati miR214 taset doksütsükliini juuresolekul ja seejärel viidi doksütsükliini indutseerija miR214 eemaldamisel kõrgemale tasemele kui töötlemata rakkudes (joonis 6e).

Image

( a ), CUX1 rikastamine miR214 lookuses. ChIP testid viidi läbi Hs578T rakkude abil. Kuvatakse iga qPCR amplikoni kordne rikastamine ja keskpunkti asukoht. * P <0, 05 ( t- test). ( b ) MiR214 ekspressioonitasemed pärast CUX1 taandumist miR122 vaigistatud Huh7 rakkudes määrati kvantitatiivse RT-PCR abil. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. * P <0, 05 ( t- test). Sarnased tulemused saadi kasutades PLC / PRF / 5 rakke. ( c ) miR214 ja CUX1 RNA tase Hs578T rakkudes, mis on nakatatud tühja vektori või CUX1 shRNA-d konstitutiivselt ekspresseeriva lentiviirusvektoriga. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. * P <0, 05 ( t- test). ( d ) Hs578T rakud nakatati p110 CUX1 ekspresseeriva retroviirusega. MiR214 ja CUX1 mRNA tasemed mõõdeti üks päev hiljem. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. * P <0, 05 ( t- test). ( e ) miR214 ja CUX1 mRNA tase Hs578T rakkudes, mis ekspresseerivad doksütsükliinist indutseeritavat CUX1 shRNA-d. Tasemed kuvatakse enne ravi, pärast 5-päevast ravi doksütsükliiniga ja 2, 3 ja 4 päeva pärast doksütsükliini manustamist. Kuvatakse kolme sõltumatu katse keskmised ± sd ja P- väärtused ( t- test).

Täissuuruses pilt

Järgmisena, et hinnata miR214 panust ZBTB20 ekspressiooni kontrollimisse miR122 vaigistatud rakkudes, mõõtsime ZBTB20 ekspressiooni pärast miR214 paralleelset vaigistamist miR122 vaigistatud rakkudes. Ehkki ZBTB20 valgu ekspressiooni vähendati miR122 vaigistamisega peaaegu 50%, taastati see miR214 vaigistamise abil 90% -ni kontrolltasemetest (täiendav joonis S3). Seega reguleerib CUX1 indutseeritud miR214 vähemalt osaliselt ZBTB20 ekspressiooni miR122 vaigistatud rakkudes, mis viib AFP ekspressiooni ülesreguleerimiseni.

CUX1 ja AFP ekspressiooni reguleerimine miR122 abil kinnitati ka teistes HCC rakuliinides, milles miR122 oli üleekspresseeritud või vaigistatud. Põhja blottimine näitas, et miR122 ekspressioon oli Hep3B ja HepG2 rakkudes suhteliselt madal, kuid Huh1, Huh7 ja PLC / PRF / 5 rakkudes suhteliselt kõrge (täiendav joonis S4a). Seetõttu üleekspresseerisime miR122 prekursorit Hep3B ja HepG2 rakkudes ja vaigistasime miR122 Huh1, Huh7 ja PLC / PRF / 5 rakkudes (täiendav joonis S4b). CUX1 ekspressiooni pärssisid ja suurendasid vastavalt miR122 prekursori üleekspressioon ja miR122 vaigistamine (täiendav joonis. S4c). Seevastu AFP ekspressioon oli vastavalt tugevdatud ja allasurutud (täiendav joonis S4d), kinnitades, et AFP ekspressiooni reguleerib miR122-CUX1 rada mitmetes HCC rakuliinides.

Need tulemused näitavad, et miR122 funktsionaalne vaigistamine põhjustab CUX1 valgu ekspressiooni suurenemist, mille tulemuseks on ZBTB20 repressioon miR214 ekspressiooni suurenemise kaudu. ZBTB20 repressioon põhjustab omakorda AFP ekspressiooni suurenemist. Kuna CUX1 on rakkude liikuvuse ja sissetungi 35, 36, 37 modulaator, suurendab selle valgu ülesreguleerimine ka RhoA aktiivsust, suurendades vähirakkude pahaloomulisi omadusi.

CUX1-ga seotud molekulide ekspressioon miR122 vaigistatud hiirtel

Eespool in vivo mudelis piiritletud raja uurimiseks genereerisime antikeha miR122 ekspresseerivaid transgeenseid hiiri H1 promootori kontrolli all (joonis 7a), et pärssida endogeense miR122 funktsiooni (viide 38). Nende hiirte in situ hübridisatsiooni analüüs näitas maksakoes nõrka miR122 värvumist võrreldes kontrollhiirtega, mis on tõenäoliselt tingitud antisenss-miR122 seondumisest endogeense miR122-ga, mis tekitab kaheahelalise DNA ja pärsib tõenäoliselt sondi hübridisatsiooni (joonis fig. 7b). Ehkki maksa struktuurne areng näis olevat hematoksüliini ja eosiini värvimise põhjal normaalne (täiendav joonis. S5), reguleeriti anti-miR122 transgeensete hiirte maksas AFP mRNA ekspressiooni (joonis 7c) ning p200 ja p110 CUX1 valgu ekspressiooni (joonis 7c). 7d). Pealegi, kuigi ZBTB20 mRNA tasemed ei muutunud, vähenes ZBTB20 valgu ekspressioon maksas (joonis 7d), kooskõlas in vitro tulemustega, mis näitasid ZBTB20 reguleerimist translatsioonitasemel (joonis 5c, d). Seda seostati miR214 taseme olulise suurenemisega anti-miR122 transgeensetes hiirtes (joonis 7e). Seega kinnitavad hiire maksakoe tulemused, et miR122 / CUX1 / miR214 / ZBTB20 regulatsioonitee on funktsionaalne ka in vivo mudelis.

Image

( a ) DNA konstruktsioon, mida kasutatakse transgeensete hiirte moodustamiseks, milles miR122 on funktsionaalselt vaigistatud (anti-miR122 transgeensed hiired). See konstruktsioon (nagu ka in vitro uuringutes kasutatud konstruktsioon) loob funktsionaalse üheahelalise täispika antisenss-miRNA, mis täiendab miR122. ( b ) miR122 vastase antisense RNA ekspressiooni kinnitamine anti-miR122 transgeensetes (anti-miR122 Tg) hiirtes. MiR122 kogused, mis tuvastati in situ hübridisatsiooni teel (sinine / lilla värvimine) anti-miR122 transgeensete hiirte ja WT hiirte maksakudedes. Näidatud tulemused esindavad kolme iseseisvat katset, mis viidi läbi nelja erineva hiireliini pesakonnakaaslastega. Skaalariba, 100 μm. Negatiivse kontrollproovi (LNA-skrambleerimine) kasutamisel spetsiifilist värvumist ei täheldatud. ( c ) AFP mRNA ekspressiooni hiire maksakudedes analüüsiti kvantitatiivse RT-PCR abil. Andmed tähistavad tulemuste keskmist ± sd mõlemas rühmas viie hiire kohta. * P <0, 05 ( t- test). ( d ) CUX1 ja ZBTB20 ekspressiooni hiire maksakudedes hinnati Western blot meetodil. Näidatud on kolme iseseisva katse esinduslik tulemus. e ) miR214 tase maksakudedes määrati kvantitatiivse RT – PCR abil. Andmed tähistavad kolme sõltumatu katse keskmist ± sd. * P <0, 05 ( t- test). f ) HCC rakkude ortotoopse ksenotransplantaadi mudelite protokollid. Valmistati kontroll- ja miR122 vaigistatud PLC / PRF / 5 rakud ning need süstiti hiiglase karva maksa vasakpoolse osa kapsli alla. Igasse rühma kuulus kuus hiirt. 4 nädalat pärast siirdamist koguti maksakuded ja viilutati nad järjestikku. Tuumorirakkude sissetungi staatuse uurimiseks viidi läbi histoloogiline uuring H&E värvimisega. ( g ) Kuvatakse representatiivsed maksa histoloogilised kujutised 4 nädalat pärast kasvajarakkude siirdamist. Kui maksa serva kapsli all oli võimalik tuvastada ainult siirdatud HCC rakke (nool, vasak vasak paneel), siis kontrollrakkudega siirdatud hiirte maksas ei täheldatud ei intrahepaatilist metastaasi ega veresoonte sissetungi. Seevastu miR122 vaigistatud rakkudega siirdatud hiirtel täheldati vaskulaarset invasiooni mitmete kasvajarakkude poolt (nool, parem ülemine paneel). Skaalariba, 500 μm. WT, metsik tüüp.

Täissuuruses pilt

MiR122 vaigistatud rakkude invasiivsus ksenografti mudelis

Järgmisena siirdasime kontroll- ja miR122 vaigistatud PLC / PRF / 5 rakud alasti hiirte maksakapsli alla (joonis 7f), et teha kindlaks, kas miR122 vaigistamine HCC-s tekitab in vivo pahaloomulisema fenotüübi. PLC / PRF / 5 rakud valiti nende siirdatavuse tõttu karvututel hiirtel 39 . Kontrollrakkudega siirdatud hiirte maksas 4 nädalat pärast siirdamist ei tuvastatud ei intrahepaatilisi metastaase ega veresoonte sissetungi. Seevastu miR122 vaigistatud HCC rakkudega siirdatud hiirte maksades täheldati veresoonte sissetungi (joonis 7g). Need tulemused viitavad sellele, et miR122 vaigistamine HCC-s põhjustab agressiivsemat fenotüüpi.

HCC staadium ja miR122-ga seotud molekulide ekspressioon

Nende tulemuste olulisuse hindamiseks inimese haigustega uurisime miR122 ja AFP ekspressiooni mitmetes kliinilise kvaliteediga inimese HCC proovides. Me analüüsisime miR122 ekspressiooni in situ hübridisatsiooni (joonis 8a) ja AFP ekspressiooni immunohistokeemia abil (joonis 8b). Nii AFP ekspressioon kui ka pahaloomulise kasvaja raskusaste olid pöördvõrdelises korrelatsioonis miR122 ekspressioonitasemetega (joonis 8c, d). Lisaks korreleerusid CUX1, miR214 ja ZBTB20 ekspressioon ka miR122 ekspressiooniga, mis määrati seerialõikude abil (täiendavad joonised S6a, b ja c). Need tulemused koos meie uuringutega koekultuurisüsteemides ja transgeense hiiremudeliga viitavad sellele, et miR122 ekspressiooni vähenemine suurendab AFP ekspressiooni miRNA122-CUX1-miRNA214-ZBTB20 raja kaudu ja et bioloogiliselt agressiivsemate HCC vormide arendamine toimub miRNA122-CUX1-RhoA raja kaudu (täiendav joonis. S7). Selles aruandes kirjeldatud miRNA-vahendatud mehhanism võib selgitada kliiniliselt teadaolevat seost suurenenud AFP taseme ja HCC bioloogiliselt agressiivsemate rakuomaduste vahel.

Image

a) miR122 ekspressiooni inimese kliinilistes proovides hinnati in situ hübridisatsiooni teel. MiR122 (sinine / lilla värvumine) ekspressioon 2. astme (pahaloomulisemad) HCC proovides oli väiksem kui tavalistel inimese maksakudedel või 1. astme (vähem pahaloomulistel) HCC proovidel. Kuvatakse representatiivsed pildid. Tuumad värviti FastRed-iga. Skaalariba, 500 μm. ( b ) AFP ekspressiooni, mida on näidatud pruunina, analüüsiti immunohistokeemia abil. AFP ekspressioon oli kõrgem 2. astme HCC proovides kui tavalistes inimese maksakoe või 1. astme HCC proovides. Kuvatakse representatiivsed pildid. Skaalariba, 500 μm. ( c ) Graafik näitab korrelatsiooni miR122 ja AFP ekspressiooni vahel. Suurenenud AFP ekspressioon oli korrelatsioonis miR122 ekspressiooni vähenemisega. ( d ) Graafik näitab korrelatsiooni miR122 ekspressiooni ja HCC pahaloomulise kasvaja astme vahel. Pahaloomulisuse astme suurenemine oli korrelatsioonis miR122 ekspressiooni langusega.

Täissuuruses pilt

Arutelu

Kliinilise uuringu kohaselt on kõrge AFP tase HCC-ga patsientide jaoks ebasoodne prognostiline tegur 40 . Selles uuringus näitasime, et miR122 vähenenud ekspressioon HCC rakkudes aitab kaasa AFP ekspressiooni tõusule ja seejärel agressiivsemale fenotüübile. Need tulemused pakuvad molekulaarset raamistikku, mis selgitab teatatud seost kõrgenenud AFP taseme ja halva kliinilise tulemuse vahel HCC patsientidel.

Kliiniliselt on kõrge AFP ekspressioon korrelatsioonis HCC bioloogiliselt agressiivsemate omadustega, kuna kõrge AFP tasemega patsientidel on portaalveeni sissetungi ja intrahepaatiliste metastaaside esinemissagedus oluliselt kõrgem. Lisaks on neil patsientidel märkimisväärselt madalam korduvuseta elulemuse määr ja üldise elulemuse languse tendents 41 . Käesolevas uuringus oleme esitanud mitu tõendusmaterjali, mis näitavad, et miR122 vähenenud ekspressioon HCC-s põhjustab kahte nähtust, mida kliinikus sageli samaaegselt täheldatakse: AFP kõrgendatud ekspressioon ja pahaloomulisem bioloogiline fenotüüp. Esiteks täheldati miR122-knockdown-rakkudes kõrgenenud AFP ekspressiooni ja suuremat rakuinvasiivsust in vitro ja in vivo . Teiseks näidati, et CUX1, mis on seotud kartsinoomirakkude invasiivsete omadustega 32, 36, 37, on seotud AFP ekspressiooni reguleerimisega ja tuvastati, et see on miR122 otsene sihtmärk. Kolmandaks, HCC-ga patsientide koeproovides täheldati pöördvõrdelisi seoseid miR122 ekspressiooni ja AFP ekspressiooni ning miR122 ekspressiooni ja kasvaja astme vahel. These data suggest that it is unlikely that the clinical correlation between elevated AFP levels and a more biologically aggressive phenotype in HCC is a coincidental epiphenomenon, but, instead provide a possible molecular explanation for the decrease in miR122 expression in HCC cells.

A recent study on liver development reported that liver-enriched transcription factors activate the expression of miR122, which in turn was found to promote terminal differentiation of hepatocytes through the silencing of CUX1 (ref. 42). In the present study, we confirmed that CUX1 is a direct target of miR122 and, in contrast to the situation in normal development, we showed that in grade 2 HCCs the decrease in miR122 is associated with higher CUX1 expression. High CUX1 expression was previously shown to inversely correlate with relapse-free and overall survival in high-grade breast cancers 36 . In transgenic mice, CUX1 was reported to cause various cancer-associated disorders depending on the specific isoform and tissue type expression 34, 43, 44, 45, 46 . In particular, expression of CUX1 caused organomegaly in several organs including the liver 43 . Hepatomegaly was associated with progression of lesions beginning with inflammation and leading to the development of mixed cell foci, hyperplasia and even HCCs, although in this last case statistical significance was not achieved because of the small size of the transgenic cohort 47 . The underlying mechanisms for the role of CUX1 in cancer is complex and is likely to involve both cell-autonomous and non-cell autonomous effects. However, from cell-based assays it is clear that CUX1 has a role in at least three distinct processes: cell motility, cell cycle progression and chromosome segregation 30, 31, 36, 48 . The knockdown of CUX1 using siRNA was shown to delay entry into S phase and to hinder cell motility and invasion 31, 36, 48 . In contrast, overexpression of p110 CUX1 was able to accelerate S phase entry and to stimulate proliferation, migration and invasion 35, 48 . Moreover, CUX1 was shown to promote genomic instability following cytokinesis failure 30

Regulation of AFP gene expression is a complex process mediated by a number of transcriptional activators and repressors that bind the AFP gene 7, 8 . ZBTB20 was recently identified as a potent repressor of AFP transcription in knockout mouse studies 9 . Our results demonstrate that decreased miR122 expression leads to concomitant decreases in ZBTB20 protein expression. This effect is mediated through upregulation of CUX1, as CUX1 silencing in miR122-silenced cells was shown to lead to both recovery of ZBTB20 levels and reduced AFP expression. Furthermore, the increased expression level of ZBTB20 in CUX1 knockdown cells suggests that ZBTB20 expression is regulated by CUX1. This miR122/CUX1/miR214/ZBTB20/AFP pathway may explain the deregulated AFP expression observed in HCC cells. Additionally, the ability of CUX1 to activate RhoA and to regulate the expression of many proteins involved in cell motility may explain the increased migration and invasiveness associated with malignancy of HCC 31, 32, 33, 34, 35, 36 . It should be noted that, although this analysis revealed a trend toward inverse correlation between expression of miR122 and expression of AFP, this correlation could not be applied to all cases examined. Therefore, the possibility of additional pathways that regulate AFP expression cannot be discounted. Nonetheless, our results demonstrate that a decrease in miR122 function is a key factor that contributes to the regulation of AFP expression in HCC.

MiR122 is the most abundant miRNA in the normal adult liver, comprising approximately 80% of all miRNAs 18 . The numerous reported roles of miR122 include regulation of cholesterol biosynthesis 19, 20, hepatitis C virus replication 49 and maintenance of the adult liver phenotype 21 . Specific miRNAs are often involved in the differentiation of specific cells and tissues 50 . As miR122 is liver-specific, we reasoned that this miRNA may have a role in the differentiation of normal hepatocytes. In our study, transgenic mice in which miR122 was functionally silenced were found to exhibit elevated AFP levels, but did not display abnormal morphological development in the liver (at least, not up to the age of 12 weeks), suggesting that decreased miR122 expression itself does not cause cells to become transformed. Ongoing characterization of these mice will be required to fully determine the physiological roles of miR122 in the noncancerous liver in vivo .

In summary, we have shown that decreased miR122 expression in HCC is linked both to more biologically aggressive tumour behaviour and elevated AFP expression. Furthermore, both of these effects were shown to be mediated by increased expression of CUX1, a direct target of miR122. Similar strategies could also be used to develop new therapeutics and diagnostics for other cancers in which miRNAs that regulate both tumour characteristics and serum markers have been identified.

Meetodid

Rakukultuur

The human HCC cell lines, Huh7, PLC/PRF/5, HepG2, Hep3B and Huh1 were obtained from the Japanese Collection of Research Bioresources. The human embryonic kidney cell line, 293T and the human breast cancer cell line HS578T were obtained from the American Type Culture Collection . All cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle medium, supplemented with 10% fetal bovine serum.

Hiirekatsed

All experiments were carried out in compliance with the regulations of the Animal Use Committee of The University of Tokyo and The Institute for Adult Disease, Asahi Life Foundation.

Generation of transgenic mice in which miR122 was functionally silenced

Mice in which miR122 function was knocked down were generated using previously described protocols 38, 51 . Briefly, a DNA fragment of 1, 085 bp, containing the H1 promoter region, the coding region for the antisense miR122 stem-loop-stem RNA precursor, and a transcriptional terminator of five thymidines, was resected from the miRZip-122 construct described above by digestion with Pvu II. Proper silencing function of the resulting DNA was confirmed via transient transfection-based reporter assays that showed efficient knockdown of miR122 function. Stable C57BL/6 embryonic stem cell lines were generated by electroporation of the linearized transgene, and the resulting cells were injected into blastocysts by the UNITECH Company. Genotyping was performed by PCR using DNA isolated from tail snips. Four different mouse lines were maintained and the male littermates were used in experiments.

Kromatiini immunosadestamise test

ChIP for CUX1 was performed as previously described 52 . For the scanning ChIP of the miR214 locus, realtime PCR analysis was performed using primer pairs specific for different regions of the promoters. Templates for the PCR reactions were 0.1% total input DNA (I), nonspecific DNA from sepharose beads alone (S), or chipped chromatin. The respective fold enrichment of the different DNA fragments are indicated relative to the DNA obtained by purification on sepharose beads without IgG (S). Enrichment was calculated using the HPRT locus as a reference.

Doxycyclin-induced shRNA against CUX1 system

For conditional knockdown of CUX1 in Hs578t cells, we took advantage of the Addgene plasmid 11643. HS578T cells were infected with pLVCT shCUX1(5, 326–5, 348)-tTRKRAB lentivirus as described 53 . At 48 h after infection, cells were split and cultured with or without doxycyclin at a final concentration of 2.5 μg ml −1 . Cells were used for experiments after 5 days of treatment. Doxycyclin was then removed from the culture media and cells were maintained for 4 days following release.

Rakkude proliferatsiooni test

Relative cell proliferation was assessed using a Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories), as described previously 54 .

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs

AFP levels in the cell-culture supernatant were examined using an AFP-specific ELISA kit supplied by an outsourcing company, SRL.

Western blot analüüs

Protein lysates were prepared from cells or mouse liver for immunoblot analysis. Proteins were separated by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to polyvinylidene difluoride membranes. After blocking with 5% dry milk to decrease nonspecific binding, membranes were probed with the appropriate primary antibodies. Primary antibodies were obtained from Abcam (ZBTB20, #ab48889, 1:500) and Santa Cruz Biotechnology (CDP, #sc-13024, 1:1, 000). CUX1 antibodies (#861, 1:1, 000) were generated as described previously 52 . Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies were used to detect primary antibodies. Bound antibodies were detected using ECL Plus Western blotting detection reagents (GE Healthcare Life Sciences).

Kriimustusanalüüs

The effects of miR122 knockdown on cellular migratory function were determined by evaluating cellular migration after scratching of a confluent monolayer of cells. Monolayers were cultured on 10 μg ml −1 fibronectin-coated dishes and were scratched using a 200-μl pipette. Migration was analysed at the indicated time points after scratching.

In vitro invasiooni test

The effect of miR122 knockdown on invasive function was determined using BD BioCoat Matrigel Invasion Chambers (Becton Dickinson) according to the manufacturer's recommended protocol. Cell invasion was induced by removing the serum in the upper chamber. The number of invading cells was analysed after 22-h incubation. Cell numbers were counted in four randomly chosen fields at each time point.

Quantitative pseudopodia assay

Pseudopodium quantitation was performed using a Quantitative Pseudopodia Assay Kit (Chemicon) according to the manufacturer's instructions. Briefly, the upper chamber was coated with fibronectin and seeded with cells in serum-free medium. Serum was added to the lower chambers. 8 h later, pseudopodia on the lower surface were stained and eluted, and the absorbances of solubilized samples at 600 nm was measured using a microplate reader.

CUX1-knockdown lentiviral construct

Lentiviral particles expressing CUX1 shRNA were purchased from Santa Cruz Biotechnology (#sc-35051-V).

In situ hybridization to assess miR122 and miR214

The expression of miR122 and miR214 in mouse liver and human HCC tissues was examined by in situ hybridization 55, 56 . Locked nucleic acid (LNA)-scramble (negative control) and LNA-anti-miR122 and LNA-anti-miR214 probes were obtained from EXIQON. After deparaffinization, tissue sections were treated with 10 μg ml −1 proteinase K for 5 min at 37 °C and refixed with 4% paraformaldehyde, followed by acetylation with 0.25% anhydrous acetic acid in 0.1 M Tris–HCl buffer (pH 8.0). Following pre-hybridization for 30 min at 48 °C, hybridization was performed overnight with each 20 nM LNA probe in hybridization buffer (5xSSC buffer, 50% formamide, 500 μg ml −1 tRNA, 50 μg ml −1 Cot-1 DNA). After completion of hybridization, the sections were washed with 0.1×SSC buffer for 10 min at 52 °C three times and blocked with DIG blocking buffer (Roche Diagnostics) for 30 min. Sections were then probed with anti-DIG (1:500; Roche Diagnostics) for 1 h at room temperature. Detection was performed by incubation in NBT/BCIP buffer (Promega) overnight. Nuclei were stained with Nuclear FastRed (Sigma-Aldrich).

Immunohistokeemia

Tissue arrays containing HCC tissues were purchased from US Biomax. To determine the correlations between AFP, ZBTB20, CUX1, miR122 and miR214 expression and HCC differentiation grade, slides carrying consecutive sections were obtained. Slides were baked at 65 °C for 1 h and deparaffinized. Endogenous peroxidase activity was blocked by incubation in 3% hydrogen peroxide buffer for 30 min. Antigen retrieval was performed by incubating the slides at 89 °C in 10 mM sodium citrate buffer (pH 6.0) for 30 min. To minimize nonspecific background staining, slides were blocked in 5% normal goat serum (Dako) for 10 min at room temperature. Tissues were labelled overnight at 4 °C with primary antibodies raised against AFP (Dako, #N1501, 1:100), CUX1 (#sc-13024, 1:100) and ZBTB20 (HPA016815, Sigma-Aldrich, 1:100). Slides were then incubated with anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (Nichirei Bioscience) for 1 h. Primary antibody binding was visualized by incubation in 3, 3′-diaminobenzidine in buffered substrate (Nichirei Bioscience) for 5 min. The slides were counterstained with haematoxylin, dehydrated with ethanol, and mounted with Clarion mounting medium (Biomeda).

GTP-binding RhoA and Rac1 immunoprecipitation assay

The amount of RhoA activity was examined using an Active Rho Pull-down and Detection Kit (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's recommended protocol. The amount of GTP-bound RhoA protein (the active form of RhoA) was detected by Western blotting with the provided anti-RhoA antibody (1:100). Rac1 activity was similarly determined by using PAK-GST Protein Beads (#PAK02, Cytoskeleton) for pulldowns and anti-Rac1 antibodies (1:100) for subsequent Western blotting (#89856D, Thermo Fisher Scientific).

Orthotopic xenograft tumour model of HCC

Male BALB/c (nu/nu) nude mice were purchased from CREA Japan (Tokyo, Japan). The transplantation of tumour cells into mouse livers was performed using previously reported methods 57, 58 . Briefly, 2×10 6 control or miR122-silenced PLC/PRF5 cells were suspended in 30 μl of PBS containing 1% Matrigel (Becton Dickinson). After anaesthesia, the liver was exposed through a surgical incision. Cells were slowly injected under the capsule of left lobe of the liver using a 28-gauge needle. When successful, a transparent bleb of cells could be seen through the liver capsule. After injection, light pressure was applied to the injection site with sterile gauze for 2 min to prevent bleeding and tumour cell leakage. The abdomen was then closed with sutures. Transplantation was successful in a total of 12 mice (6/group). At 4 weeks post-transplantation, liver tissues were collected, serially sectioned, and stained with haematoxylin and eosin.

Statistiline analüüs

Statistically significant differences between groups were determined using Student's t -test when variances were equal. When variances were unequal, Welch's t -test was used instead. P- väärtusi alla 0, 05 peeti statistiliselt oluliseks.

Plasmid and stable cell line construction, reporter assays, RT–PCR, northern blotting and immunocytochemistry are described in the Supplementary Methods. All primer information is provided in Supplementary Table S1.

Lisainformatsioon

How to cite this article: Kojima, K. et al . MiRNA122 is a key regulator of α-fetoprotein expression and influences the aggressiveness of hepatocellular carcinoma. Nat. Kommuun. 2:338 doi: 10.1038/ncomms1345 (2011).

Muutuste ajalugu

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

    Supplementary Figures S1 – S7, Supplementary Table S1, Supplementary Methods and Supplementary Reference.

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.