Valguse poolt põhjustatud struktuurimuutused ja o = o-sidemete moodustumise koht psüfides, mida püüab xfel | loodus

Valguse poolt põhjustatud struktuurimuutused ja o = o-sidemete moodustumise koht psüfides, mida püüab xfel | loodus

Anonim

Õppeained

  • Bioenergeetika
  • Nanokristallograafia
  • Fotosüntees

Abstraktne

Fotosüsteem II (PSII) on tohutu membraani-valgu kompleks, mis koosneb 20 erinevast subühikust monomeeri kogu molekulmassiga 350 kDa. See katalüüsib valguse abil juhitavat vee oksüdatsiooni selle katalüütilises keskmes, hapniku eralduskompleksis (OEC) 1, 2, 3 . PSII struktuuri on analüüsitud 1, 9 Å eraldusvõimega sünkrotroni kiirgusröntgenikiirte abil, millest selgus, et OEC on Mn 4 CaO 5 klaster, mis on korraldatud asümmeetrilises, moonutatud tooli vormis 4 . Seda struktuuri analüüsiti täiendavalt femtosekundiliste röntgenkiirguseta elektronlaseritega (XFEL), saades 'kiirguskahjustusteta' 5 struktuuri. O = O-sidemete moodustumise mehhanism jääb vahepealsete olekustruktuuride puudumise tõttu siiski varjatuks. Siin kirjeldame PSII struktuurimuutusi, mis on põhjustatud toatemperatuuril kahe välguga valgustusest eraldusvõimega 2, 35 Å, kasutades ajaliselt eraldatud femtosekundilist kristallograafiat koos XFEL-iga, mida pakub SPring-8 ångström kompaktne vabaelektronlaser. Isomorfne erinevus Fourier-kaardil kahe välguga ja pimedas kohandatud oleku vahel näitas kaht ilmsete muutuste piirkonda: Q B / mitterauaraua ja Mn 4 CaO 5 klastri ümber. Q B / mitte-hemilise raua piirkonna ümber toimunud muutused peegeldasid kahe välguga valgustuse indutseeritud elektronide ja prootonite siirdeid. OEC ümbritsevas piirkonnas kadus kahe välguga valgustuse korral kaardilt veemolekul, mis asub Mn 4 CaO 5 klastrist 3, 5 Å kaugusel. See vähendas teise veemolekuli ja hapnikuaatomi O4 vahelist kaugust, viidates sellele, et toimus ka prootoniülekanne. Oluline on see, et kahe välguga miinus-tume isomorfne erinevus Fourieri kaardil näitas positiivset piiki O5, ainulaadse μ4-okso-silla, mis asub Mn1 ja Mn4 kvaasikeskmes, ümber (viited 4, 5). See viitab uue hapnikuaatomi (O6) sisestamisele O5 lähedale, tagades O = O vahemaa 1, 5 Å nende kahe hapnikuaatomi vahel. See annab O = O-sideme moodustumise mehhanismi, mis on kooskõlas eelnevalt pakutud 6, 7-ga .

Peamine

Joonis fig 1a näitab PSII elektronide ülekandeahela korraldust pseudo- C2 sümmeetrias kahe alaühikuga, D1 ja D2. Vee oksüdeerumisreaktsioon toimub läbi S i- oleku tsükli 8 (kui i = 0–4), kus dioksiini toodetakse üleminekul S 3 → (S 4 ) → S 0 (joonis 1 b). Siiani analüüsitud PSII kõrge eraldusvõimega struktuurid olid pimedas stabiilse S1 oleku jaoks 4, 5, kuigi mõne uuringu järgi on madala eraldusvõimega S-oleku vahestruktuurid saadud ajaliselt eraldatud femtosekundilise kristallograafia (TR-SFX) 9 abil., 10, 11 . Meie käsikirja revideerimise ajal on Young jt . teatasid kahe välguga (2F) valgustatud olekustruktuurist eraldusvõimega 2, 25 Å, milles O5 ümber ei ilmnenud mingeid muutusi 12, ehkki eraldusvõime hinnangud võivad anda mõnevõrra teistsugused väärtused ja seetõttu võis avastada mõne veemolekuli väikese liikumise. Piisavalt kõrge eraldusvõime saavutamiseks, et paljastada välguvalgustusega indutseeritud väikesed struktuurimuutused, võimaldades samal ajal S i- oleku üleminekut tõhusalt toimuda, määrasime PSII optimaalse kristalli suuruse maksimaalse pikkusega 100 μm, mis hajub kuni eraldusvõime 2, 1 Å SPring-8 ångströmi kompaktse vabaelektronlaseri (SACLA) –XFEL impulsi abil (laiendatud andmed, joonis 1; meetodid). Valgustasime väikseid kristalle 2F-ga (joonis 1; meetodid), mille tulemuseks oli populatsiooni 46% S 3 arvutamine Fourier-teisendusega infrapuna (FTIR) erinevuste spektroskoopia abil (laiendatud andmed, joonis 2; meetodid).

Image

a, PSII elektronide ülekandeahela korraldus (punased nooled). b, S i - OEC vee oksüdeerumisreaktsiooni tsükkel. hv, footonid. c, PSII TR-SFX katsete eksperimentaalne seadistamine. d, selles katses kasutatud kahe välguvalgustuse ja XFEL-impulsi ajaline skemaatiline esitus. e, 2m F o - D F c kaardid, mis saadakse eelvalgustamata tumeda oleku andmetest (hall kontuuriga 2 σ ) ja m F o - D F c kaardilt (roheline (negatiivne) ja punane (positiivne)), mis on kontuuritud ± 5 σ ) Chl D1 saidi ümbruse piirkonnast, enne kui need asuvad kahe veemolekulil Chl D1 läheduses . f, 2 m F o - D F c stereopilt kaardistab OEC ümbritsevas piirkonnas halli ja tsüaani kontuuriga vastavalt 2 σ ja 8 σ .

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

PSII mikrokristallid segati rasvamaatriksiga ja toimetati suure viskoossusega mikroekstrusiooninjektori 13 abil XFEL-i talale, mis vähendas oluliselt proovi tarbimist ja andis stabiilse voolu ühtlaseks ergastuseks. PSII muutumise tagamiseks lisati proovidele kaaliumferrütsüaniidi ja enne PSII S 1 olekusse sünkroniseerimise ja YD türosiini oksüdeerimise mõõtmisi proovide eelkolb viidi läbi. Difraktsiooniandmeid koguti ka proovidelt, millel ei olnud eelvälku (eelvälk), ja neid arutatakse juhul, kui need erinesid eelvälgutatud proovidest.

Iga proovi jaoks koguti kaks andmekogumit (eelvälkudega või ilma); üks on pimedas olekus ja teine ​​2F-valgustusega proovidest. Kahte eelvalgustatud proovide andmekogumit analüüsiti eraldusvõimega 2, 35 Å ja eelvalgustamata proovide andmeid analüüsiti eraldusvõimega 2, 50 Å (laiendatud andmed, joonis 1, laiendatud andmetabelid 1, 2); kõigil andmekogumitel oli väga suur paljusus (vt meetodid). Joonis 1e, f näitab osa elektronide tiheduse kaardist eelvalgustamata tumedast proovist (sarnased kaardid saadi eelvälgutatud proovidega ja keskendume siin eelvälgatud proovide tulemustele, kui pole öeldud teisiti), kus aminohappe külgahelate ja veemolekulide orientatsiooni elektrontihedused on selgelt nähtavad. Me suutsime ehitada pimeda oleku jaoks 1626 vett ja 2F-riigi jaoks 1 584 vett. Mangaani aatomid ja kaltsiumi aatom OEC-s eristusid isegi anomaalses erinevuses Fourier 'kaardil, mille tipptugevused ületasid mürataset tunduvalt, tulenevalt kasutatava XFEL-i pika lainepikkusega. Näiteks eelvälgatamata 2F-andmete anomaalses kaardis sisalduva 30 parima tipu hulgas (Protein Data Bank (PDB) 5GTI) oli mangaani aatomiteks 7 parimat tippu, mille intensiivsus oli üle 15, 0 σ , ja ülejäänud 23 piiki identifitseeriti kui kaltsiumi (sealhulgas värskelt tuvastatud kaltsiumi sait CP43 strooma küljel), kloriidi või väävliaatomitega (laiendatud andmete joonis 3, laiendatud andmete tabel 3), mis näitab, et difraktsiooni mõõtmine ja integreerimine intensiivsused olid täpsed. Sellegipoolest ei olnud piiratud eraldusvõime tõttu OEC-siseseid interaktiivseid vahemaid võimalik täpselt täpsustada. Seega kasutati tumeda oleku andmete täpsustamisel kitsaid Mn – O kauguse piiranguid, mis tuletati S 1 olekust 1, 95 Å struktuur 5 ja 2F oleku andmete jaoks kasutati suhteliselt lahtisi piiranguid (Methods). Seetõttu keskendume kahe välgu põhjustatud struktuurimuutustele, tuginedes isomorfsele erinevusele Fourier-kaardil kahe andmekogumi vahel.

Kahe erineva oleku kaks andmekogumit olid väga isomorfsed, R iso väärtusega 0, 068 eraldusvõimega 2, 35 Å, mis võimaldab meil tuvastada peent struktuurimuutusi isomorfse erinevuse Fourier 'kaardi põhjal (laiendatud andmete tabel 1). Kahe olekustruktuuri superpositsioon andis ruutkeskmiseks hälbeks 0, 10 Å. Vastavad R iso väärtused eel- ja eelselektiveerimata proovide vahel olid eraldusvõimega 2, 5 Å üle 0, 118; selle erinevuse võivad põhjustada erinevad proovipartiid või erinevused kasutatud kristallimisjärgsetes protsessides.

Isomorfse erinevuse Fourier-kaardil 2F- ja tumeda oleku vahel ( IS (2F) - F (tume) erinevuste kaart; joonis 2) täheldati kahte ala, kus esinevad suured valguse poolt põhjustatud struktuurimuutused. Need piirkonnad paiknevad Q B / mitte-rauaga seonduva saidi ja OEC (punktiirpunased punased ringid joonisel fig 2b) ümber ning sarnaseid muutusi täheldati ka dimeeri mõlemas monomeeris (kolmas piirkond, näilise erinevusega Fourieri piigid olid leiti Y-d läheduses eelvalgustamata proovides; vt allpool ja laiendatud andmeid joonis 4). Kõik need alad on seotud elektronide ja prootonite siirdamisega PSII-s, mis viitab efektiivsele laserimpulsi ergastusele. Piigid tuvastati Q B saidil 8, 6 ja OEC 10, 7 σ juures, monomeeris A monomeeris B ja 6, 9 σ Q Q saidil ning 12, 7 σ OEC juures monomeeris B. Suurim Fourier 'erinevus piik PSII muudes piirkondades. oli 4, 4 σ (joonis 2d), mis näitab, et nendes kahes piirkonnas täheldatud piigid on müratasemest palju kõrgemad.

Image

a, b, isomorfne erinevus Fourier-kaart 2F-oleku ja tumeda oleku vahel rohelisel (positiivsel) ja punasel (negatiivsel) olekus, mis on kontuuritud ± 4, 5 σ , pealtvaates helendavast küljest ( a ) ja külgvaates risti membraan normaalne ( b ). Punased punktiirjoontega ümmargused ringid tähistavad kahte piirkonda, milles täheldati olulisi erinevuste piike. c, piirkonna stereokujundus, mis on märgistatud punktiga b kriipsjoontega. d, isomorfse erinevuse Fourier-kaardi histogramm, mis näitab Fourier-tippude erinevuse ilmseid kõrvalekaldeid mürataseme Gaussi jaotusest rohkem kui ± 5 σ . Kaks noolt näitavad võimalikku suurimat mürataset.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Q B moodustab H-sidemed D1 His215 ja Ser264-ga; esimene on mitteheemilise raua ligand. Q B isoprenoidne saba asub hüdrofoobses keskkonnas, mille moodustavad D1 Phe211, Met214, Phe255 ja Phe265, D2-pheophytin (Pho D2 ) ja lipiidid (joonis 3a). Kõrgresolutsiooniga S 1 olekustruktuurides 4, 5 oli QB nõrga elektronide tihedusega, kõrgema B teguriga kui Q A, tõenäoliselt oma segatud protonatsiooniseisundite tõttu. Pärast 2F-valgustust täheldati Q B peagrupi piirkonnas positiivseid elektrontihedusi, samal ajal kui Fourier-erinevuste kaardil täheldati isoprenoidses sabas positiivsete ja negatiivsete tiheduste paari ning kinoonpeade rühma keskmine temperatuuritegur vähenes alates 116 Å 2 kuni 91 Å 2 . See muutus näitab peagrupi pöörlemist bensiiniringiga vertikaalse telje ümber umbes 10 ° D1 Ser264 ja His215 suunas, mis lühendab Q B peagrupi ja nende kahe jäägi vahelisi vahemaid 0, 1–0, 2 Å ja seega tugevdab H-sidemeid nende vahel. Neid liikumisi saab selgitada järgmiselt. Kuna me lisasime kristallidele kaaliumferrütsüaniidi palju enne mõõtmisi, oksüdeeriti mitteheemiline raud Fe 3+ -ks, mis võimaldas tal välguvalgustuse ajal ühe elektroni vastu võtta. Nii saadi 2F-valgustuse tulemusel domineeriv liik QB -, mis loob tugevamad H-sidemed Ser264 ja His215-ga, mille tulemuseks on peagrupi pöörlemine ja temperatuuriteguri langus. Selle protsessiga seoses liikusid ka D1 hüdrofoobsed jäägid Phe211, Phe255, Phe265 ja Met214, mis ümbritsevad isoprenoidset saba, QB saidi õõnsuse kohandamiseks (joonis 3a, b). Nimelt liikus D1 Asn266 – Ser268 hõlmav silmusregioon, mis varjab pimedas struktuuris Q B ala süvendit, 2F valgustatuse korral kuni 0, 8 Å, mille tulemuseks on Q B ala osaline avamine, mis võib viidata kinoonivahetuse marsruut.

Image

a - d, isomorfne erinevus Fourier-kaardid eelvalgustatud proovide 2F-oleku ja tumeda oleku vahel rohelisel (positiivsel) ja punasel (negatiivsel) kontuuril ± 5, 0 σ . D1 ja D2 alaühikud on S1 olekus vastavalt kollased ja tsüaanid ning S 3 olekus rohelised. a, b, struktuursed muutused Q B / mitte-rauaga seonduva saidi ümber. c, d, OEC ümbritsevad struktuurimuutused. Punktis b - d tähistatakse jääkide või rühmade liikumist mustade nooltega ja vee (hapniku) sisestamist või nihutamist tähistatakse kriipsudega nooltega. e, Mn 4 CaO 5 klastri struktuur pärast 2F-valgustust, mis asetseb kaardil 2m F o - D F c, mille kontuur on 10, 1 σ . f, äsja sisestatud hapnikuaatomi O6 asukoht selle läheduses olevate aatomite suhtes. Heledad tumedad kuulid märgistusega 1D – 4A tähistavad Mn ioone; punased ja tsüaanilised kuulid märgistusega 1–6 tähistavad hapnikuaatomeid.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Q B läheduses täheldati Fourier 'erinevuse kaardil tugevat negatiivset piiki vesinikkarbonaadi (BCT) ja mitteheemilise raua vahel. BCT vastasküljel oli väiksem positiivne tipp, mis põhjustas BCT positsioonilise nihke kuni 0, 5 Å ja BCT ja mitterauaraua vaheliste kauguste suurenemiseni 0, 2 Å (joonis 3b). Need muutused võivad tuleneda H-sideme võrgu ümberkorraldamisest BCT ümber ja / või BCT ümberorienteerumisest 2F-valgustuse korral, mille võib põhjustada BCT osalemine Q B protoneerimise prootoniülekandes või mitteraua raua vähendamine. BCT võimalik kaasamine prootoniülekandesse on kooskõlas tähelepanekuga, et BCT eemaldamine põhjustas kinoonivahetusreaktsiooni aeglustumist 14 . Erinevalt Q B saidist ei leitud Q A saidil suuri muutusi.

OEC ümbritsevas piirkonnas leiti mitmeid Fourier 'erinevuse piike (joonis 3c, d); need piigid võimaldavad tuvastada järgmisi olulisi struktuurimuutusi: (i) Mn4 liikus kergelt kuubaani väliskülje poole, mille tagajärjel selle kaugus Mn1-st pisut pikenes 0, 1–0, 2 Å. (ii) Ca 2+ nihkus pisut ka Mn4-st. (iii) O5 lähedale leiti uus tugev tugev positiivne tipp, mis modelleeriti uue hapnikuaatomi O6 moodustamiseks. (iv) D1 Glu189 külgahel liikus kubaanist eemale, et mahutada O6. (v) Veemolekulil W665 leiti tugev negatiivne piik, mis näitab, et see veemolekul nihkus sellest asendist 2F valgustatuse korral. Sellega seoses liikus veemolekul W567 (mis on H-ga seotud O4 ja W665-ga) O4 poole, mille tulemuseks on väiksem kaugus W567 ja O4 vahel. (vi) Nendega muudatustega kaasnesid ka mõnedel teistel ligandijääkidel kerged struktuurimuutused; nende hulka kuuluvad Dl Asp61, Asp170, His332 ja Ala344.

Ülalkirjeldatud struktuurimuutuste hulgas oli W665 nihkumine ja uue hapnikuaatomi O6 ilmumine olulist mõju vee oksüdeerumise mehhanismile. W665 nihke tõttu purunes H-side selle vee ja W567 vahel. See põhjustas W567 liikumise O4 suunas, kuna need on juba H-seotud (joonis 3c). Keskmine kaugus W567 ja O4 vahel 2F valgustatuse korral kahes monomeeris määrati 2, 32 Å. See vahemaa on äärmiselt lühike, mis võib arvata, et W567 on pigem S 3 oleku vesi hüdroksiidioon kui vesi. See suurendab võimalust, et need kaks hapniku liiki esindavad eelseisvaks O = O-sideme moodustumiseks ettevalmistatud olekut (joonis 4). Tõepoolest, uuringud, mis kasutavad W-riba 17 O elektronide-elektronide topeltresonantstuvastusega NMR-i, on osutanud, et kas O4 või O5 on vahetatavad ja seega võivad nad olla substraadi vee 15 kandidaadiks. Varasem teoreetiline uuring näitas ka, et O = O-sidemete moodustumisel võib substraadiks olla kas O4 või O5 16 . Kui aga arvestada võimalike eksperimentaalsete vigadega praeguse eraldusvõimega määratud interaktiivsetes vahemaades, võivad need kaks hapnikuaatomit siiski olla seotud H-sidemega, selle asemel et luua eelseisund O = O-sideme moodustamiseks. Seetõttu viitavad täheldatud struktuurimuutused kindlalt prootoniülekande toimumisele selle piirkonna ümber, kooskõlas hiljutiste teadetega, et H-sidemete võrk, mis algab O4, W567 ja W665 (laiendatud andmed joonis 5), võib olla tee prootonite vabanemiseks. OEC üleminekul S 0 -st S 1-le (vt 17, 18). Selles uuringus täheldatud W665 liikumine võib olla seotud selle prootoniülekandega. Lähtudes prootonite eraldumismustrist 1: 0: 1: 2 üleminekute S 0 → S 1 → S 2 → S 3 → S 4 korral, võib prootoni üleminek W567-lt W665-le toimuda S 2 → S 3 korral. üleminek.

Image

Punktiiriga tähistatud ring näitab veemolekulide (W665) nihkumist O4-ga seotud vee (W567) H kõrval, mille tulemuseks on W567 lähenemine O4-le. Katkendjoontega nooled tähistavad prootoni siirdamise võimalikke teid. Kaks hapnikuaatomite paari, mis on ümbritsetud katkendlike punaste joontega, tähistavad O = O-sideme moodustumise võimalikke saite, kusjuures O5 ja O6 vaheline vahemaa on palju lühema vahemaaga ja tähistab seetõttu O = O-sideme tegelikku saiti.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

2F-valgustusega O6 aatom on O5-le väga lähedal (kahe monomeeri keskmine kaugus 1, 5 Å; joonis 3c – f), mis võimaldab neil moodustada peroksiidi või superoksiidi, näiteks 19 . See viitab kindlalt sellele, et see sait on O = O-sideme moodustumise reaktsioonisaidiks (joonis 4), vastavalt Siegbahni jt pakutud mudelile. 6, 7, 20, samuti elektronide paramagnetilise resonantsi mõõtmiste 21, 22 ja kvantmehaanika / molekulaarmehaanika (QM / MM) arvutuste tulemused 23 . Ülejäänud struktuurseid muutusi saab hõlpsalt seletada selle hapnikuaatomi sisestamisega: Mn4 ja Mn1 vahelise kauguse pikenemine tuleneb ilmselt vajadusest mahutada see uus hapnikuaatom. Eelkõige on D6 Glu189 liikumine kuubaanist eemal vajalik O6 mahutamiseks, kuna selle tulemuseks on O6 ja Glu189 vahel keskmine vahemaa 2, 70 Å. Ilma selle liikumiseta oleks O6 ja Glu189-OE2 vaheline kaugus 2, 30 Å, mis takistaks hapnikuaatomi sisestamist. Liikumise teeb võimalikuks tänu Glu189 kui OEC monodentaadi ligandi ainulaadne omadus, võrreldes kõigi teiste kahepoolsete ligandidega. Samuti peaksime rõhutama, et O6 ei ole tingimata uus veemolekul väljastpoolt PSII, kuna juba S 1 olekus olev veemolekul võib liikuda sellesse positsiooni 4, 19, 24 .

Lisaks kahele eelpool kirjeldatud eelvalatud proovide olulisele muutuste piirkonnale leiti eelvälgatamata proovides YD ümber ka kolmas struktuurimuutuse piirkond (D2 Tyr160). YD on osaliselt H seotud veemolekuliga W508, millel on kaks konformatsiooni: üks on H-seotud (W508I) ja teine ​​- H-ga seotud (W508II) - YD. Eelvalamata proovide Fourier-erinevuste kaardil leiti W508I positsioonil negatiivne piik, mis viitab sellele, et see veemolekul on nihkunud ja H-side YD-ga on katki (laiendatud andmed, joonis 4a – c). . See leid viitab sellele, et prootonite ülekanne toimub selle piirkonna ümber 2F valgustatuse korral, kooskõlas hiljutiste QM / MM arvutustega, kus proksimaalne W508I osutus Y D25 oksüdeerumisel ebastabiilseks. See omakorda viitab sellele, et 2F-valgustus indutseerib eelvälgatamata proovides YD osalise oksüdeerimise, tõenäoliselt kristallides asuva Mn 4 CaO 5 klastri elektronide ebaefektiivse annetamise tõttu. YD oksüdeerimine põhjustab prootonite ülekande YD-st põhilahustisse, H-sideme purunemise YD ja W508I vahel ja selle veemolekuli viimise distaalsesse asendisse ehk lahusti 25, 26 . Niisiis põhjustab see struktuurimuutus jälle prootoniülekannet YD ümber.

Meetodid

Valimi suuruse määramiseks statistilist meetodit ei kasutatud. Katseid ei randomiseeritud ning uurijaid ei pimestatud katsete ja tulemuste hindamise käigus eraldama.

Fotosüsteemi II ettevalmistamine ja kristallimine

Kõrgendatud aktiivsusega PSII eraldati termosünechococcus vulcanusest ja kristalliti vastavalt eelnevale kirjeldusele kergete modifikatsioonidega 4, 27, 28 . Lõplikud PSII tuuma dimeerid suspendeeriti 20 mM Mes (pH 6, 0), 10 mM NaCl, 3 mM CaCl2 ja lõplik kristallimispuhver sisaldas 20 mM Mes, 20 mM NaCl, 40 mM MgS04, 10 mM CaCl2, 5. –7% polüetüleenglükool 1450, 0, 85% n-heptüül-β-d-tioglükopüranosiid (Dojindo). Ümberkristallimisprotseduuri ei rakendatud. XFEL-i abil TR-SFX jaoks sobivate proovide ettevalmistamiseks sõeluti erineva suurusega PSII kristalle ja kristallimisjärgseid töötlustingimusi (vt allpool) ja leidsime, et liiga väikesed kristallid ei difrakteeru kõrge eraldusvõimega, samas kui suuremad kristallid andsid madalama tulemuse laser-erutustest põhjustatud S i- oleku ülemineku efektiivsus. Kristallide optimaalse suuruse maksimaalseks pikkuseks määrati 100 μm, mis difundeerus SACLA – XFEL impulsiga (laiendatud andmed joonis 1) eraldusvõimeks 2, 1 Å ja lõppfaas 46% S 3 olekust 2F valgustuse korral (vt allpool).

Kõik protseduurid ettevalmistamiseks, kristallimiseks, välgu valgustamiseks ja difraktsiooni katseteks viidi läbi pimedas või hämaras rohelises valguses. Suure koguse mikromõõduliste kristallide valmistamiseks viidi kristallimine läbi 1, 5 ml mikrotsentrifuugiklaasides proovi mahuga 50 μl kontsentratsioonil 2, 3 mg klorofülli ml kohta temperatuuril 20 ° C. Kristallid ilmusid mõne tunni pärast; kui kristallide suurus saavutas maksimaalse pikkuse 100 μm, lisati kristallide edasise kasvu peatamiseks 50 μl kristallimispuhvrit, milles PEG1, 450 kontsentratsiooni suurendati 1–2% võrreldes kristallisatsioonitingimustega (vt laiendatud andmeid) Joonis 1a tüüpiliste kristallide pildist). Kristalle pesti mitu korda selle puhvriga, et eemaldada PSII proovid, mis ei olnud kristalliseerunud, ja hoiti üleöö.

Enne XFEL-i katseid viidi kristallid värskesse emavedelikku, mis sisaldas 10 mM kaaliumferrütsüaniidi elektronide aktsepteerijana eelvilgutatavate proovide jaoks ja 2 mM kaaliumferrütsüaniidi proovide jaoks ilma eelvälgu (eelvälke). Seejärel suurendati 'krüokaitsja' kontsentratsiooni 22% glütserooli, 9% PEG1, 450 ja 9% PEG5000 MME-ni, asendades järk-järgult emalahust 1, 5 tunni jooksul. Lõpuks segati kristallid ettevaatlikult määrdemaatriksiga, tuumaenergia Super Lube määrdega (Synco Chemical Co.) ja laaditi kõrge viskoossusega mikroekstrusioonpihustisse, nagu eelpool kirjeldatud 13 .

Ehkki SFX-i saab läbi viia toatemperatuuril ja kristalle pole vaja külmutada, leidsime, et see kristallimisjärgne protseduur krüokaitsja kontsentratsiooni suurendamiseks oli oluline heade difraktsiooni tekitavate PSII kristallide saamiseks. Kui kristallimisjärgne protseduur ei olnud piisav, tekitasid mõnede kristallide suuremad raku mõõtmed a = 129, 1 Å, b = 228, 8 Å ja c = 305, 4 Å (laiendatud andmed, joonis 6a – c). Selle suurema ühikuelemendi kristallide difraktsioonipaigad olid eraldusvõimega 3, 0 Å madalamad, tõenäoliselt kristallide lahtise pakkimise tõttu. Tõepoolest, leidsime, et selles kristallpakendis olev PSII dimeer kandis kahte PsbY subühikut (üks PsbY monomeeri PSII kohta; laiendatud andmed, joonis 6e). Teisest küljest leiti PSII dimeerist ainult üks PsbY (üks monomeer sisaldas PsbY, samas kui teine ​​monomeer ei sisaldanud seda) struktuuris rakuühiku mõõtmetega a = 126, 5 Å, b = 231, 2 Å ja c = 287, 5 Å, mida analüüsiti see uuring (laiendatud andmed, joonis 6f). Kui kaks struktuuri olid üksteise peal asetatud, segas üks suurematest kristallpakenditest moodustunud dimeerses struktuuris ühte kahest PsbY alaühikust väiksema kristallpaketiga külgnevat monomeeri (laiendatud andmed, joonis 6d – f).

PSII kristallide välklambi eelne valgustus

S 0 oleku võimaliku saastumise vähendamiseks pimedas kohandatud kristallides valgustati PSII mikrokristalle ühe kristallieelsega enne kristallimisjärgset töötlemist. 100 μl lahuse alikvoot, mis sisaldas PSII mikrokristalle, viidi dialüüsinuppu ja eelvälku viidi läbi Nd: YAG laseriga (Minilite-I, Continuum) lainepikkusel 532 nm, läbimõõduga 7 mm (suur) piisavalt, et katta kogu proovipind) energiaga proovi asukohas ~ 52 mJ cm −2 . Pärast välklambi eelset valgust hoiti proovi 1–3 tundi pimedas ja viidi seejärel krüokaitsetingimustesse. See pimeda inkubatsiooni aeg oli piisavalt pikk, et kõrgematel S i- olekutel (S 2 ja S 3 ) laguneda S 1 olekusse ja seetõttu minimeerida S 0 oleku võimalik saastumine pimedas kohandatud kristallides. kui neid on.

PSII kristallide S 3 populatsiooni hinnang ATR – FTIR mõõtmiste järgi

S 3 oleku populatsiooni pärast 2 välgu ilmnemist PSII mikrokristallides hinnati valguse indutseeritud FTIR erinevuste spektroskoopia abil koos nõrgestatud kogupeegelduse (ATR) meetodiga. SACLA katsetega samas puhvris olevad PSII kristallid (sealhulgas 10 mM kaaliumferrütsüaniidi) laaditi kolme peegeldusega räniprismale ja suleti seejärel läbipaistva plaadi ja silikoonkummist vahetükkidega. Standardsete spektrite mõõtmiseks laaditi PSII südamiku lahus räniprismale ja proovi temperatuuri hoiti 20 ° C juures. FTIR spektrid registreeriti eraldusvõimega 4 cm −1, kasutades MCT detektoriga varustatud Bruker IFS-66 / S spektrofotomeetrit. Välklambi valgustuseks oli Q-lülitusega Nd: YAG-laser (Quanta-Ray INDI-40-10; 532 nm, ~ 7 ns FWHM, ~ 21 mJ cm –2 ). Laservälgu küllastumine kinnitati FTIR-signaali võimsussõltuvuse kontrollimisega. Pärast kahte eelvälku koos sellele järgneva pimedas kohandamisega 30 minuti jooksul tehti proovile kaks välguga intervalli 10 s ja mõlemal välgul mõõdeti FTIR erinevuste spektrid. Me kinnitasime, et kõrgemad S-olekud lagunesid selle 10-sekundilise intervalli jooksul väga vähe. Seda mõõtmist korrati 10 korda, et suurendada spektrite signaali-müra suhet, kusjuures iga mõõtmine eraldati 30-minutise tumeda inkubatsiooniga.

Lahuses (mustad jooned) ja kristallides (punased jooned) PSII komplekside 1. (a) ja 2. (b) välgul saadud FTIR erinevuse spektrid on toodud laiendatud andmetega joonisel 2. Spektrid normaliseeriti vastavalt II amiidi riba, mis peegeldab valgu kogust. S-oleku üleminekute efektiivsust PSII kristallides hinnati vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetodile 29, 30 . PSII kristallide 1. ja 2. välgu spektrid vastavalt vastavalt f 1 ( v ) ja f 2 ( ν ) varustati 1. ja 2. välklambi spektri lineaarsete kombinatsioonidega lahuses, F 1 ( v ) ja F 2 ( ν ) vastavalt standardse spektrina: f 1 ( ν ) = c 11 F 1 ( ν ); f 2 ( ν ) = c 21 F 1 ( ν ) + c 22 F 2 ( ν ), kus c 11, c 21 ja c 22 on lineaarse kombinatsiooni koefitsiendid. Väikseimate ruutude sobitamine viidi läbi sümmeetrilises COO piirkonnas (laiendatud andmed, joonis 2b). Koefitsientideks hinnati c 11 = 0, 73 ± 0, 02, c 21 = 0, 27 ± 0, 01 ja c 22 = 0, 64 ± 0, 02. S 1 → S 2 ja S 2 → S 3 üleminekute efektiivsused on väljendatud vastavalt vastavalt α 0 c 11 ja α 0 ( c 22 / c 11 ) ning arvutatakse S 3 oleku populatsioon pärast teist välku kui α 0 2 c 22 . Siin on α 0 lahuse S-oleku üleminekute keskmine efektiivsus ja 12 järjestikuse välguga saadud intensiivsuse võnkejoonelt 1400 cm −1 (vt 31, 32) määrati see 0, 85 ± 0, 01. Selle põhjal on hinnanguliselt S3 oleku populatsioon PSII mikrokristallides pärast kahte sähvatust 0, 46 ± 0, 03.

Difraktsioonikatse SACLA – XFEL-is

Ühekordsete XFEL-andmete kogumiseks kasutati femtosekundilisi röntgenimpulsse SACLA-st BL3 juures. SACLA impulsi parameetrid olid järgmised: impulsi kestus, 2–10 fs; Röntgenienergia, 7 keV; energia ribalaius, 0, 5% (FWHM); impulsi voog, ~ 7 × 10 10 footonit impulsi kohta; kiire suurus 3, 0 μm (H) × 3, 0 μm (W); kordumissagedus, 30 Hz.

Rasvaga segatud PSII kristallid laaditi pihustisse, mille otsiku läbimõõt on 150 μm, ja seati heeliumiga täidetud difraktsioonikambrisse, kasutades süsteemi SACLA (DAPHNIS) 33 nimega Diverse Application Platform kõva röntgendifraktsiooni jaoks. Voolukiirus oli 2F andmete jaoks seatud 5, 6 μl min- 1 (5, 28 mm s −1 ) ja tumedate andmete puhul 2, 8 μl m −1 (2, 64 mm s −1 ). Difraktsioonimustrid registreeriti, kasutades multiport CCD detektorit 34 . Kuna ergastamise laserimpulsside sagedus oli 10 Hz ja XFEL-i impulsside kordumissagedus oli 30 Hz, järgnesid igale sisselülitatavale pildile kaks "väljalülitamise" pilti, mis registreeriti eraldi. Pumbatavaid pilte kasutati 2F-oleku struktuuri analüüsimiseks, samal ajal kui pimeda oleku difraktsiooniandmed koguti eraldi käitamisega.

PSII proovide S 3 -olekusse viimiseks tehti kahest järjestikust ergastuslaservälku kahest eraldi Nd: YAG laserallikast (Minilite-I, Continuum) proovile t = 0 ms ja t = 10 ms (see tähendab, eraldati kaks välkkiiret 10 ms) eelvalatud proovide puhul ja t = 0 ms ja t = 5 ms (eraldatud 5 ms) eelvalmimata proovide korral. Piisava erutuse tagamiseks jaotati mõlemad pumbalaserid kaheks kiireks ja kõik samast pumbalaserist (pump 1 või pump 2) saadud valguskiir fokuseeriti samale proovipunktile üksteise suhtes 160 ° nurga all ( peaaegu vastupidine geomeetria). Pumba 1 kahte tala kasutati esimeseks välgu valgustamiseks, samas kui teisi kahte pumba 2 tala kasutati teise välgu valgustamiseks. Kõigi kiirte pumba fookuskauguseks seati 240 μm (ülemine müts) ja selle energia oli 42 mJ cm −2 mõlemast suunast. XFEL-impulsse edastati 93 μm pumba fookuskaugusest allavoolu, eelvälgatud proovide puhul 10 ms ja teise ergutuslaseri järgselt 15 ms eelvalgustamata proovide korral (esimesele välgule järgnev koguaeg on seetõttu mõlemal juhul 20 ms) (joonis 1d, e). Voolukiirusel 5, 6 μl min −1 eraldati iga sissepumbatava XFEL-kujutise jaoks valgustatud kristall 528 μm-ga, mis oli piisavalt pikk, et vältida eelmiste ergastuslaserite mõju, kuna viimase laseriga valgustuspunkt ulatub valgustuskeskmest vaid 120 μm-ni.

Andmetöötlus

Detektori tausta määrati tumedate piltide keskmistamise teel ja lahutati difraktsioonimustritest. Difraktsioonipildid filtreeriti programmiga Cheetah 35, 36, mis oli kohandatud SACLA-le, ja töödeldi programmi CrystFEL 37 abil . Punktide leidmise ajal tippude tuvastamiseks kasutatud parameetrid 'min-snr', 'läved' ja 'min-gradient' olid järgmised: vastavalt 6, 500 ja 10 000 eelvälgatud tumedate andmete ja eelvälgatud 2F andmete jaoks; 5, 500 ja 10 000 eelvälgutamata tumedate andmete korral; ja 5, 500 ja 5000 eelvälgatamata 2F andmete jaoks. Indekseerimine viidi läbi kasutades DirAx 38 ja Mosflm 39 tippintegratsiooniparameetritega int-raadius = 3, 5, 7, kus edastati ühikuelemendi teave, et vältida difraktsioonipiltide integreerimist pikema c- teljega kristallidest. Enne Monte-Carlo integreerimist loobuti indekseeritud piltidest, mille difraktsiooni_resolutsiooni_piir on väiksem kui 4, 2 Å või num_kõne on väiksem kui 400. Kogutud piltide koguarv, Cheetahi poolt filtreeritud kokkulangevate piltide arv, indekseeritud kujutised ja eelvälgatud proovide täpsustamiseks kasutatud piltide arv olid järgmised: vastavalt 408 071, 76 067, 64 985 ja 27 497, tumedate andmete puhul; ja 273, 550, 60, 885, 51, 482 ja 21, 680 2F andmete jaoks. Eelvälgutamata proovide vastavad numbrid on 462 343, 70 083, 54 956 ja 22 341 tumedate andmete korral; ja 876 874, 165 463, 63 711 ja 23 903 2F andmete jaoks (laiendatud andmete tabel 1). Lükatud hetktõmmiste Lorentzi tegurit rakendati käsitsi eelvalatud tumedate ja 2F-andmestike 40 keskmiste intensiivsuste suhtes. Andmekogumise statistika on esitatud laiendatud andmetabelites 1, 2, mis näitavad, et meie andmed nii pimedas kui ka 2F olekus olid eraldusvõimega 2, 35 Å eelvalgustatud proovide puhul ja 2, 5 Å eelvalgustamata proovide korral, mis põhineb CC 1/2 piirväärtusel umbes 50%. Peaksime juhtima tähelepanu sellele, et kõigi meie andmete üldine korrutatavus on väga suur ja isegi kõrgeima eraldusvõimega kordarvis ületati korrutatus 500. Koos faktidega, et: (i) CC 1/2 väärtused kõrgeima eraldusvõimega kestades on mõistlikult kõrged; ii) CC 1/2 väheneb järk-järgult, ilma et tekiks ebanormaalseid häireid madala eraldusvõimega kõrgema eraldusvõimega kestadest; ja (iii) CC 1/2 väärtus kõrgeima eraldusvõimega kestades on mõistlikult kooskõlas väärtusega I / σ ( I ) (teoreetiliselt 0, 5 CC 1/2 vastab 2, 0-le I / σ ( I ) ja iga olulised kõrvalekalded neist väärtustest on süsteemimuutuse ja / või probleemide indikaatorid veamudelis 41 ), leiame, et käesolevas uuringus sisalduvate andmete kvaliteet on piisavalt kõrge, et saaksime paljastada välguvalgustuse põhjustatud väikesed struktuurimuutused .

Eelvalatud pimedas kohandatud oleku S 1, eelvälgatud S 1 oleku ja 2F oleku struktuurne täpsustamine

Algfaasid kuni 4 Å eraldusvõime saadi molekulaarse asendamise teel programmiga Phaser CCP4 komplektis 42, kasutades otsimismudelina PSII 1, 95 Å eraldusvõimega XFEL-i struktuuri (esialgse eelarveprojekti liitumiskood 4UB6; viide 5), milles OEC ja selle otsesed ligandid, QB, veed ja glütseroolimolekulid jäeti välja. Pärast mõnda jäika keha täpsustamise tsüklit ja sellele järgnevat reaalse ruumi tiheduse muutmist, kasutades lahusti lamestamist, histogrammi sobitamist ja mittekristallograafilist sümmeetriat, mis keskmistati programmi DM abil CCP4 komplektis 42, näitasid saadud elektronide tiheduse kaart omadused, mis on piisavalt selged, et saaksime ehitada mudel enesekindlalt. Struktuurne viimistlemine viidi läbi Phenix 43-ga ja mudelit modifitseeriti käsitsi COOT 44-ga . Pärast mõnda vaoshoitud rafineerimise tsüklit pandi veemolekulid kõrgema eraldusvõimega struktuuris olevatele veemolekulidele vastavatele kohtadele, kus m F o - D F c kaardil olid selgelt tuvastatud positiivsed piigid üle 3, 5 σ . Seejärel leiti saadud m F o - D Fc kaardi põhjal lisaks veemolekulid ja glütseroolimolekulid, kui leiti positiivsed piigid, mis olid suuremad kui 3 σ . QB, OEC ja selle otsesed ligandijäägid modelleeriti viimases etapis. Meie eelmises XFEL-i struktuurianalüüsis eraldusvõimega 1, 95 Å 5 tuvastati oksosildade täpsed asukohad m F o - D F c kaardil, jättes välja okso-sillatud hapniku aatomid; kui aga vaoshoitud rafineerimine viidi selles uuringus läbi samal viisil, ei olnud mangaani ja / või kaltsiumi aatomite temperatuuritegurid OEC-s ühtlustunud ja andsid tulemuseks väga kõrged väärtused, kuna lahutusvõime oli vahemikus 2, 35–2, 5 Å . Nii ehitasime OEC struktuuri, kasutades geomeetrilisi piiranguid, mis põhinevad Mn 4 CaO 5 klastril 1, 95 Å eraldusvõimega XFEL-struktuuris, ning rakendasime Mn – O-sidemetele, Ca – O-sidemetele ja Mn-le tihedaid kauguspiiranguid σ = 0, 02 Å. –Liiga jääkide vahemaa täpsustamise ajal. Mn – Mn ja Mn – Ca vahemaadele ei seatud mingeid piiranguid. The R factor and R free values obtained were 0.133 and 0.171, respectively, for the pre-flashed dark state, 0.139 and 0.186 for the non-pre-flashed dark state, and 0.139 and 0.187 for the non-pre-flashed 2F state (Extended Data Table 1).

Structural refinement for the pre-flashed 2F state

Given the population of the S 3 state estimated from the FTIR measurement, the diffraction data obtained from the 2F illuminated sample is expected to contain those partly from the S 2 and S 1 states of PSII, which means that the resulted electron density would be a mixture of these S-states, including the S 3 state. Even with a high-resolution data set, the structural refinement of the mixed states (or mixed structures) would be challenging, especially when the mixed structures are very similar, as in the case of PSII. As we did not have the structure corresponding to the S 2 state, we refined the pre-flashed 2F data set as a mixture of the S 1 state structure and the 2F state structure 45 . The occupancies for the S 1 structure and the 2F state structure were set to 0.2 and 0.8, respectively, on the basis of the distributions of the temperature factors. The region in which the structure was refined in multiple states was selected on the basis of the large peaks observed in the isomorphous difference Fourier map, and the rest was refined as a single conformation. As a result, thirty-five amino acid residues, five water molecules, one non-haem iron, one Q B and one OEC per monomeric PSII were modelled as multiple states. During the restrained refinement, the coordinate for the S 1 state structure was fixed. Relatively loose geometric restraints for distance, angle and plane with relatively high sigma values (3–10 times larger than the default values) were applied to the OEC and Q B during the refinement. Large positive peaks of 10.3 σ for monomer A and 9.5 σ for monomer B, found at a position with distances of 1.5 Å and 2.3 Å from O5 and Mn1D, respectively, were modelled as a new oxo-oxygen O6 with an occupancy of 0.4, which gave rise to a temperature factor similar to its nearby atoms. This is also consistent with the population of the S 3 -state estimated from the FTIR results. The R factor and R free values thus obtained were 0.129 and 0.176, respectively.

Data availability

The structure factors and atomic coordinates have been deposited in the Protein Data Bank (PDB) with accession numbers 5WS5 and 5WS6 for the pre-flashed dark-stable S 1 state and 2F states, and 5GTH and 5GTI for the non-pre-flashed dark-stable S 1 state and 2F state, respectively. All other data associated with this manuscript are available from the authors on reasonable request.

Liitumised

Primary accessions

Protein Data Bank

  • 5GTH
  • 5GTH 3d view
  • 5GTI
  • 5GTI 3d view
  • 5WS5
  • 5WS5 3d view
  • 5WS6
  • 5WS6 3d view

Extended data

Extended data figures

  1. 1

    Micro-sized crystals of PSII, its diffraction image and quality of the diffraction data sets.

  2. 2

    Measurement of the S3 state population upon 2F illumination by FTIR.

  3. 3

    Anomalous signals obtained with the XFEL beam.

  4. 4

    Electron density maps and structural changes around Y D between the non-pre-flashed 2F and dark data sets.

  5. 5

    Electron density maps for the O4–water chain.

  6. 6

    Distribution of the unit cell parameters and crystal packing of PSII for the non-pre-flashed samples.

Extended data tables

  1. 1

    Statistics of the diffraction data and structural refinements for the dark state and 2F state data sets of both pre-flashed and non-pre-flashed samples, collected at SACLA ( a ), and the R iso values between the different data sets ( b )

  2. 2

    Statistics for the processing of the diffraction data for the pre-flashed dark state ( a ), pre-flashed 2F state ( b ), non-pre-flashed dark state ( c ), and non-pre-flashed 2F state ( d ) collected at SACLA

  3. 3

    List of the top 30 anomalous peaks identified in the non-pre-flashed dark state and 2F state data sets

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.