Anaeroobse metaani oksüdeerimise (damo) ja anammoksi protsesside vastastikmõjude laboratoorne uurimine anoksilistes keskkondades | teaduslikud aruanded

Anaeroobse metaani oksüdeerimise (damo) ja anammoksi protsesside vastastikmõjude laboratoorne uurimine anoksilistes keskkondades | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Mikroobide ökoloogia
  • Veemikrobioloogia

Abstraktne

Selles uuringus uuritakse hiljuti tuvastatud denitrifitseeriva anaeroobse metaani oksüdatsiooni (DAMO) ja anaeroobse ammooniumi oksüdatsiooni (anammoksi) protsesse kontrollitud anoksilistes laborireaktorites. Kaks reaktorit külvati sama inokulaadiga, mis sisaldas DAMO organisme Candidatus Methanoperedens nitroreducens ja Candidatus Methylomirabilisxyfera ning anammoksorganismi Candidatus Kuenenia stuttgartiensis. Mõlemat toideti ammooniumi ja metaaniga, kuid ühte toideti ka nitraadiga ja teist nitritiga, pakkudes anoksilisi keskkondi erinevate elektronide aktseptoritega. Pärast mitme kuu jooksul saavutatud püsiseisundit sai DAMO protsess ainuisikuliselt / peamiselt nitraatide redutseerimise eest vastutavaks, samas kui anammoksi protsess vastutab nitritite redutseerimise eest mõlemas reaktoris. 16S rRNA geeni amplikoni järjestamine näitas, et nitraatide poolt juhitav DAMO organism M. nitroreducens domineeris nii nitraatidega toidet (~ 70%) kui ka nitrititega toidet (~ 26%) reaktorites, samal ajal kui nitrititest juhitav DAMO organism M.xyfera kadus mõlemas kogukonnas. M. oxyfera elimineerimine mõlemast reaktorist oli selle anammoksibakterite poolt nitritite osas tõenäoline, et see organism võitis. Mõlemas reaktoris tuvastati K. stuttgartiensis suhteliselt madalal tasemel (1–3%).

Sissejuhatus

Anaeroobne ammooniumi oksüdatsioon (anammox) ja denitrifitseerivad anaeroobsed metaani oksüdatsiooni (DAMO) protsessid on mõlemad avastatud viimastel aastakümnetel ning neil on oluline mõju kogu lämmastiku tsüklile. Anammoksi protsessi demonstreeriti esimest korda eksperimentaalselt 1980. aastate lõpus reoveepuhastis, kus ammoonium ja nitrit tarbiti lämmastiku ja nitraadi 1 tootmiseks . Hiljem leiti, et anammox on üldlevinud paljudes looduskeskkondades 2, 3, 4, sealhulgas anoksilistes meresüsteemides, kus on arvatud, et anammox võib moodustada lämmastikugaasi tootmises kuni 50% 5 . DAMO mikroorganisme rikastasid esmakordselt 2006. aastal Raghoebarsing jt. magevee kanali setetest 6 . Rikastamiskultuuris domineeris Candidatus Methylomirabilisxyfera (~ 80%), samas tuvastati ka anaeroobse metanotroofse (ANME-2d) arhaea rühm (~ 10%). Kasutades metagenoomikat, on Ettwig jt. näitas, et M. oxyfera võib redutseerida nitriti lämmastikoksiidiks ja saavutab seejärel metaani oksüdeerimise, kasutades lämmastikoksiidi 7 demutatsioonil tekkinud kohapeal toodetud hapnikku. Hu et al. teatasid ANME-2d domineeriva DAMO kultuuri edukast rikastamisest, mis sisaldas ka M. oxyfera 8 . Kõigi varem teatatud DAMO kultuuride suhtelise toimimise põhjal põhinevad Hu et al. tegi ettepaneku, et ANME-2d võib mängida olulist rolli nitraatide vähendamisel 8 . Kasutades metagenoomilisi ja metatranscripomic lähenemisviise, Haroon et al. kinnitas, et need ANME-2d, mis kannavad nime Candidatus Methanoperedens nitroreducens, võivad oksüdeerida metaani vastupidise metanogeneesi kaudu süsinikdioksiidiks ja redutseerida nitraadid nitrititeks 9 . Praeguseks on DAMO teadaolevate mikroorganismide hulka kuulunud nitraadist juhitav DAMO archaea M. nitroreducens ja nitrititest juhitavad DAMO bakterid M.xyfera.

Varem on spekuleeritud, et nii anammoksi kui ka DAMO protsessid toimuvad tõenäoliselt setete või veergude, kus on saadaval metaani ja lämmastikuühendite, toksilise / toksilise piiril, 10, 11 . Nendes keskkondades võiksid anammoksi ja DAMO organismid eksisteerida koos ja suhelda risttoite või substraadi konkurentsi kaudu. M. nitroreducens on võimeline redutseerima nitraadi nitritiks 9, mis on anammoksibakterite ja ka M.xyfera substraat. Teisest küljest toodavad anammoksibakterid nitraati, mis on substraat M. nitroreducens'ile . Tõepoolest, Luesken et al. On avaldanud anammoksibakterite ja M. oxyfera rikastatud kaaskultuuri. 12 järjestikuses nitritite, ammooniumi ja metaaniga toidetud reaktoris rikastati M. nitroreducens ja anammox bakterite ühiskultuuri nitraadi, ammooniumi ja metaaniga 9 varustatud bioreaktoris, samal ajal kui M. nitroreducens , M - oksüfeera ja anammoksibakterid rikastati membraaniga biokilereaktoris (MBfR), mida toideti ka nitraatide, ammooniumi ja metaaniga 13 .

Selles uuringus uurime üksikasjalikult DAMO ja anammoksiorganismide koostoimeid kontrollitud anoksilises keskkonnas. Kahe sama inokulaadiga nakatatud reaktorit, mis sisaldas anammoksibakterite, M.xyfera ja M. nitroreducens segu, toideti lisaks metaanile ja ammooniumile vastavalt ka nitraadi või nitritiga ja neid töötati 10–12 kuud. Mikroobseid kooslusi reaktorites jälgiti fluorestsentsi in situ hübridisatsiooni (FISH) ja 16S rRNA geeni amplikoni järjestamise abil. DAMO ja anammoksi mikroorganismide aktiivsuse jälgimiseks mõõdeti katse jooksul metaani, nitraadi, nitriti ja ammooniumi tarbimise määra ja lämmastiku gaasi tootmist. Pakutakse välja kontseptuaalne mudel, mis iseloomustab DAMO ja anammoksorganismide vastastikmõju anoksilises keskkonnas, tuginedes mõõdetud reaktsiooni ja mikroobsete koosluste andmetele.

Tulemused

Nitraadiga toidetud reaktor

Joonised 1a ja 1b näitavad NO 3 -, NO 2 -, NH 4 +, CH 4 ja N 2 ajalist massiprofiili nitraatidega toidetud reaktoris, mida kasutati nitraadi, nitriti, iganädalase tarbimise või tootlikkuse määra määramiseks nädalas. ammoonium, metaan ja lämmastiku gaas, kasutades lineaarset regressiooni. NO 3 -, NO 2 - ja NH 4 + mass arvutati, korrutades vastavad mõõdetud kontsentratsioonid vedeliku mahuga. CH4 ja N2 mass arvutati, võttes arvesse neid aineid nii gaasi (mõõdetud) kui ka vedelas faasis (kasutades Henry seadust, nagu on eelnevalt selgitanud Hu jt 8 ). r anammox (NO 2 - anammoxi tarbimise määr), r DAMO-nitrit (NO 2 - DAMO tarbimise määr) ja r DAMO-nitraat (NO 3 - DAMO tarbimise määr), mis on määratud ammooniumi, nitriti ja andmed nitraatide määra kohta (vt jaotist Meetodid) on esitatud joonisel 1c. Pärast reaktori käivitumist täheldati viivitamatult DAMO aktiivsust, millele viitas joonistel fig 1a ja 1b näidatud metaani ja nitraadi tarbimine ning samuti joonisel fig 1c näidatud andmed r DAMO-nitraadi ja r DAMO-nitriti kohta. Seevastu esimese 33 päeva jooksul oli ammooniumitarbimine ebaoluline, mis viitab sellele, et sellel perioodil anammoksi aktiivsus puudus (r anammox = 0) ja r DAMO-nitrit oli ekvivalentne r DAMO-nitraadiga . Nende tulemuste üks võimalik seletus on, et sel perioodil ei olnud anammoksi jaoks saadaval nitraate, mis oleks toodetud DAMO organismide poolt nitraatide redutseerimisel. Päevade 33 ja 80 vahel vähenes DAMO (r DAMO-nitrit ) nitrititarbimise määr aeglaselt, kaasnedes anammoksi aktiivsuse suurenemisele (r anammox ). Pärast 80. päeva näis nitritite vähene vähenemine DAMO poolt (r DAMO-nitrit = 0). DAMO poolt nitraatide redutseerimisel toodetud nitrit kulus anammoksi protsessis täielikult.

Image

a): metaani ajalised profiilid (

Image

) ja lämmastiku gaas (

Image

), mis tähistavad nende ainete üldkogust nii gaasi- kui ka vedelas faasis; b): ammooniumi ajalised profiilid (

Image

), nitraat (

Image

) ja nitrit (

Image

). Nitriti kontsentratsioon (

Image

) oli enamuse ajast nullilähedane; c): NO 2 vähendamise määr anammoxi poolt (

Image

, r anammox ), NO 2 - DAMO redutseerimise määr (

Image

, r DAMO-nitrit ) ja NO 3 - vähendamise määr DAMO poolt (

Image

, r DAMO-nitraat ), arvutatud vedeliku faasi mõõtmiste ja reaktsiooni stöhhiomeetria põhjal.

Täissuuruses pilt

Pärast 120. päeva saavutati püsiseisund, metaani, ammooniumi ja nitraadi tarbimismäärad ning lämmastiku lämmastiku tootmistase olid kõik stabiilsed. Nitritit ei tuvastatud. Ammooniumi ja nitraadi keskmised tarbimismäärad olid vastavalt umbes 1, 33 mmol NH4 + -N / d ja 1, 48 mmol NO3 -N / d. Mõõdetud N2 tootmistase oli umbes 2, 75 mmol N2-N / d, mis on väga lähedane ammooniumi tarbimise kiiruse ja nitraatide tarbimise kiiruse (2, 81 mmol N2-N / d) summale. Suletud lämmastikubilanss näitab, et kogu ammoonium ja nitraat muundati gaasiliseks lämmastikuks ning bioreaktoris ei toodetud muid lämmastiku päritoluga tooteid või see oli ebaoluline. Tõepoolest, N 2 O mõõtmised päevadel 53, 115, 199 ja 260, kasutades N2 O mikrosensorit, kinnitasid, et N 2 O polnud reaktoris tuvastatav (andmeid pole näidatud), mis viitab sellele, et kõik redutseeritud nitraadid ja nitritid muundati lämmastiku gaas.

Elektroni tootmise kiirus ammooniumi oksüdatsioonil lämmastikgaasiks on 4, 0 mmol e / d. Võrdluseks - elektronide tarbimise kiirus nitraatide redutseerimisel gaasiliseks lämmastikuks on hinnanguliselt umbes 7, 4 mmol e / päevas. Metaani tarbimise kiirus püsis stabiilsena umbes 0, 43 mmol / d, andes elektronide kiirust 3, 4 mmol e / päevas. See vastas väga hästi täiendava elektronõudlusega nitraatide redutseerimisega (7, 4 mmol e - / d - 4, 0 mmol e - / d = 3, 4 mmol e - / d). Üldiselt viitavad lämmastiku ja elektronide tasakaalud sellele, et ammoonium ja nitraat muundati gaasiliseks lämmastikuks ja metaan oksüdeeriti süsinikdioksiidiks.

Reaktsiooni stöhhiomeetria põhjal kasutati 40% DAMO organismide poolt oksüdeerunud metaanist nitraatide redutseerimiseks nitrititeks ja ülejäänud nitritite redutseerimiseks lämmastiku gaasiks esimese 33 päeva jooksul. Pärast seda, kui anammoxi protsess hakkas kogu nitritit tarbima (alates 80. päevast), kasutasid DAMO organismid kõiki metaani anaeroobsel oksüdeerimisel saadud elektrone, et redutseerida nitraadid nitrititeks, mille tulemusel suurenes neto nitraatide redutseerimise määr 0, 68-lt 1, 48 mmol-ni. päevas, mis on kooskõlas reaktsiooni stöhhiomeetriaga (meetodite reaktsioonid 1–3). Nitraat on ka anammoksi reaktsiooni (reaktsioon 1) kõrvalsaadus ja seega oli nitraatide näiline eemaldamise kiirus madalam kui DAMO organismide tegelik nitraatide vähendamise määr (reaktsioon 3).

Mikroobse koosluse molekulaarne iseloomustamine nitraatidega toidetud reaktoris viidi läbi, kasutades FISH ja 16S rRNA geeni amplikoni järjestamist. Algselt olid bioreaktoris domineerivateks mikroorganismideks M. nitroreducens , M. oxyfera ja anammox bakterid ( Kueneniaceae ) (joonis 2a). M. oxyfera populatsioon vähenes pärast anammoksi aktiivsuse algust (33. päev) ja pärast seda, kui päeva 100 enam tuvastada ei saanud (joonis 2b). Uuringu hilisemas etapis (päev 259) domineeris mudakoosluses M. nitroreducens (~ 70%; joonis 2b). Day 259 bioreaktoriproovist saadud 16S rRNA geeni amplikoni järjestuste analüüs kinnitas, et M. nitroreducens moodustasid ~ 71% kogukonnast ja M. oxyfera enam süsteemis ei olnud (avastamispiir: 0, 02%) (joonis 2c). Järjestuse määramise tulemused näitasid ka, et Kueneniaceae moodustas kogukonnast vaid 0, 6%, mis oli palju madalam kui FISH-piltide visuaalse uurimise hinnanguline protsent (joonis 2b). Selle lahknevuse üks võimalik seletus on see, et 16S praimerikomplekt (926F ja 1392R), mida kasutatakse amplikonide järjestamiseks eelistatult võimendatud konkreetsete liinide võrreldes teistega, nagu varem oli teatatud 14, 15, hõlmas seega vähem kui anammoksi-spetsiifiline AMX-820. Teisel DNA-proovil, mis koguti 360. päeval ja seejärel sekveneeriti, ilmnes sarnane mikroobikoosluse struktuur, kus M. nitroreducens ja Kueneniaceae moodustasid vastavalt 78% ja 0, 7% kogukonnast, samas kui M.xyfera jäi avastamata. Kuigi mikroobikooslus muutus oluliselt, oli selle reaktori VSS kontsentratsioon kogu katse jooksul stabiilne, umbes 1, 1 g / l. Stabiilne VSS kontsentratsioon kogu eksperimendi kohta viitab sellele, et biomassi süntees oli ebaoluline, mis on kooskõlas varasemate aruannetega.

Image

Päeval 0 (a) ja päeval 259 (b) fikseeritud mudaproovide FISH-pildid pärast hübridiseerimist spetsiaalsete sondidega: Cy3 ARC872 M. nitroreducens (punane), Cy5 NC1162 M.xyfera (sinine) ja FITC AMX820 anammoksibakterite jaoks ( roheline). c) Mikroobse kogukonna koostis määrati bioreaktoris järjestamise teel päeval 259.

Täissuuruses pilt

Phycisphaeralesi ja Chloroflexi (mis vastavalt päeval 259 moodustasid vastavalt 11% ja 6% kogukonnast ja päeva 360 valimis sarnastel tasemetel) roll tuleb veel välja selgitada. Phycisphaerales on varem leitud anammoxi reaktoritest, kuigi puuduvad selged tõendid selle kohta, et see rühm oleks võimeline anammoxi reaktsiooni läbi viima. Kloorofleksiid tuvastati varem M. oxyfera rikastamises 16 ja AOM kultuuris, mis vähendas mangaani ja rauda 17 .

Nitritiga toidetud reaktor

Pärast inokuleerimist suurendati nitritite laadimiskiirust järk-järgult 0, 75 mmol / d-lt 2, 74 mmol / d-ni 18 päeva jooksul, ilma et nitritid akumuleeruksid kultuuris (joonis 3b). Nii DAMO kui ka anammoksi aktiivsust täheldati metaani, ammooniumi ja nitriti tarbimisest ning lämmastiku gaasi tootmisest (joonis 3). Inokulaadis sisalduva ja anammoksi poolt toodetud nitraadi elimineerimiseks vähendati nitriitide sisaldust 57. päeval 2, 29 mmol / d-ni, et vähendada nitraaditootmist anammoxi poolt. Muutuste tulemuseks oli 83. päevaks kogunenud nitraadi täielik tarbimine. Päevade 118–198 vahel kogunes nitraat siiski uuesti, põhjustega, mida arutada edasi. Dilämmastikoksiid oli kogu uuringuperioodi jooksul allpool avastamistaset (0, 7 μM) (andmeid ei esitatud).

Image

punktid a ja b: metaani tarbimine (

Image

), ammoonium (

Image

) ja nitraat (

Image

) ja lämmastiku tootmine (

Image

). Nitriti (-) laadimiskiirus oli püsiv alates 57. päevast, välja arvatud päevade 230 kuni 234 vahel, kus partiikatsete ajal lisati nitraat ja nitrit käsitsi (andmeid pole näidatud). c): NO 2 vähendamise määr anammoxi poolt (

Image

, r anammox ), NO 2 - DAMO redutseerimise määr (

Image

, r DAMO-nitrit ) ja NO 3 - vähendamise määr DAMO poolt (

Image

, r DAMO-nitraat ), arvutatud vedeliku faasi mõõtmiste ja reaktsiooni stöhhiomeetria põhjal.

Täissuuruses pilt

R anammoksi, r DAMO-nitriti ja r DAMO-nitraadi (arvutatud nitraadi, nitriti ja ammooniumi profiilide põhjal) areng on toodud joonisel 3c. Päevade 18 ja 78 vahel oli reaktori jõudlus suhteliselt stabiilne. Nitriti tarbimise määr anammoxi poolt oli umbes 2, 0 mmol / d, mis on madalam kui nitriti laadimiskiirus (2, 74 mmol / d päevade 18 ja 54 vahel ja seejärel 2, 29 mmol / d), mis viitab sellele, et DAMO eemaldas osa lisatud nitrititest ka. DAMO nitrititarbimise määr arvutati tõepoolest umbes 1, 0 mmol / d, mis hõlmab mitte ainult osa väljastpoolt tarnitavast nitritist ja ka seda, mis saadakse DAMO nitraatide redutseerimisel.

Pärast seda (75. päev) vähenes DAMO nitrititarbimise määr aeglaselt, samaaegselt anammoksi aktiivsuse suurenemisega. Stabiilse nitraaditarbimise määraga DAMO poolt vähenes metaani oksüdatsioonikiirus vahemikus ~ 0, 5 kuni 0, 12 mmol / d. Pärast 125. päeva tundus, et DAMO vähendas nitriti tähtsust, anammoksiga eemaldades kogu saadaoleva nitriti. Pange tähele, et anammox ei tarbinud mitte ainult kogu lisatud nitritit, vaid ka nitritit, mida M. nitroreducens tootis nitraadi redutseerimise teel, mis on anammoxi aktiivsuse kõrvalsaadus. Järelikult oli r anammox nitritite laadimiskiirusest kõrgem. Suurenenud anammoksi aktiivsus tekitas päevast 118 kuni 160 päevani nitraate, mis ületas DAMO (r DAMO-nitraat ) nitraatide tarbimise määra, mille tulemuseks oli nitraatide kogunemine sel perioodil. Seejärel suurenes DAMO organismide nitraatide redutseerimise kiirus (joonis 3c) ja akumuleerunud nitraat eemaldati aeglaselt (joonis 3b). Alates 216. päevast saavutati püsiseisund. Anammox tarbis kogu väljastpoolt tarnitud ja DAMO toodetud nitritit, DAMO organismid aga elasid anammoxi bakterite toodetud nitraadis.

Mikrobioloogiline analüüs FISH-iga näitas, et mikroobide kooslus muutus uuringu käigus oluliselt (joonis 4). NC10 bakteripopulatsioon vähenes aeglaselt pärast anammoksi aktiivsuse suurenemist ja muutus alates 219. päevast tuvastamatuks. Samal ajal püsis M. nitroreducens madalal, kuid stabiilsel tasemel. M. nitroreducensi klastrid muutusid aja jooksul suuremaks ja uuringu lõpus olid nad ümbritsetud anammoksibakteritega (joonised 4a ja 4b), mis viitab sünergistlikule koostoimele kahe populatsiooni vahel. Päeva 259 proovist saadud 16S rRNA geeni amplikoni järjestuste analüüs näitas, et mikroobikooslus koosnes liikmetest, mis sarnanesid nitraatidega toidetud reaktorile, kuid suurema mitmekesisusega. Kooskõlas FISH-i tulemustega ei olnud M. oxyfera enam süsteemis (joonis 4c). M. nitroreducens moodustas ~ 26% kogukonnast, mis viitab selle võimalikule rollile anammoksi reaktsioonil tekkiva nitraadi eemaldamisel. Kueneniaceae moodustasid umbes 2, 6% kogukonnast, kuid Kuenenia- spetsiifilist AMX-820 kasutava sondi FISH näitas, et suurem osa kogukonnast märgistati sondiga (joonis 4b). Nagu varem mainitud, võis see lahknevus ilmneda praimeri eelarvamustest. Sarnaselt nitraatidega toidetud reaktorile leiti ka Phycisphaerales , Chloroflexi ja Proteobacteria olulisel tasemel, moodustades vastavalt 12%, 15% ja 21% kogukonnast. Päeval 360 kogutud teine ​​DNA proov näitas sarnast mikroobse koosluse struktuuri (andmeid pole näidatud). Selle reaktori VSS kontsentratsioon oli kogu uuringu vältel stabiilne umbes 1, 1 g / l.

Image

Päeval 0 (a) ja 259 (b) fikseeritud mudaproovide FISH-pildid pärast hübridiseerimist spetsiaalsete sondidega: Cy3 ARC872 M. nitroreducens (punane), Cy5 NC1162 M.xyfera (sinine) ja FITC AMX820 anammox-bakterite jaoks (roheline) ). c) Mikroobse kogukonna koostis määrati nitritega toidetud reaktoris sekveneerimisega päeval 259.

Täissuuruses pilt

Arutelu

Protsessi andmed viitavad kindlalt sellele, et mõlemas reaktoris vastutasid lämmastiku ja süsiniku muundamise eest DAMO ja anammoksi protsessid ühiselt. Sõltumata oksüdeerunud lämmastiku vormidest (nitraat vs nitrit) söödas, vastutas M. nitroreducens nitraatide redutseerimise eest nitrititeks ja anammoksi protsessi eest nitritite redutseerimise, kui püsiseisundid saavutati. Seda järeldust toetasid mikroobide kogukonna andmed, mis näitasid, et M. nitroreducens , mis suutis redutseerida nitraatidest nitrititeks metaani kui elektronidoonorina 9, oli mõlemas reaktoris rikkalikult, samas kui M. oxyfera , mis oli võimeline redutseerima nitritit lämmastiku gaasiks koos metaani kui elektronidoonorit 7, püsikontsentratsiooni ühendites ei olnud. Samuti leiti mõlemast kooslusest tuntud anammoksibakter Kueneniaceae, hoolimata selle suhteliselt madalast arvukusest, mis viitas muude anammoksiorganismide võimalikule esinemisele.

Mõlema reakatori inokulaadis oli M. oxyfera märkimisväärses arvukuses (hinnanguliselt ~ 20% kogukonnast). Hüpotees on, et M. oxyfera kadus mõlemast kultuurist, kuna seda konkureerisid anammoksibakterid ja M. nitroreducens . Nitrit on nii M.xyfera kui ka anammoxi bakterite peamine substraat. Kuigi nii M.xyfera kui ka anammoxi bakteritel on madal afiinsuskonstant nitriti 5, 18 suhtes, olid kirjanduses anammoxi bakterite poolt avaldatud nitriti tarbimise määrad palju kõrgemad kui M. oxyfera puhul . Varasemad uuringud on ka näidanud, et M. nitroreducens sisaldavate DAMO kultuuride nitraadid on redutseeritavad palju kõrgema kiirusega kui DAMO kultuuride puhul, mis sisaldavad ainult M. oxyfera 8, mis viitab sellele, et M.xyfera ei suuda vähendada nitraati 7 või on selle nitraatide vähendamise kiirus tõenäoline olema palju madalam kui M. nitroreducens .

Praeguse uuringu tulemuste ja kirjanduses kättesaadava teabe põhjal oleme välja pakkunud hüpoteetilise kontseptuaalse mudeli, mis näitab DAMO ja anammoksi mikroorganismide võimalikku koostoimet ammooniumi ja metaani rikkas anoksilises keskkonnas, kus nitraat või nitrit on väliselt tarnitud (joonis 5). . Skeemil lisasime DAMO protsessi nitritist gaasiliseks gaasiliseks võimaluseks, kuna see toimus mõlemas reaktoris mööduvatel perioodidel. Samuti tuleks rõhutada, et meie arusaam DAMO arhaea ja bakterite kasvu kineetikast ning nende konkurentsi reguleerivatest keskkonnateguritest on praegu väga piiratud ja seetõttu ei saa välistada, et M. oxyfera võib moodustada kogukond keskkonnatingimustes, mis erinevad selles töös kasutatud tingimustest. Tõepoolest, hiljutine uuring näitas, et M. oxyfera eksisteerib koos M. nitroreducens ja anammox bakteritega MBfR reaktoris, kus ammoonium / nitraat ja metaan kanti vastasdifusiooni teel biokile 13 .

Image

Materjali voog ja elektronide vool on näidatud vastavalt tahke ja katkendliku joonega.

Täissuuruses pilt

Selle uuringu järeldused võivad olulisel määral mõjutada lämmastiku ja süsiniku muundamist looduskeskkonnas. Mõnes looduskeskkonnas, näiteks veekogudel, kus talud saavad toitainerikkaid vette, võivad nitraadid ja ammoonium veekogus kokku puutuda settes toodetud metaaniga. Kuna nitraat on peamine oksüdeeritud lämmastikuühend, võib M. nitroreducens olla üks denitrifitseerivatest mikroorganismidest, mis redutseerib nitraadi nitritiks ja saab anammoksibakterite partneriks. Anammoxi ja DAMO protsesside koostöö võib nendes keskkondades oluliselt mõjutada süsiniku ja lämmastiku muundamist. Looduslikes süsteemides selle interaktsiooni edaspidistes uuringutes on vaja isotoopjälgimismeetodit, kuna oodata on eriti madalat reaktsiooni.

M. nitroreducens ja anammox bakterite ühiskultuuri saab potentsiaalselt kasutada reovee puhastamiseks. Anammoxi protsessi kasutatakse juba täies ulatuses lämmastiku eemaldamiseks reoveest 1 . Nitraati toodetakse siiski kõrvalsaadusena, mis kogu denitrifikatsiooniprotsessi läbiviimiseks vajab järeltöötlust. Mõnel teisel juhul võib söödas koos ammooniumi ja nitritiga olla ka nitraate. See uuring näitab, et DAMO ja anammoksi protsesse saab ühendada ühes reaktoris, et samaaegselt eemaldada nitraat ja ammoonium, täiendava elektronidoonorina metaan. See on eriti atraktiivne, kuna metaani saab reoveepuhastusjaamas toota anaeroobse reovee või muda kääritamise kaudu 19 . DAMO ja anammoksiorganismide ühiskultuuri kasutamise teostatavust reoveepuhastuses on hiljuti uuritud 14 . Selles uuringus kasutatud kaaskultuur sisaldas aga M.xyfera ja anammoxi baktereid, mis ei eemalda nitraati ja mis ei pruugi tegelikult olla stabiilne, kui ammooniumisisaldus on üle 14 . Selle protsessi jaoks sobivam kandidaat oleks M. nitroreducens ja anammox bakterid. Tulevaste uuringute peamine väljakutse on reageerimiskiiruse suurendamine, et see vastaks tööstusliku rakenduse vajadustele. Siin saadud denitrifikatsiooni määr on umbes 20 mgN / gVSS.d, mis on suurusjärgu võrra madalam kui metanooli 20 korral saavutatav denitrifikatsiooni määr. Teine tulevaste uuringute väljakutse on biomassi kasvatamine lühikese aja jooksul, kuna mõlemad mikroorganismid on tuntud aeglased kasvatajad.

Käesoleva uuringu tulemused näitasid, et meie arusaam DAMO organismidest ja nende võimalikust koostoimes teiste mikroobirühmadega pole kaugeltki täielik. DAMO ja anammoksi mikroorganismide vahelist sünkroofilist suhet tuleks täiendavalt uurida, et mõista selle mõju lämmastiku ja süsiniku tsüklitele looduskeskkonnas. Samuti tuleb veel uurida DAMO organismide ja teiste mikroobirühmade, näiteks nitritite / nitraatide tootjate / redutseerijate, võimalikku koostoimet.

Meetodid

Inokula

Laboratoorses mõõtkavas anammoksi / DAMO reaktorist võeti 800 ml rikastuskultuuriproov, millele lisati ammooniumi, nitritit ja metaani ning mida kasutati temperatuuril 35 ° C. Proovide võtmise ajal oli nitritite laadimiskiirus umbes 1, 4 mmol / Ld ja VSS kontsentratsioon oli ~ 1, 2 g VSS / L. FISH analüüs näitas, et umbes 40% mikroobipopulatsioonist olid anammoksibakterid ( Kueneniaceae ) ja ~ 20% olid M.xyferaga seotud bakterid. Selles mudas arhaea ei tuvastatud. Veel 800 ml mudaproov võeti teisest bioreaktorist, mida toideti nitraadi ja metaaniga 8 . Proovide võtmise ajal oli nitraadi tarbimise määr ~ 1, 1 mmol / Ld ja VSS kontsentratsioon oli ~ 1, 0 g VSS / L. FISH analüüs näitas, et ~ 60% selle kultuuri mikroobipopulatsioonidest olid arheeaga seotud M. nitroreducensiga ja 30% olid M.xyferaga seotud bakterid. Ülalnimetatud mikroorganismide sihtimiseks kasutatavad spetsiifilised sondid leiate jaotisest FISH .

Reaktori töö

Kahe mudaproovi segamisel saadud 1, 6-liitrine inokulaat jaotati võrdselt kahte 2-liitrisesse klaasreaktorisse, millest mõlemale lisati 1, 6-liitrine töömaht 800 ml mineraalkeskkonna lahusega, mis oli valmistatud vastavalt Raghoebarsing et al 6 . Reaktorid olid varustatud vesivoodiga ja töötasid temperatuuril 35 ° C ning neid segati pidevalt magnetsegistidega kiirusel 200 p / min. Metaani saamiseks süsiniku- ja energiaallikana kasutati segatud gaasi (90% CH4, 5% N 2 ja 5% CO 2 ) iga reaktori 0, 4 L pearuumi korrapäraseks loputamiseks, et hoida metaani osarõhk vahemikus 0, 5 atm ja 1 atm. Pärast iga loputamist süstiti pearuumi heelium (~ 80 ml), et suurendada rõhku umbes 1, 2 atm-ni ja selle osarõhku jälgiti, et kinnitada, et gaasi leket ei toimunud.

Nitraadiga toidetud reaktori jaoks süstiti igal nädalal nitraadi ja ammooniumi põhilahuseid (nitraat 5, 7 M ja ammoonium 3, 4 M juures), et pärast iga süstimist saavutataks ~ 15 mmol / L. Need põhilahused valmistati degaseerimata milli-Q veega ja säilitati suletud lämmastiku atmosfääri pudelites.

Nitritiga toidetud reaktori jaoks juhiti nitriti akumuleerumise ja seega selle võimaliku toksilise mõju 21 vältimiseks poolhaaval 1 ml kontsentreeritud nitritit, varieerudes iga päev päevase kiirusega, mida tuleb täpsustada tulemuste jaotises. Söötmispump lülitati sisse 1 minutiks iga 72 minuti järel, andes nitriti etteande iga päev 20 impulsina. Ammooniumit lisati iganädalaselt kontsentreeritud põhilahuse (3, 4 M) süstimisega, et saada pärast iga süstimist ammooniumi kontsentratsioon ~ 15 mmol / l.

Iga nelja nädala järel lasti kultuuridel 20 minutit settida ja 400 ml supernatanti igast reaktorist vahetati värske söötmega. Reaktorite pH-d jälgiti pH-sondidega (TPS, Austraalia) ja kontrolliti vahemikus 7, 0 kuni 7, 5, lisades käsitsi 1 M HCl lahust. Bioreaktorid töötasid ühe aasta, mille jooksul uuriti mikroobide kooslusi FISH-iga ja sekveneerimisega ning nende aktiivsust kvantifitseeriti metaani, nitraadi, nitriti ja ammooniumi tarbimise ning lämmastikugaasi produktsiooni mõõtmisega, nagu allpool täpsemalt kirjeldatakse.

Reaktori jälgimine

Nitraadi, nitriti ja VSS analüüs

Igast tööpäevast võeti igast reaktorist vedelaid proove, et jälgida biotransformatsiooni protsesse reaktoris. Vedelad proovid (1 ml) filtriti 0, 5 ml filtraadi saamiseks 0, 22 μm filtritega. Ammooniumi (NH4 + ), nitraadi (NO 3 - ) ja nitriti (NO 2 - ) kontsentratsioone analüüsiti Lachat QuickChem8000 vooluinjektsiooni analüsaatori abil (Lachat Instrument, Milwaukee, WI). Ammooniumi (NH 4 + ), nitraadi (NO 3 - ) ja nitriti (NO 2 - ) tarbimismäärad, mida tähistatakse vastavalt kui rNH4 +, rNO 2 -, rNO 3 -, määrati vastavate kontsentratsiooniprofiilide abil lineaarse regressiooni abil. Samuti võeti reaktorist igakuiselt 5–10 ml vedelaid proove, et APHA standardmeetodeid järgides mõõta VSS kontsentratsiooni igas reaktoris.

Gaasiliste lämmastikuühendite ja metaani analüüs

Perioodiliselt (teisipäevast reedeni) võeti 0, 5 ml gaasiproovid gaasikindla klaasist süstlaga (Sge, Austraalia) läbi kummiseptikate reaktorite kohal. Gaasilämmastikku, metaani ja heeliumi mõõdeti gaasikromatograafiga (Shimazu, Jaapan), mis oli varustatud Porapak Q kolonniga ja temperatuuril 160 ° C töötava soojusjuhtivuse detektoriga, nagu eelnevalt kirjeldatud 8 . Vedelas faasis olevat N2O mõõdeti N2O mikrosensoriga (N2O25, Unisense A / S, Aarhus, Taani) avastamispiiriga 0, 7 μM. Metaani tarbimise ja lämmastiku gaasi tootmise kiirused, mida tähistatakse vastavalt rCH4 ja rN2, määrati mõõdetud metaani ja lämmastiku gaasiprofiilide abil lineaarse regressiooni abil.

Reaktsioonide määratlus ja reaktsioonikiiruste arvutamine

Süsiniku ja lämmastiku muundamise kirjeldamiseks reaktorites kasutatakse järgmisi reaktsioone:

Image

(nitriti redutseerimine anammoxi abil, reaktsioonikiirus r anammoxi toimel )

Image

(nitriti redutseerimine DAMO abil, reaktsioonikiirus r DAMO-nitrit )

Image

(nitraatide redutseerimine DAMO abil, reaktsioonikiirus r DAMO-nitraat )

Reaktsioonikiirused r anammox, r DAMO-nitrit, r DAMO-nitraat arvutati mõõdetud ammooniumi tarbimiskiiruse (rNH 4 + ), nitriti kogunemiskiiruse (rNO 2 - ) ja nitraadi tarbimismäära (rNO 3 - ) põhjal järgmiselt: massitasakaalu võrrandid:

Image

Image

Image

r anammox, r DAMO-nitrit ja r DAMO-nitraat, mis on määratud ekvivalendist . Seejärel võimaldasid 4–6 arvutada lämmastiku gaasi eeldatava tootmise (rN 2- p) ja metaani tarbimise kiiruse (rCH 4- p) (ekv 7–8), mida hiljem võrreldi mõõdetud rN 2 ja rCH 4 väärtused kontrollimise eesmärgil.

Image

Image

Mikroobse kogukonna seire

KALA

Igal kuul võeti kultuurist võetud biomassist proovid, need fikseeriti, säilitati ja hübridiseeriti FISH jaoks nagu eespool kirjeldatud 8 . Järgmised sondid hübridiseeriti bioreaktoriproovidega, kasutades 40% formamiidi: S - * - NC10-1162-aA-18 (5'-GCCTTCCTCCAGCTTGACGCTG-3 ') NC10 bakterite 8, S - * - Amx-820-aA-18 ( 5′-AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3 ′) anammoksibakterite 22, S - * - Darc-872-aA-18 (5′-GGCTCCACCCGTTGTAGT-3 ′) jaoks DAMO archaea 6, üldise bakteriaalse sondi EUBmix ja üldise arheoloogilise sondiga Arch-0915-aA-20. Fülogeneetiliste rühmade protsent kvantifitseeriti 30 pildi põhjal, mis tehti igast süvendist DAIME tarkvara abil, nagu eespool kirjeldatud 21 .

Nukleiinhappe ekstraheerimine ja 16S rRNA geeni amplikoni järjestamine

Genoomne DNA ekstraheeriti reaktorite kogukonna proovidest, kasutades FastDNA SPIN for Soil kit (MP Biomedicals, USA) ja Fastprep beadbeating masinat (Bio101, USA) vastavalt tootja protokollile. 16S rRNA geen amplifitseeriti ja järjestati vastavalt eelnevalt kirjeldatule 9 . Lühidalt, amplikonide genereerimiseks kasutati laia spetsiifilisusega oligonukleotiidseid praimereid 926F (5′-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3 ') ja 1392R (5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3'), mis sisaldasid multipleksseid identifikaatoreid ja LibL-i adapterjärjestusi (pole näidatud). Amplikonid sekveneeriti genoomi sekvenatori FLX Titanium sekveneeriga (Roche, USA).

Järjestuste analüüs

Pürotagmi järjestusi töödeldi ja analüüsiti Pyrotaggeri abil, mida on kirjeldanud Kunin ja Hugenholtz 23 . Lühidalt eemaldati vöötkoodid ja amplikoni praimerijärjestused ning loendite otsad lõigati LUCY 9- ga nende kvaliteediväärtuste põhjal. Lugemid koondati Markovi klastri algoritmi abil 97% nukleotiidide sarnasuse juurde. Klastri tüüpilised järjestused määrati taksonoomiliselt, võrreldes Greengenes'i andmebaasi blastn 24 abil . Bellerophon 14 abil tuvastatud võimalikud kimäärsed järjestused jäeti edasisest analüüsist välja. Pyrotagger koostas OTU tabeli, mis näitab suhtelist arvukust ja taksonoomilisi jaotusi.

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.