Substraati puudutavate rakkude kineetiline käitumine: pindade jäikus juhib rakkude levikut | teaduslikud aruanded

Substraati puudutavate rakkude kineetiline käitumine: pindade jäikus juhib rakkude levikut | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Bioloogiline füüsika
  • Biomaterjalid - rakud
  • Rakuväline maatriks
  • Kineetika
  • Selle artikli Erratum avaldati 7. juulil 2014

Seda artiklit on värskendatud

Abstraktne

Substraadi jäikuse mõjul laialivalguvate rakkude üksikasjaliku käitumise kirjeldamiseks jälgiti in situ A549 rakke polüdimetüülsiloksaani (PDMS) ja polüakrüülamiidi (PAAm) pindadel, mille puistejäikus oli vahemikus 0, 1 kPa kuni 40 kPa. Rakkude hajumiskäitumine PAAm-ga esitas positiivse korrelatsiooni levimiskiiruse ja substraadi jäikuse vahel. Pärast PAAm-geelide ja kollageeni deformatsioonide väljaarvutamist määras rakkude käitumise PAA-de põhiosa jäikus, mitte maatriksi lõastamine. Teisest küljest ei mõjutanud PDMS puistejäikuse varieerimine rakkude hajutamiskäitumist. Simulatsioonianalüüside põhjal domineeris ultraviolettkiirguse poolt PDMS-pinnaga indutseeritud ränidioksiidilaadse kihi elastsus raku ja substraadi koostoimes, mitte aga materjali jäikus, mis näitab, et raku levikut juhtis peamiselt pinnavaheline jäikus. Ja siis modelleeriti rakkude levimise kineetika esimest korda absoluutkiiruse teooria põhjal.

Sissejuhatus

Rakkude ja neid ümbritseva substraadi (rakuväline maatriks, ECM) interaktsioonid kutsuvad esile mitmeid reaktsioone, millel on oluline roll nende käitumise ja saatuse reguleerimisel 1 . Kuna ECM pakub rakkude kinnituspunktidele füüsilist tuge ja vastutab keskkonnasignaalide edastamise eest rakku, on raku-ECM-i bioliides raku elu hädavajalik osa. Seega saab rakk tajuda ja reageerida mitmesugustele välistele signaalidele, sealhulgas liidese keemiale, topograafiale ja mehaanikale, mis muudab selle morfoloogia, dünaamika, käitumise ja funktsiooni 2 . Selle pinna keemilise ja topograafilise mustri uurimisel oleme juba teada, et rakud reageerivad pinnakeemia muutustele erinevalt ja suudavad eristada mõne aminohappe valke või isegi peptiide 3 . Rakkude liikumise suundjuhtimist etteantud radadel saab teostada asümmeetriliste raku kleepuvate saarte 4 mikrokiiretel. Viimastel aastatel on muutunud üha selgemaks, et raku reageerimine keskkonnasignaalidele ületab kaugelt raku võimet pinnakeemiat ja topograafiat ning seetõttu on rõhuasetus keskendunud bioliidese mehaanikale, eriti maatriksi jäikusele 5, 6, 7 Lisaks näitas hiljuti väljatöötatud multidistsiplinaarne uuring vastavalt biometenofamarkoloogia põhimõttele 8, 9, et substraadi jäikus võib mõjutada ka selliste rakkude nagu vähirakud reageerimist ravimitele 10 .

Jäikuse tuvastamise protsessi, st rakud tunnetavad ümbritseva keskkonna mehaanilisi omadusi seda tõmmates ja lükates ning kandes vastusena jõu biokeemilisteks signaalideks, nimetatakse mehaaniliseks transduktsiooniks. Mehaanilise transduktsiooni protsessi on oluline mõista, kuna see seos aitab säilitada pingelist homöostaasi ning normaalset kudede struktuuri ja funktsiooni 11, 12, 13, nagu eespool mainitud. Kuna nende protsesside keerukus on hirmutav, on meie mõistmine alles lapsekingades.

Rakkude levik on kineetiline protsess, mis järgneb adhesioonisündmustele pärast raku kokkupuudet substraadiga, mis on hea prototüüp raku ja substraadi interaktsioonide lihtsustamiseks 14 . Substraadi jäikuse mõju rakkude käitumisele ja selle aluseks oleva füüsikalise mehhanismi uurimiseks valisime kahte tüüpi kunstlikku substraati, st PAAm ja PDMS, mis oli modifitseeritud kollageen I abil. Siin on erineva jäikusega PAAm alati erineva poorse võrgustruktuuriga. Seevastu sama ränidioksiidilaadse kihi jäikus PDMS-i pinnal põhjustab tõesti ultraviolettkiirgust, hoolimata sellest, kui pehme on PDMS-i põhiosa. Viidi läbi rakkude leviku käitumise kohapealne vaatlus ja uuriti vastavalt selgitusi, enamasti teoreetiliselt.

Tulemused

Rakkude leviku membraani pikendamise ja mastaapimise seaduse iseloomustus

Rakkude levik, mis hõlmab aktiinist sõltuvaid membraani pikendusi ja integriini vahendatud adhesioone, on raku ja substraadi vahelise tiheda kontakti algprotsess. Selle dünaamilise protsessi ilmne omadus on 2-D pinna kontaktpindade variatsioonid. Siin kasutasime kontaktpiirkonna paljastamiseks DIC-mikroskoopiat ja arvutasime kontaktpinna muutused submikroni ja teise täpsusega. Joonisel fig 1b näidatud kiirväljaga piltide aegrida näitab, et kontaktpinnad suurenevad aja jooksul levimistesti ajal. Kui rakk esimest korda substraadiga kokku puutub, muutub see töötlemata sfäärist paksu ketta pinnale ja võtab selle protsessi käigus vastu signaali ligandatud integriinidest. Konkurents kahe membraaniliikumise vahel, aktiini polümerisatsioonist ajukoores põhjustatud pikendus ja müosiini kokkutõmbumise ning membraani pinge tõttu tagasiulatuv vool, domineerib piirkonna variatsioonides 15 . Sarnaselt anisotroopse levikuga 14 on filopodia poolt toetatud pikendused ebaregulaarsed paljude stohhastiliste mööduvate pikendusperioodidega (STEP). Rakkude levikuala, laialt kasutatavat statistikat tsütoskeleti regulatsioonis 16 oleva konkreetse molekuli või haigusseisundi rolli kindlaksmääramisel aja funktsioonina kirjeldab hästi sigmoidkõver 17 . Seda sigmoidset kõverat saab kohandada võimsuse eksponentsiaalse funktsiooniga (joonis 1c); seetõttu iseloomustab raku levimist skaleerimisseadus R ~ t α . Võimsusseaduse skaleerimistegur α on universaalne ja mõõtmeteta parameeter ning see on parem rakkude hajumise kineetika kirjeldamiseks kui muud mõõtmete parameetrid, näiteks raku servakiirused. Rakkude leviku käitumine on analoogne tilkade levitamisega 18, kuigi selle aluseks olev mehhanism on täiesti erinev.

Image

a) Lahtrite pindala arvutamise sammud. Vasakult paremale: originaalne DIC-pilt, serva tuvastamine, läve optimeerimine, augu täitmine müra eemaldamisega. b) Rakkude leviku ajaline registreerimine esimese 20 minuti jooksul. c) Suhteline kontaktraadius aja funktsioonina. Seda suhet sobivad hästi jõuseadused. Skaalariba: 10 μm.

Täissuuruses pilt

PAAm ja PDMS substraatide jäikuse mõju rakkude levikule

ECMi mehaanilised omadused, eriti selle elastsusmooduliga määratletud jäikus (“jäik jäikus”), mängivad olulist rolli paljude rakutüüpide käitumise reguleerimisel nii in vitro kui ka in vivo . Tuginedes nende reageeringule substraatide jäikusele, saab rakuliinid jagada kahte kategooriasse: „jäikusest sõltuvad” (need, millel on selgelt erinev raku käitumine, erineva aluspinna jäikusega) ja „jäikusest sõltumatud” (need, mis on võrdsed mõlemal pehmed ja jäigad aluspinnad) 7 . Kuna jäikus on materjali olemuslik kogus, on huvitav leida, et A549 rakkude hajumiskäitumine näitas samas jäikuse vahemikus PAAm-ist sõltuvat jäikust ja PDMS-ist jäikust sõltumatut.

Nagu on näidatud joonisel 2 ja filmis Sl, avaldasid A549 rakud PAAm substraatidel selget vastust. PAAm-l varieerus A549 rakkude morfoloogia 1200 s pärast külvamist vastusena substraadi jäikuse muutumisele. Ümardatud, peaaegu sfäärilised rakud, kus pehmel geelil 0, 3 kPa on näha väheseid ebakorrapäraseid membraanide väljaulatuvaid osi, on terav kontrast lamedatele, suurtele hajutatud rakkudele, millel on ilmsed eendid kangeimatel geelidel 32, 6 kPa. Rakud, mis külvati geelidele keskmise jäikusega 2, 3 kPa, näitasid käitumist vahepeal. Rakkude prognoositavad alad pärast 20-minutist külvamist suurenesid substraadi jäikuse suurenemisega, näiteks suurenesid 326 ± 67 μm 2 (n = 17) pehmel substraadil 479 ± 196 μm 2 (n = 21) jäiga substraadi korral. Rakkude projitseeritud pindala geelidel 2, 3 kPa oli 442 ± 106 μm 2 (n = 23), mis asub keskel. Pealegi näitasid jäigematel substraatidel olevad rakud levimisprotsessis rohkem membraani eendeid, samal ajal kui need pehmete substraatide pikendused tõmbusid kiiresti tagasi ega aidanud kaasa rakualade kasvule. Nagu ülaltoodud jaotises kirjeldati, kasutati membraani pikenduse kiiruste iseloomustamiseks ja selle levimisdünaamika kvantifitseerimiseks üldist parameetrit, “mastaabisüsteemi tegurit α ”. Eksperimentaalsetele andmetele tuginedes on jäiga substraadi ketendusteguri kõrgem väärtus 0, 079 ± 0, 035, mis tähendab, et rakud levivad kiiremini. Pehme ja vahepealse substraadi ketendusteguri tegurid on vastavalt 0, 017 ± 0, 011 ja 0, 048 ± 0, 018. Ülaltoodud tulemused näitavad, et rakkude levimiskiirus suureneb jäikuse suurenemisega.

Image

a) Erinevatel substraatidel rakkude leviku aeglane registreerimine. Lamellipodia või filopodia pikendused sõltuvad substraadi elastsusest. b) Rakkude prognoositavad alad pärast 20-minutist külvamist. Need suurenevad elastsusega. c) rakkude levimise kiirus erinevatel substraatidel. Jäigema substraadi rakud levivad palju kiiremini kui pehme aluspinna rakud. ** p <0, 01, saadud ANOVA ühesuunalise analüüsi abil. Skaalariba: 10 μm.

Täissuuruses pilt

PDMS-i korral ei ilmnenud erineva jäikusega substraatide korral raku morfoloogia ilmseid erinevusi (joonis 3a ja Movie S2). Pehme substraat ei pärssinud rakkude levikut. Isegi 0, 1 kPa substraadil olid rakud tasased, täielikult levinud näilise lamellipodia või filapodiaga, mida ei eristata jäiga substraadil kasvanud rakkudest. Nagu on näidatud joonisel 3b, olid projitseeritud alad pärast 20-minutist kultiveerimist kõigi kolme substraadi korral peaaegu ühesugused, umbes 440 μm 2 (447 ± 132, 413 ± 80, 444 ± 106, jäigast substraadist pehmeni). Laotamiskiiruse analüüsimisel leidsime, et kõigi substraatide mastaabiseadustegurid olid suuresti samad, mis tähendab, et PDMS-i substraatide jäikuse variatsioonidel ei olnud rakkude laotamiskiirusele ilmset mõju (vt joonis 3c). Pehme substraadi mastaabitegur oli 0, 087 ± 0, 026 (n = 15), samas kui vahepealse ja jäiga põhimiku mastaabitegur oli vastavalt 0, 066 ± 0, 020 (n = 15) ja 0, 076 ± 0, 028 (n = 19). PDMS-i skaleerimisteguri väärtused on võrdsed PAAm-i kõige jäigema substraadi väärtustega, mis tähendab, et rakud levivad PDMS-is väga kiiresti.

Image

a) Erinevatel aluspindadel rakkude hajutamise ajaline registreerimine PAAm-iga samas jäikusvahemikus. b) Peaaegu samad prognoositavad alad, millel puuduvad olulised statistilised erinevused. c) Rakud, mis levivad kiiresti nii jäigale kui ka pehmele aluspinnale. Skaalariba: 10 μm.

Täissuuruses pilt

Ränidioksiidilaadne kiht PDMS-i pinnal

Uurimisprotsessis, kuidas PAAm ja PDMS jäikus mõjutavad rakkude käitumist, standardiseerisime kollageeni sidumise meetodi substraadi pinnale, kasutades sama heterobifunktsionaalset valgu ristsildajat, sulfo-SANPAH. See standardimine minimeerib pinna keemiliste omaduste mõju kahe tüüpi substraatide võrdlemisel. Modifikatsiooni ajal on sulfo-SANPAH-s oleva N- hüdroksüsuktsinimiidi estri aktiveerimiseks vaja ultraviolettvalgusallikat, et reageerida kollageeni primaarsete amiinidega. Varasemad uuringud näitasid siiski, et pärast UV-kiirgust 19, 20, 21, 22 tekiks PDMS-i pinnale õhuke ja rabe ränidioksiidilaadne kiht. Meie katsed näitasid ka pinnakihi olemasolu PDMS-is (näidatud joonistel S1, S2 ja S3). Siin kasutasime kõigepealt lõplike elementide meetodil (FEM) ja AFM-i taanetel põhinevat optimeerimismeetodit, et saada pinnakihi mehaanilised omadused (elastsusmoodul ja paksus) ning seejärel kvantitatiivselt määrata ränidioksiidilaadse kihi mõju PDMS-i jäikuse jäikusele aastal FEM.

Pärast optimeerimisprotseduuri leiti, et PDMS-i (60: 1) pinnakihi elastsusmoodul ja paksus on 7, 0 MPa ja 200 nm. Nende tulemuste sobivust kinnitati kvalitatiivselt (kõvera kuju) ja kvantitatiivselt (keskmine viga <5%), kui võrrelda FE loodud jõu-nihke kõverat katseandmetega (joonis 4b). Pinnakihi parameeter PDMS-is (80: 1) on väga sarnane PDMS-i (60: 1) parameetriga (joonis S4). Kuna eelnev kirjandus 22 näitas, et plasma jäigastumine oli PDMS-i erinevates segude segudes sarnane, rakendasime pinnakihi (siin 60: 1) parameetreid PDMS-i muude segude suhetele (80: 1 ja 100: 1).

Image

a) Lõikeelementide treppimise simulatsiooni mudel, mis koosneb taandest ja pinnakihiga PDMS-substraadist. b) AFM-i keskmine kõver ja optimeeritud FE-kõver.

Täissuuruses pilt

Substraat deformeerus jõudude abil, mis kanduvad rakust läbi fokaalse adhesiooni; seetõttu keskendusime raku-substraadi interaktsioonide uurimiseks raku (fookusadhesioonid) ja PDMS-substraadi vahelistes kontaktpiirkonnas olevatele jõududele. Kuna kontaktpiirkonna nihkepinge oli rakkude levimisel väga oluline, võis pinnakihi mõju kvantitatiivselt kajastuda nihkepinges. Optimeeritud parameetri vastuvõtmisel kantakse selle mudeli puitmaterjalidele 40 kPa ränidioksiidilaadne kiht (200 nm), mille moodul on 7, 0 MPa. Nihkepiirangu tingimust 23 kasutatakse rakkude 24 tüve tuvastamise idee põhjal. Kui puiste jäikust varieeriti laias vahemikus, suurenes rakkude rakendatav jõud, samal ajal kui rakkude deformeerumine oli peaaegu sama. Võrreldes jäiga kihiga palja materjaliga on komposiitmaterjali maksimaalsed nihkepinged pinnal kümmekond korda suuremad, suurusjärgus 10 kPa (joonis 5b ja joonis 5e). See tähendab, et kogu materjalide elastsuses domineerib pinnavaheline jäikus. Nagu võib näha jooniselt 5 (c – e), näitab puiste jäikuse muutmine 0, 1 kPa kuni 40 kPa nihkepingetele vähest mõju. See tulemus kinnitab veelgi, et puistematerjalides domineerib ränidioksiidilaadne pind, mis tähendab, et rakkude poolt tajutav “tõeline” elastsus ei ole puiste jäikus ja on sellest palju suurem. See "tõeline" elastsus on tavaliselt väljaspool jäikuse vahemikku, mida rakk võib tunda (joonis. S5). See võib olla põhjus, miks rakud käituvad PDMSi puhul "iseseisvalt jäigalt".

Image

a) PDMS on modelleeritud poolsilindrina (raadiusega 150 μm ja paksusega 60 μm). Kontaktpinda töödeldi poolringina, raadiusega 6 μm, fookuse adhesiooni suuruse lähedal. Kõva pinnakihist ja nõuetele vastavatest puistematerjalidest koosnev mudel tõmmatakse etteantud vahemaa taha. b) Nihkepinge palja PDMS-i pinnal kontaktpuhvri piirkonna kontaktpiirkonnas. Kontaktpiirkond (fokaalse adhesiooni suurus) oli katkendliku poolringi sees. Maksimaalne väärtus oli suurusjärgus 1 kPa. (c – e) Nihkepinge kõva kihiga PDMSi pinnal. Kõva kihi tõttu oli kontaktpiirkonna nihkepinge kümme korda suurem, suurusjärgus 10 kPa. PDMS-i jäikuse muutmine 0, 1 kPa (c) -lt 40 kPa (e) -le ei mõjuta oluliselt pinna nihkepinget. Ühik (b – e): MPa.

Täissuuruses pilt

Milline on raku vastuse peamiseks määrajaks PAAm-le, rakuvälise maatriksi lõastamisele või põhimiku jäikusele?

Mehhaanilise transduktsiooni protsessis tasakaalustatakse rakkude endogeense tsütoskeleti kontraktiilsust ECM-i deformatsioonist tekkivate vastupidavate jõududega, mille suuruse määrab ECM 25 elastsusmoodul. Kuna substraati, näiteks Petri tassi / klaasi / hüdrogeele, kasutatakse sageli ECM-i toetamiseks, kanduvad jõud edasi aluspinnale ja põhjustavad deformatsiooni, kui ECM-i ja põhimiku vahelised ristmikud on piisavalt tugevad. Sel viisil toimivad ECM ja substraat jadasüsteemina, mida rakud tunnetavad ja millele reageerib. Selle süsteemi E * ekvivalentset elastsust saab määrata järgmiselt

Image

kus E C , U C ja E S , U S on vastavalt maatriksi ja põhimiku elastsusmoodul ja Poissoni suhe.

Nagu nähtub võrrandist (1), annab jadasüsteemi komponent, millel on madalam elastsusmooduli väärtus, kogu süsteemi suuremat panust. See tähendab, et pehme osa domineerib süsteemis. Kas see on pehme või mitte, saab hinnata sama koormuse all esineva deformatsiooni ulatuse järgi. Kuna ECM-i võrk on keeruline ja ebastabiilne 26, ignoreerime sageli ECM-i osa mõju ja kogu süsteemi elastsusele viidatakse põhimiku elastsusele. PAAm jaoks on Trappmanni jt pakutud lihtne meetod . loodi ECM elastsuse hindamiseks, mis põhineb poorsel materjalil 27 . Pinnal olevad poorid määravad ECM-i kinnituskohad (joonis S6), mis tähendab, et kovalentsete kinnituspunktide vaheline kaugus on suurema pooride suuruse korral pikem ja väiksema pooride suuruse korral lühem. Kui rakud rakendavad kollageenile tõmbejõudu (meie uurimuses kasutatud ECM), hõlmab mehaaniline tagasiside selle kollageenisegmendi teatud liikumist, mis oli ühendatud substraadi pehme võrguga. Kuna kollageen on poolpainduv polümeer, mille püsivuspikkus on ≥ 15 nm 28, saab kollageeni deformatsiooni saada, modelleerides pinda kinnitavat kollageeni kahe kindla fikseeritud otstega lihtsa tugikiirena (joonis 6). Seejärel määratakse kollageenikiu segmendi läbipaine D C koormuse W (raku poolt avaldatud tõmbejõu) ja kollageenisegmendi iseloomuliku pikkuse L 29 abil :

Image
kus E ′ on kollageeni moodul (mitte E C ), umbes 1 MPa 30 ja I on inertsmoment; ümmarguse kollageenikiu puhul I = πd 4/64 , d on kollageenikiu läbimõõt, umbes 100 nm 31 .

Image

On loodud hindama rakuvälise maatriksi lõastamise ja jäikuse põhitegurit.

Täissuuruses pilt

Kuna PAAm-geele kasutati algselt valkude eraldamiseks geelelektroforeesis, põhjustab ristsildaja erinev tihedus mitte ainult erinevat poorisuurust, vaid ka geelide erinevat jäikust. Selle mudeli korral väheneb kollageeni läbipaine kiiresti, kasvades segmendi pikkust, mis tähendab, et kollageenivõrk muutub pehmemaks, kui ankurdatud substraadil on suuremad pooride suurused. Kuna pooride suurus korreleerus jäikusega 27 pöördvõrdeliselt, tähendab suurem pooride suurus ka geelide väiksemat jäikust. Seetõttu on oluline hinnata kollageenivõrgu rolli ja substraadi jäikust.

Kollageeni poolt ankurdamiskohas tekitatud jõud kanduvad geelidesse ja põhjustavad deformatsiooni. Kuna kollageenikiud on jäigemad kui geelid, võib substraadi deformatsiooni saada mudeli abil, milles jäik, lame varras tõmbab elastse poolruumi. Painde väljendatakse väärtusega 32

Image
100 kPa PAAm korral on L umbes 2, 5 nm. Seejärel saab kollageeni ja PAAm võrdleva deformatsiooni arvutada järgmiselt:
Image
Substraadi deformatsiooni suurusega võrreldes deformeerub kollageenikiud väga vähe ja käitub palju jäigemalt, mis tähendab, et substraadi elastsus on peamine panus kogu süsteemi elastsusesse. Kuna kollageenikiu deformatsiooni määrab substraadi poorne võrk, näitab see ka seda, et võtmeteguriks on geelide jäik jäikus. Sellisel juhul on keskkonna jäikuse iseloomustamiseks piisavalt täpne kasutada substraadi elastsust.

Rakkude leviku teoreetiline mudel

Bioloogilisest aspektist on rakkude levik aktiivne protsess ja ka kiirusprotsess 33 . See hõlmab keerulisi biokeemilisi ja biofüüsikalisi sündmusi, nagu aktiinipõhised membraanilaiendid ja integriini vahendatud adhesioonid (joonis 7). Pidevat pikendust toetavad jätkuvad integriinide sidumised 14 . Seejärel saab ECM keemilised ja füüsikalised signaalid üle kanduda raku sisemistesse valkudesse, mis reguleerivad raku kuju pidevat ümberkujundamist. Ehkki rakud on keerulised biokeemilised automaadid, usume, et rakkude leviku füüsikalisi põhimõtteid saab tabada mikroskoopiliste parameetrite komplekti abil. Siin esitasime teoreetilise mudeli, et kirjeldada seda rakkude leviku omadust.

Image

Aktiini koostise keemilist protsessi mõjutavad integriini-ECM sidumisjõud ja membraanide vastupidavus.

Täissuuruses pilt

Rakupindade suurenemine, mis on põhjustatud membraani pikenemisest, on peamiselt tingitud aktiini polümerisatsioonist membraani perifeerias. Selle protsessi käigus mõjutab integriini-ECM sidumine ja membraanide vastupidavus aktiini polümerisatsiooni keemilist reaktsiooni. Arvestamata filapodia või lamellipodia võrku, uuritakse siin selle mudeli lihtsaima vormina isotroopset levikut 34 . Samuti eirasime korkvalke, tuumavalke ja muid valke, mis toimivad hõõgniitide reaktsioonides 35 . Seega saab rakkude levimise kiirust iseloomustada konkureerimisega polümerisatsiooni ja depolümerisatsiooni kiiruse vahel. Aktiini polümerisatsioon hõlmab G-aktiini monomeeride initsieerimist ja dimeriseerimist, millele järgneb aktiini filamentide paljundamine. Kui initsieerimine ja dimeriseerimine on lihtsuse huvides tähelepanuta jäetud, võib aktiini polümerisatsiooni käsitleda lihtsa bimolekulaarse sidumisreaktsioonina, kus vaba subühik seondub hõõgniidi otsa, mis sisaldab n alaühikut, et tekitada hõõgniit pikkusega n + 13 . Keemilises tasakaalus tasakaalustatakse hõõgniidi otstesse uute subühikute lisamise kiirust subühikute dissotsieerumise kiirusega. Kuni vaba energia on negatiivne, toimub see reaktsioon spontaanselt. Selle sidumisreaktsiooni võrrandit saab kirjutada järgmiselt:

Image
Kuna see keemiline reaktsioon on kiirusprotsess, saab raku levimise 33 skaleerimisseaduse saamiseks ja substraadi jäikuse mõju uurimiseks kasutada absoluutkiiruse teooriat (või siirdeseisundi teooriat). Tasakaalu korral peaks aktiini polümerisatsiooni edasiliikumise sagedus olema sama, mis taanduv sagedus, see tähendab
Image
kus k B on Boltzmanni konstant, T on absoluutne temperatuur, h on Plancki konstant, E a = 14 k B T on sidumisreaktsiooni aktiveerimisenergia 37, p on steeriline tegur 33, umbes 10 −7, kB T / h on põhisagedus, toatemperatuuril on see umbes 10 13 / s, mida saab tähistada ω 0 .

Kui hõõgniidi otsa rakendatakse väliseid jõude, triivib reaktsiooni tasakaal, nii et monomeeri lisamise tõenäosus muutub. Hõõgniidi otsa sõidutöö w korral saab edasiliikumis- ja tagasisagedused kirjutada järgmisel kujul,

Image
Image
Jõujõud muudavad pinna potentsiaalse kaevu sügavust ja muudavad monomeeri kokkupanemise ja lahtivõtmise tõenäosust. Seega saab hõõgniidi kasvu kiirust väljendada kui:
Image
kus δ on üksiku monomeeri iseloomulik pikkus, umbes 2, 7 nm 38 .

Võrrandi (9) lahendamiseks peame hankima sõidutöö w . Eelneva raku leviku mõistmise põhjal koosneb liikumapanev jõud keemilisest energiast, mis vabaneb integriini sidumisel, ja vastupidavusjõust membraani pinge ja membraani deformatsiooni tagajärjel. Sarnaselt elastsel kihil paiknevale lindile saab haardumispiirkonna nihkepinget, mida kontrollib veojõud, saada

Image
kus
Image
on iseloomulik vastastikune pikkus, kus μ a on ECM nihkejõud. E on Youngi A549 rakkude moodul, h E on pinna ja aktiini töö iseloomulik vahemaa, h E ≈ 20 nm ja h a on aktiini tsütoskeleti paksus, h a ≈ 0, 5 μm 39 . Varasemale uuringule 40 viidates on saadud jõud f d adhesiooni ja membraanitakistuse kombinatsioon, st
Image
kus N i on integriinide tihedus 41, umbes 800 / μm 2, 10 kB T on ühe integriini sidumisenergia, γ 0 on membraani algne pinge, 0, 01 pN / nm 42, K on elastse jäikuse koefitsient sidestatud membraani ja tsütoskeleti deformatsioon, 30 pN / nm 43, R on raku raadius, varieerudes ajaga. Kui eeldada, et membraani tipus olevad jõud mängivad juhtivat rolli, kirjutatakse sõidutööga seotud nihkepingeks τ (0) = f d λ a . Võttes arvesse iga monomeeri S keskmist pindala (umbes 0, 01 μm 2 ) 40, võib sõidutööd väljendada järgmiselt:
Image
Sõidutöö avaldise asendamisega võrrandisse (9) kirjutatakse hajuraadiuse ja aja vaheline seos ümber järgmiselt:
Image
Meie puhul on termilise kõikumisega k B T võrreldes sõidutöö w üsna väike ( w / k B T <0, 1). Vastavalt hüperboolse siinusfunktsiooni omadustele me ligikaudsed
Image
lihtsuse huvides. Siis saab võrrandi (13) lahendada järgmiselt
Image
Katseandmete käsitlemisel kasutatakse normaliseeritud raadiusega universaalsete suhete leidmiseks normaliseeritud raadiust ( R '= R ( t ) / R 0 ) ( τ = t / T 0 ). Sel moel on ajaühik meelevaldne, kuna T 0 39 suhtes ei ole mingeid piiranguid. Kasutades esimese järgu Taylori laienemist τ = 1, saame lihtsa lähenduse:
Image
Sel viisil tuletatakse raadiuse ja aja suhte skaleerimisseadus meie biofüüsikalisest mudelist ja saadakse skaleerimise tegurid, mida kasutatakse katse levimiskiiruse iseloomustamiseks. Meie uuringus sisalduva PAAm puhul varieerub substraadi jäikus vahemikus 0, 3 kPa kuni 33 kPa ja skaleerumisteguri saab kui 0, 013, 0, 06 ja 0, 095, asendades muude käesolevas jaotises esitatud koguste väärtused võrrandiga (15). Erinevate PAAm substraatide tüüpilised katseandmed sobivad meie mudeliga hästi (joonis 8). Seega võimaldab see meil uurida ka aluspinna jäikuse mõju ülaltoodud mudelile. PDMS-i korral olid kõigi aluspindade nihkepinged suuremad kui PAAm-i jäiga aluspinna oma. See tähendab, et PDMS-i "tegelik" elastsus on liiga suur ja ületab jäikuse vahemiku, mida rakk võib tajuda. Seega on meie mudeli järgi ennustatud kolme substraadi kõverad identsed ja langevad kokku PAAm jäiga kõveraga (näidatud joonisel S7).

Image

See tulemus on kooskõlas meie katses kasutatud PAA-de tüüpiliste andmetega.

Täissuuruses pilt

Arutelu

Selles uuringus käsitletakse füüsikalist mehhanismi, mis põhineb A549 rakkude hajutamiskäitumisel kahel erineval substraadil, PAAm ja PDMS: skaleerimise seadus, mida raku levimisel järgitakse, ja põhjused, miks rakud eristavad kahte substraati erineva puistejäikusega samas vahemikus. Eksperimentaalsete tähelepanekute ja teoreetilise analüüsi põhjal saime teada, et:

  1. Rakkude hajumiskäitumine PAAm-l kujutab positiivset korrelatsiooni substraadi jäikusega, samas kui rakkude hajumiskäitumist PDMS puistejäikuse muutmine ei mõjuta.

  2. PDMS-i puhul domineerib raku levimisel ränidioksiidilaadse kihi jäikus, mitte selle jäikus.

  3. Võrreldes rakuvälise maatriksi lõastamisega mängib raku käitumise määramisel PAAm jäikus olulisemat rolli.

  4. Rakkude leviku kineetikat kirjeldatakse absoluutkiiruse teooria põhjal ja keskendutakse ka pindade jäikuse mõjudele.

Rakkude hajutamine on esialgne protsess, kui rakk puudutab substraati ning raku ja substraadi vastastikmõjud toimuvad liideses. Kuna ECM ja põhimik pakuvad rakkude kinnitusele füüsilist tuge, põhjustavad “tegelikku” jäikust, mida rakud saavad tajuda ja millele reageerida, substraadi jäikus, eraldatava kihi aluspinna pinnal olev pinnajäikus ja ECMi jäikus ( mis määratakse rakuvälise maatriksi lõastamise teel).

Puistejäikust peetakse üldiselt, ehkki mitte mingil juhul alati, rakutegevuse käitumise määravaks teguriks. Varasemad uuringud näitasid, et puistejäikus mängis olulist rolli raku funktsioneerimisel, näiteks proliferatsioon 44, migratsioon 5, diferentseerumine 6 ja apoptoos 7 . Rakkude leviku ja jäikuse vahelist seost on kirjeldatud ka katsetes ja teooriates 39, 40, 45 . Rakkude leviku eraldi uuringus, mille viisid läbi Wang jt. 45, järeldati, et NIH3T3 fibroblastid levivad kiiremini ja näitasid tugevamatel PAAm-geelidel suuremaid projitseeritavaid alasid kui pehmematel. Ja seda nähtust saab modelleerida ka 39, 40, et kirjeldada laotuskineetikat ja uurida substraadi jäikuse mõju. Meie uuringutes on rakkude levimise käitumine PAAm-geelidel kooskõlas nende tulemustega.

Pindadevaheline jäikus juhtis rakkude levikut peamiselt PDMS-is. Kuna PDMS ja PAAm võrdlevad uuringud on keerulised, on tehtud vähe tööd ja selle aluseks olev mehhanism on endiselt ebaselge. Varasemates aruannetes viskoossust tähistav kadumismoodul mõjutas MSC diferentseerumist 46 ja PDMS-i viskoelastsuse erinevused võivad mõjutada epiteeli lehe liikumist 47 . See näitas, et PDMS-i viskoossus, mis mõjutas rakkude käitumist, vähendades rakkude tundlikkust jäikuse suhtes, oli selle näiliselt vastuolulise järelduse võimalik leppimine. See erineb meie seletusest. Rakkude käitumist, mida mõjutas jäik kiht PDMS pinnal, uuriti eelnevalt FEM-analüüsiga 22, kuid me oleme esimesed, kes seda katsetes täheldasid. Kuna hüdrofoobse PDMS pinna funktsionaliseerimiseks kasutatakse laialdaselt UV / UVO / plasma töötlemist, tuleks märgata seda pinna modifikatsiooni, mis võib domineerida raku ja substraadi liideses. Lisaks sellele muudab õhukese kuldkihi ( E ~ 70 GPa) katmine aluspinna jäigaks 27, mis suurendab oluliselt pindade jäikuse olulisust ja kaalub üles kogu jäikuse.

ECM-i jäikus soodustab ka “tõelist” elastsust. Trappmann ja tema kolleegid 27 tõstsid praegust arusaama tüvirakkude bioloogia ja biomaterjalide ristumiskohas edasi, näidates, et tüvirakkude levikut ja diferentseerumist mõjutab pigem see, kuidas ECM-i molekulid kinnitatakse PAAm-i substraadile, mitte substraadi mahu jäikus. Meie uurimistöö järeldus on aga vastupidine. Meie mudelis on kriteerium mahu jäikuse ja rakuvälise maatriksi lõastamise vahelise konkurentsi hindamiseks. Sel viisil tuleks arvestada mitte ainult kõige pehmema, vaid ka tugevama aluspinna aluspinna deformeerumisega. Seda saab tõestada veojõu mikroskoopiaga 23, milles fluorestsentsosakeste positsioonid muutuvad, kui rakud rakendavad kontraktiilset jõudu. Kuna kollageeni lõastade kohalik jäikus on palju suurem kui meie arvutustes kasutatav jäik jäikus, siis kohaliku jäikuse ignoreerimine ja puiste jäikuse käsitlemine kui „tõeline” jäikus tundub mõistlik. Meie mudel viitab ka sellele, et parameetri väärtuse muutmine aitab kaasa ainult ühe osa varieerumisele (kollageeni lõhede paikne jäikus või jäik jäikus) ega tõenda selle osa võrdlevat tähtsust. Näiteks õhukese kuldkihi ( E ~ 70 GPa) katmine pinnaga suurendab põhimiku pindade jäikust ja põhimiku deformatsioon on üsna väike. Siis domineerivad muutuva poorisuurusega kogu süsteemi elastsus. Kuid puistejäikuse tähtsuse minimeerimine ei tähenda, et seda saaks välistada. Kulla nanoosakeste vahekauguse vahemikus 60–190 nm kasutamine jäiga substraadil (3 MPa) näitab ka seda, et kollageeni lõhede paikne jäikus mõjutab rakkude käitumist, mis ei tähenda ühtlasi, et kogu jäikust saab välistada. What we should note in our model is that the relative distance L relates to, but may not equal to the pore sizes of the hydrogels. The collagen may also be decoupled from the hydrogels, then it shows more compliant and the role of local stiffness of collagen tethers may be reconsidered. Although the stiffness of ECM contributes little in 2D cell culture compared with bulk stiffness, it will play a more important role in 3D cell culture environment, because the cells are encapsulated in pure ECM.

The relationship between cell radius and spreading time can be obtained from the experiments, and it was found to satisfy the scaling law 39 . Studying cell spreading within the scaling law allows us to quantify the cellular dynamics through two observable quantities, projected areas A max and scaling factor α . Different but constant scaling factor α i in different phases of spreading are evident in a double logarithmic plot, which divides the whole process into three phases 48 . Due to the limitation of our experimental techniques, the membrane dynamics at the earliest spreading phase cannot be obtained since the cell body usually occludes in bright field imaging. The universal power-law behaviour of cell spreading 49 in the initial phase is omitted in our study.

The application of absolute rate theory to cell spreading, which is performed for the first time in our study, is based on the fact that all biochemical reactions are rate processes 33 . Our model predicts the scaling law of radius-time relationship, which is similar to Brownian Ratchet model 38 . It is not surprising that both models have the same form and Boltzmann factors, as long as we realize that actin polymerization can be treated as Markov process. The addition of monomer onto the end of actin filament is an independent process, and has nothing to do with previous polymerization. Brownian motion is another typical Markov process. In this way, our model based on absolute rate theory is established and linked to other models. To incorporate the influence of interfacial stiffness in our model, we introduce the shear stress of the interface between cell and substrate to disturb the biochemical reactions, as the shear stress at the margin of the contact area guides cell spreading 39 . For PAAm, which has no separable surface layer, the shear stress is determined by the bulk stiffness of the substrate. For PDMS, the shear stress obtained by FEM simulation is much larger, which indicates that the stiffness of stiffen layer at the surface outweighs the bulk stiffness of PDMS. In this way, cell spreading behaviours on PAAm and PDMS can be described and characterized as one model in the context of interfacial environments.

In summary, not only experimental results from distinguishing between PAAm and PDMS with varied bulk stiffness but also theoretical analysis on the two systems indicate that the interfacial stiffness of substrate mainly guides cell spreading behaviours. Our finding suggests that the interfacial stiffness should be taken into account in regulating cell behaviours, including cell adhesion, spreading and subsequent migration, and may have a major impact on the design of materials for tissue engineering applications.

Meetodid

Preparation of PAAm and PDMS substrates for cell spreading

The preparations of PAAm hydrogels were adapted from a previously described protocol 50 . PAAm gels were mixed with acrylamide at final concentrations of 3, 5, 10 wt/vol% and bis-acrylamide at the corresponding concentration of 0.06, 0.15, 0.3 wt/vol%. 3/1000 total volume of ammonium persulfate (APS) and 1/1000 total volume of Tetramethylethylenediamine (TEMED) were added to gel solutions to accelerate the polymerizing process. A thin film of PAAm hydrogels (about 100 μm) was formed like a “sandwich” by carefully placing an amino-silanated glass coverslip (15 mm in diameter) on top of 20 μl of gel precursor solution which sit in the middle of the chloro-silanated confocal dish (Shengyou). Three hours later, we added PBS buffer into the confocal dish, and peeled off the top coverslip. The remaining monomer and crosslinker were removed by washing with PBS three times. For cell seeding, collagen I protein was conjugated to the surface of hydrogel using the heterobifunctional linker Sulfo-SANPAH (ProteoChem). 500 μl of a 0.2 mg ml −1 solution in 50 mM HEPES were pipetted onto the gel surface in a confocal dish (with a 20 mm diameter glass bottom), which was then placed under a homemade 365 nm ultraviolet light and irradiated for 10 minutes. Afterwards, the gels were washed with 50 mM HEPES in PBS and this procedure was repeated once. The substrates were coated with 500 μl of a 0.1 mg ml −1 solution of rat type I collagen (Invitrogen) in acetic acid for three hours at 37°C. Samples were washed three times with PBS before the seeding of cells.

The two parts of the PDMS kit (Sylgard 184, Dow Corning) were mixed in different ratios at the 100:1, 80:1, 60:1 base: crosslinker. The mixture was stirred sufficiently and degassed for one hour. Then the PDMS gels were spun on the plasma-treated confocal dish, and cured at 80°C for 24 hours. For cell seeding, the PDMS substrates were treated in a similar way with PAAm gels as described above.

Mechanical characterization of substrate stiffness

The mechanical properties of PAAm and PDMS were tested at the micro-scale by atomic force microscopy (AFM, Agilent 5500). To apply the Hertz model appropriately, a glass sphere (around 8.0 μm and 5 μm in diameter) was glued on the cantilever of AFM tip. The spring constant of tip was calibrated using the method of “Thermal K” before experiment. The resonant frequency is around 35 kHz and the measured spring constant is 0.368 N/m and 0.043 N/m, respectively. The stiffer cantilever was used in the measurement of stiffer substrates, and the soft cantilever was used for soft ones. The indentation speed was set as 5.0 μm/s. The z-position ranged from 2 μm to −1.5 μm during the indentation, and can be adjusted in Pico View. The elastic modulus of the substrate was calculated from the force-curve using our homemade software and obtained as an average of multiple measurements. The elastic modulus of all substrates used in our research is shown in Table 1. The value of softest PDMS was obtained from other paper 27, because this substrate is too viscous to hold the load for a longer time. The experiment on UV treated PDMS was performed in the same way. 3 samples were tested and force curve was obtained for at least 30 locations per sample. All AFM curves were averaged, resulting in a single curve.

Täissuuruses tabel

Optimized method based on finite element simulation and AFM indentation

An optimization method based on finite element analysis was performed to evaluate the effects of plasma treatment (the thickness and elastic modulus of surface layer). The final goal was to match simulated indentation process with the corresponding AFM experiments. The indentation process can be treated as an axisymmetric problem in which a glass microsphere was glued on the AFM tip (Fig. 4a). The model was composed of the AFM spherical indenters and the bi-layer PDMS substrate consisting of a surface layer ( E surf , t ) and the bulk. The indenter was modeled as a rigid body. The material description of PDMS followed a hyperelastic and nearly incompressible neo-Hookean law. To fit with the experimental data, neo-Hookean material properties were used as the initial “ E modulus” defined by the following relationship E = 3 μ , where μ is the shear modulus. The contact between the indenter and the substrate was modeled as frictionless. The force-indention curve was derived from the displacement and reaction force of rigid sphere. Initial elastic modulus (range from 1000 to 20000 kPa) and thickness (100 to 300 nm) of the surface layer was defined and then adjusted to fit the experimental data, until an “optimized” model of the material was found.

Finite element analysis of cell-substrate interactions on the PDMS surface

Based on the determined PDMS structure and mechanical properties, an x-axisymmetric model of substrate was built, as shown in Fig. 5a. To mimic the substrate deformed by the cellular force transmitted through focal adhesion, we established such a model that the substrate was pulled by a rod at a given displacement (200 nm in z-axis, 300 nm in y-axis) as a Neo-Hookean solid (Fig. 5a). The contact region was a half circle with 12 μm in diameter which is near to the size of focal adhesions. Then the contact region was fine-meshed to facilitate contact detection and processing. As the shear stress in contact region mattered a great deal to cell spreading, the influence of surface layer could be reflected in the shear stress quantitatively.

Cell culture and seeding onto substrates

A549 cells (adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells) were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium-high glucose (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin at 37°C in 5% CO 2 . When the assay was conducted, A549 cells were harvested with trypsin and EDTA and seeded onto PAAm and PDMS substrates (functionalized with collagen I) at a density of 10, 000 per cm 2 . All reagents in this section were purchased from HyClone.

Measurement of cell spreading and motility

To address the dynamics of cell spreading, we used differential interference contrast microscopy (DIC), with a 20× air objective (Ti-E, Nikon) to quantitatively record the spreading process of individual A549 cell. The temperature of assays was controlled by a heated stage (Model 321 Autotuning Temperature Controller, LakeShore). Time-lapse imaging of a field containing 10 to 20 cells was performed with a charge-coupled device (CCD) camera (Cool SNAP HQ 2, Photometrics) at a 10 s interval for 40–60 minutes after plating on different substrates. To settle the problem of focus drift in the whole assay, a solution termed the Perfect Focus System (PFS) was used. Each assay under this specific condition was repeated at least three times. The parameters were controlled by the MetaMorph software. Cell areas were measured using MetaMorph as well. At least 15 cells in three assays per substrate type were analyzed. The measurements of the cell area were conducted at ten second interval and normalized to the initial area of the digested cells.

Data process

To obtain the radical parameters of cells on the plane of the substrate, we used MetaMorph to transform the 16-bit digital gray scale images into binary images which can separate the cell area from the background. This separation involves the following major steps: detect edges, confirm threshold, fill holes and remove noise, as illustrated in Fig. 1a. In the process of edge detecting, we used Kirsch convolution to isolate and enhance the edges in the image by comparing brightness changes in the neighboring pixels. After that, we applied segmentation to the image to differentiate between objects of interest (cell) and other parts of the image (background) based on the image's grayscale levels. Too low or too high threshold will lead to incorrect fragment of cell and background. To solve this problem, a tool called “Auto Threshold for Light Objects” was used to optimize the threshold. Once finished, the image was transformed into a binary image (orange cell and black background). The last step is filling the holes inside the edges and removing the background to obtain the data of cell areas. Because we are primarily interested in the dynamics of cells during spreading, we did not include any activity such as polarization, migration, quiescence that followed the cells reaching their fully spreading states.

Muutuste ajalugu

Täiendav teave

Videod

  1. 1

    Täiendav teave

    Film S1

  2. 2

    Täiendav teave

    Film S2

Wordi dokumendid

  1. 1

    Täiendav teave

    Supplementary infomation

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.