Autofagia osalemine folaadiga lisatud metüül-P-tsüklodekstriini kasvajavastases aktiivsuses | teaduslikud aruanded

Autofagia osalemine folaadiga lisatud metüül-P-tsüklodekstriini kasvajavastases aktiivsuses | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Vähi immunoteraapia
  • Keemiaravi
  • Ravimite väljatöötamine
  • Sihtotstarbelised ravimeetodid

Abstraktne

Autofágia, rakusiseste komponentide, sealhulgas organellide ringlussevõtu peamine lüsosomaalne tee, on kujunemas peamiseks protsessiks, mis reguleerib kasvajageneesi ja vähiravi. Viimati sünteesisime äsja folaadiga lisatud metüül-P-tsüklodekstriini (FA-M-β-CyD) ja näitasime FA-M-β-CyD potentsiaali uue kasvajavastase ravimina. Selles uuringus uurisime, kas FA-M-β-CyD vähivastane toime folaadiretseptori α (FR-α) -positiivsetes tuumorirakkudes on seotud autofagiaga. Vastupidiselt metüül-β-tsüklodekstriinile (M-β-CyD) sisenesid FA-M-β-CyD KB rakkudesse (FR-α (+)) CLIC / GEEC endotsütoosi kaudu. Pärast töötlemist FA-M-β-CyD-ga ei täheldatud KB-rakkudes olulist DNA sisalduse langust. Peale selle oli mitokondrite transmembraanne potentsiaal pärast ravi FA-M-β-CyD-ga järsult suurenenud. Vahepeal indutseeris FA-M-β-CyD KB-rakkudes autofaagiliste vakuoolide moodustumise, mis olid osaliselt kolokaliseeritud mitokondritega. Kokkuvõttes viitavad need tulemused sellele, et FA-M-β-CyD FR-α-ekspresseerivat raku suhtes selektiivset tsütotoksilist aktiivsust võiks vahendada pigem apoptoosi esilekutsumise kui autofagia reguleerimisega.

Sissejuhatus

Vähi kemoteraapias on vähivastaste ravimite maksimaalse efektiivsuse saavutamiseks ravimite manustamise tehnika äärmiselt oluline. Aktiivse sihtimisvõime andmiseks on teada tuumorispetsiifiliste ligandite keemiline modifitseerimine ravimi kandjale. Erinevatest kasvajaspetsiifilistest ligandidest on foolhape (FA) 1, 2, 3, 4, 5 kujunenud tähelepanuväärseks sihtliigandiks, mis on võimeline toimima tugevas interaktsioonis vähirakkudega, mis ekspresseerivad suure afiinsusega folaadiretseptorit (FR) ( Kd : 10 –9 ~ 10 –10 M) 6, 7 . FR haakub rakupinnaga glükosüülfosfatidüülinositool-ankru kaudu ja see on kõrge ekspressiooniga erinevates kasvajarakkudes, sealhulgas aju, munasarja, rinna, neeru ja kopsu pahaloomulised kasvajad, ja selle normaalsetes kudedes ekspressioon on tühine 8 . Lisaks suureneb vähktõve progresseerumisel märkimisväärselt FR ekspressioonitase 9 . Seetõttu on FR üks tõhusaid kandidaate mitte ainult paljutõotavaks markeriks, vaid ka vähiravis kasutatavaks sihtvalguks.

Tsüklodekstriinid (CyD) on tsüklilised oligosahhariidid, mis moodustavad laia valiku hüdrofoobsete molekulidega inklusioonikomplekse ja neid kasutatakse laialdaselt farmatseutilises piirkonnas 10, 11 . On teada, et CyD-d interakteeruvad kolesterooli ja fosfolipiidide rakumembraanide komponentidega, põhjustades punaste vereliblede hemolüüsi kõrgetes CyD-de kontsentratsioonides 12, 13, 14. Lisaks kasutatakse lipiidide parvede lõhustamiseks sageli metüül-β-tsüklodekstriini (M-β-CyD), kuna see suudab vähendada rakumembraanide kolesteroolivarusid 15 . Hulk uuringuid on ka näidanud, et lipiidide parvede lõhustamine M-β-CyD poolt võib kahjustada vähirakke ja põhjustada rakusurma. Grosse jt . näitas, et M-β-CyD vähendas märkimisväärselt tuumori kasvu tuumorit kandvatel hiirtel pärast intraperitoneaalset manustamist 16 . Kuid M-β-CyD tsütotoksilisel reaktsioonil puudub kasvajaraku selektiivsus.

Viimati, et proovida M-β-CyD-ga tekitada kasvajaspetsiifiline tsütotoksiline reaktsioon, valmistasime eelnevalt ette FA-konjugeeritud M-β-CyD (FA-M-β-CyD) 17 ja hindasime selle kasvajavastast aktiivsust 18 . FA-M-β-CyD andis suure tuumorivastase aktiivsuse, võrreldes M-β-CyD-ga KB rakkudes, ekspresseerides tugevalt folaadi retseptori α (FR-α). FA-M-β-CyD ühekordne intravenoosne manustamine pärssis märkimisväärselt kasvaja kasvu koolon-26 rakkudes (FR-α (+)) kandvatel hiirtel. Lisaks oli pärast intravenoosset manustamist samas annuses FA-M-β-CyD kasvajavastane toime parem kui doksorubitsiinil. Need tulemused näitavad, et FA-M-β-CyD-l on potentsiaali paljulubavaks vähivastaseks aineks. Kuid FA-M-β-CyD kasvajavastase toime mehhanism on endiselt ebaselge.

Autofágia, rakusiseste komponentide, sealhulgas organellide ringlussevõtu peamine lüsosomaalne tee, on kujunemas peamiseks protsessiks, mis reguleerib kasvajageneesi ja vähiravi 19, 20, 21, 22, 23 . Vähi autofaagia dünaamilisel rollil on kasvajat pärssiv toime vähktõve varases staadiumis, kuid see on väljakujunenud kasvajate kasvuefekt. Samuti võib autofagia stimuleerimine vastusena terapeutilistele vahenditele eelistada või nõrgendada kemoresistentsust ja kasvajavastast immuunsust. Seetõttu on vähi keemiaravi jaoks oluline mõista, kas ja kuidas saab autofaagiat kasutada vähirakkude tapmiseks. Selles uuringus uurisime, kas FA-M-β-CyD kasvajavastane toime FR-α (+) rakkudes on seotud autofagiaga. Selle tulemusena leiti, et FA-M-β-CyD indutseerib autofagosoomi moodustumist FR-α (+) rakkudes, mis näitab autofagia osalemist kasvajavastases aktiivsuses. Võttes arvesse meie eelnevaid tulemusi, et FA-M-β-CyD pärssis drastiliselt tuumori kasvu hiirtel nakatatud FR-α (+) kasvajarakkudes 18, saab FA-M-β-CyD rakendada uue vähivastase ravimina FR-α-üleekspresseeriva kasvaja vastase vähi keemiaravi autofagia reguleerimine.

Tulemused

FA-M-β-CyD kasvajavastane toime

FA-M-β-CyD kasvajavastase toime selgitamiseks FR-α (+) rakkudes uurisime FA-M-β-CyD kasvajavastast toimet FR-α (+) ja FR-α (-) rakkudes. FA-M-β-CyD-l oli pärast 2-tunnist töötlemist suurepärane kasvajavastane toime võrreldes FR-α (+) rakkudega, näiteks KB ja M213 rakkudega, võrreldes kontrolliga (joonis 1A, B). Kuid FR-a-negatiivsetes A549 rakkudes ei olnud olulist kasvajavastast aktiivsust (joonis fig 1C). Need tulemused näitavad, et FA-M-β-CyD-l oli FR-α (+) raku suhtes selektiivne kasvajavastane toime.

Image

(A) KB rakud, (B) M213 rakud ja (C) A549 rakud. FA-M-β-CyD kontsentratsioon oli 10 mM. Tulemused on esitatud keskmisena ± SEM (n = 3–4 rühma kohta). * p <0, 05 vs kontroll.

Täissuuruses pilt

FA-M-β-CyD rakuühendus ja rakusisene jaotus

Varem teatasime, et FA-M-β-CyD-l on FR-α (+) rakuspetsiifiline kasvajavastane toime 18 . FA-M-β-CyD FR-α-vahendatud kasvajavastase toime mehhanismi üksikasjade saamiseks uurisime, kas TRITC-FA-M-β-CyD seostub KB rakkudega (joonis 2). Silmatorkavalt on TRITC-FA-M-β-CyD KB-rakkudega tugevalt seotud (joonis 2A), vaatamata sellele, et CyD-d on teadaolevalt biomembraanis läbitungimatud. Lisaks pärssis TRITC-FA-M-β-CyD seostumist FA lisamine FR konkurendina (joonis 2A). Sarnaseid tulemusi täheldati ka M213 rakkudes (joonis 2B). Lisaks oli FA-M-β-CyD rakuline seotus FR-α allapoole reguleeritud KB-rakkudes oluliselt madalam kui KB-rakkudega (joonis 2C). Need andmed näitavad, et FA-M-β-CyD võib seostada rakkudega FR-α kaudu.

Image

(A) KB-rakud, (B) M213-rakud ja (C) FR-a-knockdown-rakud. TRITC-st saadud fluorestsentsi intensiivsus määrati voolutsütomeetriga 1 tund pärast inkubeerimist temperatuuril 37 ° C.

Täissuuruses pilt

Järgmisena uurisime TRITC-FA-M-β-CyD rakusisest jaotust KB rakkudes pärast 1-tunnist töötlemist (joonis 3). Tuleb märkida, et täheldati TRITC-FA-M-β-CyD imendumist rakkudes KB rakkudes. Lisaks lokaliseerus TRITC-FA-M-β-CyD pärast 1-tunnist töötlemist peamiselt tsütoplasmas, mitte tuumas. Need tulemused näitavad, et FA-M-β-CyD jaotub tsütoplasmas pärast raku imendumist KB rakkudesse ja annab tugeva kasvajavastase toime.

Image

KB rakke töödeldi TRITC-FA-M-β-CyD-ga (10 μM) 1 tund.

Täissuuruses pilt

FA-M-β-CyD põhjustas apoptoosist sõltumatu raja kaudu tsütotoksilise aktiivsuse

Uurimaks, kas FA-M-β-CyD indutseerib apoptoosi või mitte, uurisime DNA tuumas, transmembraanset potentsiaali mitokondrites, TUNEL-testi ja kaspaas 3 lõhestamistesti KB-rakkudes. Siin kasutasime apoptoosi indutseerija positiivse kontrollina 2, 6-di- O- metüül-β-CyD (DM-β-CyD), kuna varem näitasime, et DM-β-CyD kutsus esile apoptoosi PI3K allasurumise kaudu -Akti aktiivsus kolesterooli ekstraheerimise kaudu plasmamembraanidest NR8383 rakkudes 24 . Pärast 10 mM DM-β-CyD-ga töötlemist 2 tunni jooksul vähenes KB-rakkude DNA-sisaldus märkimisväärselt, võrreldes kontrollrühmaga (joonis 4A). Vahepeal ei täheldatud KB-rakkudes DNA sisalduse olulist vähenemist 10 mM FA-M-β-CyD korral (joonis 4A).

Image

DNA sisaldus (A) ja mitokondriaalne transmembraanne potentsiaal (B) pärast töötlemist FA-M-β-CyD-ga. KB rakke töödeldi FA-M-β-CyD-ga (10 mM) 2 tundi. Tulemused on esitatud keskmisena ± SEM (n = 3–4 rühma kohta). * p <0, 05 vs kontroll. † p <0, 05 vs KB rakud ilma FA töötlemata. (C) TUNEL-test pärast töötlemist KB-rakkudes FA-M-β-CyD-ga. (D) Lõhestatud kaspaas 3 test pärast töötlemist KB-rakkudes FA-M-β-CyD-ga. Kärbitud laigud osutati. (E) lõhustatud kaspaas 3 / pro-kaspaas 3 suhte riba intensiivsus. Tulemused on esitatud keskmisena ± SEM (n = 3 rühma kohta). * p <0, 05 vs kontroll.

Täissuuruses pilt

Järgmisena uurisime CyD-de mõju transmembraansele potentsiaalile mitokondrites, kasutades rodamiini 123 KB-rakkudes (joonis 4B). DM-β-CyD-ga töödeldud KB-rakkude transmembraanne potentsiaal mitokondrites vähenes drastiliselt, võrreldes kontrolliga. Teravas kontrastis oli FA-M-β-CyD-ga töödeldud KB-rakkude potentsiaal järsult suurenenud. Lisaks vähenes see potentsiaali suurenemine FA-M-β-CyD lisamisega kontrolltasemele FA konkurendi, FR konkurendi juuresolekul (joonis 4B).

Järgmisena viisime läbi TUNEL-testi. Nagu on näidatud joonisel 4C, värviti DM-β-CyD-ga töödeldud KB-rakke võrreldes kontrolliga, mis viitab apoptoosi esilekutsumisele. Vahepeal ei värvitud FA-M-β-CyD-ga töödeldud rakke.

Lisaks tekitas DM-β-CyD lõhustatud kaspaas 3 testis (joonis 4D, 4E) pro-kaspaas 3 lõhustumise kaudu potentsiaalselt aktiveeritud kaspaasi 3, mis näitab apoptoosi esilekutsumist. Kuid FA-M-β-CyD näitas pro-kaspaasil 3 ainult väikest lõhestavat aktiivsust. Kollektiivselt näitavad need andmed, et FA-M-β-CyD põhjustatud rakusurm oli apoptoosist sõltumatu.

Autofaagia kaasamine FA-M-β-CyD põhjustatud rakusurma

Autofágia on kehas normaalne füsioloogiline protsess, mis tegeleb keha rakkude hävitamisega ja võib teatud tingimustel rakke tappa. Pärast mitmesuguste vähivastaste ravimitega töötlemist vähirakkudes aktiveerunud autofaagia või autofaagilise rakusurma kohta on mitmeid teateid 25 . Järgmisena uurisime, kas autofagosoomide moodustumist KB rakkudes kutsub esile FA-M-β-CyD, kasutades Cyto-ID® Autophagy Detection Kit, mis tuvastab rakkudes autofaagilised vaakumid. Nagu on näidatud joonistel 5A ja 5B, täheldati KB-rakkudes autofaagilisi vaakume pärast töötlemist FA-M-β-CyD-ga 2 tundi. Lisaks vähenesid FA-M-β-CyD-ga töötlemisel esile kutsutud autofaagilised vaakumid ülekaalukalt autofagia inhibiitori LY294002 eeltöötlusega. Need tulemused viitavad sellele, et FA-M-β-CyD indutseeris KB-rakkudes autofaagiliste vakuoolide moodustumise.

Image

(A, B) FA-M-β-CyD mõju autofagosoomide moodustumisele KB rakkudes. (C, D) FA-M-β-CyD mõju valgu agregatsiooni kliirensile autofaagia kaudu. (E) Klorokiini, bafilomütsiini A1, 3-MA ja LY294002 mõju FA-M-β-CyD kasvajavastasele aktiivsusele KB rakkudes. Tulemused on esitatud keskmisena ± SEM (n = 3–6 rühma kohta). * p <0, 05 vs kontroll. p <0, 05 vs. inhibiitorita FA-M-β-CyD.

Täissuuruses pilt

Järgmisena viisime läbi autofágiatesti, kasutades Premo ™ autofágiaandurite komplekti, mis suudavad jälgida valguagregaatide kliirensit autofagia kaudu, kasutades GFP-ga märgistatud p62 joonistel 5C ja 5D. Siin on p62 valk võimeline seonduma nii ubikvitiiniga 26 kui ka LC327-ga, hõlbustades seeläbi ubikvitineeritud valkude kliirensit autofagia kaudu. GFP-p62 fluorestsents kontrolli osas vähenes drastiliselt FA-M-β-CyD lisamisega. Vahepeal ei näidanud M-β-CyD olulist muutust GFP-p62 fluorestsentsis võrreldes kontrolliga. Need tulemused viitavad sellele, et KB-rakkudes akumuleerunud autofagosoomid lagunesid autofagia kaudu FA-M-β-CyD abil.

Järgmisena uurisime selliste autofagia inhibiitorite nagu klorokiin, bafilomütsiin A1, 3-metüüladeniin (3-MA) ​​ja LY294002 mõju KB-rakkude elujõulisusele pärast töötlemist FA-M-β-CyD-ga. Siin takistavad klorokiin ja bafilomütsiin A1 endosomaalset hapestumist, mis pärsib nii autofagosoomi sulandumist lüsosoomi kui ka lüsosomaalse valgu lagunemisega. PI3K inhibiitoritena kasutati 3-MA ja LY294002. Nagu on näidatud joonisel 5E, oli FA-M-β-CyD-ga töödeldud KB-rakkude elujõulisus autofágia inhibiitorite juuresolekul kõrgem kui ainult FA-M-β-CyD-ga. Need andmed kokku viitavad sellele, et FA-M-β-CyD põhjustab tõenäoliselt autofaagilist rakusurma.

Düsfunktsionaalseid mitokondreid tuntakse ära ja lagundatakse rakkudes nii mitteselektiivse autofagia kui ka mitofagiaga, mis on selektiivne tüüpi autofagia 28, 29 . Nagu on näidatud joonisel 4B, leidsime, et FA-M-β-CyD suurendas märkimisväärselt mitokondriaalse membraani potentsiaali KB rakkudes, osutades mitokondrite stressi esilekutsumisele. Seetõttu uurisime pärast FA-M-β-CyD-ga töötlemist mitofaagide osalemist mitokondrite stressist põhjustatud rakusurmas (joonis 6). Autofaagilised vaakumid ja mitokondrid, mis olid värvitud vastavalt Cyto-ID® Autophagy Detection Kit ja rodamiin 123 abil, olid KB-rakkudes osaliselt kolokaliseeritud pärast töötlemist FA-M-β-CyD-ga (joonis 6A). Sarnased tulemused saadi ka M213 rakkudes (joonis 6B). Seetõttu viitavad need tulemused sellele, et FA-M-β-CyD põhjustatud autofaagiline rakusurma võib olla seotud mitokondriaalse stressi põhjustatud mitofagiaga.

Image

(A) KB-rakke ja (B) M213-rakke töödeldi 2 tunni jooksul FA-M-β-CyD-ga ja seejärel töödeldi rakke Cyto-ID ™ ja rodamiiniga 123, et värvida vastavalt autofagosoome ja mitokondreid.

Täissuuruses pilt

Arutelu

Kasvajavastaste ainete sihtimisvõime mängib võtmerolli mitte ainult tugeva kasvajavastase toime tagamiseks, vaid ka vähktõve kemoteraapias esinevate kõrvaltoimete riski vähendamiseks. Varem näitasime, et FA-M-β-CyD näitas FR-α (+) raku suhtes selektiivset kasvajavastast toimet 17 . Lisaks selgus, et FA-M-β-CyD kasvajavastane toime oli FA juuresolekul märkimisväärselt pärsitud, mis näitab, et FR-vahendatud endotsütoos on ülioluline FA-M-β-CyD 18 kasvajavastase toime tugevdamiseks. Üldiselt arvatakse, et CyD-de raku omastamise ulatus on ebaoluline ilmselt nende hüdrofiilsuse ja suure molekulmassi tõttu, FA-M-β-CyD sisestati tegelikult KB-rakkudesse (joonis 3). Vahepeal arvati, et FR endotsütoositakse klatriinist sõltumatu kandja / GPI-ga ankurdatud valkude kaudu, mis on rikastatud varajase endosomaalse sektsiooniga (CLIC / GEEC) 30 . Seetõttu võiksid FA-M-β-CyD rakkudesse siseneda CLIC / GEEC kaudu pärast FR-α äratundmist. Tegelikult seostub FA-M-β-CyD pigem KB-rakkudega kui FR-α-löögi alla kuuluvate KB-rakkudega (joonis 2C), mis näitab FA-M-β-CyD potentsiaali FR-α-na (+) rakuvalikuline vähivastane ravim.

Hiljuti on leitud alternatiivne meetod rakusurma kontrollimiseks ja vähirakkude lagunemist põhjustavad uued ravimid 31 . Rakusurma mehhanismide hulgas mängib apoptoos otsustavat rolli rakkude ellujäämises ja tuumori kasvamises. M-β-CyD-d kasutatakse sageli lipiidide parvede kahjustamiseks kolesterooli ekstraheerimisel plasmamembraanidest 15, 32 . Hulk uuringuid on näidanud, et M-β-CyD võib kahjustada vähirakke lipiidide parvede kahjustamise kaudu. Näiteks kutsus kolesterooli taseme langus M-β-CyD poolt esile inimese epidermoidse kartsinoomi rakkude apoptoosi 33 . Lisaks teatasime varem, et DM-β-CyD kutsus esile apoptoosi PI3K-Akt aktiivsuse nõrgenemise kaudu alveolaarsete makrofaagide lipiidide parvidest põhjustatud kolesterooli ammendumisega 24 . Samuti kontrollisime, kas DM-β-CyD andis KB rakkudes apoptoosi kolesterooli vähenemise kaudu (joonis 4). Lisaks kutsus M-β-CyD ka KB rakkudes esile apoptoosi, põhjustades kolesterooli ekstraheerimist, mis viis tuuma DNA-sisalduse vähenemiseni ja mitokondrite 34 transmembraanse potentsiaalini. Huvitav on see, et FA-M-β-CyD vabastas söötmes märkimisväärselt kolesterooli nii KB-rakkudest (FR-α (+)) kui ka A549 rakkudest (FR-α (-)), võrreldes M-β-CyD ja DM-ga -β-CyD meie eelmises uuringus 18 . Kuid FA-M-β-CyD näitas tugevat tsütotoksilist aktiivsust, vähendamata tuumas DNA sisaldust ja mitokondrites transmembraanset potentsiaali (joonis 4), mis viitab sellele, et rakusurma mehhanism FA-M-β-CyD süsteemis võib olla erinev apoptoosist. Kokkuvõttes muutis FA modifitseerimine M-β-CyD-ks järsult rakusurma mehhanismi, tõenäoliselt tänu sisenemisele FR-α-üleekspresseerivatesse rakkudesse, mida vahendas CLIC / GEEC endotsütoos.

Kõige tähtsam on see, et me avastasime autofagia osalemise rakusurmas, mille põhjustas FA-M-β-CyD FR-α ekspresseerivates rakkudes, näiteks KB rakkudes. See tähendab, et FA-M-β-CyD suurendas autofagosoomimarkeri LC3-II ekspressiooni KB-rakkude autofaagilistel membraanidel (joonis 5A). Viimasel ajal arvatakse, et autofagia on võtmeprotsess, mis reguleerib kasvajageneesi ja vähiravi. Tuumori arengu varases staadiumis toimib autofaagia tuumori supressorina. Samal ajal soodustab kasvaja arengu kaugelearenenud staadiumides autofágia kasvaja progresseerumist. Kasvajarakkude keskosas asuvad tuumorirakud läbivad autofagia, et ellu jääda madala hapniku- ja toitainesisaldusega tingimustes. Autofhagyia kaitseb vähirakke vähivastase ravi eest, blokeerides apoptootilise raja ('kaitsev autofagia'). Selles uuringus leiti, et FA-M-β-CyD indutseerib autofagosoomi moodustumist FR-α-positiivsetes rakkudes, mis viitab autofagia osalemisele kasvajavastases aktiivsuses. Võttes arvesse meie eelnevaid tulemusi, et FA-M-β-CyD pärssis drastiliselt tuumori kasvu hiirtel nakatatud FR-α (+) kasvajarakkudes 18, saab FA-M-β-CyD rakendada uue vähivastase ravimina FR-α-üleekspresseeriva kasvaja vastase vähi keemiaravi autofagia reguleerimine. Siiski jääb endiselt selgusetuks, kas FA-M-β-CyD indutseerib autofaagiat esile kutsuva mTOR-i fosforüülimist ja inaktiveerimist ning aktiveerib III klassi PI3K, mis hõlmab autofagosoomi moodustumist. Seetõttu on vaja täiendavaid uuringuid lisaks FA-M-β-CyD põhjustatud autofaagia mehhanismile, aga ka endotsütoosi raja panusele rakusurma mehhanismi.

Mitokondriaalse läbilaskvuse pooride (mPTP) aktiveerimine on seotud mitokondrite depolaliseerumisega, oksüdatiivse defosforüülimise lahtiühendamisega, mitokondrite paisumisega ja surma soodustavate tegurite vabanemisega nagu tsütokroom c35. Hiljuti avaldasid Ziolkowski jt . näitasid, et M-β-CyD vähendab roti maksa mitokondrite funktsiooni ja pärsib kaltsiumkloriidi põhjustatud turset 36 . Selles uuringus võib KB-rakkudesse sisestatud FA-M-β-CyD interakteeruda mitokondriaalsete sarikate sarnaste mikrodomeenidega, põhjustades mPTP aktiivsuse mahasurumist, mille tulemuseks on autofagosoomide moodustumise reguleerimine. Käimas on täiendavad uuringud FA-M-β-CyD mõju kohta mitokondrite funktsioonile.

Kokkuvõtteks võib öelda, et käesolevas uuringus tuvastasime autofagia seotuse FA-M-β-CyD FR-α ekspresseerivas raku-selektiivses kasvajavastases mõjus. Need leiud annavad palju teavet FA-M-β-CyD kui uudse autofagia indutseerija kohta vähi kemoteraapias.

Meetodid

Materjalid

RPMI-1640 (FA-vaba) saadi firmalt GIBCO (Tokyo, Jaapan). Tetrametüülrodamiini isotiotsüanaat (TRITC) ja FR-a siRNA (sc-39969) osteti vastavalt Funakoshi (Tokyo, Jaapan) ja Santa Cruz Biotechnology (Delaware, CA). Lipofectamine ™ 2000 reaktiiv ja Premo ™ Autophagy andurid saadi firmalt Invitrogen (Tokyo, Jaapan). Cyto-ID® Autofhagy Detection Komplekt osteti ettevõttelt Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY).

Rakukultuur ja kasvajavastane toime in vitro

KB rakke, inimese oraalset lamerakk-kartsinoomi rakuliini, A549 rakke, inimese kopsukartsinoomi ja M213 rakke, inimese kolangiokartsinoomi rakuliini, kultiveeriti vastavalt varasemale teatele 17 . Tuumorivastane toime in vitro viidi läbi WST-1 meetodil, nagu varem oli teatatud 18 . Lühidalt, KB rakke, M213 rakke ja A549 rakke (5x104 / 96 süvendiga mikroplaat) töödeldi 2 tunni jooksul temperatuuril 37 ° C 150 ui söötmega, mis sisaldas 10 mM FA-M-β-CyD. Autofágiat pärssivas uuringus töödeldi KB rakke 24 tunni jooksul eeltöödeldud RPMI-1640 söötmega, mis sisaldas 20 μM klorokiini, 1 nM bafilomütsiini A1, 5 mM 3-metüüladeniini (3-MA) ​​ja 50 μM LY294002. Pärast pesemist PBS-ga (pH 7, 4) lisati 100 ui värsket HBSS-i (pH 7, 4). Seejärel inkubeeriti plaate ja inkubeeriti WST-1 reagendiga 30 minutit. Neeldumislainepikkus ja võrdluslainepikkus olid vastavalt 450 nm ja 630 nm.

FA-M-β-CyD rakuline seotus

KB rakke ja M213 rakke (1 x 106/35 mm tassi) inkubeeriti 1 ml söötmega (FA-vaba), mis sisaldas 10 μM tetrametüülrödamiini isotiotsüanaati (TRITC) märgistatud FA-M-β-CyD (TRITC-FA- M-β-CyD) temperatuuril 37 ° C 1 tund. Pärast pesemist PBS-ga (pH 7, 4) kraapiti rakud 1 ml PBS-ga (pH 7, 4). Andmed saadi 1 × 104 raku kohta FACS Caliburi voolutsütomeetril, kasutades tarkvara CellQuest (Becton-Dickinson, Mountain View, CA).

FA-M-β-CyD rakusisene jaotus

KB rakke (1 x 106/35 mm klaasist põhjaga tassi) töödeldi 10 μM TRITC-FA-M-β-CyD-ga temperatuuril 37 ° C 1 tund. Hoechst 33342 (10 μg / ml) inkubeeriti temperatuuril 37 ° C 10 minutit. Pärast pesemist PBS-ga (pH 7, 4) lisati RPMI-1640 (FA-vaba). KEYENCE TRITC ja Hoechest33342 tuvastamiseks kasutati fluorestsentsmikroskoopi Biozero BZ-8000.

DNA sisaldus ja mitokondrite transmembraanne potentsiaal

KB-rakkude mitokondrites sisalduv DNA sisaldus ja transmembraanne potentsiaal määrati vastavalt eelnevale 34 . Lühidalt, KB rakke (1 x 106/35 mm tassi) töödeldi RPMI-1640-ga (FA-vaba), mis sisaldas 10 mM DM-β-CyD või FA-M-β-CyD, 2 tundi. Propiidiumjodiid (PI, 20 μg / ml) ja rodamiin 123, vastavalt mitokondrites sisalduva DNA sisalduse ja transmembraanse potentsiaali näitajad, kvantifitseeriti FACS Caliburi voolutsütomeetriga koos tarkvaraga CellQuest.

TUNELi test

Apoptoosi tuvastamine tehti TUNEL-testiga. Lühidalt, KB rakke (1 x 106/35 mm klaasist põhjaga nõu) inkubeeriti 5 mM DM-β-CyD või FA-M-β-CyD-ga temperatuuril 37 ° C 1 tund. Rakke pesti PBS-ga ja fikseeriti inkubeerimisega 4% paraformaldehüüdis PBS-is 1 tund toatemperatuuril. Terminaalse deoksünukleotidüültransferaasi (TdT) vahendatud dUTP hüüdnime ja märgistamise (TUNEL) testid viidi läbi TACS® 2 TdT-DAB in situ apoptoosi tuvastamise komplekti (Trevigen Inc., Gaithersburg, MD) abil vastavalt tootja juhistele.

Lõhestatud kaspaas 3 test

Kaspaas 3 lõhustumise test viidi läbi Western blot analüüsiga. Lühidalt, KB rakke (1 x 106/35 mm tassi) inkubeeriti RPM-1640 söötmega (FA-vaba), mis sisaldas 10 mM DM-β-CyD või FA-M-β-CyD, 2 tundi. Pärast PBS-ga pesemist lüüsiti rakud 4-kordse proovipuhvriga (8% SDS, 40% glütserool, 24% β-merkaptoetanool Tris-HCl puhvris (pH 6, 8)) ja keedeti 5 minutit. Pärast valgukontsentratsioonide määramist bitsükoniinhappe reagendiga Pierce Chemicalilt (Rockford, IL) eraldati proovid (valkudena 20 μg) 12% SDS-PAGE ja kanti Immobilon P membraanidele (Nihon Millipore, Tokyo, Jaapan). Membraanid blokeeriti 5% lõssiga PBS-is, mis sisaldas 0, 1% Tween 20 (PBS-T), ja inkubeeriti öö läbi temperatuuril 4 ° C kaspaas 3 antikehaga (Santa Cruz, Delaware, CA). Pärast pesemist PBS-T-ga inkubeeriti membraane peroksüdaasiga konjugeeritud lammaste sekundaarse antikehaga (Amersham-pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Spetsiifilised ribad tuvastati ECL Western blot analüüsi komplekti abil (Amersham Bioscience, Tokyo, Jaapan). Ribade tuvastamiseks kasutati Lumino-pildianalüsaatorit LAS-1000 plus (Fujifilm, Tokyo, Jaapan). Lõhustatud kaspaas 3 / pro-kaspaas 3 riba intensiivsuse suhet analüüsiti Image-J tarkvara abil.

Autofagosoomide moodustumine

Lühidalt, KB rakke (1 x 106/35 mm tassi) inkubeeriti 2 tundi FA-M-β-CyD-ga (5 mM), eeltöötluseta autofaagilise inhibiitoriga 1 μM LY294002. h ja seejärel töödeldi rakke Cyto-ID® Autophagy Detection Kit-ga. Rakkude vaatlemiseks kasutati Biozero BZ-8000 (KEYENCE) fluorestsentsmikroskoopi.

Valguagregaatide puhastamine autofagia kaudu

Valguagregaatide kliirensit autofagia kaudu hinnati Premo ™ Autofágia andurite abil. Lühidalt, rakke (5x105 / 35 mm klaasist põhjaga tassi) inkubeeriti 24 tundi RPMI-1640 söötmega (FA-vaba). Pärast pesemist PBS-ga lisati söötmele 25 ui GFP-p62. Pärast 16-tunnist inkubeerimist pesti rakke PBS-ga ja inkubeeriti 10 tundi 50 uM klorokiiniga. Seejärel inkubeeriti rakke 5 mM FA-M-β-CyD-ga 50 uM klorokiini juuresolekul 2 tundi. Pärast pesemist RPMI-1640 söötmega (FA-vaba) kasutati rakkude vaatlemiseks Biozero BZ-8000 (KEYENCE) fluorestsentsmikroskoopi.

Statistika

Kõik katsed viidi igas mõõtmistes läbi kolmes eksemplaris ja iga seeriat korrati rohkem kui kolm korda. Katsetulemused on esitatud keskmisena ± SEM. Proovide võrdluse olulisuse tasemed määrati Scheffe testiga. Statistilise olulisuse tase seati väärtusele P <0, 05.

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

    Lisajoonis 1

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.