Õhukeseseinalistest õietolmudest saadud täispuhutud sporopolleniini kapslid | teaduslikud aruanded

Õhukeseseinalistest õietolmudest saadud täispuhutud sporopolleniini kapslid | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Biovapustatud materjalid
  • Orgaanilised molekulid materjaliteaduses

Abstraktne

Sporopolleniin on füüsiliselt vastupidav ja keemiliselt vastupidav biopolümeer, mis koosneb õietolmu seinte kõige välisemast kihist ja on esimene kaitseliin karmide keskkonnatingimuste vastu. Sporopolleniini ainulaadsed füüsikalis-keemilised omadused motiveerivad üha enam sporopolleniini eksistentsikapsleid (SEC-sid) ekstraheerima õietolmu seintelt kui kapseldamise rakenduste orgaaniliste mikrokapslite taastuvat allikat. Vaatamata suurele hulgale erineva suuruse ja seinapaksusega õietolmuliikidele on õietolmu jäljendavate SEC-ide tõeline ekstraheerimine piirdunud jäikade mehaaniliste omadustega paksu seinaga õietolmukapslitega. On rahuldamata vajadus töötada välja meetodid SEC-ide valmistamiseks õhukeseseinalistest õietolmukapslitest, mis moodustavad suure osa kõigist õietolmuliikidest ja millel on atraktiivsed materjalide omadused, näiteks suurem aerosoolide dispersioon. Selles teatame esimesest õnnestunud täispuhutud SEC-i mikrokapslite ekstraheerimisest õhukese seinaga õietolmu liikidelt ( Zea mays ), ületades sellega traditsioonilisi probleeme mehaanilise stabiilsuse ja mikrostruktuuri kadumisega. Äsja välja töötatud ekstraheerimisprotokolliga saadud SEC-ide morfoloogiline ja kompositsiooniline iseloomustus kinnitab edukat valkude eemaldamist koos nanomõõtmeliste arhitektuuriliste tunnuste säilitamisega. Tulevikku vaadates on suurepärane potentsiaal rakendada sarnaseid strateegiaid paljude uurimata õhukese seinaga õietolmu liikide osas.

Sissejuhatus

Taimede 1, 2 asustamise ja levimuse võtmeteguriks on keerukate seinakujuliste õietolmukapslite evolutsiooniline kohandamine. Koosnedes kahekihilisest sisemisest kihist ja välimisest välimisest kihist 3, 4, 5, 6, moodustab õietolmu sein väga kohanemisvõimelise ja tugeva konstruktsiooni, mis võib vastu pidada karmidele keskkonnatingimustele ja keemilisele töötlemisele 7, 8 . Õietolmuseina füüsilise tugevuse põhjuseks on jäik sisemine kiht, mis koosneb tselluloosist, hemitselluloosist ja ligniinist, samas kui sporopolleniinina tuntud biopolümeerist koosnev välimine kiht aitab suurendada seina vastupidavust sporopolleniini-spetsiifiliste omadustega 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11 . Õietolmu pindadele ilmuvad sporopolleniini iseloomulikud kaunistused ja õietolmu terade suurus on taimeliikide 9, 12 arenguga lahknenud, kuid kõik sporopolleniini perekonna liikmed on säilitanud olulised füüsikalis-keemilised omadused, et hoida ära ultraviolettvalgust - põhjustatud kahjustused, pikaajaline desikatsioon, oksüdatiivsed vabad radikaalid ja mikroobide rünnak 4, 13, 14, 15 .

Õietolmuterad on põhimõtteliselt mikromõõdulised transpordivahendid, mis sisaldavad tundlikku teavet ja mida tuleb kaitsta ja säilitada kuni naiste reproduktiivstruktuuride vastuvõtmiseni 4 . Kuna tegemist on esimese kaitseliiniga, on sporopolleniin varustatud mitmesuguste evolutsioonil põhinevate vastupidavate omadustega, mis on spetsiaalselt loodud kaitseks ja vastupidavuse tagamiseks, et püsida elujõulisena pikema aja vältel. Tänu nendele atraktiivsetele omadustele ning suurele ja taastuvale varudele on õietolmuterad pälvinud laiema teadusringkondade tähelepanu ja osutunud suurepärasteks mikrokapsliteks kapseldamisel 3, 16, 17 . Bioühilduvuse ja allergeensuse võimalike probleemide lahendamiseks töötati välja ekstraheerimise teel valguvaba mikrokapsli derivaat, mida nimetatakse sporopolleniini eksistentsikapsliks (SEC), mis jätab ainult sporopolleniini õõnes kihi, mis ise toimib mikrokapslina ja mida saab kasutatakse kapseldamisrakendustes 15, 18, 19, 20, 21, 22 . Mikrokapslina on SEC-id demonstreerinud suurt mitmekülgsust selliste rakenduste jaoks nagu biokujutis 23, maitsemask 19 ja isegi rakkude külvamise karkassid 20 .

Kasutades ära sporopolleniini füüsikalis-keemilist vastupidavust, on SEC-ide 21, 24, 25, 26, 27 ettevalmistamiseks loodud mitmeid eksineerimise meetodeid kõrge temperatuuri ja söövitavate kemikaalide jaoks, säilitades samal ajal looduslikud morfoloogilised omadused, sealhulgas keerulise pinna topograafia 9, 25 . Siiski on praegused jõupingutused keskendunud ainult väikese taimeliikide, sealhulgas Lycopodium clavatum 3, 15, 17, 19, 22, 23, 24 ja Helianthus annus 16 õietolmule või eostele . Tõepoolest, SEC-i protsesside arendamine on piirdunud mikromeetri paksuseinaliste õietolmu liikidega, millel on kõrge mehaaniline stabiilsus, mis hõlbustab mikroarhitektuuri tunnuste edukat säilimist kõigis karmides töötlemisetappides. Teisest küljest jääb SEC arendamine submikronilistest õhukeseseinalistest õietolmuliikidest nõrgaks mehaaniliste omaduste tõttu, mis takistavad konstruktsiooniliste omaduste usaldusväärset säilimist. Arvestades, et õhukeseseinalistel õietolmuteradel on suurem aerosoolide dispersioon 28 ja erinevad lagundamismehhanismid 29 kui paksuseinalistel õietolmuteradel, on tugev motiiv arendada SEC-e õhukeseseinalistest õietolmuliikidest välja uute rakenduste, näiteks aerosoolravimite kohaletoimetamise, ja erineva lagunemiskäitumisega SECidest.

Üks paljulubav näide submikronilistest õhukese seinaga õietolmuliikidest on Zea mays õietolm, millel on atraktiivsed materjaliomadused, mis tulenevad selle staatusest maailmas kõige levinumalt kasvatatava põllukultuurina ja ainulaadsetest ehitusomadustest. Zea mays õietolmu terad on teiste liikidega võrreldes suurema suurusega, läbimõõduga 70 kuni 100 μm, sõltuvalt hüdratsioonitingimustest 30 . Zea mays õietolmu mitmekihiline kate, mis koosneb eksiini, sisemise ja lipiidide fraktsioonist 31, 32, on õhuke (~ 1 μm) 33 ja elastne, kuid samas piisavalt vastupidav, et toetada selle sfäärilist kuju ilma rebenemiseta 12 . Siiani on SEC-ide edukas ekstraheerimine Zea mays õietolmu teradest endiselt raske. Dominguez jt teatasid esimesest katsest Zea mays sporopolleniini ekstraheerida . hinnates mitmesuguseid õietolmuterasid, sealhulgas Betula alba , Ambrosia elatior, Zea mays ja Pinus pinaster 25 terad. Põhjalikul keemilisel töötlemisel näitasid igat tüüpi õietolmuosakesed tselluloosi puudumist, millel oli sporopolleniini põhistruktuurile ebaoluline mõju. Lõppprodukti morfoloogiline iseloomustamine näitas siiski, et Zea mays'e kortsunud struktuurideta jäänused säilitasid kõik muud liigid oma loomuliku kuju 25 . Ehkki õietolmu kahjulikkus (õietolmuterade loomulik voltimine või kokkukleepumine vastusena kuivamisele) on varem kindlaks tehtud ja laialt tuntud kui dehüdratsiooni vastane looduslik kaitsemehhanism 7, 8, 11, 34, oli Zea mays SEC- ide täielik varisemine taastumatu viimane etapp, mis osutab, et töötlemisprotokolli parandamine oleks tehnoloogiliselt elujõuliste SEC-ide saamiseks kasulik.

Neid tegureid arvesse võttes oleme välja töötanud täiustatud meetodi morfoloogiliselt puutumatute õhukese seinaga SEC-de saamiseks Zea mays õietolmukapslitest, kasutades ühe poti happelist hüdrolüüsiprotsessi, vältides vaheetapis täielikku dehüdratsiooni. Meie teada on see esimene aruanne õhukese seinaga SEC-ide kohta, millel on konserveeritud sisemised struktuurilised omadused nii mikroskaala kui ka nanomõõtme režiimis. Kapsli iseloomustamiseks kasutati skaneerivat elektronmikroskoopiat (SEM), dünaamilise kujutise osakeste analüüsi (DIPA), CHN elementide analüüsi ja konfokaalset laserskaneerimise mikroskoopiat (CLSM). SEM võimaldas kõrgresolutsiooniga pildistamist, et täpselt võrrelda saadud töötlemisstrateegiate abil saadud SEC-ide morfoloogilisi karakteristikuid ning DIPA-d kasutati suure läbilaskevõime mõõtmiseks ja sekundaarseks morfoloogiliseks iseloomustamiseks. CSLM-i kasutati ka SEC morfoloogiliseks iseloomustamiseks. Lisaks andis CHN elementaaranalüüs koostise teavet jääkvalgu määra kohta. Kokkuvõttes näitavad leiud, et õhukese seinaga SEC-sid saab valkude eemaldamise efektiivsusega 82%, kasutades happelise hüdrolüüsi ekstraheerimise meetodit 85 (mass / maht)% fosforhappe (H 3 PO 4 ) korral 2, 5 tunni jooksul.

Eksperimentaalne osa

Zea mays õietolmu materjal

Rasvatustatud Zea mays õietolmuterad saadi ettevõttest GREER® Source Materials (USA) ja tarnitud õietolmu eeltöödeldi ACS-klassi etüüleetriga, et eemaldada vahajas kate ja muud õietolmuterade rasvhapete koostisosad.

Zea mays Sporopollenin Exine kapslite (SEC) ekstraheerimine

Uuriti kolme representatiivset lähenemist SEC ekstraheerimisele, sealhulgas 6 M HCl hüdrolüüsi, H 3 PO 4 hüdrolüüsi ja etanooli ultraheli. ( 1 ) hüdrolüüs 6 M HCl-ga; Kaks grammi rasvatustatud Zea mays õietolmu terad suspendeeriti 6 M HCI-s klaasjahutiga varustatud ümarapõhjalises perfluoroaloksü (PFA) kolvis. Kergelt loksutades kuumutati lahust tagasijooksutemperatuuril 70 ° C 10 tundi. Saadud SEC-id koguti vaakumfiltriga ja pesti seejärel rea orgaaniliste ja vesilahuste seeriaga järgmiselt: 5x vesi (100 ml), 2 x atsetoon (100 ml), 1 x 2 M HCl (100 ml), 5 X vesi (100 ml), 2 x atsetoon (100 ml), 1 x etanool (100 ml). Iga pesemise vahel jäeti SEC-id suspensiooniks vähemalt viieks minutiks, filtreeriti seejärel lahusti vahetamiseks vaakumis. Pärast lahustivahetuse jadapesu lõpetamist koguti SEC-id ja kuivatati kaheksa tundi temperatuuril 60 ° C ning säilitati edasiseks iseloomustamiseks. ( 2 ) Happeline hüdrolüüs H3P04-ga; Zea mays õietolmu töötlemine on identne ülaltoodud protokolliga, kuid hüdrolüüsi jaoks erineva happega. ( 3 ) etanooli ultraheli töötlemine; Kaks grammi rasvatustatud Zea mays õietolmu terad suspendeeriti 50 ml etanoolis ja asetati üheks tunniks vanni ultrahelitöötlusse. Pärast 5-minutist tsentrifuugimist kiirusel 3000 pööret minutis eemaldati supernatant, asendati värske etanooliga ja pandi seejärel ultrahelitöötluseks veel 30 minutiks. Etanool asendati uuesti tsentrifuugimisega ja pesti 25 ml veega, seejärel pandi 50 ml atsetooni veel 30 minutiks vanni sonikeerimiseks. Pärast atsetooni eemaldamist pesti proovi viis korda 25 ml veega, filtriti ja kuivatati kaheksa tundi temperatuuril 60 ° C.

Uute puutumatute Zea mays SEC-ide saamise protokolli osas tehti ekstraheerimisjärgsetes protsessides muudatused järgmiselt. Pärast happe hüdrolüüsi vaakumfiltritud SEC-sid loputatakse puhta, keeduklaasi asetatud 20 cm × 20 cm läbimõõduga nailonvõrguga (ϕ: 30 μm) (Elko Filtering, USA) värske Milli-Q-ga töödeldud veega. SEC-suspensiooni hoitakse 5 minutit nõrga loksutamisega vees. Seejärel võrgusilm kantakse üle ja leotatakse uude keeduklaasi, millesse on 5 minutit eelkuumutatud temperatuuril 50 ° C. Sama tüve-dialüüsi pesemise meetodit korratakse 50 ° C Milli-Q veega (4X), 50 ° C atsetooniga (2X), 50 ° C 2M HCl-ga (1X), 50 ° C veega (kuni neutraliseeritakse pH väärtusel 7–8). ), 50 ° C atsetoon (2X), siis 50 ° C etanool (2X). Pärast viimast pesemist kantakse võrk magedasse vette, mida kuumutatakse siis 30 minutit temperatuuril 80 ° C suitsukatte all, et vabaneda atsetoonist ja etanoolist. Saadud SEC-id eemaldatakse võrgusilmast ja hoitakse 50 ml torus koos 20 ml Milli-Q veega 4 ° C juures edasiseks iseloomustamiseks.

Elementaaranalüüs

Zea mays õietolmu terade ja ekstraheeritud SEC-ide kompositsioonianalüüs viidi läbi kalibreeritud VarioEL III CHN elementaalanalüsaatoriga (Elementar, Saksamaa). Ligikaudu 5 mg igast kuivatatud proovist pandi vähemalt üheks tunniks enne CHN lugemist 60 ° C ahju. Märgade proovide jaoks kuivatati enne analüüsi 5 ml suspensiooni üleöö temperatuuril 60 ° C. Proovide valgukontsentratsioonid arvutati tuvastatud lämmastiku kontsentratsiooni ja Kjeldahli lämmastiku (TKN) teisendusteguri 6, 25 abil vastavalt Analüütiliste Kogukondade Assotsiatsiooni (AOAC) 35 soovitustele, nagu on näidatud allpool:

Image

Skaneeriv elektronmikroskoopia (SEM)

SEM-i morfoloogiline iseloomustamine viidi läbi töötlemata õietolmu teradel ja töödeldud SEC-del, kasutades FESEM 7600F instrumenti (JEOL, Jaapan). Töödeldud ja töötlemata proovid kaeti plaatinaga paksusega 10 nm JFC-1600 (JEOL, Jaapan) (20 mA, 60 sek). Proovide vaatlemisel kasutati erineva suurendusega 5, 00 kV kiirenduspotentsiaali. Proovide ristlõikepiltide saamiseks külmutati õietolmu terad krüogeenselt vedelas lämmastikus. Fikseeritud proovid lõigati seejärel kirurgilise teraga kuubikuteks ja kaeti vaatluseks plaatinaga.

Kujutise dünaamiline analüüs (DIPA)

Instrument FlowCam ® (Fluid Imaging Technologies, USA) varustati 200 μm vooluhulgaga (FC-200) ja 20-kordse suurendusega objektiiviga (Olympus, Jaapan) ning seda juhib tarkvarapakett VisualSpreadSheet 3.4.4. Proovi ettevalmistamiseks suspendeeritakse enne mõõtmist 5 mg igast kuivast proovist 5 ml vees, kusjuures 1 ml igast niiskest proovist lahjendatakse mõõtmiseks 4 ml veega. Mõõtmised koguti automaatselt fikseeritud kiirusega 10 kaadrit s – 1 ja kujutiste kogumine toimus sisemise filtriga osakeste jaoks vahemikus 55–75 μm. Iga mõõtmise jaoks koguti vähemalt 100 000 osakest ja servagradiendi abil valiti igast pildipartiist 1000 suure fookusega osakest. Osakeste morfoloogia mikromeerilist analüüsi hinnati läbimõõdu, kuvasuhte ja ringikujulisuse järgi ringikujuliselt. Kuvasuhe mõõdab iga osakese pikkuse ja laiuse suhet, samal ajal kui ring-fit parameeter nummerdab osakese serva kõrvalekalde ligikaudsest kõige sobivamast ringist, mille on määranud tarkvara.

Konfokaalse laserskaneerimise mikroskoopia (CLSM)

Õietolmu terade ja SEC-ide autofluorestsentsi jälgiti konfokaalse laserskaneerimise mikroskoopiaga (Carl Zeiss LSM700, Saksamaa), mis oli varustatud kolme spektraalselt peegeldatud / fluorestsentsi tuvastamise kanaliga, kuue laseriga (405/458/488/514/543/633 nm) ja Z1 tagurpidi mikroskoop (Carl Zeiss, Saksamaa). Proovid fikseeriti kahe kleepuva slaidi vahel (Ibidi, Saksamaa) tilga Vecatashield ® Mounting Mediumiga (Vector Laboratories, USA) ja pildid jäädvustati EC Plan-Neofluar 40 × / 1, 30 Oil DIC M27 objektiivi all (Carl Zeiss, Saksamaa). järgmiste seadistustega: laseri ergastuslainepikkused lainepikkustel 405 nm (10, 0%), 488 nm (11, 0%) ja 561 nm (10, 0%), mis on tuvastatud vastavalt emissioonipaigaldistega 410–516, 493–556 ja 566–685 nm; Tasapinnalise skaneerimise režiimis fikseeriti laserskaneerimise kiiruseks 67 sekundit iga faasi kohta ja piksli viivituse ajaks seati 12, 6 μsec. Kõiki tehtud pilte töödeldi tarkvara ZEN 2008 abil (ZEISS, Saksamaa).

Tulemused ja arutlus

Selle töö põhieesmärk on töötada välja meetod, mille abil Zea mays õietolmu terade happelisel hüdrolüüsil saadakse läbipaistvad sfäärilised kapslid, millel puudub täielikult sporoplasmaatiline sisu, saades omakorda valguvabad kapslid (joonis 1a). Selle eesmärgi saavutamiseks ekstraheeriti Zea mays SEC-i algselt ühe poti töötlemismeetodil, mis järgis eelnevalt avaldatud protokolli 36, 37 . See koosnes 85 (mass / maht)% H3P04 tagasijooksul temperatuuril 70 ° C 10 tundi, millele järgnes rida pesemisetappe. Saadud kapsleid jälgiti morfoloogiliseks võrdluseks SEM-ga ja töötlemata õietolmuterade abil. SEM-piltide põhjal selgus, et esialgsed õietolmu terad nende natiivsel kujul ei olnud täielikult sfäärilised. Selle asemel tundusid nad kortsus ja neil puudusid korrapärased mustrid ega struktuurid. Teraviljapinnal oli juhuslik kokkukleepumine ja depressioon, ehkki jämedad morfoloogilised tunnused olid puutumatud (joonis 1b). Teisest küljest olid kõik töödeldud kapslid tugevalt kokku kukkunud või pragunenud, nagu on näha jooniselt fig 1c, peegeldades Dominguezi jt leide . 25 .

Image

(a) Tavalise protokolli koomiksiskeem, mis koosneb happe hüdrolüüsi etapist, millele järgneb ulatuslik pesemine, mille käigus loodetakse saada natiivset vormi säilitavad kapslid. Tavapärasest protokollist saadud SEM-tulemused näitavad töötlemata õietolmu (b) ja töödeldud SEC-e (c), millel on pärast töötlemist tugev purunemine (*) ja paakumine (#).

Täissuuruses pilt

Võttes arvesse H3P04 negatiivset mõju kapsli morfoloogiale ja SEC-ide karmi töötlemist happehüdrolüüsiga 10, võeti kasutusele kaks täiendavat SEC-i ekstraheerimise meetodit. Ühe meetodi kohaselt ekstraheeriti SEC-sid sama happe hüdrolüüsi meetodil, kuid H3P04 asemel HCl-ga, mis valiti selle tselluloosi lagunduvuse 38 põhjal . Lisaks valmistati SEC-sid etanooli ultrahelitöötlusmeetodi abil, mida on varem soovitatud õrnade õietolmu terade jaoks 26 . Selles teises meetodis suspendeeriti õietolmuterad etanoolis ja sonikeeriti kaks korda ultrahelitöötlusringide vahel värske etanooliga, seejärel pesti enne edasist iseloomustamist. Saadud SEC-ide morfoloogilisi omadusi analüüsiti SEM-ga ja viidi läbi CHN-i elementaaranalüüs (joonis 2). Kahe happelise hüdrolüüsimeetodi abil H3P04 ja HCl abil valmistatud SEC-ide SEM-kujutised näitasid nii kõverdumist kui ka üldist struktuurilist ebastabiilsust. Leiti, et suur osa kapslitest on kõigi happelistega töötlemisel kahjustatud. Suurema suurendusega piltide puhul selgus, et vaatamata ulatuslikule pesemisele kleepusid SEC-i pinnale praht, hoolimata ulatuslikust pesemisest, samas kui H3P04-ga töödeldud SEC-id näitasid minimaalset praaki (joonis. S1). CHN tulemused kinnitasid H 3 PO4 töötlemise paremust, registreerides SEC-is 0, 68% lämmastikusisaldust võrreldes 2, 64% -lise lämmastikusisaldusega HCl-ga töödeldud SEC-des.

Image

a) Töötlemata Zea mays õietolm pärast dehüdratsiooni, b) 10-tunnise happehüdrolüüsi tagajärjel tekkivad SEC-id 85% H 3 PO 4 -s, c) 10-tunnise HCl hüdrolüüsi SEC-id ja (d) etanoolist ultrahelitöötlusega saadud SEC-id. e) Keemilist koostist analüüsitakse CHN-analüüsiga ja see esitatakse keskmiste väärtustena standardhälbega (n = 3). ** Valgusisaldus arvutatakse spetsiifilise Jonesi faktoriga, nagu on kirjeldatud Kjeldahli meetodil 33 .

Täissuuruses pilt

Seevastu etanooliga töötlemisel ultraheliga ekstraheeritud SEC-id näitasid silmatorkavalt ainulaadset välimust võrreldes happega hüdrolüüsitud SEC-idega. Kõige olulisem on see, et etanooliga töötlemisel saadud SEC-id säilitasid oma sfäärilised struktuurid vähese purunemisega, kuid väga moonutatud pinna topograafiaga, millel puudus töötlemata õietolmu sujuvus. SEC-i sees oli ilmnenud kondenseerunud südamiku struktuur koos ainult piiratud voltumisega. Kuid CHN-analüüs ei näidanud keemilises koostises märgatavaid muutusi, mis viitab valkude madala eemaldamise efektiivsusele. Ehkki etanooli sonikeerimise meetodist ei piisa valgu sisalduse vähendamiseks, esitas see ka tõendeid, et sisemine tugistruktuur võib aidata vähendada kapsli purunemise ulatust. Nendest katsetest järeldame, et happeline hüdrolüüs H3P04-ga on kõige sobivam meetod valguvabade kapslite tootmiseks edasiseks uurimiseks.

Ajendatuna kapslite struktuurilise tugevdamise võimalusest tühja õõnsuse täitmisega, püstitasime hüpoteesi, et sfäärilise morfoloogia säilitamiseks piisab vedela keskkonna säilimisest kapsli sees. Lühidalt, Zea mays SEC-e ekstraheeriti sama 10-tunnise tagasijooksuga temperatuuril 70 ° C 85 (mass / maht) H3P04, kuid pesemine viidi läbi dialüüsiga, et minimeerida aeg õhus või vaakumis. Selle tulemusel oleksid tühjad kapslid alati ülespuhutud olekus (üksikasjalikku kirjeldust vt meetoditest). Pärast viimast pesemisetappi etanooliga dialüüsiti SEC-sid deioniseeritud veega ja hoiti säilitamiseks vees. Dehüdratsiooninõude vältimiseks viidi SEM-i asemele DIPA-analüüs algse protokolli ja muudetud protokolli põhjal saadud kahte tüüpi SEC-ide võrdlevaks analüüsiks. Võrdlustulemused näitavad, et sfääriline morfoloogia oli enamiku osakeste jaoks suures osas säilinud, ehkki alles mõned kahjustatud osakesed (joonis. S2). Morfoloogiliselt säilinud osakeste saagise parandamiseks testiti ka SEC-i ekstraktsioone, mille H 3 PO4 happekontsentratsioon oli 63, 5 (mass / maht) või 42, 5 (mass / maht). Ekstraheeritud SEC-sid hoiti sfäärilise struktuuri säilitamiseks hüdraatunud ja lõppprodukte hinnati DIPA ja CHN analüüsiga, nagu on näidatud joonisel 3. SEC-id, mis saadi 63, 5 (mass / maht)% H 3 PO4, näitasid paljulubavaid tulemusi võrreldavad. 85% (mass / maht)% H 3 PO4-st saadud valkude eemaldamise efektiivsusega vastavalt 80, 3% ja 85, 2%, mis on saadud protsentuaalse defekti väärtuse parandamisel 51, 4% -lt 37, 5% -ni. 42, 5 (mass / maht)% H3P04-ga töötlemisel saadud SEC-id vähendasid veel defektsete SEC-ide esinemist 29, 7% -ni, kuid see tingimus ei olnud valkude efektiivseks eemaldamiseks piisav.

Image

Testitud H3P04 kontsentratsioonid olid 85 (mass / maht)%, 63, 5 (mass / maht)% ja 42, 5 (mass / maht). Morfoloogiline iseloomustus dünaamiliste kujutiseosakeste analüüsiga (DIPA) (skaalariba = 40 μm) (vasakul). CHN-analüüsist arvutatud valgu eemaldamise efektiivsus ja osakeste jälgimisel arvutatud defekti protsent väljendatakse keskmise ja standardhälbega (n = 3).

Täissuuruses pilt

Huvitav on see, et mitu puutumatut SEC-i, mis moodustasid 42, 5 (mass / maht)% H 3 PO 4 hüdrolüüsi, olid näha munakollastes struktuurides, mille tihedad värvilised piirid (umbes 65% kogu partiist) olid kinnitatud kas välimise kihi külge või hõljuvad hõlpsalt õõnsuses, millesse läbipaistmatud jäljed on koondunud (joonis. S3). Sarnaseid esemeid täheldati ka kahjustatud osakeste väikeses populatsioonis, mis olid osaliselt kinnitatud väärastunud eksiiniga (joonis. S3). Tuginedes töötlemata õietolmu varjutamise sarnasusele ja tuginedes CHN-analüüsile, mis näitas esialgse proteiinisisalduse umbes 69% säilivust, näis tuum järelejäänud sporoplasmi kontsentraadina, samas kui tihedad piirid arvati olevat sisemist kaitsvat tuum. Vastavalt Zhang et al. , saavutatakse tselluloosi täielik lahustumine H 3 PO 4-s ainult siis, kui happe kontsentratsioon ületab 81, 7 (mass / maht)%, samas kui eeldatakse pöörduvat paisumist kontsentratsioonidel alla 80 (mass / maht)% 39 . See suundumus sobib hästi meie puutumatute sisekihtide vaatlusega 42, 5 (mass / maht) H3P04-töödeldud SEC-ides, samas kui kõrgemate happekontsentratsioonide korral toimus täielik lahustumine.

Tunnistades vajadust eemaldada sisemine rühm, käsitleti SEC-i ekstraheerimise üldist mehhanismi kaheetapilise protsessina: esmalt käsitleti rinnanäärme täielikku lahustumist kiirust piirava sammuna (joonis S4), millele järgnes ülejäänud osa eemaldamine. sporoplasmist eraldatud eksikapsli saamiseks. Mõlema etapi vajaduste rahuldamiseks otsustati, et vaatamata selle söövitavusele, 85 (mass / maht)% H 3 PO4. Töötlemistulemuse parandamiseks varieerisime happe hüdrolüüsi etapi kokkupuuteaega järgmiselt. SEC-id valmistati 85 (mass / maht)% H3P04-ga 70 ° C juures ja SEC-i proovid koguti pärast 1, 2, 5 ja 5-tunnist inkubeerimist DIPA ja CHN analüüsiks koos 10-tunnise töödeldud SEC-iga (joonis 4). Defektide protsendi järkjärgulist suurenemist täheldati pikema kokkupuuteajaga, mille järsk tõus, eriti vahemikus 2, 5 kuni 5 tundi, 9, 0% -lt 37, 3% -ni. Vahepeal näis, et H3P04 valkude eemaldamise efektiivsus saavutab oma haripunkti vahemikus 1 kuni 2, 5 tundi, koguvalgu suurenenud eemaldamisega tõustes 19, 5% -lt 82, 1% -ni. Nimelt ilmnes, et 1 tunni jooksul töödeldud SEC-ide läbipaistmatus oli sarnane 42, 5 (mass / maht)% H3P04-töödeldud SEC-idega, välja arvatud see, et esimestel oli ka puutumatu sisemine ring (joonised 3 ja 4). Vaatlusi vaadeldes vajas sisemise eemaldamise kiirust piirav samm umbes tund, mida tõendab intiini puudumine DIPA piltides ja valgu eemaldamise efektiivsuse järsk paranemine pärast esimest tundi. Järgmine 1, 5 tundi tundus olevat piisav sporoplasma koguse eemaldamiseks, mida näitab valkude eemaldamise efektiivsuse aste. Lisaks näis defektsete kapslite järsk suurenemine langevat kokku suurema koguse vähenemisega, mis rõhutab taas struktuuritoe olulisust Zea mays puutumata sfäärilise morfoloogia säilitamiseks. Ühiselt kinnitavad andmed, et 2, 5-tunnine töötlemine 85 (mass / maht)% H 3 PO4 on testitud tingimuste hulgas optimaalne, ainult defektiga 9% ja valkude eemaldamise efektiivsusega 82%.

Image

CHN-analüüsist saadud valkude eemaldamise tõhusust ja osakeste jälgimisel saadud defektide protsendi mõõtmist väljendatakse keskmise ja standardhälbega (n = 3). Graafiku esiletõstetud osa vastab punktiir-punktiga SEC-i töötlemise protokollile, mis on kindlaks määratud Zea mays SEC-i ettevalmistamise optimaalseks tingimuseks.

Täissuuruses pilt

Selle optimaalse SEC-i preparaadi täiendavaks iseloomustamiseks viidi läbi CSLM-i pildistamine ja tuvastati õietolmu jääkides autofluorestsentsi intensiivsuse muutus. Varem on öeldud, et looduslikud õietolmuosakesed eraldavad autofluorestsentsi lainepikkustel, mis on Pöhlker et al. 40 . Töödeldud SEC-sid ja töötlemata õietolmu teri jälgiti CLSM-i abil, et võrrelda koostise muutust, nagu registreeriti erinevustena autofluorestsentsi osas. Töötlemata Zea mays õietolmu CLSM-i piltides täheldati kogu õietolmu õõnsuses sinistes ja rohelistes kanalites eredat fluorestsentsi, millel oli kerge ka punane kanal (joonis 5a). Kui kõik fluorestsentskanalid liideti diferentsiaalse interferentsi kontrastsuse (DIC) mikroskoobi pildi peal, visualiseeriti homogeenne sinakasroheline fluorestsentsi sisaldav õietolmuosake, mille piiride ümber oli suhteliselt madal fluorestsents. Vastupidi, optimeeritud SEC-i CLSM-pilt kujutas intensiivset fluorestsentsi rohelistes ja punastes kanalites, samal ajal kui sinine kanal oli halvasti nähtav (joonis 5b). Kanalite ühendatud pilt andis erekollase või oranži fluorestsentsi, mis lokaliseeriti spetsiaalselt õietolmu seinale. Need tulemused näitavad sporoplasmaatiliste materjalide edukat eemaldamist. Morfoloogiliste omaduste, sealhulgas läbimõõdu, kuvasuhte ja ringikujulisuse hindamiseks viidi läbi ka mikromeerne analüüs DIPA mõõtmistega (joonis 5c). Nagu arvata võis, täheldati töötlemata terade ja töödeldud SEC-ide läbimõõdu erinevust, vähendades suurusjärku märkimisväärselt ~ 20% - 80 μm kuni 64 μm. Vahepeal olid nii töötlemata õietolmul kui ka SEC-il sarnased jaotusprofiilid kuvasuhte ja ringikujulisuse järgi, kontsentreerituna spektri tippu, mis näitab algse sfäärilise konformatsiooni säilimist. Kokkuvõtlikult võib öelda, et SEC-id, mida ekstraheeriti 2, 5 tunni jooksul 85 (mass / maht)% H 3 PO4, olid sporoplasmaatiliste jäänusteta piisavalt vabad ja suuresti terved, säilitades samal ajal töötlemata terade iseloomuliku struktuurilise väljanägemise. Veelgi enam, SEC-sid oli võimalik laadida veise seerumi albumiiniga kui näidisühendiga ja, mis kõige tähtsam, näitas SEM-i iseloomustus, et ravimite laadimine pakub struktuuritoetust mikrokapslite täispuhutud morfoloogia säilitamiseks ka kuivatatud olekus (joonis. S5).

Image

a) CLSM-i tuvastatud töötlemata Zea mays õietolmu autofluorestsentsi esitletakse vastavalt sinise, rohelise ja punase kanali jaoks ja seejärel liidetakse vastava DIC-kujutisega. (b) SEK-de autofluorestsentstuvastust väljendatakse samas võrdlemise järjekorras. c) nii töötlemata õietolmu kui ka SEC-ide mikromeerilised omadused, mida morfoloogia osas analüüsitakse kolmes kategoorias: läbimõõt, kuvasuhe ja ringikujulisus.

Täissuuruses pilt

Töötlemata ja töödeldud proovide edasiseks iseloomustamiseks võrreldi SEC-ide eraldusvõimega SEM-pilte töötlemata õietolmu teradega, keskendudes eriti õietolmu seina põhijoontele (joonis 6). Järgides modifitseeritud happe hüdrolüüsi SEC ekstraheerimise protokolli skeemi, koguti eeltöödeldud ja järeltöödeldud proovid, külmutati ja purustati, et saada õietolmu seinte ristlõige (joonis 6a). Töötlemata õietolmuproov paljastas seina välis- ja sisekülgedel vahajas ülekatte, millel oli üldine sile kuju (joonised 6b ja S6). Pärast töötlemist H3P04-ga eemaldati idanemispoori ummistav sisu, jättes põhiava koos nanopooridega kogu pinna taha (joonised 6c ja S6). ~ 500 nm paksuse väliseina ristlõike vaade näitas täpselt määratletud väliseid substruktuure, sealhulgas välimist tektumikihti, mida kaunistasid spinnad, ja basaaljala kihti, mis oli tekti külge kinnitatud sammastega ~ 50 nm läbimõõduga collumellae. Nanokanalid olid näha ka kogu tektumi kihis, andes sellele triibulise välimuse (joonis 6c). Kokkuvõtlikult näitavad SEM-mikrograafiad optimaalse H 3 PO 4 töötluse tõhusust seina pinnalt eksogeensete prahtide eemaldamiseks, säilitades samal ajal õietolmu seina kõik peamised konstruktsioonilised omadused.

Image

a ) Õietolmust SEC eraldamise protsessi skemaatiline illustratsioon (vasakul). SEM täheldab põhiliste tunnuste muutumist töötlemata õietolmu osakestest (I) lõplikuks SEC (IV). b) Zea mays õietolmu seina idanemis poor ja läbilõige. c) Zea mays SEC seina idanemispoor ja läbilõige on esitatud märgistatud exine sektsioonidega.

Täissuuruses pilt

Selles uuringus saadud tulemuste põhjal on joonisel 7 esitatud õietolmuteradest SEC-ide ekstraheerimisega seotud etappide terviklik ülevaade. Kiirust piirav samm, mis hõlmab sisemise lahustumist täielikult, määratakse H 3 PO4 abil. happe kontsentratsioon. Happe kontsentratsioonidel alla 80 (mass / maht)% H3P04 jääb sisemine rühm puutumata, varjates suure osa sporoplasmist happest, mille tulemuseks on kõrge valgupeetusega SEC-id. Happelise hüdrolüüsi läbiviimisel 85 (mass / maht)% H3P04-ga piisab täielikust lahustumisest soolas üks tund. Sporoplasma kahanemine toimub varsti pärast sisekesta eemaldamist, selle põhiosa eemaldatakse 2, 5 tunni jooksul. Edasine tagasivool kuni kümme tundi, mida oli algses protokollis 36, 37 ette nähtud, avaldas SEC-i puhtuse parandamisel ebaolulist mõju ja suurendas kahjulikult defektide osakaalu. SEC-i purunemiskiiruse suurenemise kriitilises punktis võrreldes platooliga valkude eemaldamise efektiivsuses (vt joonis 4) võib järeldada, et sporoplasma massisisu aitas stabiliseerida SEC-i struktuuri enne selle eemaldamist. BSA laadimise mõju mikrokapsli struktuurse terviklikkuse säilitamisele kuivamisel toetab seda mõtet veelgi. Selle struktuuritoe kaotamisel on vältimatu puutumatute SEC-ide järkjärguline kadu. Samuti kaasneb morfoloogia täieliku kokkuvarisemisega dehüdratsioon, mis aitab veelgi kaasa struktuurilise toe puudumisele. Seega on 2, 5-tunnine töötlemine 85 (mass / maht)% H 3 PO4-ga katsetatud tingimuste põhjal optimaalseks töötlemisskeemiks Zea mays SEC tootmiseks. Samuti soovime kommenteerida valkude eemaldamise tõhusust. While ~85% protein was removed from the SECs, there was a small remaining fraction based on the CHN analysis that should be considered in the context of in vivo applications and potential risk of allergenicity. In principle, the residual protein could affect the quality of drug loading although the preliminary BSA encapsulation data obtained in this study supports that the drug loading in the thin-walled pollen microcapsules is feasible and, in fact, beneficial. Looking forward, the addition of a benign surfactant treatment step may be considered among the possibilities to fully remove protein depending on the application need.

Image

Intine dissolution is the rate-limiting step to obtain SECs but the use of corrosive acid increases the chance of rupture with increasing time. Dehydration causes the flattening of capsules, and in some cases, causes rupturing of the capsules. The dotted box (*) is recommended as the optimal condition for Zea mays extraction.

Täissuuruses pilt

Conclusions

To date, SEC extraction from pollen grains has been limited to thick-walled, rigid pollen grains. The fundamental problem limiting the use of thin-walled pollen has been the lack of rigid structure in the exine wall and, in turn, reliance on the intine and sporoplasm for structural support. With the disintegration of its internal counterpart and corrosive effects of the treatment conditions, the exine sheath becomes susceptible to extrinsic forces and fragile from the chemical treatment eventually leading to structural failure. The required dehydration step in the conventional protocol further destabilizes the structure, resulting in complete morphological loss.

Through the systematic approaches taken here, various factors involved in acid hydrolysis of natural Zea mays pollen grains were evaluated. Based on our findings, we have outlined a two-step model whereby SECs are produced starting with intine removal followed by sporoplasm removal, and the protocol was optimized to maintain particle morphology. The required dehydration step was also avoided in order to bypass the natural tendency of pollen walls to buckle when exposed to drying and to address the need for structural support to maintain the original shape of Zea mays pollen. Taking all matters into consideration, a reconstructed protocol is proposed for the extraction of Zea mays SECs which consists of a 2.5 hour reflux in 85 (w/v)% H 3 PO 4 followed by dialysis with a series of solvents for washing, and finally, storage in an aqueous suspension. Based on this approach, successful Zea mays SEC production is reported for the first time with an optimized SEC extraction protocol. This new protocol opens the door to investigating a wide range of previously unexplored pollen species, especially those with thin and fragile walls which are attractive candidates for aerosol drug delivery and possess more sensitive degradation behaviors that could be exploited for controlled release. Also, the identified effects of pollen folding during SEC production will be useful in significantly improving product quality regardless of the pollen species and can even be exploited for applications that require controlled cycling of dehydration-rehydration. Lastly, the prodigious and renewable abundance of Zea mays pollen worldwide brings great promise towards scaling up the methodologies reported in this work towards generating renewable supplies of natural microcapsules.

Lisainformatsioon

How to cite this article : Park, JH et al. Inflated Sporopollenin Exine Capsules Obtained from Thin-Walled Pollen. Sci. Rep. 6, 28017; doi: 10.1038/srep28017 (2016).

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.