Konserveeritud ja mitmekesiste metaboolsete nihete tuvastamine riisitera arengu ajal | teaduslikud aruanded

Konserveeritud ja mitmekesiste metaboolsete nihete tuvastamine riisitera arengu ajal | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Ainevahetus
  • Taime füsioloogia

Abstraktne

Seemne arendamine on ette nähtud sünteesi ja akumulatsiooni reserveerimiseks ning geneetiliste ja biokeemiliste mehhanismide paljastamiseks on olnud suur uurimistöö keskmes. Ehkki proteoomilised ja transkriptoomilised analüüsid näitasid kaasatud geenide ja ensüümide dünaamilisi muutusi, puudub teave samaaegsete metaboolsete muutuste kohta. Siht -metaboolika meetodil uurisime siinkohal kahe japonica ja kahe indica kultivari dünaamilisi metaboolseid muutusi riisitera arengus, milles tuvastasime edukalt 214 metaboliiti. Statistilised analüüsid näitasid riisiterades nii kultivarist kui ka arengustaadiumist sõltuvaid metaboolseid muutusi. Üldiselt vastas etapispetsiifiline metaboolne kineetika arenevate terade füsioloogilisele seisundile ning metaboolsed muutused arenevates riisiterades on sarnased dikotilise Arabidopsise ja tomati varude kogunemise etapis toimuvate muutustega, kuid erinevad seemnete kuivamise etapis toimuvate kaheidulehtede omadest. Japonica ja indica riisitera metaboliitide sisalduse märkimisväärset erinevust täheldati reservi kogunemise etapis. Metaboliitide ja metaboliitide korrelatsiooni analüüs paljastas mitmete metaboliitide potentsiaalsed uued teed. Kokkuvõttes paljastas see uuring nii konserveeritud kui ka mitmekesise riisiterade arenguga seotud metaboolse kineetika, mis hõlbustab edasisi uuringuid, et uurida põhiküsimusi, mis käsitlevad nii seemne metaboolsete võimete arengut, kui ka nende potentsiaalseid rakendusi saagi parandamisel.

Sissejuhatus

Riis ( Oryza sativa ) ei ole mitte ainult oluline põhitoiduaine, mis toidab pool maailma elanikkonnast, vaid ka suurepärane mudel taimede uurimisel. Riisiseemne arengu aluseks oleva molekulaarse mehhanismi mõistmine on oluline protsess, mille eesmärk on varustada seemneid toiduks ja toitumiseks, ning riisi elutsükli oluline komponent. Riisiseemne areng on keeruline ja kooskõlastatud protsess, mis on ühendatud paljude geneetiliste, füsioloogiliste, metaboolsete ja signaalimisradadega ning mida mõjutavad nii sisemised kui ka välised stiimulid 1, 2, 3, 4 .

Üldiselt hõlmab riisiseemne areng kahte peamist etappi (embrüo ja endospermi areng), sealhulgas embrüogeneesi, küpsemise, kuivamise ja unisuse eraldi, kuid kattuvad etapid 1, 3, 5, 6 . Riisiseemne kooskõlastatud protsess põhineb erineval geenide / valkude komplektil, mida ekspresseeritakse õigel ajal. Varasemad uuringud transkriptoomiliste ja proteoomiliste muutuste kohta erinevatel arenguetappidel, eriti reservide kogumise etapil, on suuresti laiendanud meie arusaamist riisiseemne arengu molekulaarsest regulatsioonist ja metaboolsetest võrkudest 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 . Transkriptoomiline analüüs näitas, et ekspresseeritud geenide tase ja tüüp varieerub erinevates arenguetappides suuresti ning eeldatakse, et paljude geenide ekspressioonitasemed kasvasid või langesid enne riisiterade põhjalikke füsioloogilisi ja morfoloogilisi muutusi 3, 5, 11 või vastavad neile . Samuti leitakse, et arenevates riisiterades ekspresseeritud geenides on tuvastatavaid kultivaridevahelisi erinevusi 3, 5, 7, 11 . Proteomianalüüsi uuringud näitasid samasuguseid arenguetappidest sõltuvaid valkude ekspressioonimustreid (tasemeid ja tüüpe) piki teravilja arengut 6, 8, 12 .

Riisiseemne arendamine hõlmab arvukate metaboliitide sünteesi, muundamist ja akumuleerumist mitmesuguste makromolekulide moodustamiseks ja akumuleerimiseks, toimides seemne oluliste osade ning sisemiste toitumis- ja reservvarude ehitusplokkidena. Ehkki ülalnimetatud transkriptoomilised ja proteoomsed analüüsid on näidanud geenide ja valkude rolli riisiseemne arengus, ei saanud nendest andmetest lihtsalt järeldada samaaegselt toimunud metaboomika muutusi, mis esindavad genoomsete, transkriptoomsete ja proteomiliste regulatsiooniprotsesside lõppsaadusi. Geenidest pärineva teabe voog on tegelikult ühendatud paljude ahelate ja nende järgnevate toodete vahel, mille tulemuseks on keeruline ja dünaamiline transkriptide, valkude ja metaboliitide süsteem. Selle tagajärjel võivad üksikute geenide või ensüümide koguste muutused radade kaudu avaldada metaboolsetele voogudele vähe mõju, kuid neil võib olla oluline mõju üksikute metaboliitide kontsentratsioonile 13, 14 . Seega on metaboomi üksikasjalik analüüs fenotüübi 15 esitus. Kuigi metaboomikat on kasutatud riisi bioloogia, näiteks metaboolse variatsiooni 16, 17, 18, 19, 20, 21 ja geneetiliselt muundatud riisi 16 uurimisel, ei ole seda kunagi kasutatud riisiseemne arengu uurimiseks, mis on oluline protsess, millel on tähtsus mitte ainult riisi arengubioloogia alusuuringutes, aga ka riisi aretamise rakendusuuringutes.

Varasemad Arabidopsise seemne arengu metabolismi uuringud näitasid, et seemnete küpsemisega kaasneb enamiku avastatud metaboliitide oluline vähenemine, et tagada varude tõhus kogumine, ja et seemne kuivamine on seotud silmatorkava metaboolse nihkega eraldiseisvate metaboliitide kuhjumiseks 22 . Tomati metabolismi uuring näitas sarnasusi ja erinevusi viljaliha arengu ajal viljaliha ja seemnete vahel ning tõi välja ka selle, et enamus avastatud metaboliitidest vähenevad viljade arenedes 23 . Mõlemad uuringud andsid uusi teadmisi seemne arengu ja metaboolsete muutuste vahelistest seostest ning panid aluse potentsiaalseks kasutamiseks põllukultuuride parendamisel. Kuna endosperm moodustab suurema osa riisiseemnest, samal ajal kui embrüo moodustab suurema osa Arabidopsise või tomati seemnest, huvitab meid, kas üheöögise riisi seemne arengu metaboolne kineetika erineb kaheidulehe Arabidopsis või tomati seemne arengu kineetikast . Varem leidsime, et Japonica ja indisi riisi küpsed seemned erinevad oluliselt metaboliitide sisalduse ja võrgustiku poolest 20, kuid me ei teadnud, millal see metaboolne erinevus moodustub.

Selles uuringus kasutati kahes japonica ja kahes indika kultuuris kineetiliste metaboolsete muutuste paljastamiseks teravilja kujunemise ajal sihtrühma mittekuuluvat metaboomikat. See uuring paljastas alamliikide ja alamliikide metaboolseid erinevusi arenevas teraviljas lisaks konserveerunud arenguastmest sõltuvale metaboolsele dünaamikale. Neid tulemusi arutatakse seemnete arengu üldmudelite ja riisitera parendamise osas.

Tulemused

Riisiterade metaboliitide arendamise kineetilised mustrid

Riisiterade metaboolse kineetika uurimiseks riisiseemne kujunemise ajal võetakse teraviljaproovid 7, 10, 14, 28 ja 42 päeva pärast õitsemist (DAF) kahest indica kultivarist (Qingfengai ja 9311) ja kahest japonica kultivarist (Nipponbare ja Nongken 58) koguti ja nende suhtes teostati metaboolne profiilianalüüs gaasikromatograafia (GC) -masspektromeetria (MS) ja ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafia (UHPLC) -MS põhjal. 3011 intensiivse signaali hulgast tuvastati 214 metaboliidi täpne keemiline struktuur (joonis 1 ja täiendav tabel S1), sealhulgas 44 aminohapet ja dipeptiidi, 41 süsivesikut ja orgaanilist hapet, 11 kofaktorit, 11 nukleotiidi, 33 lipiidi ja 69 sekundaarsed metaboliidid (sealhulgas flavonoidid, hüdroksütsinnamaadi derivaadid, fenüülpropanoidid, terpeenid ja diterpenoidsed fütoakseliinid) ja veel viis ühendit.

Image

Ruudud ja ringid tähistavad vastavalt selles uuringus avastatud ja tuvastamata metaboliite. Metaboliitide täisnimed viitavad lisatabelile S1.

Täissuuruses pilt

Seejärel viidi läbi 3011 metaboolsete tunnuste põhikomponentide analüüs (PCA), et vaadata arenevate riisiterade kineetilist metabolismi. Nimelt ilmnes kahe japonica ja kahe indica kultivari arenedes riisiterade metabolismi muutuste osas sarnane dünaamiline muster (joonis 2). Varastes staadiumides kuni 14 DAF-ni oli selge ja lai jaotus sama kultivari erinevatel etappidel arenenud riisiteraproovide vahel või sama faasi erinevate kultivaride proovide vahel, tuues välja nii arenguetappidest kui ka kultivaridest sõltuvad metaboomid (joonis 2). . Hilisemates etappides 28 DAF-st 42 DAF-ni oli 28 DAF-i ja 42 DAF-i proovide eraldamine peaaegu eristamatu, mis näitas, et riisiterade metaboliidi erinevus 28 ja 42 DAF korral oli palju väiksem, kui 7, 10 ja 14 DAF. Seetõttu arenesid arenedes samas etapis nelja sordi proovide PCA proovitükid lähemale ja lähemale, mis näitab, et seemne arenedes muutub metaboolne varieeruvus erinevate kultivaride terade vahel järjest väiksemaks.

Image

Punane, roheline, sinine, violetne ja hall värv esindavad proove vastavalt 7, 10, 14, 28 ja 42 kraadi juures. Kast, ruut, avatud kolmnurk ja kolmnurk tähistavad vastavalt terade metabomeere vastavalt 9311, Nongken 58, Nipponbare ja Qingfengai. PC 1 selgitab 53, 3% variatsioonist, eristades riisiterasid erinevatest arenguetappidest.

Täissuuruses pilt

Kuna PCA ei suuda tuvastada, milline tegur põhjustab täheldatud variatsiooni, viidi seejärel kahesuunaline ANOVA (variatsioonianalüüs) lähteandmete lagundamiseks, et lahustada arengujärku, kultivarit või nende interaktsioonist tulenevaid variatsioone. 2545, 2683 ja 2515 metaboolsete omaduste arvukust mõjutas märkimisväärselt arengustaadium, kultivar ja nende vastastikune mõju, nende hulgas mõjutas 2329 metaboolsete tunnuste rohkust samaaegselt arengustaadium, kultivar ja nende koostoime (joonis 3a ja täiendav teave). Tabel S2). Lisaks viidi läbi iga eksperimentaalse teguri tõlgendamiseks ja iga teguriga seotud peamiste mustrite tuvastamiseks ANOVA-simultaankomponentide analüüs (ASCA), mis oli ühevariandilise ANOVA-lähenemise 24 mitmevariandiline laiendus. ASCA tulemus näitas, et täheldatud metaboolsetest erinevustest 40, 4%, 24, 8% ja 20, 9% oli seletatav vastavalt arenguetapi, kultivari ja nende koostoimega (täiendav joonis S1). Vastavate alammudelite PC1 põhjal arenguetappide graafikud näitasid, et skoorid vähenesid järk-järgult aja jooksul (joonis 3b), mis on kooskõlas joonisel 2 näidatud PCA tulemusega, kus erinevate kultivaride metaboliidid nihkusid arenguga samas suunas . Sordi skoori graafikud näitasid, et erinevad kultivarid erinevad PC1 skooride poolest; Nongken 58 ja Qingfengai oli vastavalt kõrgeim ja madalaim skoor (täiendav joonis S2a). Qingfengai koostoime skoori graafik vähenes, samal ajal kui Nongken 58 oma suurenes ning Niponbare ja 9311 tulemused olid seemne arenguga võrreldes stabiilsed (täiendav joonis S2b). Iga kultivari interaktsioonide skooride erinevus 7 DAF juures oli suurim ning 10 DAF ja 14 DAF interaktsioonide skooride erinevus oli üsna väike (täiendav joonis S2b). Metaboolsete tunnuste korrelatsiooniks eksperimentaalsete teguritega tehti graafikud finantsvõimenduse / ruudu ennustusvea (SPE) jaoks. Finantsvõimendus hindab metaboliidi olulisust mudelis ja SPE testib mudeli sobivust konkreetsete metaboliitide suhtes. Hästi modelleeritud metaboliitideks valiti välja suure võimendusega ja madala SPE-ga metaboliidid, mis annavad mudelile olulise panuse. Seejuures erines arengufaasi peamise mustri põhjal kokku 153 metaboolset tunnust, millest 12 olid struktuurselt tuvastatud (joonis 3c ja täiendav tabel S3) ja 9 neist näitasid sarnaseid dünaamilisi mustreid, nagu on näidatud lisas Joonis S4, mis oli kooskõlas joonisel 3b näidatud diagrammi tulemusega. Lisaks püsis vastavalt kultivari ja interaktsiooni peamistel mustritel kokku 56 ja 143 metaboolset omadust (täiendav joonis S3 ja lisatabel S3).

Image

a ) Venna diagrammi kokkuvõte kahesuunalise ANOVA tulemustest. b ) Ajaga seotud peamine muster (arenguetapp) c ) Ajaga (arenguetapp) seotud oluliste muutujate ASCA valimine Leverage / SPE analüüsi abil. Need analüüsid viidi läbi MetATT veebisaidil (//metatt.metabolomics.ca/MetATT/).

Täissuuruses pilt

Siiani analüüsisime ainult tuvastatud 3011 metaboolsete omadustega riisitera globaalseid ainevahetuse muutuste mustreid. Nüüd asusime uurima, millistes metaboolsetes muutustes oli igas arengufaasis 214 tuvastatud metaboliiti.

Riisiterade metaboolsed muutused varude kogunemise ajal

Varude kogunemise perioodil arenevate terade metaboolsete muutuste paljastamiseks võrreldi kultivarist sõltuva variatsiooni kõrvaldamiseks 214 tuvastatud metaboliidi taset 10 DAF ja 14 DAF juures sama sordi 7 DAF tasemega. Reservide kogunemise edenedes vähenes 69, 2% (27-st 39-st) aminohapete ja nende derivaatide sisaldus dramaatiliselt kõrgeimal tasemel 7 DAF madalaima tasemeni 14 DAF kõigis neljas kultivaris, ehkki erineval määral (joonis 4a ja 4). Lisalaud S4). Näiteks langes histidiini ja spermidiini tase üle 10 korra, samal ajal kui N- atsetüülglutamaat ja trüptofaan langesid 14 DAF juures umbes kolm korda, võrreldes 7 DAF tasemega. Silmatorkava kontrastina tõusis kahe aminohappe, betaiini ja γ-guanidinovõihappe (GBH) ning ühe dipeptiidi (Leu-pro) tase märkimisväärselt 10 ja 14 DAF, võrreldes 7 DAF tasemega. Enamik süsivesikuid ja orgaanilisi happeid näitasid aminohapetega sarnaseid muutusi (täiendav joonis. S5a). Kuid sahharoosi tase oli kõigis neljas kultivaris üsna konstantne, mis näitab lehe piisavat süsinikuvarustust sel perioodil. Kofaktorite ja nukleotiidide sisalduse sarnast langust täheldati ka kõigis neljas kultivaris, kuigi on oluline märkida, et siin kasutatud ekstraheerimisprotokoll ei ole ideaalne nukleotiidide säilitamiseks nende in vivo olekus, seega tuleb neid konkreetseid andmeid tõlgendada ettevaatust (täiendavad joonised S5b, 5c). Ehkki paljude lipiidide tase langes ka reservi kogunemise ajal (joonis 4b), oli lipiidide languse aste väiksem kui eelpool nimetatud metaboliitidel. Annotatsiooniga sekundaarsete metaboliitide hulgas vähenes kõige tuvastatud hüdroksütsinnamaadi derivaatide tase dramaatiliselt reservi kogunemise ajal, eriti 14 DAF juures kõigis neljas sordis (täiendav joonis S5d), samas kui metüülbensoaadi (Meth-ben) tase tõusis märkimisväärselt 14 DAF juures (täiendav joonis fig. S5e). Avastatud flavonoidide hulgas langes märkimisväärselt ainult kahe flavonoidi, isoorientiin C-heksoosi-C-heksoosi I (isoo-C-heks-C-heks I) ja apigeniin-6-C-glükosiidi (Api-6C-glu) sisaldus. samal ajal kui viie flavonoidi, näiteks tritsiini ja isoorientiin-7-O-glükosiidi (Isoo-7O-glu) sisaldus tõusis kõigis neljas sordis 10 DAF ja 14 DAF juures (joonis 4c, silt 1).

Image

a ) aminohapped ja dipeptiidid. b ) lipiidid. c ) flavonoidid. Q, Nip ja N on lühendatud vastavalt kolmele riisisordile - vastavalt Qingfengai, Nipponbare ja Nongken 58. Voldi muutuste suhted on antud punase või sinise varjundina vastavalt skaalaribale. Andmed tähistavad iga sordi ja ajapunkti nelja bioloogilise korduse keskmisi väärtusi. Statistiline analüüs viidi läbi t-testiga (lisatabel S4). Metaboliitide täielikud nimed leiate täiendavast tabelist S1.

Täissuuruses pilt

Mõnedel peamistest metaboliitidest ilmnes aga sordispetsiifiline muutus. Näiteks tõusis glutamiini ja glümaati sisaldus kahes japonica kultivaris (10 DAF Nongken 58 ja 14 DAF Nipponbare), kuid langes kahes testitud indis kultivaris pärast 7 DAF; nukleotiidi 5-metüültioadenosiini (MTA) tase, mis tõusis 10 DAF ja 14 DAF juures, langes seejärel dramaatiliselt kahes japonica kultivaris, samal ajal kui see langes järk-järgult 7 DAF-st kogu seemne arengu jooksul kahes indica kultivaris. Flavonoidide tasemetel ilmnesid kõige silmatorkavamad sordispetsiifilised muutused (joonis 4c). Näiteks viie flavonoidi sisaldus, sealhulgas krüserioliool C-glükosiid (Chr-C-glu), swertisin ja isoorientin 7, 3′-dimetüüleeter (Isoo-7, 3′-dimeet), tõusis kahes indi kultivaris, kuid Nongkenis vähenes. 58 (joonis 4c, silt 2); Isoskopariini 2 ”-O- (6” ’- (E) -feruloüül) -glükopüranosiidi (isos-2“ O-6 ”'- ferglü) ja tritsiin-4′-O- (erütro-β-guaatsüüülglütserüül) sisaldus eeter (Tri-4′O-ery-gua), kippus suurenema 9311 ja Nipponbare, kuid vähenes Qingfengai ja Nongken 58 (joonis 4c, silt 3).

Riisiterade metaboolsed muutused seemnete kuivamise ajal

Samuti võrdlesime metaboliitide taset 28 DAF ja 14 DAF proovide vahel, et uurida metaboolset nihet üleminekul varude kogunemisest seemne kuivamisele. 102, 125, 125 ja 137 metaboliitide tase langes veelgi, samal ajal kui 23, 14, 12 ja 12 metaboliitide sisaldus tõusis selle ülemineku ajal vastavalt Qingfengai, 9311, Nipponbare ja Nongken 58 (täiendav tabel S5). Aminohapete ja nende derivaatide 57, 8% (26-st 45-st) sisaldus langes märkimisväärselt sõltuvalt kultivarist ja metaboliidist endast (joonis 5a ja täiendav tabel S5). Näiteks vähenes argininosuktsinaadi (ASA) ja homoseriini (Hser) sisaldus üle 25 korra, glutamaadi (Glu) sisaldus vähenes kõigis neljas sordis vaid kaks kuni kolm korda ja Nongken 58 korral glütsiini (Gly) sisaldus 20 korda, kuid ainult 3 korda Qingfengai. Nimelt tõusis asparagiini (Asn) sisaldus kõigis neljas sordis. Kõigis neljas sordis (dramaatiline joonis S6a ja täiendav tabel S5) langes dramaatiliselt ka 34, 1% (14 41-st) süsivesikute ja orgaaniliste hapete, näiteks malaadi, suktsinaadi, fumaraadi, galaktinooli, ribitooli ja müoinosinosooli sisaldus (dramaatiline joonis S6a ja täiendav tabel S5). Ehkki sahharoos suurenes Qingfengai ja Nipponbare koostises ning vähenes kahes teises kultivaris seemnete kuivamise ajal, oli muutuste aste alla 33%, mis on palju väiksem kui muude süsivesikute muutumisel. Lisaks ei olnud viie süsivesiku ja orgaaniliste hapete, näiteks trehaloosi ja 4-hüdroksüvõihappe (GHB) muutus kõigis neljas kultivaris statistiliselt oluline (lisatabel S5). Peaaegu kõigi kofaktorite ja nukleotiidide tase langes dramaatiliselt (täiendavad joonised S6b, S6c) ja mõõdetud lipiidiliikide 51, 5% (17 33-st) tasemed vähenesid märkimisväärselt vähemalt kolmes kultivaris (joonis 5b ja täiendav tabel S5).

Image

a ) aminohapped ja dipeptiidid. b ) lipiidid. c ) flavonoidid. Q, Nip ja N on lühendatud vastavalt kolmele riisisordile - vastavalt Qingfengai, Nipponbare ja Nongken 58. Voldi muutuste suhted on antud punase või sinise varjundina vastavalt skaalaribale. Andmed tähistavad iga sordi ja ajapunkti nelja bioloogilise korduse keskmisi väärtusi. Statistiline analüüs viidi läbi t-testi abil (lisatabel S5). Metaboliitide täielikud nimed leiate täiendavast tabelist S1.

Täissuuruses pilt

40% (kuus 15-st) hüdroksütsinnamaadi derivaatide tase langes dramaatiliselt vähemalt kolmes sordis seemne kuivamise ajal (täiendav joonis S6d ja täiendav tabel S5). Näiteks N-feruloüülputrestsiin (Fer-Put I ja Fer-Put II) ja 3-O-feruloüülkiniinhape (3O-Fer-qui) vähenesid enam kui 15 korda. Jällegi suurenes metüülbensoaadi sisaldus, kuid 4-hüdroksübensoehape vähenes selles etapis oluliselt (täiendav joonis S6e). Erinevalt teistest metaboliitidest langes ainult ühe flavonoidi (apigeniin-6-C-glükosiid, Api-6C-glu) sisaldus, samal ajal kui 54, 3% (25 46-st) flavonoidide sisaldus polnud kõigis neljas sordis oluliselt muutunud (joonis 5c). ja lisalaud S5).

Paljude metaboliitide muutus seemne kuivamise ajal näitas ka kultivaride spetsiifilisi mustreid. Arginiini (Arg) ja proliini (Pro) sisaldus tõusis Qingfengai umbes kaks korda, kuid vähenes märkimisväärselt kolmes muus sordis, eriti Nongken 58-s. Kahe fosfolipiidi, 2-LysoPC (14: 0) ja 1-LysoPC (14: 0) tasemed. ), suurenes märkimisväärselt ainult kahes japonica sordis. Hüdroksütsinnamaadi derivaatide tase, sealhulgas 1-O-sinapoüül-β-D-glükoos (Sin-O-glu), 1-O-feruloüül-β-D-glükoos I (Fer-O-glu I), salitsüülhape 2 C-β-D-glükopüranosiid (Sal-2C-glu) ja Pro-O-heks I vähenesid Qingfengai, 9311 ja Nongken 58, kuid mitte Nipponbare. Kahe flavonoidi sisaldus muutus kolmes sordis märkimisväärselt, st isoskopariini sisaldus vähenes Qingfengai, 9311 ja Nipponbare, samas kui tritsiini 7-O-neohesperidosiidi (Tri-7O-neo) sisaldus suurenes 9311, Nipponbare ja Nongken 58 korral. Samamoodi muutused terpeenides ja diterpenoidides. fütoakseliinid olid ka kultivarispetsiifilised (täiendav joonis. S6f). Cafestoli ja fütosukaani C sisaldus tõusis Qingfengai puhul 37, 8 ja 55, 5 korda, palju vähem (3, 2 ja 2, 5 korda) 9311, kuid vähenes Nongken 58-s enam kui kolm korda ja oli Nipponbares muutumatu.

Riisiterade metaboolsed muutused puhkeoleku ajal

Lisaks võrdlesime riisiterade metabolismi 42 DAF juures 28 DAF väärtusega metaboliitidega, et uurida unisuse staadiumis toimunud metaboolseid muutusi. Nagu näidatud PCA tabelis (täiendav joonis S7), eraldati riisi teraproovid 42 DAF juures 42 DAF-ist õiglaselt 28 DAF-i proovidest, nagu on näidatud PCA tabelis (täiendav joonis S7), mis näitas, et riisiterade metaboliit muutus ka pärast kuivamist. Kuid metaboolsete muutuste astmed olid selles etapis mõnevõrra väiksemad kui reservi kogunemise etapis, kuid palju väiksemad kuivatusjärgus.

14, 18, 17 ja 26 aminohappe ja dipeptiidi tasemed kõikusid märkimisväärselt vastavalt Qingfengai, 9311, Nipponbare ja Nongken 58, kuid ükski neist ei muutunud järjekindlalt kõigis neljas sordis (lisatabel S6 ja joonis 6a). Näiteks metioniini (Met), fenüülalaniini (Phe) ja proliini (Pro) sisaldus suurenes 9311, Nipponbare ja Nongken 58, kuid mitte Qingfengai. Glutamiini (Gln) ja türosiini (Tyr) sisaldus suurenes 9311 ja Nongken 58, kuid vähenes Nipponbare'is. Qingfengai, 9311, Nipponbare ja Nongken 58 korral muutusid vastavalt 11, nelja, 16 ja 14 süsivesikute ja orgaaniliste hapete tasemed (lisalaud S6 ja täiendav joonis S8a). Sarnaselt aminohapetega ei muutunud ükski süsivesik kõigis neljas sordis märkimisväärselt. Pantoteenhape (VB5) oli ainus kofaktor, mille tase kõigis neljas sordis vähenes ja kofaktorite tase ei olnud märkimisväärselt suurenenud (täiendav joonis S8b). Viie, kahe, kümne ja kaheksa nukleotiidi tasemed muutusid vastavalt Qingfengai, 9311, Nipponbare ja Nongken 58 korral. (Täiendav joonis S8c). Adeniin oli ainus nukleotiid, mille tase kõigis neljas kultivaris langes ja teiste nukleotiidide muutused olid kultivarispetsiifilised. Kahe vaba rasvhappe, punikaadi ja 13-HODE + 9-HODE, sisaldus tõusis kõigis neljas sordis (joonis 8b). Samamoodi langes kolme lipiidi, 2-palmitoüülglütserooli (2-PG), 2-linoleoüülglütserooli (2-LG) ja 2-LysoPC (18: 3), samal ajal kui Sn-glütsero-3-fosfokoliini (GPC) sisaldus suurenes kolm kultivari.

Image

a ) aminohapped ja dipeptiidid. b ) lipiidid. c ) flavonoidid. Q, Nip ja N on lühendatud vastavalt kolmele riisisordile - vastavalt Qingfengai, Nipponbare ja Nongken 58. Voldi muutuste suhted on antud punase või sinise varjundina vastavalt skaalaribale. Andmed tähistavad iga sordi ja ajapunkti nelja bioloogilise korduse keskmisi väärtusi. Statistiline analüüs viidi läbi t-testi abil (lisatabel S6). Metaboliitide täielikud nimed leiate täiendavast tabelist S1.

Täissuuruses pilt

Kuue kuni seitsme hüdroksütsinamaadi derivaadi tasemed muutusid igas sordis märkimisväärselt, kuid ükski neist ei muutunud üheaegselt (täiendav joonis. S8d). Näiteks 3-O-feruloüülkiniinhappe (3O-Fer-qui) ja 1-O-feruloüül-P-D-glükoos II (Fer-O-glu II) tase tõusis märkimisväärselt 9311. aastal, kuid vähenes Qingfengai ja Nipponbare'is. Üks fenüülpropanoididest, 4-hüdroksübensoehape, vähenes märkimisväärselt kõigis neljas sordis, teine ​​- metüülbensoaat - suurenes 9311 ja Nipponbare (täiendav joonis S8e). Viie, kahe, viie ja kaheksa flavonoidi tasemed muutusid vastavalt Qingfengai, 9311, Nipponbare ja Nongken 58 korral, kuid mitte ükski neist ei muutunud korraga kõigis neljas sordis (joonis 6c). Kolme diterpenoidse fütoakseliini (fütokaseaan C, momilaktoon A ja momilaktoon A derivaat) ja ühe terpeeni (kafestool) tasemed langesid märkimisväärselt ainult Qingfengai, kuid mitte teistega (täiendav joonis S8f).

Ainevahetuse erinevused kahe japonica ja kahe indica riisitera vahel

Küpsed riisiseemned erinevad märkimisväärselt japonica ja indica alamliigi 20 arvukuse ja metaboliitide võrgustiku poolest, kuid selle vähesuse kohta kõigis arenguetappides on vähe teada. Selle küsimuse lahendamiseks on kahe japonica kultivari (Nipponbare ja Nongken 58) ja kahe indica kultivari (Qingfengai ja 9311) vahel erinev metaboliitide suhte (edaspidi suhe näitab kahe japonica keskmist väärtust jagades kahe indikaatori keskmise väärtusega) soojuskaart ehitati arenguetapid (lisa joonis S9 ja lisalaud S7).

Tulemused näitasid, et Japonica ja Indones kultivarite metaboliitide arvukuse erinevus oli arengustaadiumist sõltuv (täiendav joonis S9), kuna Japonica kultivarid ja indica kultivarid erinesid enamiku tuvastatud metaboliitide sisalduse languse osas (täiendav joonis S9). Tabelid S4 kuni S6). Näiteks 17 aminohappe, 19 süsivesiku ja orgaanilise happe, nelja kofaktori, kolme nukleotiidi ja 15 lipiidi tase oli kahes japonica kultivaris 7 DAF juures märkimisväärselt kõrgem, nende suhe saavutas haripunkti 10 DAF või 14 DAF ja järsult tagantjärele vähenenud (lisalaud S7). Lisaks olid kahes japonica kultivaris 7 DAF juures 14 aminohappe, viie süsivesiku ja orgaanilise happe, viie kofaktori, kuue nukleotiidi ja 13 lipiidi tasemed oluliselt madalamad ja kõikusid seejärel pärast seda (lisatabel S7). Mõnedes primaarsetes metaboliitides oli japonikas põhiliselt kõrgem või madalam kui indis kõigis arenguetappides. Näiteks olid GBH, indool-5-karboksüülhappe, VB5, tsütosiini II ja karnitiini tasemed põhiliselt madalamad, samas kui GABA, suktsinaadi, trigonelliini, adeniini ja LysoPC tasemed (18: 1) olid japonica kultivarides kõigil arengujärkudel konstitutiivselt kõrgemad. etapid (täiendav joonis S9). Lisaks ei erinenud kümnete metaboliitide (näiteks histidiini, spermidiini, müo-inositooli, dehüdroaskorbaadi ja suktsinüüladenosiini) tasemed 7 DAF juures, kuid erinesid oluliselt 10 ja 14 DAF juures (täiendav tabel S7).

Sekundaarsete metaboliitide osas oli kuue hüdroksütsinnamaadi derivaadi, 13 flavonoidi, kahe fenüülpropanoidi ja kahe diterpenoidse fütoakseliini sisaldus japonikas kõrgem kui 7 DAF ja suhe jõudis haripunkti 10 DAF juures ning kõikus siis, kas hoiti seda põhimõtteliselt kõrgena või vähendas (lisatabel S7). Teisest küljest olid viie hüdroksütsinnamaadi derivaadi, kuue flavonoidi ja ühe diterpenoidse fütoakseliini tase japonikas madalamad kui 7 DAF ja kõikusid pärast seda (täiendav tabel S7). Kahe hüdroksütsinnamaadi derivaadi (4-kumumaraat, protokatehhape O-heksosiid II), ühe fenüülpropanoidi (metüülbensoaat) ja viie flavonoidi (Apigenin-6-C-β-glükosiid-8-C-α-arabinosiidderivaat, tritsiin, tritsiin) sisaldus 7-O-neohesperidosiid, tritsiin-7-O-β-D-glükopüranosiid ja tritsiin-7-O-β-D-glükopüranosiid olid püsivalt kõrgemad, samas kui ühe hüdroksütsinnamaadi derivaadi (N-Feruloylputrescine II) ja nelja flavonoidi (apigenin 6) omadused olid kõrgemad. -C-α-L-arabinosüül-8-C-β-L-arabinosiid, krüsoeriool C-glükosiid, C-pentosüül-apeigniin-O-feruloüülheksosiid, isoorientiin 7, 3'-dimetüüleeter) japonikas kõigil arenguetappidel (täiendav Joonis S9g - S9i).

Metaboliitide ja metaboliitide korrelatsioonid arenevates terades

Kuna kõigil testitud neljal sordil olid teravilja arengu ajal sarnased kineetilised metaboolsed muutuste mustrid, on huvitav uurida kaasreguleeritud metaboliite korrelatsioonianalüüsi abil, mis põhineb süü ja seose põhimõttel, ning otsida võimalikke säilinud ainevahetuse radu edaspidiseks ainevahetuse kujundamiseks . Sel eesmärgil viidi läbi paaris korrelatsioonianalüüs, kasutades Pearsoni produktihetke korrelatsiooni 193 tuvastatud metaboliitiga, mis tuvastati enam kui 50% viljaproovides.

Absoluutse korrelatsiooni väärtuse lävel, mis on suurem kui 0, 70 (| r-väärtus | ≥ 0, 70), oli 4642 paari positiivseid korrelatsioone ja 198 paari negatiivseid korrelatsioone (täiendav tabel S8). Enamik positiivseid korrelatsioone oli primaarsete metaboliitide ning primaarsete metaboliitide ja hüdroksütsinamaadi derivaatide vahel (täiendav joonis S10), mis on kooskõlas ülalnimetatud terade metaboolsete muutuste mustritega, kus enamus primaarseid metaboliite ja hüdroksütsinnamaadi derivaate näitasid sarnaseid muutusi, samas kui sekundaarsed metaboliidid mitmesuunalised muutumismustrid. 198-st negatiivsest korrelatsioonist 85 ja 71 leiti olevat seotud vastavalt 2-LysoPC (14: 0) ja 1-LysoPC-ga (14: 0), ilmselt seetõttu, et nende kahe lipiidide tase tõusis, samas kui enamiku teistest metaboliitide sisaldus teravilja arengu ajal vähenes.

Suurim korrelatsiooniväärtus oli vähemalt kolme erineva suhtega metaboliitide vahel. Esimene seos oli seotud isomeeridega, millel oli äärmiselt kõrge korrelatsioon. Näiteks r-väärtused pipecolate I ja pipecolate II, isoleutsiini ja leutsiini, 1-LysoPE (18: 2) ja 2-LysoPE (18: 2), 1-LysoPE (16: 0) ja 2-LysoPE (16) vahel. : 0), olid kõik suuremad kui 0, 99 (P-väärtus <4, 44E-16) (tabel 1). Teine seos oli metaboliitidega, millel oli substraadi ja produkti vaheline seos sama ainevahetuse raja kaudu. Näiteks salitsüülhappe ja salitsüülhappe 2-O-β-D-glükopüranosiidi, fumaraadi ja Malaadi, seriini ja glütsiini, fenüülalaniini ja türosiini r-väärtused olid kõik kõrgemad kui 0, 98 (P-väärtus <4, 44E-16) ( Tabel 1). Kolmas seos esindas sama substraadi ja sama ensüümiga seotud metaboliite. Näiteks isoletsiini ja valiini r-väärtus, millel on mõlemad biosünteesi käigus ühised substraatpüruvaadid ja samad viis ensüümsüsteemi, oli samuti äärmiselt kõrge (r-väärtus = 0, 987, P-väärtus = 8, 88E-16) ( Tabel 1). Nimelt leiti kõige tugevam seos (r-väärtus = 0, 999, P-väärtus <4, 44E-16) momilaktooni A (valem C20H26O3) ja momilaktoon A derivaadi (tuletatud valem C20H 29N03) ( Tabel 1). Arvestades, et neil kahel metaboliidil oli sama peetumisaeg (RT = 13, 87 min) ja väga sarnane MS / MS spekter (täiendav joonis S11), järeldasime, et momilaktooni A derivaat võib olla tuletatud momilaktoonist A. Selles mõttes on metaboliidi metaboliit korrelatsioonianalüüs võib olla kasulik uue raja leidmiseks.

Täissuuruses tabel

Arutelu

Rice seed development undergoes profound changes in its metabolites, therefore, understanding of the molecular mechanisms underlying the rice seed development at metabolomic level is of fundamental importance not only for the basic understanding of rice biology but also for the applied rice breeding. In this study, taking the advantage of an established non-targeted metabolomics platform, we investigated into the kinetic changes of the metabolomes of rice grains at various developmental stages. Our results showed that the kinetics of metabolic changes in developing rice grain are similar among different cultivars although the metabolome of rice grain is cultivar and development stage dependent, which suggested a highly conserved metabolic regulation within rice seed development. In addition, our results also showed that some metabolic changes in developing grain of monocot rice share common characteristics with those of dicot Arabidopsis and tomato, while others show rice specific patterns.

Most of the metabolites, except for flavonoids, decreased from 7 DAF to 14 DAF in all four cultivars. Those metabolic change patterns of developing rice grains are consistent with previous proteomic and transcriptomic results 6, 8, 26 . Proteins related to central carbon metabolism (glycolysis and TCA cycle), amino acid metabolism, nucleotide metabolism and lipid metabolism were shown to be highly expressed from 2 to 8 DAF and down-regulated afterwards, although proteins involved in starch synthesis were highly expressed from 8–12 DAF and remained upregulated until seeds maturated 6, 8 . The expression of genes coding the enzymes involved in carbohydrate metabolism, especially those in the TCA cycle, and amino acid metabolism were gradually decreased in embryo and endosperm from 7 DAF to 42 DAF 26 (Supplementary Fig. S12). The incorporation of carbohydrates, amino acids and nucleotides into macromolecules, such as starch, storage proteins and DNA may contribute to the observed decrease of most detected metabolites in rice grains at the reserve accumulation stage as was previously hypothesized for Arabidopsis 22 . In addition, the accumulation of starch and storage proteins results in a greater than doubling of grain weight in 14 DAF grains as compared with those at 7 DAF 27, which could be an alternative explanation for the observed decrease of the metabolite levels. Interestingly, the relative level of sucrose was rather stable from 7 DAF to 42 DAF in all four cultivars, indicating that carbon is replete during rice grain development and that the decrease of the metabolites in developing rice grains was not caused by the deficient of carbon sources from source tissues.

The grain weight doubled from 14 DAF to 28 DAF 27, while the decreases of most amino acids, cofactors, nucleotides, hydroxycinnamate derivatives, carbohydrates and organic acids were much more than that could be explained simply by this weight increase. This discrepancy likely resulted from the grain physiological status, at 28 DAF, rice grain is in dormant and therefore no longer metabolically active, which is consistent with previous reports that there is a shift in grain from a highly active metabolic status to much less active dormant status 1 . Notably, asparagine, an ideal nitrogen transport and storage molecule 28, was found to be considerably higher in rice grains at 28 DAF than that at 14 DAF in all four cultivars. In the rice grain asparagine is transported from the root through the xylem and from the leaves through the phloem and is thereafter rapidly catabolized into glutamate and other amino acids for seed development and germination 29 . Almost inactivated mobilization of asparagine in dormant rice grains was likely the cause of asparagine accumulation at 28 DAF.

Similar metabolic kinetics was also found in developing seeds of tomato and Arabidopsis 22, 23 . The metabolome of tomato seeds at different developmental stages were different with the largest differences were found between the seed at the earliest stage (8 DAF) and that at the latest stage (45 DAF). Sugars, amino acids and organic acids decreased significantly at 45 DAF as compared with those at 8 DAF. The degree of decrease for many metabolites, such as fructose, glucose, GABA, glutamate, glutamine, 5-oxoproline, valine, citrate and linolenate, between the last developmental stage and the earliest stage in rice grain and tomato seeds were very similar. The metabolome of Arabidopsis seeds at different developmental stages differed as well, with the progression of Arabidopsis seeds from 10 DAF to 14 and 17 DAF being associated with major decreases in the levels of most amino acids, sugars, polyols, and organic acids. Abovementioned results indicated that there is a conserved metabolic shift in plant seeds, a typical sink tissue, from simple soluble metabolites to complex macromolecules, which occurred mainly at the late organogenesis stage and early seed maturation stage. This appears to be a unique metabolic feature of sink tissues since it is not observed in source tissues, such as in Arabidopsis leaves 30 .

The major difference in metabolite shifts between Arabidopsis seeds and rice grains is apparent at the desiccation stage. Desiccating Arabidopsis seeds are associated with a general increase in most amino acids, sugars (including raffinose), polyols, organic acids (with the exception of TCA intermediates), fatty acids and fatty acid-related compounds 22, while desiccating rice grains are associated with significant decreases of these metabolites (except asparagine). In addition, levels of palmitate and oleate increased at reserve accumulation stage and dropped afterwards in developing Arabidopsis seeds, but constitutively decreased from the beginning in developing rice grains. These observed metabolic differences between developing grains of monocot and dicot plants indicated possible different regulatory machinery operating in the process of seed desiccation. There is striking difference in the seed structure between monocot and dicot plants, the major component of mature rice seed is lifeless endosperm while that of Arabidopsis mature seed is vivo embryo, which might be a causing factor for the observed metabolic differences.

Mature seeds of Japonica and indica rice differ profoundly in their contents and molecular fine structure of amylose and amylopectin, eating and cooking quality and metabolite levels 20, 31, 32, 33 . These morphological and physiological differences are likely associated with the distinguishable metabolic abundance of japonica and indica developing grains. Although we here provide direct evidence that the largest metabolic difference between japonica and indica developing grains was found at the reserve accumulation stage especially at 10 DAF, the molecular mechanisms underlying the metabolic variation between these two subspecies merits future investigations.

Metabolite-metabolite correlation analysis can be used to uncover the relationships amongst metabolite. In this study, metabolite-metabolite correlation analysis revealed that the levels of primary metabolites in developing rice grains was positively associated, which is similar to our previous findings in various rice mature seeds 20 . Notably, the r-values observed in developing grains in this study were higher than those found in mature seeds. This could result from the fact that almost all the primary metabolites were decreased from 7 DAF to 28 DAF in all four cultivars while the metabolic changes in grains from 28 DAF to 42 DAF were more cultivar specific as described above. It is noteworthy that metabolite pairs with the top r-values have direct connection in specific metabolic pathways, which would facilitate the metabolite annotation/identification and new pathway discovery, when combined with accurate mass of the metabolite and MS/MS spectrum information.

It is worthy to note that in this study the metabolomics platform we used only identified 214 metabolites from detected 3011 metabolic features. First, the limited number of MS/MS spectrums in our in-house metabolite library and public database restricted the number of metabolites being identified. Second, the nature of highly diverse properties and abundances of plant metabolites rendered it impossible to detect all of them using one extraction method or single platform 34 . In this study, we used methanol based extraction solution to extract a broad range of metabolites, and employed LC-MS/MS and GC-MS to identify as many metabolites as possible for a global purpose. Therefore, this approach is not the best way to identify targeted metabolites. In the future, optimized extraction methods and/or detecting methods for targeted metabolites, such as acyl CoAs 35, lipids 36, 37 and volatiles 38, 39, 40, 41, should be combined with current non-targeted approach, to better understand the whole metabolomic changes occurring in developing rice grains.

In summary, our study not only corroborates published transcriptomic and proteomic data but also brought new insights concerning the developing rice grain metabolomes with the observed metabolic kinetics corresponding well to the physiological processes occurring in the developing rice grains. Whilst some of these metabolic changes share common characteristics with reported developing seeds of Arabidopsis and tomato, others show rice specific patterns. As such this study demonstrates both conserved and diverse elements of the metabolic regulatory system of plant seeds. This observation merits further study both to explore fundamental questions regarding the evolution of seed metabolic capabilities as well as their potential applications in crop improvement.

Meetodid

Materjalid

Rice plants were planted in a paddy filed in Minghang (31.03°N, 121.45°E), Shanghai, during the summer season in 2013. Four biological replications of rice seeds at 7, 10, 14, 28 and 42 DAF were collected, immediately frozen with liquid nitrogen, lyophilized for 48 hours and stored at −80 °C until metabolomics analysis.

Metabolite Profiling

Samples were grounded into fine powder, and methanol extracts from 20 mg sample were then analyzed by GC-MS and UHPLC-MS (positive and negative mode). The detailed information concerning GC-MS analysis can be found in published paper 22, 42, with data acquisition and processing being performed with TagFinder software 43 . Raw data of GC-MS can be downloaded from Metabolights website (//www.ebi.ac.uk/metabolights/) with the study identifier MTBLS288.

LC analysis was performed on the Aglient 1290 Infinity II LC TM system. Samples were injected into an Agilent Eclipse-plus C18 column (150 × 3.0 mm id, 1.8 μm), and the column temperature was set at 40 °C. The mobile phase consisted of A (0.1% formic acid in water) and B (100% acetonitrile). The gradient conditions of the mobile phase as follows: 0 min, 98.0% A; 1.0 min, 98% A; 5.0 min, 60% A; 12.0 min, 30% A; 15.0 min, 5% A; 20.0 min, 5% A. The flow rate was 0.40 ml/min. The sample injection volume was 1.00 μl. MS detection was performed on a Agilent 6550 iFunnel/Q-TOF mass spectrometer with Agilent Jet-Stream source. Full scan mass spectra were recorded through a range of 50–1000 m/z with scan rate at 2 spectra/sec. The ESI source was operated in positive and negative ionization modes with a capillary voltage of 3.5kV for both modes, nozzle voltage at 250V (+) and 1500V (-), fragmentor voltage of 380V, nebulizer was 25psi, sheath gas and dry gas were set at the flow rate of 12L/min and 16L/min, respectively, and CID voltage applied with 10V, 20V and 40V. Metabolites were annotated by searching Personal Compound Database and Library (PCD/PCDL), Metlin database 44, Massbank database 45 and literatures 18, 46, 47 . Data acquisition, review, alignment and normalization to Quality Control (QC) sample were performed with the softwares of MassHunter Acquisition 6.0, MassHunter Qualitative 6.0, Mass Profinder 6.0 and Mass Profiler Professional 13.0 (MPP 13.0), respectively. Raw data of UHPLC-MS can be downloaded from Metabolights website with the study identifier MTBLS286 and MTBLS287 for positive and negative ionization mode, respectively.

Andmete analüüs

The sample weight and non-normalized peak areas are available in Supplementary Table S9. For data normalization, peak areas were divided by the sample weight and the median value of each metabolite. The missing values of a giving metabolite were imputed with the detected minimum value for statistical analysis, assuming that they were below the limits of instrument detection sensitivity. The final statistics matrix with normalized data for the following statistical analysis are available in Supplementary Table S10. Metabolic differences between rice grains at different stages were determined using the t -test algorithm embedded in Excel 2013 and deemed significant at level of 5%. Principle Component Analysis was performed with SIMCA-P version 11.0. Two-way ANOVA and ASCA were performed with MetATT 48 using “Pareto Scaling” for data normalization. Two-way ANOVA type used is “within subjects ANOVA”, significance threshold is defined as the corrected P-value < 0.05 and False Discovery Rate is chosen for multiple testing correction. ASCA was performed with default parameters. Metabolite-metabolite correlations were analyzed by using Pearson correlation method in R software. Metabolic pathways and the graphical presentation of metabolite-metabolite correlations were presented with Cytoscape version 2.8.3. The heatmaps of metabolite ratios were visualized with MultiExperiment Viewer (MeV) version 4.8.

Lisainformatsioon

How to cite this article : Hu, C. et al. Identification of Conserved and Diverse Metabolic Shifts during Rice Grain Development. Sci. Rep. 6, 20942; doi: 10.1038/srep20942 (2016).

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

Exceli failid

  1. 1

    Täiendav andmestik 1

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.