Hüpoksiline – isheemiline ajukahjustus kutsub esile vastsündinud põrsaste kaugema põletikulise kopsukahjustuse | laste uuringud

Hüpoksiline – isheemiline ajukahjustus kutsub esile vastsündinud põrsaste kaugema põletikulise kopsukahjustuse | laste uuringud

Anonim

Õppeained

  • Füsioloogia

Abstraktne

Taust:

Meie eesmärk oli uurida, kas vastsündinu hüpoksilis-isheemiline (HI) ajukahjustus põhjustab põletikulisi kopsukahjustusi.

Meetodid:

Seega tehti 1-2-aastastel põrsastel hüpoksilisi (HYP, FiO2 10% 30 minuti jooksul), isheemilisi (ISC, kahepoolse unearteri voolu katkemine 30 minutiks) või HI-viirust. Dünaamilist sobivust (Cdyn), hapnikusisalduse indeksit (OI) ja ekstravaskulaarset kopsuvett (EVLW) jälgiti 6 tundi. Seejärel hinnati aju ja kopsu histoloogilisi kahjustusi (kopsukahjustuse raskusaste). Valgu üldsisaldus (TPC) määrati broncoalveolaarses loputusvedelikus (BALF) ja IL-1β kontsentratsioon mõõdeti kopsu- ja ajukoes ning veres.

Tulemused:

Kontrollidena kasutati hüpoksia või isheemiata põrsaid (SHM). HI-viiruse põhjustatud ajukahjustusi seostati Cdyni vähenemise, OI ja EVLW suurenemise ning histoloogiliste kopsukahjustustega (interstitsiaalse leukotsüütide infiltratsioon, kongestiivne hüperemia ja interstitsiaalne ödeem). BALF TPC sisaldus suurenes, mis viitab põletikulistele kahjustustele. Kokkuleppel suurenes kudede IL-1β kontsentratsioon ajus ja kopsus koos suurenenud IL-1β kontsentratsiooniga seerumis. Ei HYP ega ISC üksi põhjustanud aju- ega kopsukahjustusi.

Järeldus:

HI-viiruse ajukahjustus vastsündinud põrsastel põhjustas põletikulise kopsukahjustuse, mis soovitab täiendavat mehhanismi kopsufunktsiooni häirete tekkeks pärast vastsündinu HI-entsefalopaatiat.

Peamine

Muude elundite kui aju kahjustused muudavad pärast perinataalset asfiksiat sageli vastsündinute hüpoksilis-isheemilise (HI) entsefalopaatia (NHIE) (1, 2). Kõrvaltoimete sagedus suureneb järk-järgult, kuna NHIE-ga vastsündinutel suureneb kaasatavate täiendavate elundite arv (2). Sageli kahjustatakse kopse: sõltuvalt määratluskriteeriumitest ilmnevad 25–86% -l HIE-ga imikutest hingamishäirete tunnused (1, 2). Perinataalse asfiksia ekstratserebraalne mõju on ühtlaselt omistatud verevoolu ümberjaotumisele ja / või globaalse hüpoksia - isheemia mõjudele (2, 3). Täiskasvanute vaatlusuuringud näitavad, et kopsukahjustus võib tekkida pärast lokaalseid ajukahjustusi, näiteks koljusisene hemorraagia, traumaatiline ajukahjustus või isheemiline ajuinfarkt (4, 5, 6). Nendes haigusseisundites on kopsukahjustuste esinemissagedus seotud ajukahjustuse raskusega ja see on sõltumatu tegur, mis on seotud halva kliinilise tulemusega (7).

Ehkki täiskasvanute ajukahjustusejärgse hingamisfunktsiooni häirete etioloogia ei ole täielikult teada, arvatakse, et põletikul on võtmeroll koos muude mehhanismidega, nagu neurogeenne kopsuturse, vasaku vatsakese düsfunktsioon või infektsioon (8, 9). Täiskasvanud loommudelites ja subaraknoidse hemorraagia all kannatavatel patsientidel põhjustab ajukahjustus süsteemse põletikulise reaktsiooni põletikuliste vahendajate, näiteks TNF-α, rakusisese adhesioonimolekuli-1, IL-1β ja NF-kB ning reaktiivsete hapniku liikide ülesreguleerimisega, mikrogliaalse aktiveerimine ja neutrofiilide akumuleerumine (5, 9, 10). On püstitatud hüpotees, et kopsukahjustus võib vallanduda selle (sellise süsteemse) vastuse levikust, mida soosib vere-aju barjääri katkemine selle põletikulise protsessi kontekstis (10). Selline sündmuste kaskaad pole aju jaoks privaatne. Näiteks kahepoolsele neeruisheemiale järgneb seerumi IL-1, IL-6 ja IL-12 suurenemine ning kopsukahjustus hiirtel (11). Sarnaselt põhjustab sooleisheemia-reperfusioonikahjustus rottidel ägedat kopsukahjustust koos rakulise infiltratsiooni, mikrovaskulaarse düsfunktsiooni ja interstitsiaalse ödeemiga (12).

Kuna süsteemne põletik ja oksüdatiivne stress koos vere-aju barjääri katkemisega on tavaliselt NHIE patofüsioloogias aset leidvad sündmused (13, 14), on huvipakkuv hüpotees, et eespool nimetatud ajukahjustusejärgse kopsukahjustuse ülalnimetatud mehhanismid võivad olla seotud ajukahjustusega. vastsündinu HIE-ga kaasnev kopsufunktsiooni häire. Varasemad uuringud teatasid, et vastsündinud põrsastel on pärast aju HI-viiruse solvamist kahjustatud kopsude vastavust ja gaasivahetust (15, 16), osutades sel juhul kopsukahjustuse olemasolule.

Selle töö eesmärk oli konkreetselt näidata aju HI-viiruse põhjustatud kopsukahjustuse olemasolu ja uurida selle aluseks olevaid mehhanisme, kasutades vastsündinud põrsa HI-ajukahjustuse mudelit.

Tulemused

Homöostaatilised parameetrid

Tabelis 1 on toodud nelja erineva rühma homöostaatilised parameetrid. Kõigil ajahetkedel ei leitud südame väljundi rühmade vahel statistiliselt olulisi erinevusi. Kuid HI põhjustas keskmise arteriaalse vererõhu märkimisväärse languse, mis püsis kogu katseperioodi vältel, nii et pool HI-põrsaste arvust vajas sobiva säilitamiseks olulist inotroopset tuge (dopamiin, keskmine annus: 13 ± 4 μg / kg / min). arteriaalse vererõhu keskmised väärtused. Huvitaval kombel ei täheldatud keskmise arteriaalse vererõhu langust hüpoksilistes (HYP) ega isheemilistes (ISC) rühmades: igast grupist sai ainult üks põrsas inotroopset tuge (dopamiin 7, 5 μg / kg / min) lõpuks eksperimendi kohta. Ükski kontroll (SHM) põrsas ei vajanud inotroopset tuge. Kui katse ajal ei täheldatud põrsastel pCO2 varieerumist, siis hüpokseemilisel perioodil HI ja HYP rühmas täheldati vere pH ning aju- ja somaatilise rSO2 mööduvat, kuid märkimisväärset langust. Juba ainuüksi ajuisheemia, nagu ISC korral, põhjustas peaaju rSO2 leebema, kuid olulise languse somaatilises rSO2 muutusteta. Hematokrit püsis kogu eksperimendi vältel stabiilsena kõigi rühmade puhul.

Täissuuruses tabel

Ajukahjustus

Ajukahjustuse hindamine. Jätkuv sedoanalgeesia määras, et amplituudiga integreeritud EEG (aEEG) amplituud vähenes SHM-i loomadel kogu katse jooksul ( joonis 1 ), kuigi seda mõju ei seostatud EEG-i tausta aktiivsuse ja / või EEG-i mustri kahjustusega (andmeid pole näidatud). HI põhjustas aju aktiivsuse järsu languse, mis ei taastunud järgmise 6 tunni jooksul ( joonis 1 ). Ainuüksi hüpoksia ja isheemia tagajärjel aEEG amplituud pisut langes, kuid sel juhul taastas aEEG normaalse amplituudi katse lõpuni. Kogu katse vältel oli aEEG amplituud HYP-is või ISC-s statistiliselt oluliselt kõrgem kui HI-s ( joonis 1 ).

Image

Aju aktiivsust uuriti pideva AEEG registreerimise keskmise amplituudi muutuste järgi 1-2-vanustel põrsastel pärast võltsoperatsiooni (SHM, avatud ring) või pärast hüpoksilist (HYP, avatud ruut), ajuisheemiat (ISC, täidetud ruut) või peaaju hüpoksiline – isheemiline (HI, täidetud ring) solvamine. Tulemused on väljendatud keskmisena ± SEM 5–8 looma kohta. B, basaal. Ma solvan. * P <0, 05 vs SHM. § P <0, 05 vs HI. Vaadake üksikasju meetoditest .

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Nissl-värvitud ajukoe analüüs näitas, et HI-ga võrreldes on normaalsete neuronite arv vähenenud, võrreldes SHM-iga, mitte-elujõuliste neuronite protsendi 5-kordne suurenemine frontopariettaalses ajukoores ja hipokampuse 10-kordne suurenemine ( joonis 2a ). Aju histoloogia oli HYP ja ISC korral sarnane SHM-iga.

Image

Aju ja kopsude kahjustused. Vasakul: esinduslikud heledad mikrofotod a ) parietotemporaalse ajukoore (CX) ja hipokampuse (HPC) Nissl-värvimisest ajukoest (algne suurendus × 200, riba = 100 µm) ja ( b ) kopsukoe lõikude hematoksüliin-eosiinvärvimisest (ülemine) : algne suurendus × 80, tulp = 100 µm; põhi: algne suurendus × 800, tulp = 50 µm), mis on saadud 1-2-vanustelt põrsastelt pärast võltstoimingut (SHM, valged ribad) või pärast hüpoksilist toimet (HYP, hall baarid), peaaju isheemiline (ISC, ribad) või aju hüpoksiline – isheemiline (HI, mustad ribad) solvamine. HI-viiruse ajus on suurenenud püknootiliste rakkude (noolte) arv. HI-viiruse kopsus on interstitsiaalne leukotsüütide infiltratsioon, kongestiivne hüperemia ja interstitsiaalne ödeem. Parempoolne: a ) CX ja HPC nekrootiliste neuronite arvu kvantifitseerimine; b ) kopsukahjustuse kvantifitseerimine raskusastmega. Tulemused on väljendatud keskmisena ± SEM 5–8 looma kohta. * P <0, 05 vs SHM. Vaadake üksikasju meetoditest .

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

HI-viiruse põhjustatud neuroinflammatsioon. Tserebraalne HI kutsus esile lokaalse põletikulise reaktsiooni, mida tõendab IL-1β kontsentratsiooni suurenemine ajukoes võrreldes SHM-ga ( joonis 3 ). Aju IL-1β kontsentratsioon oli HYP või ISC korral sarnane SHM-iga.

Image

Põletikuline reaktsioon. Interleukiin-1α (IL-1α) kontsentratsiooni määramine a ) kudedes, b ) plasmas ja c ) kopsukoes, mis on saadud 1–2-aastastelt põrsastelt 6 tundi pärast võltsoperatsiooni (SHM, valged ribad) või pärast hüpoksilist (HYP, hallid ribad), ajuisheemilist (ISC, ribad) või aju hüpoksilist-isheemilist (HI, mustad ribad) solvamist. Tulemused on väljendatud keskmisena ± SEM 5–8 looma kohta. * P <0, 05 vs SHM. ( d – f ) lineaarne korrelatsioon IL-1ß kontsentratsiooni vahel d ) ajukoes ja seerumis, e ) seerumis ja kopsukoes ning ( f ) aju ja kopsukoes. Pärast aju ja kopsu uuringuid tehti mikrokiireid kasutades, pärast valgu kontsentratsiooni süvendi kohta viimist 500 ug / ml. Plasmauuringud viidi läbi ELISA abil (neeldumine 450 nm). Vaadake üksikasju meetoditest .

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Verepõletiku markerid

HI tõi kaasa IL-1β seerumi taseme tõusu võrreldes SHM-iga - suurenemist, mida ei täheldatud HYP ega ISC korral ( joonis 3 ). Huvitaval kombel leiti positiivne korrelatsioon aju ja seerumi IL-1β kontsentratsioonide vahel ( R2 = 0, 75; P <0, 05).

Kopsukahjustus

Kopsukahjustuse hindamine. Dünaamiline vastavus (Cdyn) püsis SHM rühmas uuringuperioodil muutumatuna. Seevastu HI viis Cdyni languseni 6 tunni möödumisel HI-st ( joonis 4 ). Cdyn jäi HYP või ISC korral sarnaseks SHM-iga. Ka hapnikuindeks (OI) püsis eksperimendi ajal SHM-is stabiilsena, kuid näitas jätkuvat tõusu pärast HI-d, nii et katse lõpuks oli OI statistiliselt oluliselt kõrgem kui SHM-is ( joonis 4 ). HYP või ISC korral püsis OI kogu eksperimendi ajal sarnane SHM-iga.

Image

Kopsu dünaamika. Muutused a ) kopsu dünaamilises vastavuses (Cdyn), b ) hapnikusisalduse indeksis (OI) ja c ) ekstravaskulaarse kopsuvee (EVLW) sisalduses 1–2-aastastel põrsastel pärast võltsoperatsiooni (SHM, avatud ring) või pärast hüpoksilist (HYP, avatud ruut), ajuisheemilist (ISC, täidetud ruut) või aju hüpoksilis-isheemilist (HI, täidetud ring) solvamist. Tulemused on väljendatud keskmisena ± SEM 5–8 looma kohta. B, basaal; Ma solvan. * P <0, 05 vs SHM. Vaadake üksikasju meetoditest .

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Hüpoksia ja / või isheemia seostati ekstravaskulaarse kopsuvee (EVLW) suurenemisega, võrreldes SHM-iga solvamise ajal ( joonis 4 ). Hiljem kippus ELVW normaliseeruma, kuid tõusis veelgi HI, nii et eksperimendi lõpuks oli ELVW oluliselt kõrgem HI kui SHM korral. Sellist lõplikku ELVW tõusu ei täheldatud HYP ega ISC korral, nii et katse lõpuks oli ELVW nendes rühmades ja SHM-is sarnane.

HI põhjustas histoloogilise kopsukahjustuse, mis ilmnes 6 tundi pärast solvamist. Seega ilmnesid HI-põrsaste SHM-rühmaga võrreldes kõrgemad raskusastmed, peamiselt interstitsiaalse leukotsüütide infiltratsiooni, kongestiivse hüperemia ja interstitsiaalse ödeemi tõttu ( joonis 2b ). Raskusaste ei olnud SH-ga võrreldes HYP ega ISC statistiliselt erinev.

Kopsupõletiku hindamine. HI-d seostati IL-1β sisalduse suurenemisega kopsukoes, võrreldes SHM-iga ( joonis 3 ). IL-1β sisaldus oli HYP või ISC korral sarnane SHM-iga.

Märkimisväärselt korreleerusid IL-1β kontsentratsioonid kopsukoes ajukoes ( R2 = 0, 45; P <0, 05) ja plasmas ( R2 = 0, 61; P <0, 05) ( joonis 3 ).

HI-viirus põhjustas bronhoalveolaarse loputusvedeliku (BALF) üldise valgu kontsentratsiooni suurenemist 250% võrra baasseisundist katse lõpuni ( joonis 5 ). Teistes rühmades BALF-i proteiinisisalduse statistiliselt olulist suurenemist ei täheldatud ( P <0, 05).

Image

Muutused bronhoalveolaarses loputusvedeliku (BALF) valgusisalduses 1–2-aastastel põrsastel põhitingimustes või 6 tundi pärast võltsoperatsiooni (SHM, avatud ring) või pärast hüpoksilist (HYP, avatud ruut), ajuisheemiat (ISC, täidetud) ruut) või peaaju hüpoksilis-isheemiline (HI, täidetud ring) solvamine. Tulemused on väljendatud keskmisena ± SEM 5–8 looma kohta. * P <0, 05 vs SHM. Vaadake üksikasju meetoditest .

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Arutelu

Selles töös teame esimest korda, et HI-i aju solvamine oli seotud vastsündinud sigade põletikulise kopsukahjustusega. Seda näitasid funktsionaalsed, histoloogilised ja biokeemilised uuringud. HI-viirusega loomadel ilmnes kopsu talitlushäireid suurenenud ventilatsioonivajaduse tõttu vähenenud kopsuhaiguste ja halva gaasivahetuse tõttu. Kops on NHIE-s üks kõige sagedamini mõjutatud rakuvälised organid ning neil patsientidel on sageli vajalik ventilatsiooni toetamine ja kõrge hapnikuvajadus (1, 2). Terve katseperioodi vältel täheldasime HI-põrsaste EVLW tõusu. Südame talitlushäirete puudumisel on EVLW hea mittekardiogeense kopsuturse indikaator varem ja tundlikum kui muud parameetrid, näiteks rindkere röntgen või OI (17). See on valideeritud loommudelites kasutatava kuldstandardi gravimeetrilise meetodi ja in vivo topeltindikaatori meetodi (18, 19) alusel. Huvitav on see, et EVLW suureneb insuldi (6) või koljusisese trauma (20) all kannatavatel patsientidel. EVLW seos kopsutursega on kooskõlas meie järeldusega histoloogilise kopsukahjustuse kohta HI-põrsastel, mis koosneb peamiselt interstitsiaalse leukotsüütide infiltratsioonist, kongestiivsest hüperemiast ja interstitsiaalsest tursest. Meie teadmiste kohaselt on see esimene uuring kopsu histoloogia hindamiseks aju HI vastsündinu loommudelil. Kokkuvõttes osutasid need leiud kopsude põletikulistele kahjustustele. Toetajana täheldasime HI-põrsaste BALF-i üldvalgu kontsentratsiooni suurenemist. Valgu kogukontsentratsioon BALF-is on veresoonte läbilaskvuse ja alveolaarse epiteeli terviklikkuse otsene näitaja (10). Suurenenud veresoonte läbilaskvus võib olla veresoonte kahjustuse tagajärg või raku vahendatud põletikulise vastuse tagajärg (21). Kokkuleppel leidsime IL-1β suurenenud kontsentratsiooni HI-põrsaste kopsukoes. On teatatud, et IL-1, IL-6 ja muud põletikulised vahendajad, näiteks COX-2, LTB4 või rakusisene adhesioonimolekul-1 on kopsukoes pärast traumaatilist ajukahjustust suurenenud (9, 10). Kõik meie katsetes kopsus täheldatud muutused olid seotud HI-viiruse esinemisega, kuna ainuüksi hüpoksia ega ajuisheemia ei põhjustanud meie katsetes olulist kopsukahjustust. Kuid oma töö ülesehituse tõttu ei saa me täielikult välistada, et hüpokseemia võib mingil määral kopse mõjutada. Pidev hüpokseemia põhjustab kopsuarteri vasokonstriktsiooni tõttu kopsuarteri hüpertensiooni ~ 10–25% -l NHIE-ga imikutest (2). 60-minutise hüpokseemia ajal ja pärast seda elustati põrsastel mööduvat kopsu hüpertensiooni 21% hapnikuga (22, 23). Kokkuleppel, meie eksperimentides ei olnud hüpokseemilise episoodi lühem kestus märkimisväärse ja püsiva pulmonaalse hüpertensiooni esilekutsumiseks piisav, mida peegeldab OI kiire normaliseerumine HYP-rühmas.

On hästi teada, et vastsündinutel ajukahjustuse esilekutsumiseks on vaja hüpoksia ja isheemia kombinatsiooni (13). Tegelikult ilmneb ajukahjustus katsetes, kus vastsündinud loomadel ilmnes ainult hüpokseemia, ajukahjustus alles siis, kui hüpokseemia on piisavalt pikk hüpotensiooni ja seega isheemia esilekutsumiseks (24). Kokkuleppel kestis meie katsetes hüpoksiline episood vaid 30 minutit; see ei olnud seotud hüpotensiooniga ega põhjustanud seega histoloogilist ajukahjustust ega aEEG aktiivsuse püsivat halvenemist. Pikaajaline isheemia, näiteks püsiva hüpotensiooni tõttu, võib vastsündinud sigadel põhjustada ajukahjustusi (24). Meie katsetes ei kestnud isheemiline episood siiski piisavalt kaua, et tekitada histoloogilisi või funktsionaalseid (aEEG) ajukahjustusi. Selle põhjuseks võib vähemalt osaliselt olla tõsiasi, et nii lühikese isheemilise perioodi jooksul võib tänu selgroolülide vereringele vaatamata kahepoolsele unearteri tihenemisele esineda mõni ajuverevool, nagu soovitab crSO 2 tagasihoidlik langus ISC-s põrsad isheemilise episoodi ajal. HI-sündmused käivitavad sündmuste kaskaadi, mis põhjustab ajukahjustusi. Nende hulgas moodustavad surmava triaadi kolm muutujat: eksitotoksilisus, oksüdatiivne stress ja põletik. HI-viirus, traumaatiline või hemorraagiline ajukahjustus kutsub esile põletikulise reaktsiooni, mida iseloomustab mikroglia aktiveerimine, ergastavate aminohapete, reaktiivsete hapnikuühendite, lämmastikoksiidi, proteaaside ja põletikku ennetavate tsütokiinide vabanemine (13, 25, 26). Neutrofiilide infiltratsioon suurendab veelgi reaktiivsete hapnikuühendite ja tsütokiinide lokaalset akumuleerumist (13, 25). Põletiku tähtsus NHIE patofüsioloogias on viimasel ajal tõusnud (26). Erinevate proinflammatoorsete tsütokiinide hulgas on IL-1 eriti oluline HI-indutseeritud ajukahjustuse kontekstis (25), kus IL-1 tase tõuseb HI-tüüpi imikute tserebrospinaalvedelikus paralleelselt entsefalopaatia raskusega. Tõepoolest, see tsütokiin ennustab HI ajukahjustust paremini kui TNFa (27). Selles töös kinnitasime, et aju IL-1β taseme suurendamiseks on vaja hüpoksiat ja isheemiat koos, kuna IL-1β kontsentratsioon oli HYP või ISC korral sarnane SHM-iga.

NHIE-le järgneb sageli kauge organi kahjustus (1, 2). Seda komplikatsiooni on klassikaliselt omistatud verevoolu ümberjaotumise (sukeldumisrefleksi) kompenseerivale mehhanismile sellistele organitele nagu aju, südamelihas või neerupealised (2, 3). Alvarez jt . (15) teatasid põrsaste kopsuhaiguste vähenemisest ja OI suurenemisest pärast aju HI-viirust. Need leiud omistati ventilaatoritest põhjustatud kopsukahjustustele. Kuid meie uuringus rakendati kõigis rühmades sama ventilatsiooniprotokolli, kuid kopsukahjustusi täheldati ainult HI-põrsastel. Seega on välistatud ventilaatori põhjustatud kopsukahjustus. Huvitaval kombel avastasime oma uuringus pärast IL-ajukahjustust IL-1β taseme tõusu plasmas. Põletikuvastaseid tsütokiine nagu IL-6, IL-10, IL-1β või TNF-α on HIE-ga imikute veres kõrgenenud (14). Ajukahjustuse loommudelitega tehtud uuringud näitavad, et eelnimetatud põletikuline vastus ei piirdu ainult ajuga ja see võib levida kaugematesse elunditesse (9, 10). Tegelikult põhjustab tõsine ajukahjustus põletikuliste vahendajate, näiteks TNF-α, IL ja rakusisese adhesioonimolekuli-1, vabanemise süsteemsesse vereringesse (28) tänu vere-aju barjääri läbilaskvuse suurenemisele, mis järgneb põletikulisele ajukahjustusele (10, 29). Meie uuringus toetab IL-1β kontsentratsiooni ajukoes ja plasmas ning IL-1β kontsentratsiooni plasmas ja kopsus lineaarne seos aju ja kopsukahjustuse vahelise patofüsioloogilise seosega pärast põrsaste aju HI-viiruse insuldi. Wu jt . (9) teatavad ajutisest hemorraagilise ajukahjustusega kokkupuutunud rottide kopsu IL-1β tõusust, mis on paralleelne selle tsütokiini suurenemisega ajus. Sellega seoses näitavad mitmed insuldihaigetega läbi viidud kliinilised uuringud seost ajukahjustuse raskuse ja ulatuse ning süsteemse põletikulise ravivastuse astme vahel (30, 31). Lisaks sellele järgneb selles olukorras trombolüüsile ja seega aju isheemilise piirkonna vähenemisele põletikuliste parameetrite taseme langus plasmas (30).

Meie teadmiste kohaselt on meie uuringus pakutud kopsukahjustusmehhanismi, mis seob aju HI-viirust ja põletikulist kopsukahjustust, vastsündinutel kunagi spetsiaalselt uuritud. Kuid mitmete uuringutega on uuritud isheemia-reperfusiooni kahjustuse mõju kopsudele teistes elundites. Näiteks neeruisheemia - reperfusioon kutsub esile histoloogilise kopsukahjustuse ja suurendab kopsu veresoonte läbilaskvust ja proinflammatoorsete tsütokiinide ekspressiooni kopsukoes (11, 32). Mõned uuringud näitavad ka seost soole isheemia - reperfusiooni vigastuse ja kopsukahjustuse vahel (12, 33). Kuigi kopsukahjustus on palju vähem uuritud, võib see põhjustada ka põletikulisi ajukahjustusi. Sellega seoses näitas hiljutine eksperimentaalne uuring, et ülemäärase loodete ruumalaga ventilatsioon sünnituse ajal elustamise ajal põhjustab kopsukahjustusi ja vallandab ajupõletiku (34). Iseloomulik on see, et kops, mille epiteeli pindala on nii suur, et selle ristlõikepindala on umbes tenniseväljaku suurus, saab suurema osa süsteemsest verevoolust (35). Need tegurid muudavad kopsu nii süsteemse põletikulise reaktsiooni potentsiaalseks allikaks kui ka sihtorganiks, nagu on öeldud ägeda respiratoorse distressi sündroomi (36) ja traumaatilise ajukahjustuse (10) korral. Kokkuvõttes viitavad need andmed sellele, et isheemiast põhjustatud reperfusiooni kahjustus ja / või põletik võivad tekitada läbilõike põletikulist protsessi levitavate elundite vahel, et tekitada kaugeid kahjustusi.

Sellel uuringul on mõned piirangud. Esiteks põhineb meie poolt kasutatud loommudel, ehkki laialt aktsepteeritud, lokaalse ajuisheemia ja süsteemse hüpoksia kombinatsioonil, samal ajal kui NHIE ilmneb kliinilises olukorras globaalse isheemia ja / või hüpoksia taustal, näiteks pärast platsenta katkestamist verevarustus (13). Kuid see eripära võimaldas meil isoleerida ja iseseisvalt uurida aju HI ja reperfusioonikahjustuse spetsiifilist rolli kopsukahjustuste tekitamisel. Veel üks piirang on lühike õppeperiood. See võib kindlaks teha, et kopsukahjustus oli märkimisväärne, kuid mitte väga raske. Selline lühike uuringuperiood võimaldab meil siiski vältida mehaanilise ventilatsiooni kahjulikku mõju iseenesest, mida viitavad kerged kopsukahjustuste nähud, mis ilmnevad isegi SHM-loomadel pärast 6-tunnist ventilatsiooni. Seetõttu võis meie katsetes täheldatud kopsukahjustusi seostada patoloogilise seisundiga, mitte iatrogeense toimega. Sellegipoolest on õigustatud täiendavad uuringud, mis uurivad aju HI-viiruse keskpikka ja pikaajalist mõju kopsudele. Kuna lõpuks vältisime oma mudelis tõsist süsteemset hüpokseemiat ja / või hüpotensiooni, et vältida nende seisundite olulist mõju kopsudele, ei olnud sellest tulenev ajukahjustus tõsine. See näitab, et isegi kerge ajukahjustus suutis põhjustada kaugemaid kopsukahjustusi. Sellegipoolest pakuvad suuremat huvi täiendavad uuringud, mis uurivad aju raskete ajukahjustuste mõju kopsudele.

Võib teha järeldusi, et vastsündinud põrsastel põhjustab aju HI-viirus iseenesest põletikulisi kopsukahjustusi, mida ei saa seostada süsteemse hüpoksia tagajärgedega. Meie tulemused viitavad sellele, et selle põhjuseks on lokaalne põletikuline reaktsioon, mis pole piiratud ajuga, mida peegeldab põletikuliste vahendajate tõus seerumis, mis levib kaugesse elundisse nagu kops, kus see kutsub esile histoloogilisi ja funktsionaalseid kahjustusi. Seega pakume välja täiendava mehhanismi kopsufunktsiooni häirete tekke arvessevõtmiseks pärast vastsündinu HIE-d koos teiste tuntud mehhanismidega, näiteks elundi verevoolu ümberjaotusega. Nende mehhanismide suhtelise tähtsuse kindlaksmääramine nõuab edasisi uuringuid.

Meetodid

Katseprotokoll vastas katseloomade kaitset käsitlevatele Euroopa ja Hispaania määrustele (86/609 / EMÜ ja RD 53/2013) ning selle kiitis heaks Puerta de Hierro Majadahonda ülikooli (Hispaania, Hispaania) loomade heaolu eetikakomitee. Statistilise olulisuse saavutamiseks määrati minimaalseks kasutatud loomade arv.

Loomade ettevalmistamine

Nagu varem teatatud (15, 16), intubeeriti 1–2-aastased isased põrsad ja seejärel mehaaniliselt ventileeriti (Evita 4; Dräger, Lübeck, Saksamaa). Ventilaatori algseaded olid: PEEP 5 cmH20, hingamissagedus 30 lööki minutis, sissehingamise aeg 0, 5 s, maksimaalne sissehingamisel vajalik rõhk loodete ruumala jaoks 6 ml / kg, FiO2 0, 21. Ventilatsiooniparameetrid (ventilaatori arvutipõhise pneumotachograafia abil), loodete CO 2 kontsentratsioon ja O 2 küllastus (SpO 2 ) (Ohmeda 5250 RGM, Louisville, CO). Hemodünaamilisi parameetreid, EVLW sisaldust ja kesktemperatuuri (PiCCO Plus, Pulsion, Feldkirchen, Saksamaa) jälgiti pidevalt. Arteriaalse vere gaasid saadi tunnis, et reguleerida ventilatsiooniseadet ja FiO2 ning arvutada OI (PMVA × FiO 2 / PaO 2 x 100). Aju aktiivsust jälgis pidevalt aEEG (BRM3; BrainZ Instruments, Auckland, Uus-Meremaa). Tserebraalset (crSO2) ja somaatilist (srSO2) piirkondlikku hemoglobiini hapniku küllastust mõõdeti pidevalt infrapuna-lähispektroskoopia süsteemi abil (INVOS 5100C; Covidien, Mansfield, MA).

Katseprotokoll

Seejärel määrati loomadele juhuslikult 30-minutine hüpoksia (HYP, n = 7), alandades FiO2 väärtusele 0, 10; 30 min ajuisheemia (ISC, n = 5), katkestades unearteri verevoolu, tõmmates elastsed ribad välja; 30 min aju hüpoksia – isheemia (HI, n = 8); või kontrollrühm (SHM, n = 6). Isheemia ja / või hüpoksia perioodi lõpus taastati unearteri vool ja / või FiO2 suurenes 0, 21-ni.

Kuus tundi pärast HI / HYP / ISC-d või samaväärset perioodi SHAM-is tapeti põrsad iv kaaliumkloriidi booluse teel.

Aju töötlemine

Nagu varem teatatud (16), saadi 4 um laiused aju koronaalsed lõigud varajase neuronaalse nekroosi hindamiseks Nissli värvimisega parietaalses ajukoores tagumisel tasapinnal 3 mm, nagu on näidatud seaaju stereotaksilises atlasis (37).

Bronhoalveolaarsete loputusvedelike kogumine ja töötlemine

BALF saadi algtasemel ja pärast ohverdamist, järgides standardiseeritud protseduuri (38). Pärast tsentrifuugimist (1000 p / min 10 minutit temperatuuril 4 ° C) supernatant koguti ja külmutati (-20 ° C). Seejärel määrati BALF-i üldvalgusisaldus, kasutades BCA valguanalüüsi komplekti (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Kopsu töötlemine

Pärast ohverdamist täideti kopsud ja loputati soolalahusega. Paraformaldehüüd 4% -liselt kinnitatud parafiiniga manustatud lõigud parempoolsest kopsust ülemisest, alumisest, keskmisest eesmisest ja keskmisest tagumisest lobesest värviti hematoksüliin-eosiiniga, et viia läbi neljapunktiline, poolkvantitatiivne, raskusastmel põhinev punktisüsteem (negatiivne = 0, väike = 1, mõõdukas = 2 ja raske = 3), hinnates atelektaasid, turset, põletikku ja muid muutujaid (39).

Tsütokiini ekspressiooni hindamine aju- ja kopsukoes ning -plasmas

IL-1β kontsentratsioon määrati Madridi teaduspargis (Hispaania) külmunud aju või vasaku kopsu proovides (30 mg), kasutades tsütokiini massiive (Quantibody sea sigade tsütokiinide massiiv, RayBiotech, Atlanta, GA).

IL-1β kontsentratsioon määrati EDTA-ga töödeldud tuubidesse kogutud vereproovide ELISA abil (IL1ß Pig ELISA komplekt; Abcam, Madrid, Hispaania) plasmas, mida tsentrifuugiti kiirusel 1500 p / min 10 minutit temperatuuril 4 ° C.

Statistiline analüüs

Kõigi statistiliste analüüside jaoks kasutati tarkvara SPSS 15.0.0 (IBM Software, Armonk, NY). Kõik andmed on esitatud keskmisena ± SD. Keskmisi väärtusi võrreldi Mann – Whitney testi abil. Mitme võrdluse korral võrreldi keskmisi väärtusi Kruskall – Wallis testi abil vahemiku analüüsil ja post hoc Dunn testiga mitme võrdluse jaoks. Muutujate korrelatsiooni analüüsimiseks kasutati Spearmani testi. P <0, 05 peeti statistiliselt oluliseks.

Finantstoetuse avaldus

Seda tööd toetasid uurimisinstituudi Carlos III (ISCiii) toetused vastavalt kava Nacional de I + D + I 2008–2011 ja kava Estatal de Investigación Científica y Técnica y de Innovación 2013–2016 koos kaasrahastamisega Euroopa Regionaalarengu Fondid (FEDER) (FIS-PS09 / 01900, PS09 / 00434, PI12 / 00852 ja PS12 / 00192) ning Madridi Kogukonna biomeditsiini programmist (S2010 / BMD-2308). Ükski rahastamisallikas ei olnud seotud uuringute kavandamise, andmete kogumise, analüüsi ja tõlgendamise, aruande koostamise ega artikli avaldamiseks avaldamise otsusega.

Avalikustamine

JM-O. on sõlminud uurimislepingu GW Pharmaga, Cambridge, Suurbritannia (GWCRI09119). Teistel autoritel pole deklareerimiseks konkureerivaid majanduslikke huve.