Hüperoksia reguleerib inimese loote kopsufibroblastide angiotensiini konverteerivat ensüümi 2 | laste uuringud

Hüperoksia reguleerib inimese loote kopsufibroblastide angiotensiini konverteerivat ensüümi 2 | laste uuringud

Anonim

Õppeained

  • Füsioloogia

Abstraktne

Taust:

Angiotensiin (ANG) II osaleb eksperimentaalses hüperoksiast põhjustatud kopsufibroosis. Angiotensiini konverteeriv ensüüm-2 (ACE-2) lagundab ANG II ja on seega kaitsev, kuid täiskasvanu inimese ja eksperimentaalse kopsufibroosi korral on selle regulatsioon madal. Hüperoksia on teadaolev vastsündinute kroonilise fibrootilise kopsuhaiguse põhjus, kuid ACE-2 roll vastsündinute kopsufibroosil pole teada. Hüpoteesiks olime, et hüperoksikaasi tõttu võib inimese loote kopsurakkudes olev ACE-2 olla allareguleeritud.

Meetodid:

Inimese loote kopsufibroblasti IMR90 rakud puutusid in vitro kokku hüperoksiliste (95% O 2 /5% CO 2 ) või normoksiliste (21% O 2 /5% CO 2 ) gaasidega . Rakud ja söötmed eraldati eraldi ACE-2 ensümaatilise aktiivsuse, mRNA ja immunoreaktiivse valgu määramiseks.

Tulemused:

Hüperoksia vähendas ACE-2 immunoreaktiivset valgu ja ensüümi aktiivsust IMR90 rakkudes (mõlemad P <0, 01), kuid ei muutnud ACE-2 mRNA-d. ACE-2 valk oli raku supernatandis suurenenud, mis viitab proteaasi vahendatud ektodomeeni eraldumisele. TAPI-2, TNF-α-konverteeriva ensüümi (TACE / ADAM17) inhibiitor, hoidis ära nii raku ACE-2 languse kui ka lahustuva ACE-2 suurenemise (mõlemad P <0, 05).

Järeldus:

Need andmed näitavad, et ACE-2 ekspresseerub inimese loote kopsufibroblastides, kuid hüperoksiline gaas vähendab seda märkimisväärselt. Samuti viitavad nad sellele, et hüperoksia vähendab ACE-2 ADAM17 / TACE vahendatud varjutusmehhanismi kaudu.

Peamine

Täiendav hapnik, mida sageli kasutatakse enneaegsete imikute kopsu puudulikkuse ravis, on seotud bronhopulmonaalse düsplaasia (BPD) tekkega. BPD on endiselt esimesel eluaastal peamiseks haigestumuse ja suremuse põhjustajaks ning mõnel neist imikutest on kogu lapseeas olulised hingamisprobleemid, sealhulgas suurenenud hingamisteede reaktsioonivõime ja piirava hingamisteede haiguse teke (1). Hüperoksia põhjustab kopsukahjustusi ja võib kaasa aidata BPD-le. Kirjanduse põhjalik ülevaade näitab tugevat seost hüperoksiaga kokkupuute ja kaasnevate haiguste ilmnemise vahel. Hüperoksia võib reageerivaid hapnikuradikaale tekitades põhjustada kopsukahjustusi. Vastsündinute hiirte pikaajaline kokkupuude hüperoksiaga põhjustab alveolaarsuse ja kapillaaride arengu häirumist ning kopsufibroosi suurenemist, mis on sarnane inimese BPD-ga (2).

Kopsufibroosi patogeneesi soodustavate mehhanismide hulgas on ACE-2 suur tähtsus, kuna reniini-angiotensiinisüsteemi (RAS) ekspresseerivad inimese kopsufüo müro-fibroblastid ja see on funktsionaalne, arvatakse rakud, mis on sünteesimisel kõige olulisemad kollageenid, mis kogunevad fibrootilistesse kopsudesse (3). Kudede fibrogeneesi uuringutes usutakse, et koe RAS mängib võtmerolli kiulise koe kuhjumise algatamisel ja progresseerumisel erinevates elundites. On tõestatud, et nii AKE inhibiitorid kui ka angiotensiini retseptori antagonistid takistavad südame (4), maksa (5), neeru (6) ja kopsude (7, 8) fibrogeneesi. ANE II, mida toodab ACE, on RAS-i peamine efektormolekul. ANG II on potentsiaalne pulmonaalne profibrootiline vahendaja, mis aktiveerib ANG II I tüüpi retseptori ja stimuleerib kollageeni sünteesi. In vivo tehtud uuringud näitasid, et angiotensiinisüsteem oli hapnikuga kokkupuutunud loote kopsufibroblastides ülesreguleeritud (9). ACE-2 peamine ülesanne on muuta ogipeptiid angiotensiin II heptapeptiidiks ANG 1–7. See piirab ANG II kogunemist ja kaitseb eksperimentaalse kopsufibroosi eest.

Imai jt (10). näitasid kolmes erinevas ägeda respiratoorse distressi sündroomi (ARDS) mudelis, mis kõik kasutasid ACE2 väljalülitatavaid hiiri, et neil hiirtel oli metsiktüüpi hiirtega võrreldes väga raske haigus. Varasemad selle labori tööd näitasid, et ACE-2 kaitseb fibroosi eest, kuid on nii inimese kui ka eksperimentaalse kopsufibroosi mudelis reguleeritud (11) ning et ACE-2 pärssimine on seotud kopsukoe suurenenud kahjustuse / fibroosiga. Varem on Uhal jt (3). demonstreerisid inimese kopsu müofibroblastides angiotensiini / TGF-β1 “autokriinset silmust”. Vastsündinu kopsu kontekstis on olulisem, Jiang jt (12). näitasid angiotensiinisüsteemi aktiveerimist hüperoksiast põhjustatud kopsufibroosil vastsündinute rottidel. Chou jt (13). näitasid, et ANG II aktiivsuse blokeerimine läbi AT1R (I tüüpi angiotensiini retseptori) blokaatori losartaan takistas kopsufibroosi vastusena hüperoksiale. ACE-2 rolli nendes mudelites ei ole aga veel hinnatud.

ACE-2 funktsiooni SARS-Coronaviiruse rakulise retseptorina demonstreerisid Li et al (14). Haga et al (15). demonstreerisid TNF-α-konverteeriva ensüümi (TACE) rolli, mis võib lõhustada ACE-2 ektodomeeni, viiruse sisenemisel kopsudesse. Need autorid näitasid ka, et ACE-2 ektodomeeni TACE-sõltuv „levik” sõltub täielikult SARS-S valgu seondumisest ACE-2-ga ja et viiruse sisenemiseks oli vaja TACE (16). Lisaks blokeerisid varisemist TACE antagonistid TAPI-0 ja TAPI-2 (15). TACE (tuntud ka kui ADAM17), mida algselt identifitseeriti kui metalloproteaas, mis on vajalik TNF-α membraanvormi töötlemiseks ja selle vabanemiseks lahustuva tegurina (17), on nüüd teadaolevalt seotud ACE-2 lõhustamisel ja vabastamisel. ektodomeen mitmes kudedes (18).

Arvestades teiste RAS-i komponentide teadaolevat osalemist kopsufibroblastide funktsioonis (3) ja hüperoksilise gaasi profibrootilist toimet, püstitasime hüpoteesi, et ACE-2 võib ekspresseerida loote kopsufibroblastidega ja lisaks võib see hüperoksia tõttu alareguleerida. Edasi teoreetiliselt teadsime, et ACE-2 alareguleerimist hüperoksiaga saab ära hoida, takistades selle eraldumist varitsemist põhjustava ensüümi TACE inhibiitoril. Esitame siinkohal järeldused, et inimese loote kopsufibroblastide kultuurides on hüperoksia tõttu tugevalt vähenenud ACE-2 valkude ja ensüümide aktiivsus. Samuti teatame, et TAPI-2 takistab seda langust.

Tulemused

Rakkude elujõulisuse andmed

Tabelis 1 on näidatud häiritud plasmamembraani terviklikkusega rakkude arv, mõõdetuna trüpaansinisega ja väljendatud protsentides rakkude koguarvust. Hüperoksiaga kokkupuutunud rakukultuurid näitasid surnud rakkude arvu mõõdukat (vähem kui 1%), kuid statistiliselt olulist suurenemist võrreldes toaõhuga kokkupuutuvate rakkudega, kui kokkupuutele järgnes 24-tunnine taastumisperiood ( P <0, 01). Joonis 1 näitab kaspaas 9 vesiniku blotti kui apoptoosi markerit, mis β-aktiiniks normaliseerituna ei näidanud densitomeetriaga olulisi muutusi. Need andmed kokku viitavad hüperoksiaga ravitud rakkude elujõulisuse väga väikesele langusele pärast taastumisperioodi, kuid ainult väga väikeses osas (<1%) rakkudest.

Täissuuruses tabel

Image

Kaspaas 9 loote kopsufibroblastides, mis on kokku puutunud hüperoksilise või normoksilise gaasiga. IMP 90 rakke konfluentses kultuuris eksponeeriti 72 tundi kuni 95% hapniku ja 5% C02- ga . Kontrollrakke inkubeeriti 72% 21% O2-ga 5% C02- ga . 72 tunni möödudes rakud koguti või inkubeeriti 24 tundi seerumivabas söötmes täiendava „taastumise” faasi jaoks. Seejärel viidi läbi kaspaas 9 Western blot, nagu on kirjeldatud materjalides ja meetodites. Hoolimata ribalaiuse intensiivsuse väikesest langusest hüperoksiaga töödeldud rakkudes, ei näidanud kvantitatiivne määramine densitomeetria abil statistiliselt olulist erinevust kaspaasi 9 / β-aktiini suhte osas (pole näidatud).

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Hüperoksia mõju ACE-2-le

Joonis fig 2 näitab hüperoksia mõju AKE-2 immunoreaktiivsele valgule Western blot analüüsil. Nii ACE-2 immunoreaktiivsus kui ka ensüümi aktiivsus olid hüperoksiaga ravitud rakkudes märkimisväärselt vähenenud, võrreldes normoksiaga ravitud rakkudega. See vähenemine (74, 6%, P <0, 01 densitomeetriliselt) ilmnes alles siis, kui rakkudel lasti taastuda, inkubeerides normoksilises seerumivabas söötmes 24 tundi.

Image

Normoksilise taastumisega hüperoksia reguleerib inimese loote kopsufibroblastides angiotensiini konverteerivat ensüümi-2 (ACE-2). IMR90 rakud eksponeeriti hüperoksikaalsele või normoksilisele gaasile, nagu on kirjeldatud joonisel 1. a ) Seejärel viidi läbi ACE-2 valgu Western blot ja normaliseeriti β-aktiiniks. ( b ) Ilma taastumiseta ACE-2 muutusi ei toimunud, kuid taastumise korral põhjustas hüperoksia AKE-2 immunoreaktiivse valgu olulise languse (74, 6%, * P <0, 01 vs 21% O 2 Studenti t- testi järgi).

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

ACE-2 ekspressiooni kinnitamine konkureeriva inhibiitoriga, DX 600

Joonisel 3 oli ACE-2 sünteetilise substraadi abil mõõdetud ensümaatiline aktiivsus täielikult sünteetilise peptiidi DX 600 ( P <0, 01), mis on ACE-2 konkureeriv inhibiitor (11). Joonis 3b ei näidanud ACE-2 mRNA olulist vähenemist hüperoksia tõttu, mis viitab sellele, et ACE-2 redutseerimine ei toimu RNA tasemel, vaid valgu tasemel.

Image

Normoksilise taastumisega hüperoksia vähendab angiotensiini konverteeriva ensüümi-2 (ACE-2) ensümaatilist aktiivsust, kuid mitte ACE-2 mRNA-d. IMR90 rakud eksponeeriti hüperoksikaalsele või normoksilisele gaasile, nagu on kirjeldatud joonisel 1 (ainult taastumisega), kuid rakud koguti ACE-2 ensüümi aktiivsuse määramiseks (11) koos ACE-2 konkureeriva inhibiitori DX600 lisamisega ja ilma 1 umoliga. / l ensüümi proovianumas. ( a ) ACE-2 ensümaatiline aktiivsus näitas statistiliselt olulist hüperoksia vähenemist (koos taastumisega) ja täielikku ummistust DX 600 abil (* P <0, 01 vs 21% O 2 ANOVA ja Dunnetti testi abil). ( B ) ACE-2 mRNA kvantifitseerimine qRTPCR abil ei näidanud olulisi muutusi. Vaadake üksikasju meetoditest.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

TAPI-2 mõju ACE-2-le hüperoksiale avatud loote kopsurakkudes

Joonisel 4 on näidatud, et TAPI-2 lisamine hüperoksiaga kokkupuute ajal takistas immunoreaktiivse ACE-2 vähenemist, mis vastasel juhul tekiks hüperoksiaga ravitud rakkudes ( P <0, 05).

Image

Normoksilise taastumisega hüperoksia vähendab TAPI-2 tundliku mehhanismi abil rakulist angiotensiini konverteerivat ensüümi-2 (ACE-2). IMR90 rakud eksponeeriti hüperoksikaalsele või normoksilisele gaasile, nagu on kirjeldatud joonisel 1 (koos taastumisega), kuid ADAM17 / TACE inhibiitori TAPI-2 juuresolekul või puudumisel. Seejärel koguti raku monokihid ACE-2 Western blot analüüsi jaoks (ülemine paneel). Densitomeetria (alumine paneel) näitas rakkude monokihiga seotud ACE-2 olulist vähenemist hüperoksiaga töödeldud rakkudes võrreldes kontrollrühmaga (* P <0, 05 vs CTL ANOVA järgi ja Tukey mitmekordne võrdlustesti). TAPI-2 lisamine takistas langust.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

TAPI-2 mõju lahustuvale ACE-2-le rakuvabas kultuuri supernatantides

Järgmisena analüüsiti ACE-2 immunoreaktiivsust hüperoksiaga paljastatud rakkudest kogutud söötmes. Joonisel 5 on näidatud, et loote kopsufibroblastide töötlemine hüperoksiaga suurendas lahustuva ACE-2 vabanemist kultuuri supernatandist ( P <0, 01) ja TAPI-2 hoidis ära selle suurenemise ( P <0, 01).

Image

Normoksilise taastumisega hüperoksia suurendab TAPI-2 tundliku mehhanismi abil lahustuvat angiotensiini konverteerivat ensüümi-2 (ACE-2). IMR90 rakud eksponeeriti hüperoksikaalsele või normoksilisele gaasile, nagu on kirjeldatud joonisel 1 (koos taastumisega), kuid ADAM17 / TACE inhibiitori TAPI-2 juuresolekul või puudumisel. Seejärel koguti rakuvabad kultuuri supernatandid rakukihist eraldi ja kontsentreeriti ning teostati Western blot analüüs ACE-2 jaoks (ülemine paneel). Densitomeetria (alumine paneel) näitas hüperoksiaga töödeldud raku supernatantide lahustuva ACE-2 olulist suurenemist võrreldes kontrollrühmaga (* P <0, 01 vs. CTL ANOVA ja Student-Newman-Keulsi mitu võrdlustesti). TAPI-2 lisamine takistas suurenemist (** P <0, 01 vs. 95% O 2 ANOVA ja Student-Newman-Keulsi mitmekordse võrdlustesti abil).

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Normoksilise taastumisega hüperoksia mõju ADAM17 / TACE-le

Joonis 6 näitab, et hüperoksia ravi, millele järgnes normoksiline taastumine, suurendas ADAM17 / TACE immunoreaktiivset valku märkimisväärselt IMR90 rakkudes kolmekordselt ( P <0, 05). Ainuüksi hüperoksiline gaas (ilma taastumiseta) ADAM17 / TACE ei suurendanud (andmeid pole näidatud). Nagu arvata võis, ei olnud TACE inhibiitori TAPI-2 (aktiivse saidi blokeerija) lisamisega võimet vähendada hüperoksiast põhjustatud TACE valgu suurenemist normoksilise taastumisega (andmeid pole näidatud). Joonis 6, paneel c näitab, et ka normoksilise taastumisega hüperoksia põhjustas ADAM17 / TACE mRNA olulist suurenemist (2, 2-kordne, * P <0, 05).

Image

Normoksilise taastumisega hüperoksia suurendab inimese loote kopsufibroblastide ADAM17 / TACE taset. IMR90 rakud eksponeeriti hüperoksikaalsele või normoksilisele gaasile, nagu on kirjeldatud joonisel 1 (koos saagisega), seejärel koguti ADAM17 / TACE Western blot analüüsi jaoks, nagu on kirjeldatud materjalides ja meetodites. ( a ) Seejärel viidi läbi ADAM17 / TACE valgu Western blot ja normaliseeriti β-aktiiniks. ( b ) Densitomeetria abil põhjustas normoksilise taastumisega hüperoksia ADAM17 / TACE olulise suurenemise (3, 1-kordne, * P <0, 05 õpilase t- testi järgi). ( c ) Koguti kogu RNA kogumiseks korduvad korpused, millele järgnes qRTPCR, nagu on kirjeldatud meetodites; hüperoksia koos normoksilise taastumisega põhjustas ka ADAM17 / TACE mRNA olulise suurenemise (2, 2-kordne, * P <0, 05 Studenti t- testi järgi).

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Joonis fig 7 kujutab toimivat hüpoteesi ACE-2 funktsionaalse rolli kohta hüperoksiast põhjustatud kopsufibrogeneesis. Üksikasju leiate joonise legendist.

Image

Angiotensiini konverteeriva ensüümi-2 (ACE-2) kavandatud roll hüperoksiast põhjustatud kopsufibroosis. Alveolaarsete epiteelirakkude või müofibroblastide (3) poolt toodetud angiotensinogeeni (AGT) saab lõhustada mitmesuguste pulmonaarsete aspartüülproteaasidega (3), et saada angiotensiin (ANG) I, mida omakorda lõhustavad erinevad kopsuensüümid, et saada profibrootiline ANGII . ANGII lagundatakse ACE-2 abil, saades antifibrootilise peptiidi ANG1-7, mis toimib selle retseptori kaudu. Hüperoksia põhjustab veel tundmatute mehhanismide kaudu ACE-2 vabanemist rakust ektodomeeni lõhustamise kaudu, mida vahendab suurenenud ADAM-17 / TACE. Selle mehhanismi kaudu teoreeritakse hüperoksia fibroosi soodustamiseks nii ( a ) ANGII kogunemise soodustamise (8, 9) kui ka ( b ) antifibrootilise peptiidi ANG1-7 produktsiooni vähendamise kaudu (21). Vt arutelu teksti. Protsessid, mida on siin kujutatud rakusisestena (tumedad varjutatud alad) või rakuvälistena (heledad varjundid), võivad toimuda ühes või mõlemas sektsioonis.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Arutelu

Hapnikukahjustuse vältimise ja / või vähendamise meetodid on endiselt vaevalised. Hapnikukahjustuse molekulaarsete mehhanismide ja endogeensete kaitsefaktorite tuvastamine võib pakkuda hädavajalikke sihte sekkumiste kavandamiseks tulevikus. Lang jt (9). näitasid hiljuti, et angiotensiin II (ANGII) vahendab hüperoksia profibrootilist toimet inimese kasvatatud kopsufibroblastidele, kuid need autorid ei uurinud ANGII lagundava ACE-2 potentsiaalset panust hüperoksiast stimuleeritud kollageeni produktsiooni angiotensiinist põhjustatud suurenemisse . Lisaks näitas eelnev töö, et ACE-2, mis kaitseb loommudelites ANGII lagundamise korral kopsufibroosi eest, on idiopaatilise kopsufibroosiga patsientide kopsus reguleeritud mehhanismide abil, mis on veel täielikult tuvastamata (11).

Koos viisid need küsimused meie hüpoteesideni, et: (i) hüperoksia võib AKE-2 allapoole reguleerida ja (ii) ACE-2 moduleerimine võib olla kasulik hüperoksiast põhjustatud kopsukahjustuste ravis ja ennetamisel. Näiteks võib koe ACE-2 kõrge taseme säilitamine selle väljavoolu ärahoidmise ja / või valgu asendamise kaudu bioloogiliselt aktiivse ensüümi manustamisega olla hüperoksikaalse kopsukahjustuse ravimise strateegia potentsiaal. Selle teooria toetuseks on inimese rekombinantse ACE-2 (rhACE-2) ravimpreparaat ägeda kopsukahjustuse kliinilistes uuringutes (GlaxoSmithKline, torujuhtmeravim GSK2586881). ACE-2, karboksüpeptidaas, mis lagundab Angiotensiin II, näitas olevat kaitsev, kuid see on inimese interstitsiaalse kopsufibroosi ja eksperimentaalselt indutseeritud kopsufibroosi korral Li jt (11) poolt reguleeritud. ACE-2 selge roll ägeda kopsu moduleerimisel vigastusi näitasid Imai jt meeleavaldused (10). kes näitasid, et ACE-2 puudumine ACE-2 knockout hiirtel süvendab eksperimentaalset ägedat kopsukahjustust. Praeguseks pole ACE-2 potentsiaalset rolli hüperoksilise kopsukahjustuse korral uuritud.

Viimastel aastatel näevad kliinikute arstid vähem klassikalist “vana BPD-d”, mida iseloomustab kopsufibroos vaheldumisi tsüstilise emfüseemiga rindkere röntgenuuringus koos kollageeni ladestumise ja fibroosiga (19). Hiljuti kirjeldati leebemat vormi, mida nimetatakse uueks BPD-ks, mida iseloomustavad kõrvalekalded alveolaarses eraldumises, kopsuturse ja vähem ilmne fibroos (19, 20). Ägeda kopsukahjustuse (10, 21) täiskasvanud loommudelites näitas ACE-2, et see pärsib kopsuturse teket ja põletikku, samuti fibrogeneesi. Ehkki ACE-2 rollist alveolaarses septatsioonis on vähe teada, võib arvata, et ACE-2 kaitseb nii uue BPD kui ka fibrootilisema "vana" vormi eest. Vaatamata sellele on väike protsent BPD-ga lastest tänapäeval klassikalise "vana BPD" leidudega ja võib juhtuda, et kergemate vormide ja raskemate esituste vahel on olemas pidevus. Seetõttu on AKE-2 ja teiste RAS-i komponentide uurimine hüperoksilise kopsukahjustuse korral ja võimalus hüperoksikaalse kahjustusega seotud BPD kõige raskemate ja võib-olla ka leebemate vormide leevendamiseks kriitiline.

On näidatud, et ACE-2 osaleb ka viiruse poolt põhjustatud kopsuhaiguses. ACE-2 on raku retseptor SARS-Coronavirus, mis on vajalik koronaviiruste sisenemiseks ja selle leviku pärssimine TACE inhibiitori poolt on seotud SARS-CoV nakkuse raskusastmega (14, 15, 16). Liu jt (22). näitasid, et ACE2 valgu tase oli pärast H1N1 viirustega nakatumist oluliselt allareguleeritud, kuid see oli viiruse replikatsiooniks hädavajalik. Samuti leidsid nad, et ACE-2 lõhustumist saab reguleerida gripi neuraminidaasiga. Zou jt (23). näitasid, et eksperimentaalsetes hiiremudelites põhjustab kõrge patogeensusega linnugripi A H5N1 viirusega nakatumine AKE-2 ekspressiooni alandamist kopsus ja seerumi ANG II taseme tõusu. ACE-2 geneetiline inaktiveerimine põhjustab H5N1-ga vaktsineeritud hiirtel tõsiseid kopsukahjustusi, mis kinnitab ACE-2 kaitsvat rolli H5N1-indutseeritud kopsupatoloogiate korral. Samad autorid näitasid ka, et inimese rekombinantse ACE-2 manustamine leevendab hiirtel klassikalise lindude katku H5N1 viiruse põhjustatud kopsukahjustusi. Seega on tulevase uurimise jaoks huvitav teema ACE-2 hüperoksilise gaasi allareguleerimise võimalik mõju viirusinfektsioonile.

Kasvavad tõendid ACE-2 rolli (de) uurimisel normaalses kopsufüsioloogias või kopsu patofüsioloogias on näidanud, et alveolaarsed epiteelirakud on hiirtel ACE-2 ekspressiooni peamine koht (24), kuid suhteliselt vähem tähelepanu on sellele suunatud fibroblastide rolli mõistmine ACE-2 vahendatud kopsufüsioloogias või kopsu patofüsioloogias. Meie teada on käesolev uuring esimene, mis näitab, et ACE-2 ekspresseeritakse inimese kopsufibroblastide poolt ja seda reguleerib hüperoksia. See on ka esimene, mis dokumenteerib, et TACE antagonist võib hüperoksiaga töödeldud rakkudes seda alareguleerimist ära hoida. Arvestades ACE-2 teadaolevat funktsiooni kopsukollageeni ladestumise ennetamisel kopsufibroosil (11), pole selle ekspressioon kollageeni sünteesi eest vastutavate fibroblastiliste rakkude poolt üllatav. Teised autorid on tõepoolest näidanud, et angiotensiini retseptori AT1 blokaatorid võivad ära hoida kopsukollageeni kogunemise vastsündinud rottidel, kellel on kokkupuude hüperoksikaga (25).

Hüperoksilise gaasi hästi uuritud kopsutoksilisus hõlmab teadaolevalt alveolaarsete epiteelirakkude apoptootilist rakusurma (26), kuid rakuliini IMR90 kokkupuude kõrge hapnikusisaldusega, mida sageli manustatakse enneaegsetele vastsündinutele (95% O2), ei suurendab inimese loote kopsufibroblastide apoptootilise rakusurma markerit (kaspaas 9, joonis 1 ). Ehkki 95% -line hapnik põhjustas nekrootiliste rakkude väga väikest suurenemist (<1%, vt tabel 1 ), näib ebatõenäoline, et sellel väikesel, kuid statistiliselt olulisel mõjul oleks füsioloogiline tähtsus. Hüperoksiline gaas põhjustas aga ACE-2 olulise languse ( joonis 2 ); kas subfüsioloogilised hapniku kontsentratsioonid vähendavad ACE-2 või mitte, on huvitav teema edasiseks uurimiseks. Kõigi avaldatud tõendite valguses võib ACE-2 allareguleerimine eeldada ANG II ja selle allavoolu profibrootiliste radade kuhjumist (vt joonis 7 ). Tõepoolest, hüperoksiline gaas suurendas varem ANGII-vahendatud kollageeni sünteesi inimese kopsufibroblastidega (9) ja kas ACE-2 pärssimine või geenide pärssimine suurendas inimese kopsurakkude autokriinse ANGII teket kultuuris (11). Veelgi enam, ACE-2 saadus heptapeptiid ANG1-7 oli kopsukoes antifibrootiline (21, 27) ja ACE-2 pärssimine vähendas selle tootmist (vt joonis 7 ). Sellest lähtuvalt eeldatakse, et hüperoksiast põhjustatud raku ACE-2 vähendamine soodustab fibrogeneesi, suurendades nii ANGII kui ka vähendades samal ajal ANG1-7.

Mehhanism, mille abil hüperoksia vähendab ACE-2, näib olevat valgu tasemel, kuna mRNA-s olulisi muutusi ei toimunud ja langust takistas TAPI-2, mis on ensüümi ADAM17 / TACE inhibiitor, mis lõikab ACE-2 ektodomeeni vastusena SARS-i koronaviirusele (16). Nagu näitasid Haga jt (15), näitas käesolev uuring ka seda, et hüperoksia mõju ACE-2-le näib hõlmavat ADAM17 / TACE mRNA ja valgu ülesreguleerimist (vt joonis 6 ), mis omakorda vahendab ensümaatilist eraldumist. ACE-2 ektodomeeni toimest ja selle vabanemisest rakuvälisse ruumi. Signaliseerimismehhanismi (de) määramine, mille abil hüperoksia ADAM17 / TACE ülesreguleerib, on edaspidiste uurimiste jaoks huvitav ja köitev teema.

On tähelepanuväärne, et ACE-2 langus toimus ainult siis, kui hüperoksilise kokkupuute perioodile järgnes 24 tunni jooksul normoksiline taastumine ( joonised 2, 3, 4, 5 ja 6 ). See redokspoisi muutuste jada tuletab meelde isheemia-reperfusiooni vigastusi, mille puhul paljud olulised signaaliülekandeteed ei indutseerita mitte isheemilisel perioodil, vaid naastes normoksiasse (28). Ehkki need pole praegu teada, võib hüperoksiliste / normoksiliste tsüklite indutseeritud mehhanismide osas spekuleerida nii, et need hõlmavad mitokondriaalseid või muid redokside tuvastamise mehhanisme, mida teadaolevalt mõjutavad reaktiivsed hapniku või lämmastiku liigid (29). Nende teede selgitamine on ka edaspidiseks uurimiseks väga huvitav teema.

Kokkuvõtlikult näitas see uuring, et ACE-2 ei ekspresseeri mitte ainult kopsuepiteelirakud (24), vaid ka inimese loote kopsufibroblastid. ACE-2 valgu ja ensüümi aktiivsust, kuid mitte mRNA-d vähendas loote kopsufibroblastide hüperoksia, kuid rakukultuuri supernatantides suurenes ACE-2 valk. Nende toimete TAPI-2 pärssimine viitab mehhanismile, mida vahendab ADAM-17 / TACE-indutseeritud ACE-2 eraldumine raku pinnalt. Kuna on teada, et kopsukahjustusi ja fibroosi saab ACE-2 abil tühistada, avaldab hüperoksia otsese mõju ACE-2-le inimese kopsurakkudes tõendamine märkimisväärset mõju hüperoksilise kopsukahjustuse, fibrogeneesi ja viirusnakkuse patogeneesile. kopsud.

Meetodid

Materjalid

Peptiid DX 600, mis on ACE-2 konkureeriv inhibiitor, osteti ettevõttest Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA. ACE-2 vastased antikehad saadi firmast Santa Cruz Biotechnology. TAPI-2 osteti ka ettevõttest Calbiochem, SanDiego CA. Loote kopsufibroblasti rakuliin IMR 90 osteti ettevõttest ATCC, Manassas, VA. Kõik muud materjalid olid reaktiivi puhtusega.

Rakukultuur

Selle uuringu kiitis heaks Michigan State University, MI East Lansing, institutsionaalne ülevaatekogu. Loote kopsufibroblasti rakuliini IMR-90 subkultiveeriti täissöötmes ja koguti konfluentuuris ning seejärel analüüsiti ACE-2 suhtes Western blot analüüsi ja ensüümi aktiivsuse abil. Rakke uuriti kõigis katsetes passaažil 13–15. ACE-2 testi spetsiifilisuse demonstreerimiseks mõõtsime ACE-2 taset selle konkureeriva inhibiitori DX600 juuresolekul (11). Seejärel töödeldi ühinemiskohas olevad rakuliinid hüperoksiaga 95% hapniku ja 5% CO2 sisaldusega 72 tundi, inkubeerides samal ajal veise loote seerumis 5%. Kontrollrakud eksponeeriti sama söötmega 72 tunni jooksul 21% hapniku ja 5% CO2 sisaldusega. 72-tunnise kultiveerimisperioodi lõpus võeti rakud inkubaatoritest välja ja sööde aspireeriti ning loputati üks kord seerumivaba söötmega. Enne inkubeerimist hüperoksia korral ravisime mõnda rakku ka 10 umol / l TAPI-2-ga. Nendel lasti ka 72 tundi kokku puutuda ja neid töödeldi samades tingimustes nagu ülalkirjeldatud.

Seejärel lasti rakkudel taastuda, inkubeerides seerumivabas söötmes 24 tundi toatemperatuuril. Taastumisperioodi lõpus koguti rakud 10x proteaasi inhibiitori kokteiliga ja määrati ACE-2 sisaldus immunoblotanalüüsi teel reaktiivse valgu ja ACE-2 ensüümi aktiivsuse suhtes.

Rakkude elujõulisus

Ühenemiseks kultiveeritud rakuliini töödeldi ülalkirjeldatud viisil, kontrollrakkudega 21% hapnikusisaldusega ja hüperoksiaga paljastatud rakkudega 95% hapniku juures (mõlemad 5% C02). Pärast 72-tunnist kokkupuudet 5% veise loote seerumiga lasti rakkudel 24 tunni jooksul taastuda seerumivabas söötmes normoksilises gaasis (21% O2 + 5% CO 2 ). Seejärel töödeldi rakke trüpaansinisega ja vaadati mikroskoobi all ning loendati surnud rakkude markerina siniseks värvitud rakud. Rakke töödeldi seejärel propiidiumjodiidiga, et DNA arv oleks kogu rakkude marker. Vähemalt kolme mikroskoobi välja kohta loendati kultuurisüvendi kohta vähemalt 400 rakku mikroskoopilise välja kohta. Seejärel keskmistati iga kultuurisüvendi väljade loendused, et saada andmeid, mida kasutati arvude n = 3 arvutamiseks (kolm kultuurisüvendit, milles igas rakus oli 1200 rakku). Seejärel arvutati nekrootiliste rakkude koguarv protsentides rakkude koguarvust. Võimaliku apoptoosi hindamiseks detekteeriti kaspaas 9 rakulüsaatide Western blot analüüsiga, mis oli kogutud 72-tunnise hüperoksiaga kokkupuute lõpus või normoksilise gaasi 24-tunnise taastumise lõpus. Blotimismeetodeid kirjeldatakse allpool.

Western blot

Rakud koguti proteaasi inhibiitoriga (Proteaasi inhibiitori kokteil P840, Sigma, St Louis, MO). Lahustuv valgu lüsaat (45 ug) laaditi ja töödeldi 10% Tris / glütsiini / SDS puhvris (BioRad, Berkeley, CA) SDS-PAGE-ga eraldatud 10% Tris.HCL polüakrüülamiidi geelidel. Geelid viidi Immun-blot polüvinülideenfluoriidi blot-membraanile. Blotmembraani blokeeris 5% rasvavaba kuivpiim 0, 1% Tween 20-ga Tris-puhverdatud soolalahuses. ACE-2 Western blot analüüs viidi läbi anti-ACE-2 polüklonaalse antikehaga (1: 4000: Abcam Biotechnology, Cambridge, MA). Kaspaas 9 ja ADAM17 / TACE antikehad saadi firmast Cell Signaling, Danvers, MA. Valkude võrdse laadimise tagamiseks sondeeriti membraane β-aktiini (Cell Signaling Technology) vastase antikehaga. Ribad visualiseeriti HRP-ga konjugeeritud kitse küülikuvastase sekundaarse antikehaga (lahjendus 1: 10 000, Santa Cruzi biotehnoloogia, Santa Cruz, CA), kasutades täiustatud kemoluminestsentsi tuvastamist standardsete meetoditega.

ACE-2 ensüümi test

Kuue auguga kollageen I-kattega plaatidel (BD Biosciences, Bedford, MA) kasvatatud ja töödeldud IMR-90 koguti jääkülmas Tris-HCl puhverlahuses (Tris-HCl (pH 6, 5), 1x täielik proteaasi inhibiitori kokteil EDTA -vaba (Roche, Indianapolis, IN) ja lisinopriil (50 μg / l; Sigma-Aldrich). Puhvrisse lisati lisinopriili AKE aktiivsuse blokeerimise vahendina. Poolealaga mustas 96-augulises mikrotiiterplaadil, siis lisati ACE-2, MCA-YVADAPK (Dnp) -OH (R&D Systems, Minneapolis, MN) fluorogeenne peptiidsubstraat lõppkontsentratsioonil 10 μmol / l 30 μl raku lüsaadile (kogumahus 50 μl) pooltesse süvenditesse lisati ka DX 600 (lõppkontsentratsioonil 10 umol / l; Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA), mis on ACE-2 konkureeriv inhibiitor, ensümaatilise võrdluseks ACE-2 aktiivsuse pärssimine. Plaat soojendati toatemperatuurini ja fluorestsents loeti plaadilugejaga (ergastamine 310/20 nm ja emissioon 420/50 nm) BioTekis. FL600 mikroplaadi fluorestsentslugeja (BioTek, Burlington VT) 30 minutit. Kineetilised näidud normaliseeriti vastavalt nende vastavatele DNA kontsentratsioonidele.

Hoeschti värvaine DNA test

Selgele 96-augulisele mikrotiiterplaadile lisati 4 ui rakulüsaati ja 46 ui täielikku NP-40 lüüsipuhvrit (NP-40, 1 x täielik proteaasi inhibiitori kokteil etüleendiamiintetraäädikhappevaba (Roche)). Üldmaht viidi 100 ui-ni, lisades 50 ui Hoeschti värvainet (lõppkontsentratsioon 5 umol / l). Seejärel kaeti mikrotiiterplaat ja loksutati 30 sekundit keskmise kiirusega. Seejärel asetati plaat 15 minutiks inkubaatorisse 37 ° C. Fluorestsentsi loeti plaadilugejal (ergastus 360/40 nm ja emissioon 460/40) (FL600 Microplate Fluorescence Reader).

RNA eraldamine ja reaalajas PCR

Pärast töötlemist ekstraheeriti IMR 90 rakud kogu RNA jaoks TRIzoli reagendiga (Invitrogen, Carlsbad, CA) vastavalt tootja juhistele. Esimese ahela cDNA sünteesiti kogu RNA-st, kasutades Superscript II pöördtranskriptaasi ja oligo (dT) 12–18 (Invitrogen). Reaalajas PCR viidi läbi cDNA-ga, mis oli sünteesitud 50 ng kogu RNA-st, SYBR Green PCR tuumareaktiividest (Applied Biosystems, Foster City, CA) vastavalt tootja juhistele ja 0, 2 μmol / l inimese ACE-2 spetsiifiliste praimeritega ( senss 5'-CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3 'ja antisenss 5'-GAGCTA-ATGCATGCCA-TTCTCA-3', ADAM17 / TACE (5. tähendus - TTGGTGGTAGCAGATCATCG-3 'ja antisenATA 5'-CTG (mõttes 5'-AGGCCAACCGCG-AGAAGATGACC-3 'ja antisenss 5'-GAAGTCCAGGGCGACGTAGC-3'). ACE-2 ja β-aktiini termiline profiil algas 10-minutise aktiveerimisega temperatuuril 95 ° C, millele järgnes 40 denatureerimise tsüklit temperatuuril 95 ° C 60 sekundit, lõõmutamine 55 ° C juures 60 sekundit, pikendamine temperatuuril 72 ° C. s ja lõpetades PCR-produktide dissotsiatsioonikõvera analüüsiga. ADAM17 / TACE termiline profiil algas 10-minutise aktiveerimisega temperatuuril 95 ° C, millele järgnes 40 denatureerimise tsüklit temperatuuril 95 ° C 15 sekundit, lõõmutamine 55 ° C juures 15 sekundit, pikendamine temperatuuril 72 ° C 30 sekundit. Reaktsioonid viidi läbi StepOnePlus reaalajas PCR süsteemi seadmes (Applied Biosystems). Künnistsükli ( Ct ) andmed koguti tarkvara StepOne versiooni 2.1 (Applied Biosystems) abil. Suhteline ACE-2 ekspressioon normaliseeriti β-aktiiniks ja arvutati 2-ΔΔCT võrdleva CT-meetodi abil, kus ΔCT = CTACE-2 - CTβ-aktiin ja ΔΔCT = ΔCT töötlemine - ΔCT.

Rakukultuurisöötmete käitlemine

Rakud, mis olid plaaditud kogumahus 1 ml, koguti sööde 15 ml koonilisse torusse, mis sisaldas 300 ui 10-kordset proteaasi inhibiitori täielikku EDTA-vaba kokteili (Roche). Proovist saadud rakujäägid eemaldati tsentrifuugimise teel. Proovid ettevalmistati dialüüsiks, kasutades Spectra / Por Biotech tselluloosiestri dialüüsimembraane, mille MWCO 10 kDa (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) vastavalt tootja juhistele. Membranes containing the samples were then kept at 4 °C in a 2 l beaker of deionized water with gentle stirring until the media sample became clear (~2 d). At the completion of dialysis, samples were transferred to a new 15 ml canonical tube and frozen at −80 °C. Completely frozen samples were lyophilized using the Labconco Freeze Dryer/Freezone 4.5 system according the manufacturer's protocol. Lyophilized samples were diluted in 100 µl of sterile deionized water. Western blot for ACE-2 and β-actin was done by standard protocols.

Finantstoetuse avaldus

This work was supported by HL-45136 from US National Institutes of Health, Bethesda, MD to BDU and by a grant from the Fellowship Research Fund of Sparrow Hospital, Lansing, MI (to CIO).