Jõehobu signaalimine kontrollib droonide aktiivsust, et reguleerida elundi suurust drosophilas | rakusurm ja diferentseerumine

Jõehobu signaalimine kontrollib droonide aktiivsust, et reguleerida elundi suurust drosophilas | rakusurm ja diferentseerumine

Anonim

Õppeained

  • Apoptoos
  • Drosophila
  • HIPPO signalisatsioon
  • Organogenees

Abstraktne

Hippo rada kontrollib elundi suurust mitmete mehhanismide abil, mis lõpuks reguleerivad transkriptsiooni kaasaktiveerijat Yorkie (Yki). Hippo signaali ülereguleerimine põhjustab Yki-vahendatud sihtgeenide aktiveerimise tõttu kudede ülekasvu, samas kui raja üleekspresseerimine kutsub esile arenevate kudede apoptoosi. Hippo (Hpo) aktivatsioonist põhjustatud rakusurma põhjustavat mehhanismi ei mõista. Leidsime, et Hpo üleekspresseerimine põhjustab Dronci ( Drosophila kaspaas-9 homoloog) homoloogide ekspressiooni esilekutsumist ja drooni alareguleerimine võib Hpo-vahendatud apoptoosi pärssida / blokeerida. Lisaks surus Dronci aktiivsuse ülesreguleerimine tugevalt Yki üleekspressioonist põhjustatud ülekasvu, viidates sellega, et Hippo signaalimine piirab Dronci aktiivsust. Hippo-vahendatud rakusurm nõuab initsiaatori kaspaasi Dronci aktiivsust. Dronci funktsiooni kaotamine geneetilistes mosaiikides põhjustab rakkude ellujäämist ja rakkude suurenenud proliferatsiooni kujutlusketastes. dronc surutakse transkriptsiooni teel Yki üleekspresseerivates rakkudes või rakkudes, mis on mutantsed Hippo raja teiste komponentide jaoks, näiteks tüükad ( wts ). Teeme ettepaneku, et Dronc oleks jõehobu signaaliraja transkriptsiooniline sihtmärk. Hippo – Dronci ühendus mõjutab elundi üldise suuruse ja muude kasvu reguleerivate mehhanismide, näiteks kompenseeriva vohamise ja rakkude konkurentsi kontrolli.

Peamine

Hippo signaaliülekandetee on kujunenud võtme suuruse regulatiivseks rajaks, mis piirab rakkude proliferatsiooni ja soodustab apoptoosi, et samal ajal reguleerida kärbeste ja selgroogsete elundite suurust. 1, 2 Hippo signaaliraja keskmes on tuumakinaasi kaskaad, mis koosneb kahest seriini / treoniini spetsiifilisest kinaasist Hippo (Hpo) 3, 4, 5, 6, 7 ja tüükadest (Wts), 8, 9 ja nende adapterist valgud Salvador 10, 11 ja Mob tuumori supressorina (Mats). 12 Kinaasi kaskaad inaktiveerib onkoproteiini Yorkie (Yki) 13, mis toimib Hippo raja transkriptsiooni kaasaktiveerijana ja reageerib mitmele ülesvoolu regulaatorile nagu FERM-domeen, mis sisaldab valke Expanded (Ex) ja Merlin (Mer), 14 WW- ja C2-domeeni sisaldavad proteiinid Kibra, 15, 16, 17 ja ühekäigulised membraanivalgud Crumbs (Crb) 18, 19, 20 ja rasv. 21, 22, 23, 24 Yki partnerit, kellel on vähemalt kolm transkriptsioonifaktorit, Scalloped, Homothorax ja Teashirt, 1, et reguleerida raku kasvu reguleerivate geenide ( myc, bantam ), rakutsükli kulgemist ( cyclinB, cyclinD, cyclinE, e2F1 ) transkriptsiooni reguleerivate geenide transkriptsiooni apoptoosi pärssimine ( diap1 ). Hippo signaalimine reguleerib ka transkriptsiooniliselt tagasiside ülesreguleerimise teel mitmeid ülesvoolu komponente, näiteks mer, ex, nelja liigendiga, kibra ja crb . 1 Oma mitmete sisendite ja sihtmärkidega on jõehobu signaalimine kujunenud pleiotroopiliseks rajaks, mis toimib kontekstist sõltuval ja koespetsiifilisel viisil elundi suuruse reguleerimiseks.

Hippo signaalimise praeguste mudelite kohaselt suudab aktiveeritud Hpo siduda Sav ja fosforüleerida Wts ja selle kaasfaktor Matid, soodustades Mats-Wts kompleksi moodustumist ja Wts kinaasi aktiivsuse suurenemist. Aktiveeritud Wts / Mats fosforüülib ja pärsib Yki. 1 Alternatiivina võivad Hpo, Wts ja Ex Yki-ga vahetult suhelda fosforüülimisest sõltumatul viisil, mis põhjustab tsütoplasmaatilist sekvesteerimist ja Yki aktiivsuse pärssimist. 1 Hippo signaali kaotamine põhjustab elundite ülekasvu, kuna mutantsed rakud vohavad kiiremini kui metsikut tüüpi rakud ja on vastupidavad arenguga reguleeritud proapoptootilistele signaalidele, mis tavaliselt elimineerivad kasvavas elundis lisarakud. 2 On näidatud, et kärbeste hüpoaktiveerimine hüpoaktiveerimisega Hpo, Sav, Mats ja Ws üleekspresseerimisega põhjustab rakkude surma ja moodustab väiksemaid elundeid. 6, 7, 25 peidetud proapoptootiline geen ja bantaamne mikroRNA indutseeritakse vastusena Hippo raja komponentide üleekspressioonile; aga jõehobu vahendatud rakusurma molekulaarne mehhanism jääb ebaselgeks. 2 Selles uuringus uurisime geenide sisemise rakusurma rada, et tuvastada Hpo-vahendatud rakusurma mehhanism. Meie uuringud näitavad, et jõehobu rada reguleerib Dronci ( Dro sophila N edd -2-taolist c- aspaasi, mis on ortoloogiline inimese Caspase 9-le) taset, et kontrollida nii rakkude paljunemist kui ka rakkude ellujäämist, reguleerida elundi suurust.

Dronc kodeerib kaspaasi (tsüsteiinproteaasi), mis moodustab raku apoptootilise surma mehhanismi tuuma. 26, 27 Kaspaasid sünteesitakse inaktiivsete tsümogeenidena, mis aktiveeritakse proteolüütilise lõhustamise teel, mida reguleerib apoptoosi (IAP) valguperekonna inhibiitor. Kärbestes tagab Drosophila IAP (DIAP1) rakkude elujõulisuse, seondudes otseselt kaspaasidega ja reguleerides nende aktiivsust ubikvitiinist sõltuval viisil. 28 Vastusena apoptootilistele stiimulitele seovad Reaper, Hid ja Grim (RHG) valgud DIAP1 BIR-domeeni, mille tulemuseks on DIAP1 üldine ja proteosoomne lagundamine ning kaspaasi kaskaadi aktiveerimine pimedas ( Drosophila Apaf-1-ga seotud tapja aka DAPAF) -1, Drosophila apoptoosi soodustav faktor-1-sarnane adaptervalk) sõltuval viisil. See hõlmab initsiaatori kaspaas Dronc ja efektor kaspaase Drice ja DCP1. 28, 29

Nii DIAP1 kui ka Dronc ekspresseeritakse üldlevinud viisil, kuid neil on apoptoosis vastupidised rollid. Diap1 kaotamine põhjustab kaspaasi vahendatud rakusurma, 28 kuna drooni kaotus blokeerib kärbeste enamiku apoptoosi. 26, 27, 30 DIAP1 aktiveeritakse mitmete mehhanismide abil, nagu autoaktiveerimine, RHG valkude poolt transkriptsioonijärgne reguleerimine ja Hippo raja transkriptsiooniline reguleerimine. 6, 7 Dronc aktiveeritakse autokatalüütilise mehhanismi 31 abil ja transkriptsiooni järel Dark poolt. 32 Dronci aktiivsust reguleerivad lagundavad (DIAP1-sõltuvad) ja mitte-lagunevad (DIAP1-st sõltumatud) mehhanismid. 28 DIAP1 üleekspressioon ei vähenda Dronci taset ega mõjuta Dronci või sihtmärgi Dronci katalüütilist aktiivsust lagundamisel elusrakkudes. DIAP1-st allavoolu pärsib p35 (bakuloviiruse kaspaasi inhibiitor) üleekspressioon Dronc-sõltuvat rakusurma, kuid see ei pärssi Dronc-i. Siin pakume tõendeid, mis viitavad sellele, et jõehobu rada reguleerib dronci transkriptsiooni ja Hippo signaali hüperaktiviseerimine kutsub esile dronci, mis aitab kaasa apoptoosile. Dronci suurenenud aktiivsus (sidudes selle adapteriga Tume) võib maha suruda Hippo signaalimise alareguleerimise põhjustatud ülekasvud. Dronc funktsiooni kaotus põhjustab suurenenud proliferatsiooni ja vähenenud apoptoosi. Kokkuvõtlikult võib öelda, et meie tulemused viitavad sellele, et Hippo signaalikomponendid peavad kontrollima Dronci aktiivsuse taset, et kontrollida rakkude proliferatsiooni ja rakkude ellujäämist.

Tulemused

Hippo signaalikomponentide üleekspressioon kutsub esile kaspaasist sõltuva rakusurma

GMR-Gal4 draiverit kasutades arenesime silmaümbruse ketastes Hpo üleekspressiooniks (joonis 1a). Hpo ( GMR-Gal4 UASHpo, joonis 1b) üleekspressioon põhjustas GMR- domeenis raku massilise surma (aktiveeritud Drice, joonis fig 1c ja d), häirimata silma diferentsiaalide või mustrite kujunemist (ELAV joonis fig 1c) silmaklapi ketastes. Nukule keskmises võrkkestas (∼ 24 h APF) jätkasid nii fotoretseptori kui ka pigmendirakkude surm enneaegselt (joonis 1e ja f). Võrdluseks - metsikut tüüpi võrkkestarakkude surm toimub pigmendirakkudes ja võrkkesta piiri ümber silmnähtavalt (joonis 1i). Võrreldes metsikut tüüpi täiskasvanud silmadega (joonis 1g), peetakse Hpo üleekspresseerivaid täiskasvanud kärbseid faraatidena toatemperatuuril ja temperatuuril 18 ° C on neil väikesed karedad silmad (joonis 1h). Hpo üleekspressioon põhjustas apoptoosi kõigis epiteeli kudedes, näiteks tiivaketastes Hpo üleekspressiooni lühikese impulsiga, kasutades kuumašokki ( hsp70) -Gal4, põhjustatud apoptoosi (joonis 1i). Võrdluseks - metsikut tüüpi tiibketastes toimub apoptoos väga vähestes rakkudes (joonis 1j). Seega, kooskõlas varasemate leidudega, põhjustab jõehobu üleekspressioon rakusurma aktiveerimist kõigis kasvavates elundites. Yki ja Hpo koekspressioon silmaklapi plaatides ( GMR-Gal4 UASYki, UASHpo ) päästis Hpo aktiveerimise väikese silma fenotüübi (täiendav joonis S1). See viitab sellele, et Hpo avaldab oma apoptootilist mõju Yki koaktyvaatorit hõlmava klassikalise raja kaudu. Geneetiliste epistaasikatsete käigus selgus, et Hpo toimib proapoptootilistest geenidest ülesvoolu nagu Df (3L) H99 jaoks mutantsetes rakkudes (mis katab RHG geenide piirkonna), ei põhjusta Hpo üleekspressioon apoptoosi (täiendav joonis S2). Seega vajab Hpo apoptoosi esilekutsumiseks proapoptootilisi geene ( RHG ) (lisajoonis S2).

Image

Hpo üleekspressioon kutsub esile rakusurma. ( a ) GMR-Gal4 UASGFP silmaümbruse kujutlusketas, mis näitab GFP reporteri ekspressiooni silma ketta GMR-domeenis. ( b - d ) GMR-Gal4 UASHpo silma- antennilised kujutluskettad, mis on värvitud ( b ) Hpo, c ) aktiveeritud Drice'i (Drice *, punane), Elav (roheline) ja TOPRO (sinine) jaoks. Drice * tähistab silmaümbruse ketastes surevaid rakke ( d, halltoonid). ( e ja f ) GMR-Gal4 UASHpo loomadest pärit keskmise nina võrkkest (∼ 24APF), kellel on emakavälise raku surm, mida tähistab Drice * ( e punane, halltoon), Elaviga tähistatud fotoretseptori rakud ( e, sinine) ja rakk kuju tähistatud plaatidega suured (Dlg) ( e, roheline). f ) Ektoopiline rakusurm võrkkestas põhjustab võrkkesta võre katkemist. ( g ja h ) Võrreldes metsiktüübiga ( g ), võrkkesta ( h ) ekspresseeriva Hpo fenotüüp halveneb järk-järgult ja selle tagajärjel arenevad täiskasvanul väikesed karedad silmad. ( i ) Drice * -ga tähistatud f -tüüpi võrkkestaga võrreldav metsiktüüpi keskklassi võrkkest näitab arengu apoptoosi. ( j - l ) Metsikut tüüpi tiiva kujutluskettad ( j ) kolmandast vastsest vastses näitavad väga vähe Drice * ekspressiooni, samal ajal kui hsp70-Gal4 UASHpo loomade ( k ja l ) kujuteldavatel tiivaketastel on rakusurma kindel indutseerimine, nagu näevad aktiveeritud Drice * ekspressioon ( i, punane) mõni tund pärast Hpo aktiveerimist. Kujutiste orientatsioon a - i-s on ees paremale ja seljaga ülespoole ning kujuteldava tiiva ketaste ( j ja l ) orientatsioon on vasakule ees

Täissuuruses pilt

Diap1 tase püsib Hpo üleekspresseerivates rakkudes muutumatuna

Arvestades, et Diap1 on Hippo signaaliraja transkriptsiooniline sihtmärk ja proapoptootilised geenid toimivad Diap1 ülesvoolu, testisime, kas Hpo üleekspressioon viib diap1 taseme allareguleerimisele. Leidsime, et GMR-Gal4 UASHpo silmaümbruse ketastes (joonis 2e – h) jäävad diap1-lacZ (joonis 2e) ja DIAP1 valgu (joonis 2f) tasemed sarnasteks metsiktüübiga (joonis 2a ja b). Sarnaseid tulemusi täheldati Sav, Wts üleekspresseerimisel või Sav Wts (täiendav joonis S3), Hpo Sav (andmeid pole näidatud) või Hpo Wts (paaris) kombinatsiooni paarisväljendamisel. Järgmisena testisime Hpo reageerimiselementi ( diap1-4.3-GFP ), mis kordab diap1 ekspressiooni Hpo regulatsiooni järgi silma- ja tiivaketastes (joonis 2j). Hub üleekspresseerimine nub -Gal4 ( nub-Gal4 UASHpo ) all (joonis 2k – m) põhjustab tiibketastes ulatuslikku rakusurma ja tulemuseks on väikese tiibuga fenotüübi teke. 6, 7 nub-Gal4 juhib transgeenide ekspressiooni tiivakotis ( nub-Gal4 UASGFP , joonis 2n). diap1-4.3-GFP ekspressioon jääb nub-Gal4 UASHpo tiibketastel muutumatuks (joonis 2k ja l). See tulemus oli huvitav, kuna Hpo üleekspresseerivates rakkudes toimus rakusurm hoolimata normaalsest DIAP1 ekspressioonist. On teada, et DIAP1 üleekspressioon blokeerib apoptoosi mitmes apoptootilises kontekstis (nt Hidi üleekspressioon). 28 Kuna Hpo üleekspresseerivad rakud kutsusid esile Dronci aktiivsuse 'funktsionaalse näidu' kõrgel tasemel lõhustatud Caspase 3 (Casp3 *), 33 testisime Dronci ekspressiooni Hpo üleekspresseerivates rakkudes.

Image

Hpo üleekspressioon kutsub esile Dronci. ( a - d ) ( a ) diap1-lacZ, ( b ) DIAP1, ( c ) Hpo ja ( d ) Dronc on metsiktüüpi ekspressioon kolmandas instinktis, mis on tehtud kujutise kettaheites. ( e - h ) GMR-Gal4 UASHpo silmaümbruse kujutluskettad, millel on vastavalt ( e ) diap1-lacZ , ( f ) DIAP1, ( g ) Hpo ja ( h ) Dronc ekspressioon. ( i ja j ) Metsikut tüüpi tiibkujulised kettad, mis näitavad ( i ) Dronci ja ( j ) Hpo-vastuselemendi diap1-4.3GFP normaalset ekspressioonitaset. nub-GAL4 UASHpo tiibkettad ei näita muutusi diap1-4.3GFP (roheline k, hallskaala l ) ekspressioonis ja näitavad Dronci induktsiooni (punane k, hallskaala m ). ( n ) Metsikut tüüpi kolmanda instinkti tiiva kujutluskettad, mis näitavad NAS- GFP -ga tähistatud nub-Gal4 ekspressioonidomeeni . o ) Poolkvantitatiivne Western blot dronci ekspressioonitasemete hindamiseks. Western blot analüüs viidi läbi metsiktüüpi (WT), GMR-Gal4 UASHpo ja GMR-Gal4 UASproDronc silmaümbruse kujutisketaste valguekstraktidega. α- tubuliin on laadimiskontroll. Kujutiste orientatsioon on identne a - h (ees paremale, selja üles) ja i - m (vasakule ees). Kollane nooleots tähistab morfogeneetilist vagu, mis langeb kokku GMR-Gal4 ekspressioonidomeeni piiriga

Täissuuruses pilt

Jõehobu indutseerib Dronci ja nõuab apoptoosi esilekutsumiseks kõrgendatud Dronci aktiivsuse taset

Võrreldes metsiktüübiga (joonis 2d ja i), põhjustab Hpo üleekspressioon Dronci ekspressiooni ülesreguleerimist silmamuna ( GMR-Gal4 UASHpo , joonis 2h) ja tiibketastes ( nub -Gal4 UASHpo , joonis 2m). Dronci valgu taseme hindamine poolkvantitatiivsete Western blot-analüüside abil toetab seda tähelepanekut veelgi (joonis 2o). Hpo Dronci interaktsiooni mõistmiseks testisime Dronci üleekspressiooni mõju (joonis 3, täiendav joonis S4). Silmaümbruse ketastes kutsub pro-Dronci ( GMR-Gal4 UASproDronc , joonis 3c) üleekspressioon rakusurma (Casp3 *, joonis 3b), mõjutamata Hpo (lisajoonis S4) või Yki (lisajoonis S4) taset ja paiknemist . Kooskõlas varasemate andmetega näivad 27 täiskasvanu silmad normaalse suurusega ja täpilise pigmendiga silma fenotüübiga (joonis 3a). Hpo ( GMR-Gal4 UASHpo ) üleekspresseerimise tulemuseks on täiskasvanul (väikeste silmadega) fenotüüp (joonis 3d), mis on põhjustatud rakusurma (joonis 3e) ja Dronci (joonis 3f) esilekutsumisest silma ketastes. Pro-Dronci koekspressioon Hpo-ga ( GMR-Gal4 UASHpo, UASproDronc , joonis 3g – i) põhjustab suurenenud rakusurma (joonis 3h) võrreldes Dronci (joonis 3b) või ainult Hpo-ga (joonis 3e); Dronci akumuleerumine (joonis 3i) ja tuuma Yki lokaliseerimine (täiendav joonis S4). GMR-Gal4 UASHpo, UASproDronc vastsed arenevad väikeste silmadega faraat täiskasvanuteks ja näitavad suurenenud rakusurma (joonis 3g) võrreldes GMR-Gal4 UASproDronc (joonis 3a) või GMR-Gal4 UASHpo (joonis 3d) loomade silmadega . Seega suhestub hpo geneetiliselt drooniga .

Image

Hpo suhtleb geneetiliselt Dronciga rakusurma reguleerimiseks. GMR-Gal4 UASproDronc , ( d - f ) GMR-Gal4 UASHpo üleekspressiooni fenotüübid , ( g - i ) GMR-Gal4 UASHpo UASproDronc , ( j - l ) GMR-Gal4 UASDNproDronc ja ( m - o ) GMR-Gal4 UASHpo UAS Kuvatakse DNproDronc . Iga transgeeni üleekspressioonist põhjustatud rakusurma võrdlus on näidatud aktiveeritud kaspaas 3 (Casp3 *) antikeha ekspressiooniga kolmandates silmamuna kujutlusketastes. ( a, d ja g ) Sellest tulenev täiskasvanute kaspaasi induktsiooni fenotüüp näitab UASprodronci ( a ja b ) üleekspressiooni kergeid mõjusid, mida suurendab UASHpo ( g ja h ) ekspressioon. Võrdluseks on punktides d ja e näidatud rakusurma, mis on põhjustatud ainult UASHpo üleekspressioonist. ( j - o ) UASDNproDronci üleekspressioon ei indutseeri aktiveeritud kaspaasi ( k ) ekspressiooni, mille tulemuseks on peaaegu metsikut tüüpi täiskasvanu silma fenotüüp ( j ). ( m - o ) UASHpo ja UASDNproDronc koos ekspressioon ei suuda aktiveeritud kaspaasi ( n ) indutseerida kolmanda instari vastse arengu ajal, mille tulemuseks on UASHpo vahendatud apoptoosi täielik päästmine täiskasvanu silmas (võrrelge m punktiga d ). ( c, f, i, l ja o ) Nendel paneelidel on näidatud näidatud genotüüpide silmaümbruse kujutluskettad, mis on värvitud Dronci ekspressiooniks, et kinnitada Dronci transgeenide üleekspressiooni. Pange tähele, et Dronci tasemeid reguleerib UASHpo ( f ) üleekspressioon . ( p - u ) ( p - r ) nub-Gal4 UASHpo ja ( s - u ) nub-Gal4 UASHpo UASDronc RNAi tiibade kujutisega ketaste värvimiseks Hpo (roheline) ja apoptoos (TUNEL, punane). nub-Gal4 UASHpo kettad identifitseeriti npo -Gal4 domeeni Hpo ekspressiooni (rohelise) ülesreguleeritud taseme järgi, kasutades Hpo vastast antikeha. Pange tähele, et Hpo põhjustatud ulatuslik rakusurm ekspressiooni ( q ja r ) tõttu surutakse alla Dronci taseme ( t ja u ) allareguleerimisega. Kuid Dronci allareguleerimine ei mõjuta Hpo ekspressiooni (võrrelge q t-ga ). Q, r, t, u suurendusega alad on p ja s-ga tähistatud valgena. Kujutiste orientatsioon on kõigil paneelidel ühesugune

Täissuuruses pilt

Dronci katalüütiliselt inaktiivne vorm toimib domineeriva negatiivsena ja surub teadaolevalt raku surma Hid / Reaper rada. 27 Domineerivat-negatiivset Dronc ( GMR-Gal4 UASDNproDronc ) üleekspresseerivate kärbeste täiskasvanud silmad näivad fenotüüpiliselt normaalsed (joonis 3j) ja nendes silmakollete ketastes ei põhjustata enneaegset rakusurma (mõõdetuna Casp3 * ekspressiooniga) (joonis 3k). Testimaks, kas Hpo indutseeritud apoptoos nõuab droonifunktsiooni , ekspresseerisime dominant-negatiivset Dronc koos Hpo-ga ( GMR-Gal4 UASHpo, DNproDronc ) (joonis 3m – o). Hpo üleekspressioonist põhjustatud rakusurma pärsib täielikult domineeriva negatiivse proDronci ekspressioon, nagu nähtub Casp3 * dramaatiliselt madalamast tasemest (joonis 3n). Selle tulemuseks on silma märkimisväärne päästmine täiskasvanul (joonis 3m), võrreldes ainult GMR-Gal4 UASHpo-ga (joonis 3d), mis viitab sellele, et Hpo indutseeritud apoptoos nõuab suuremat Dronci aktiivsuse taset või drooni normaalset funktsiooni. Teistes arenevates elundites, näiteks tiibketastes, põhjustab Hpo üleekspresseerimine nub -Gal4-ga ( nub-Gal4 UASHpo , joonis 3p – r) tiivakotis (joonis 3r) tugeva rakusurma ja täiskasvanu väikeste tiibadega. Et testida, kas Hpo üleekspressioon võib põhjustada droonide alareguleerimisel rakusurma, ekspresseeriti Hpo koos dronc RNAi-ga ( nub-Gal4 UASHpo, UASdronc RNAi , joonis 3s – u). Nendes tiibketastes (joonis 3u) raku surm oli Hpo üleekspresseerivates rakkudes dramaatiliselt vähenenud. Nub -Gal4 domeenide kvantitatiivne määramine Hpo (nub -Gal4 UAS-Hpo ) üleekspresseerivate või Hpo koos ekspresseerivate vastsete tibaketastes näitas Non -Gal4 domeeni nub-Gal4 olulist päästmist dronc RNAi-ga ( nub-Gal4 UASHpo, UASdronc RNAi ). täiskasvanud tiiva suurus on taastatud ( P <0, 05, n = 4, andmeid pole näidatud). Seega nõuab Hpo üleekspressioonist põhjustatud apoptoos Dronci.

Hippo rada reguleerib koe suuruse kontrollimiseks Dronci aktiivsuse taset

Järgmisena küsisime, kas muutunud Dronci aktiivsuse tase mõjutab konkreetselt apoptoosi reguleerimisega seotud jõehobu funktsioone või mõjutab see ka teisi jõehobu funktsioone, näiteks rakkude vohamise piiramist. Transkriptsiooniline koaktyvaator Yki on Hippo raja pärsitud peamine sihtmärk. Võrreldes metsiktüübiga (joonis 4a – c), põhjustab Yki ( GMR-Gal4 UASYki ) üleekspressioon täiskasvanud silmade ülekasvamist (joonis 4j), mis on tingitud jõehobu signaali ülereguleerimisest. GMR-Gal4 UASYki silmaantennaalsed kettad näitavad Dronci allareguleerimist GMR ekspressioonidomeenis (joonis 4d) võrreldes metsiktüübiga (joonis 4a). Dronci aktiivsuse reguleerimine proDronci ja Yki ekspressiooni kaudu ( GMR-Gal4 UASYki, UASproDronc ; joonis 4g – i) põhjustas täiskasvanu silmade suuruse olulist vähenemist (joonis 4j). Täiskasvanu silmade suuruse kvantitatiivne määramine õigustas meie tähelepanekut, et suurenenud Dronc aktiivsus vähendab oluliselt Yki-indutseeritud ülekasvu (joonis 4j, n = 5, P <0, 05). Need andmed viitavad sellele, et droonide tase langeb rakkudes, kus Hippo signaali reguleerimine on alareguleeritud, ja suurenenud Dronci aktiivsus võib summutada Hippo signaali signaali allareguleerimise tagajärgi.

Image

Hpo suhtleb geneetiliselt Dronciga, et reguleerida elundi suurust. Metsiku tüübi silmaantennaalsete kujutlusketaste GMR-Gal4 domeeni Dronci taseme, mitootiliste arvude ja TUNEL-profiilide võrdlus ( d - f ) GMR-Gal4 UASYki , ( g - i ) GMR-Gal4 UASYki, UASproDronc ja ( k - i ) - l ) Kuvatakse GMR-Gal4 UASproDronc loomad. Võrreldes metsiktüübiga ( a ), on Dronci tase Yki ( d ) üleekspresseerivates rakkudes alareguleeritud. ( b ja c ) Näita metsiktüüpi silmaümbruse kujutlusketaste tüüpilist vohamise ja rakusurma profiili, kus rakud läbivad mitootilise arreteerimise pärast SMW-d (teine ​​mitootiline laine) ( b ). Selles arengujärgus ei indutseerita apoptoosi ( c ). ( e ja f ) GMR-Gal4 UASYki silmaantennaalsetes ketastes on SMK ( e ) tagaküljel Yki üleekspresseerivates rakkudes mitootiliste figuuride (PH3, e ) arv märkimisväärselt suurenenud ja apoptoosi ei indutseerita ( f ). UASproDronci ja UASYki koekspressioon põhjustab SMW-le ( h ) järgnevate mitootiliste figuuride arvu vähenemist ja indutseerib apoptoosi ( i ). Võrdluseks on näidatud kontrollkettad, mis näitavad U3proDronci üleekspressiooni PH3 ( k ) ja apoptoosi ( l ) jaoks. ( j ) näitab täiskasvanute silma suuruse kvantifitseerimist kärbeste hulgast, kes ekspresseerivad UASYki üksi või koos UASDNproDronci ( P > 0, 05) või UASproDronciga ( P <0, 05). Täiskasvanu silma suurust mõõdeti, lugedes iga genotüübi ommatidia koguarvu ( n = 5). Kujutiste suurendus ja suund on kõigil paneelidel ühesugused. Kollased nooled tähistavad morfogeneetilise vagu asukohta, mis tähistab GMR-Gal4 domeeni piiri. Kõiki võrdlusi tehakse morfogeneetilise vagu tagumises piirkonnas (st vasakul). Selle joonise värvitoon on saadaval veebis ajakirjas Cell Death and Differentiation

Täissuuruses pilt

See toime võib olla tingitud Dronci proapoptootilisest mõjust või kui Yki ekspresseerivad rakud võivad Dronci üleekspresseerimise korral vähendada proliferatsiooni. Nende võimaluste eristamiseks tähistasime rakud jagunemise M-faasi sisenevaid rakke fosforhistooni H3 (PH3) antikehaga ja rakke, mis läbivad TUNEL-i abil apoptoosi. Metsikut tüüpi silmakollete ketaste korral on raku jagunemine MF-i ees juhuslik, MF-i järel aga rakud rakutsükli peatuvad ja jagunevad kord teises mitootilises laines (SMW, joonis 4b). Võrdluseks - metsikut tüüpi silmaümbruse ketaste arengufaasis ei käi paljudes rakkudes apoptoosi (joonis 4c). Yki ( GMR-Gal4 UASYki ) üleekspresseerimine põhjustas GMR-domeenis SMW järel oleva PH3 kõrge ekspressioonitaseme, mis näitab emakavälist vohamist (joonis 4e), samal ajal kui silmakollete ketastes oli näha vähe apoptoosi (joonis 4f). Ainult pro-Dronci (GMR-Gal4 UASproDronc) üleekspressioon ei avalda mingit mõju PH3 tasemele (joonis 4k) ja kerge mõju apoptoosile (joonis 4l) võrreldes metsiktüübiga (joonis 4b ja c). ProDronci koekspressioon Yki ekspresseerivates rakkudes (GMR-Gal4 UASYki, UASproDronc) näitas vähem PH3-positiivseid mitootilisi rakke (joonis 4h) ja TUNEL-i märgistuse dramaatiline suurenemine (joonis 4i), võrreldes GMR-Gal4 UASYki-ga (joonis 4i). 4e ja f). Seega võib GMR-Gal4 UASYki, proDronci silmade suuruse vähenemise seostada nii vähenenud proliferatsiooni kui ka suurenenud apoptoosiga rakkudes, kus Hippo signaaliülekanne on alareguleeritud.

Dronci aktiivsuse tase mõjutab jõehobu funktsiooni

Dronc nõuab apoptosoomi holoensüümi moodustamiseks Dark'i ja nad toimivad tagasisidet pärssivas ahelas, et reguleerida kaspaasi aktiveerimist. 32 Dronci aktiivsuse taseme mõju rakusurma reguleerimisele edasiseks uurimiseks ekspresseerisime Dronci koos tema sidumispartneriga Tume. Tume üleekspressioon arenevates silmaümbruse ketastes ( GMR-Gal4 UASDark ) ei kutsu esile olulist apoptoosi. 32 Tume ja Dronci koos ekspressioon (GMR-Gal4 UASDark, UASproDronc, UASGFP) kutsus esile massiivse apoptoosi silmaklapi ketastes (joonis 5a ja b) ja täiskasvanute silmades (joonis 5c). 32 See fenotüüp on võrreldav GMR-Gal4 UASHpo fenotüübiga (joonis 1h). Tume, Dronci ja Hpo ( GMR-Gal4 UASDark, UASproDronc, UASHpo ) koekspressioon kutsus esile massiivse apoptoosi silmakoopa ketta (joonis 5d ja e) ja täiskasvanu (joonis 5f). See fenotüüp (joonised 5d ja f) näib kontrollidega võrreldes tugevam (joonis 5c), kuna nii fotoretseptori- kui ka pigmendirakud elimineeritakse loomadel, kes ekspresseerivad Hpo (joonis 5e). Kõigis katsetes, kus ekspresseerisime Darki ja Dronci, täheldasime, et Dronc ekspresseerub tugevalt ribas (joonised 5a ja d), mis vastab umbkaudu Casp3 * ribale (joonis 5b ja e), osutades piirkonnale, kus Dronc aktiivsus on kõrge. Seega viitavad meie andmed sellele, et Hpo-vahendatud apoptoosi võimendab Dronci suurenenud aktiivsus. Järgmisena testisime, kas Hippo vahendatud rakkude proliferatsiooni reguleerib suurenenud Dronci aktiivsus (joonis 5g – i). Tume ja Dronci koosekspressioon Yki-ga ( GMR-Gal4 UASDark, UASproDronc, UASYki ) surus täielikult Yki üleekspressiooni ülekasvamise fenotüübi (joonis 5i), põhjuseks apoptoosi esilekutsumine (joonis 5h) vastusena Dronci suurenenud aktiivsusele (joonis 5g ). Kokkuvõtlikult kinnitavad need andmed veelgi meie hüpoteesi, et Dronc toimib geneetiliselt Hpo-st allavoolu ja Dronci aktiivsuse taseme kontrolli all hoidmine on Hippo jaoks oluline nii raku proliferatsiooni kui ka rakusurma reguleerimiseks.

Image

Hippo rada reguleerib Dronci aktiivsuse taset, et kontrollida kasvu ja apoptoosi. Tume ja proDronci koosväljendamine UASGFP-ga (magenta in a ) (GMR-Gal4 UASGFP, UASDark, UASproDronc) indutseerib ( a ) Dronci (halltoonid) ja ( b ) aktiveerib Caspase 3 (Casp3 *) silmaümbruse kujutlusketastes, mille tulemuseks on väikeste silmade areng täiskasvanud kärbestel ( c ). Tumeda ja Dronci koos Hpo ( GMR-Gal4 UASHpo, UASDark, UASproDronc) ( d - f ) ja Yki (GMR-Gal4 UASYki, UASDark, UASproDronc) ( g - i ) ekspressiooni mõju Dronci ( d ja g ) ning Casp3 * ( e ja h ) on kujutatud kujutlusketastes ja täiskasvanute silmades ( f ja i ). Kujutiste suurendus ja suund on kõigil paneelidel ühesugused. Selle joonise värvitoon on saadaval veebis ajakirjas Cell Death and Differentiation

Täissuuruses pilt

Dronci kaotamine kutsub esile liigse vohamise ja rakkude ellujäämise

Siiani näitavad meie andmed, et vähenenud Dronci tase langeb kokku rakkude suurenenud proliferatsiooniga (joonis 4d ja e). Otseseks testimiseks, kas dronc mõjutab rakkude vohamist, võrdlesime eyFLP süsteemi abil genereeritud metsiktüüpi ja dronc-i mutantsete rakkude kasvukiirusi geneetilistes mosaiikides (joonised 6a ja b). 11 Metsikut tüüpi kontrollides (joonis 6a) koosneb täiskasvanu silm enam-vähem võrdsest arvust valgetest ja punastest rakkudest, mis näitab, et mõlema rakupopulatsiooni kasvukiirus on võrreldav. Dronc-i mutantsete rakkude täiskasvanute silmade mosaiik on peamiselt valge (joonis 6b). See näitab, et dronc-i mutantsed rakud (joonis 6b, valged) vohavad kiiremini kui metsikut tüüpi rakud (punased) ja konkureerivad nendega. Järgnevalt võrdlesime dronc-i mutantsete kloonide suurust nende metsiktüüpi kaksikute täppidega kolme null-alleeli dronc I24 , dronc I29 ja dronc 2 jaoks tiibketastes , et välistada taustmutatsioonide mõju. 34 Samuti kinnitasime, et dronc I24 , dronc I29 ja dronc 2 ei täiendanud dronc 51 . Võrreldes metsikut tüüpi kloonidega (joonis 6c ja d), on dronc I24 mutantsete kloonide suurus palju suurem kui nende metsiktüüpi kaksikute täppide korral (joonis 6e ja f) ning rakkude arvu erinevus on t - test ( P <0, 003). Sama katse dronc I29 ja dronc 2-ga näitas sarnast erinevust (andmeid pole näidatud). Samuti testisime PH3 ekspressiooni dronc-i mutantsetes kloonides (joonis 6g – g ″) ja leidsime, et dronci kadumine põhjustas emakavälise vohamise (joonis 6g ″). Võrreldes metsiktüübiga (joonis 6h) näitavad hippo raja mutandid ekstra pigmendirakkude (joonis 6i) tugevat ellujäämist pupilli võrkkestas kiirusel ∼ 20hAPF. dronci nullmutandid (näiteks dronc 51 , dronc I24 , dronc I29 või dronc 2 ) näitasid ka pupillide võrkkestas täiendavaid interommatidiaalseid pigmendirakke (joonis 6j). 34 Kokkuvõttes näitavad meie andmed, et dronc mõjutab rakkude paljunemist ja raku arengut.

Image

dronc- mutandid näitavad rakkude ellujäämist. ( a ja b ) Näitab täiskasvanute metsiktüüpi ja dronc I29 mosaiigi silmade võrdlust, kasutades cl w + tehnikat 11, et võrrelda metsiktüüpi (punane) ja dronc- mutandi (valged rakud) vohamiskiirust . Pange tähele, et dronci mosaiikides silmades on vähem punaseid rakke, mis näitab, et dronci mutantsed rakud prolifereeruvad kiiremini kui metsikut tüüpi rakud. ( c - f ) Näidatud on kloonisuuruste analüüs GFP-negatiivsete kloonide ja nende metsiktüüpi kaksikute täppide (GFP-positiivne) vahel metsiktüüpi ( c ja d ) ja dronc I24 mutantide ( e ja f ) korral. Kloonide suurust mõõdeti tiibade kujutisketastelt, mis olid eraldatud kolmanda keskpaiga vastsetest. Viidatud on metsiktüüpi ( d ) ja dronc I24 ( e ) kujutisketaste tüüpilised kaksikkloonid . ( g - g) ″ dronc I29 mutantsed kloonid (GFP negatiivsed) kutsuvad esile silmamunaõõneketta teise mitootilise laine tagant ektoopilise raku proliferatsiooni (PH3, punane). ( g ′ ja g ″ ) G-ga tähistatud ala suurem suurendus on näidatud g-des, et näidata mutantide kloonides rakkude täiendavat proliferatsiooni. PH3 avaldist näidatakse halltoonides grammides . ( h - j ) Kuvatakse metsiktüüpi ( h ) P2 - / - ( i ) ja dronc 51 - / - ( j ) mutantide keskmised võrkkestad . Keskmise silma võrkkesta rakkude piirjooned tähistatakse Dlg antikehade abil. dronc- mutantsed rakud näitavad tärnidega tähistatud ekstra ommatidiaalsete rakkude ellujäämist (vt joonis 6j) Ühe metsiktüüpi ( h ) ja ühe dronc- mutandi ( j ) ommatiidiumi pigmendirakud on nummerdatud ja tähistatud kollaste joontega. Suurendus on identne täiskasvanud kärbeste ( a ja b ), kujutlusketaste ( d, e, g ′ - g ″) ja pupina võrkkestade korral h - j . Kujutislikud kettad paneelidel g on väiksema suurendusega (20 ×)

Täissuuruses pilt

Meie andmed viitavad sellele, et drooni võib Hippo signaalimine otseselt juhtida. Selle uurimiseks analüüsisime dronc- transkriptsioonilise reporteri ( dronc 1, 7 kb- lacZ) ekspressiooni, kus 1, 7 kb dronci genoomset järjestust juhib lacZ ekspressioon. 35 dronc 1, 7 kb- lacZ ekspresseeritakse üldlevinud metsiktüüpi silmakollete (joonis 7a – a ″) ja tiiva (joonis 7e) ketastes. Dronc 1, 7 kb- lacZ ekspressiooni pärsib märkimisväärselt Yki üleekspresseerimine (joonis 7c, n = 5, P <0, 033) GMR ekspressioonidomeenis ( GMR-Gal4 UASYki, joonis 7b – b ″). Võrreldes Dronci tugeva mahasurumisega Yki üleekspresseerivates rakkudes (joonis 4d), ei näi dronci 1, 7 kb- lacZ ekspressioon nii dramaatiliselt pärsitud, võib-olla β- galaktosidaasi aeglustumise tõttu. Kuid mutantsetes rakkudes ws on dronc 1, 7 kb- lacZ ekspressioon tugevalt päraste ketastes alla surutud (joonis 7d – d ″). Hpo üleekspressioon silmamuna ( GMR-Gal4 UASHpo, andmeid pole näidatud) või tiibketta ( nub -Gal4 UASHpo, joonis 7f ') tulemuseks on dronci 1, 7 kb- lacZ (joonis 7f') ekspressiooni kindel induktsioon. Seega on dronc Hippo signaaliraja transkriptsiooniline sihtmärk.

Image

Jõehobu reguleerib droonide transkriptsiooni. Kolmandad silmapõhjalised kujutluslikud kettad metsiktüübilt ( a - a ), GMR-Gal4 UASYki / dronc 1, 7 kb- lacZ ( b - b ") ja eyFLP; dronc 1, 7 kb- lacZ / +; FRT82 wt X1 / FRT82B UbiGFP ( d - d ″), vastsed, mis olid värvitud α - β -gal, et tuvastada dronc 1, 7 kb- lacZ ekspressioonitase. ( c ) Dronc 1, 7 kb - lacZ tasemete mõõtmine, mõõdetuna mR-Gal ekspressiooni piksli intensiivsuse väärtustega GMR -Gal4 domeenis metsiktüüpi ja GMR - Gal4 UAS Yki vastsete kujutisketastelt ( n = 5, P < 0, 05). Kolmanda etapi kujutluskettad metsiktüüpi ( e ) ja nubist - Gal4 UASHpo / dronc 1, 7 kb- lacZ ( f ja f ' ) vastsed, mis on värvitud α-β-ga, et tuvastada dronc 1, 7 kb- lacZ ekspressioonitase. g ) Hippo raja vahendatud geenide regulatsiooni mudel sisemise rakusurma rajal. Homoeostaasi ajal piirab Diap1 kaspaaside aktiveerimist proteosomaalse lagunemise kaudu. Kuid paljudes rakkudes tekivad Dronci ja Tume seostamisel pidevalt in vivo madalad aktiivsete apoptosoomikomplekside tasemed. Hippo raja funktsiooni kaotamine piirab Hidi ja Dronci ekspressiooni ning reguleerib positiivselt elusate rakkude Diap1, mis võimaldab rakkudel vohada ja apoptoosi vältida. Looduslikult esinevates rakusurmaradades, mis nõuavad jõehobu aktiivsust, nagu näiteks interommatidiaalsete rakkude tapmine, võib surma indutseeriv signaal aktiveerida Hpo, mis omakorda võib esile kutsuda Hidi ja Dronci ekspressiooni ja aktiveerumist, samuti DIAP1 alareguleerimist apoptoosi esilekutsumiseks. . Sarnast stsenaariumi võib ette näha ka teistes olukordades, nagu stress (põhjustatud Hpo üleekspressioonist), mis kutsuvad esile apoptootilise vastuse. Selle joonise värvitoon on saadaval veebis ajakirjas Cell Death and Differentiation

Täissuuruses pilt

Arutelu

Organogeneesi ajal on kudede homoeostaasi säilitamiseks ülioluline Hippo signaali optimaalne tase. Meie analüüs rakusurma reguleerimise kohta Hpo üleekspresseerimise teel (joonis 1) 3, 4, 6, 7 näitas, et Hpo vajab oma signaalimisteed, mis hõlmab transkriptsioonilist koaktivaatorit Yki (täiendav joonis S1), ja proapoptootilisi geene sisemine rakusurma rada rakusurma esilekutsumiseks (lisajoonis S2). Leidsime, et Sav, Wts või Hpo üleekspressioon ei kaasne Diap1 taseme muutustega (joonis 2, täiendav joonis S3). Seega on võimalik, et Hpo üleekspresseerivates rakkudes ei pruugi diap1 taset tuvastatavalt muuta või võib osutuda vajalikuks tundlikum test, et lahendada Hpo üleekspressiooni mõju Diap1 ekspressiooni reguleerimisele. Kuna Sav, Wts või Hpo üleekspressioon põhjustas aktiveeritud Caspase 3 ( Drosophila Drice / Casp3 *) tugeva induktsiooni, otsustasime testida, kas Casp3 * aktiveerimist kontrolliv initsiaatori kaspaas Dronc on Hippo raja poolt reguleeritud. Näitame siin, et droon, imetaja Caspase9 Drosophila homoloog ja rakusisese liikumise liige on hipoidi raja uus eesmärk. Näitame, et jõehobu signaalimine reguleerib droonide taset kudede suuruse kontrollimiseks ja Dronc toimib geneetiliselt Hpo-st allavoolu. dronc- mutantidel on suurenenud proliferatsioon ja vähenenud apoptoos - fenotüüp, mida jagavad mitmed kasvaja supressorgeenid Hippo raja jooksul (nt hpo, sav, wts ).

Esitame mitu tõendusmaterjali, mis näitavad, et Dronc võib olla jõehobu funktsioonide jaoks oluline. Esiteks korreleeruvad Dronci ekspressiooni ja aktiivsuse tase Hippo suurenenud või vähenenud aktiivsuse tasemega. Dronc indutseeritakse, kui Hpo on üleekspresseeritud (joonis 2h ja m), ja see surutakse maha, kui Hippo signaalimine on alareguleeritud (joonis 4d). Dronci aktiivsust jälgiti aktiveeritud Casp3 * ekspressiooni abil, mis indutseeritakse (joonis 3b) rakkudes, kus on kõrge aktiivse Dronci tase ( nt GMR-Gal4 UASproDronc ), ja allasurutud (joonis 3k) rakkudes, kus Dronci aktiivsus on vähenenud (joonis 3b). nt GMR-Gal4 UASDNproDronc ). Kui Dronci aktiivsus on kõrge Hpo ekspressioon ( GMR-Gal4 UASproDronc , UASHpo ), siis suureneb rakusurm (joonis 3h), kui Dronci aktiivsust vähendab UpoDNproDronci Hpo ekspressiooni üleekspresseerimine ( GMR-Gal4 UASDNproDronc, UASHpo ) ei suuda rakusurma esile kutsuda (joonis 3n). Teiseks , dronc interakteerub geneetiliselt jõehobu raja liikmetega (joonised 3 ja 4). Geneetilised epistaasikatsed (joonis 3j – u) näitavad, et Hpo vajab rakusurma esilekutsumiseks drooni ja droonide alareguleerimise korral saab Hpo-vahendatud apoptoosi maha suruda (joonis 3s – u). Seega toimib droon Hpo-st allavoolu. Kolmandaks, suurenenud Dronci aktiivsus pärsib Hippo signaali ülekandumise fenotüüpe (joonis 4g – i). Yki ja proDronci koos ekspressioon näitas, et suurenenud Dronci tasemed vähendasid rakkude proliferatsiooni ja suurendasid rakusurma (joonis 4h ja i), mis viitab sellele, et drooni taset tuleb reguleerida, et Hippo rada saaks kontrollida organi suurust. Tume ja Dronci koos ekspresseerimine võib pärssida jõehobu raja komponentide ülekasvu fenotüüpi, samuti võimendada Hpo üleekspressioonist tingitud rakusurma (joonis 5). Dronc Dark interaktsioonid näitavad, et Hpo-indutseeritud rakusurma vahendab Dronc-i aktiivsus, kuna rakusurma (Casp3 *, joonised 5e ja h) nähakse ainult nendes rakkudes, kus Dronc on ülesreguleeritud (joonised 5d ja g). Kokkuvõtlikult näitavad meie andmed, et Hippo signaaliradade komponendid kontrollivad Dronci aktiivsuse taset rakkude proliferatsiooni ja rakkude ellujäämise kontrollimiseks.

Dronc funktsiooni kaotuse analüüs näitab, et dronc mutantsed rakud vohavad kiiremini kui nende metsiktüüpi naabrid (joonis 6a – f). dronc-i mutantsetel rakkudel on SMW-st tagapool paiknev ektoopiline rakkude jagunemine (joonis 6g – g ″), mis näitab, et dronc-i mutantsed rakud jagunevad edasi, kui metsikut tüüpi rakud on lõpetanud. Lisaks näitavad dronc-i mutantsed rakud täiendavat rakkude ellujäämist, nagu on näha nina keskel asuvas võrkkestas, mis näitab täiendavaid interommatidiaalseid rakke (joonis 6h – j). Seega võib olla vajalik drooni kasutamine nii rakkude proliferatsiooni kui ka apoptoosi reguleerimiseks. Huvitav on märkida, et kõik droonide alleelid on poolletaalsed ja mitmed neist põhjustavad homosügootsete vastsete sisenemist pikendatud vastseperioodile (kuni 12 päeva), mille jooksul vastsetel areneb ajukoorte, kujutlusketaste ja ringlevate hemotsüütide hüperplaasia., melanootilised kasvajad ja suurenenud vastse keha suurus. 34, 36, 37, 38 Need tähelepanekud toetavad tugevalt meie järeldusi, et dronc- mutantidel on puudusi rakkude proliferatsiooni kontrollimisel ning lisaks on vähenenud apoptoos, mis aitab kaasa nende mutandi fenotüübi kujunemisele.

Muud tõendid näitavad, et Drosophila APAF-1 ( või ark või hac-1) mutantidel on kasvueelis, kuna mitootilise rekombinatsiooni abil läbi viidud ekraanides on tuvastatud tugevad ark- alleelid, kus mutantsed kloonid ( ark - / - ) olid metsikust suuremad - tüüpi kaksikud kohad. 39 Need arkmutandid (punktmutatsioonid ja deletsioonid) saadi samast sõelast, mis andis kaks hpo- mutanti. 4 Lisaks on neil tugevatel arkmutantidel sarnased pundumise defektid kui dronc- mutantidel; ajukoorte ja kujutlusketaste hüperplaasia. 39 Need leiud toetavad veelgi ideed, et apoptoosi regulatsioonis osalevatel geenidel võib olla kasvu reguleerimise funktsioon.

Huvitav on tõdeda, et nagu enamus jõehobu raja komponente, on Dronc ka kõikjal avaldatud. Meie avastused näitavad, et droon on transkriptsiooniliselt reguleeritud hipo raja poolt - hipo signaali kaotamine põhjustab dronki transkriptsiooni pärssimist (joonis 7b ja d), samas kui Hpo üleekspressioon põhjustab drooni transkriptsiooni induktsiooni (joonis 7f). Seega on tõenäoline, et Hippo raja funktsiooni kaotamine põhjustab droonide mahasurumist, mis kaitseb mutantseid rakke kaspaaside aktiveerimise eest ja aitab kaasa nende ülekasvu fenotüübile. Hippo raja komponentide üleekspressioon seevastu ülesreguleerib dronc ekspressiooni ja allavoolu efektorkaspaaside (Drice / Casp3 *) aktiveerimist, mille tulemuseks on rakusurm. Kokkuvõtlikult näeme, et dronc on Hippo signaalimise uus transkriptsiooniline sihtmärk.

Oleme välja töötanud mudeli (joonis 7), et ühitada oma leiud hipo-vahendatud geenide regulatsiooni praeguste mudelitega raku sisemise surma teel. On teada, et jõehobu rada reguleerib rakusurma Hid, Diap1 3, 6, 7 ja bantami miRNA transkriptsiooni reguleerimise teel. 1 Normaalsetes rakkudes on tasakaal diap1 ekspressiooni ja aktiveeritud kaspaaside baastasemete vahel ning Hippo signaalide abil hoitakse koe homoeostaasi, reguleerides negatiivselt hid ja dronc ning reguleerides positiivselt diap1 (joonis 7). Kui rakud kogevad stressi (nt Hpo üleekspressiooni tõttu), aktiveerivad nad apoptoosi esilekutsumiseks proapoptootilise geeni ja initsiaatori kaspaasi dronci Hippo rajast allavoolu (joonis 7).

On teada, et nii kärbestel kui ka imetajatel põhjustab hipo või MST1 / 2 signaali üleaktiveerimine apoptoosi. 1, 40 MST1 / 2 on teada olevad kaspaaside sihtmärgid. Lisaks on teada, et YAP1 / 2 interakteerub YAP-s PDZ domeeni kaudu p73-ga ja indutseerib apoptootilisi märklaudgeene. 40 Kuid need apoptoosi reguleerimise mehhanismid ei pruugi kärbestes konserveeruda, kuna Drosophila Hpo, 6 ei ole kaspaasi lõikamise koht säilinud ja Drosophila Yki ei oma konserveerunud PDZ domeeni. Seega kutsub kärbeste Hpo üleekspressioon esile apoptoosi alternatiivse mehhanismi kaudu, mis ei hõlma kaspaasi lõhustamist ega p73. Paljud rakkude ja rakkude interaktsioonid on normaalse arengu jaoks olulised või algavad reageerimisel kudede kahjustustele, näiteks kompenseeriv vohamine, rakkude konkurents ja regeneratsioon. Hippo rada on muutunud kõigi nende rakkude ja rakkude interaktsioonide oluliseks regulaatoriks ning Dronc on seotud kompenseeriva proliferatsiooni vastusega. Meie uuringud seovad Dronci nüüd Hippo rajaga ja pakuvad välja võimaliku mehhanismi, mille abil Hippo signaalimine reguleerib Drosophilas raku vastuseid. Seega on tulevikus huvitav uurida Hpo-vahendatud Dronci regulatsiooni aluseks olevat molekulaarset mehhanismi ja kas see interaktsioon on kõrgematel selgroogsetel säilinud.

Täiendav teave

Piltfailid

  1. 1

    Täiendav joonis S1

  2. 2

    Täiendav joonis S2

  3. 3

    Täiendav joonis S3

  4. 4

    Täiendav joonis S4

Wordi dokumendid

  1. 1

    Täiendavate arvude legend

Sõnastik

Yki

Yorkie

Hpo

Jõehobu

Wts

Tüükad

Matid

Mob tuumori supressorina

Nt

Laiendatud

Mer

Merlin

Crb

Puru

Sd

Kammitud

Hth

Homotooraks

Tsh

Teashirt

DIAP1

Apoptoosi valgu 1 drosophila inhibiitor

IAP

apoptoosi valgu inhibiitor

Sav

Salvador

HID

pea tahtlus defektne

Dronc

Drosophila Nedd-2-taoline kaspaas

RHG

Korjaja, varjatud sünge

Tume

Drosophila Apaf-1-ga seotud tapja

Casp3 *

Kaspaas 3

PH3

Fosfo-histoon H3

MF

morfogeneetiline vagu

SMW

teine ​​mitootiline laine

APF

pärast pupumaariumi moodustumist

YAP

Jah-seotud valk

MST

Imetaja Ste20-sarnane kinaas

DLG

ketas suure tuumori supressor

PDZ

PSD95, Drosophila (Dlg-1), ZO-1 valk

TUNEL

terminaalne deoksünukleotidüültransferaas dUTP hüüdnimi märgistamine

Drice

Drosophila interleukiini konverteeriv ensüüm

UAS

ülesvoolu aktivaatori järjestus

GFP

roheline fluorestsentsvalk

FERM

4.1 valk, ezriin, radiksiin, moesiin

BIR

Bakuloviiruse IAP korrata

GMR

klaas multimeerne kordus

RT

toatemperatuuril

Nub

nubbin

DN

domineeriv negatiivne

DCP-1

Surm Caspase-1

ELAV

embrüonaalne surmav, ebanormaalne nägemine

hsp

kuumašoki valk

Täiendav teave on lisatud rakusurma ja diferentseerumist käsitleva veebisaidi dokumendile (//www.nature.com/cdd)