Kõrge glükoosisisaldusega ülesreguleerib Bace1-vahendatud beetatoodang ros-sõltuva hif-la ja lxrα / abca1-reguleeritud lipiidide parve ümberkorraldamise kaudu sk-n-mc rakkudes | teaduslikud aruanded

Kõrge glükoosisisaldusega ülesreguleerib Bace1-vahendatud beetatoodang ros-sõltuva hif-la ja lxrα / abca1-reguleeritud lipiidide parve ümberkorraldamise kaudu sk-n-mc rakkudes | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Molekulaarne neuroteadus
  • Toitainete signalisatsioon

Abstraktne

On kogutud tõendeid, mis näitavad, et Alzheimeri tõve risk on seotud suhkruhaigusega, mis on vere glükoosisisalduse kõrge indikaatori näitaja. Selles uuringus uuriti kõrge glükoosisisalduse mõju BACE1 ekspressioonile ja amüloidogeneesile in vivo ning esitame üksikasjad nende mõjudega seotud mehhanismi kohta. Meie tulemused, kasutades ZLC ja ZDF rotimudeleid, näitasid, et ZDF rottidel on kõrge amüloid-beeta (Ap), fosforüülitud tau, BACE1 ja APP-C99 tase. In vitro tulemus hiire hipokampuse neuroni ja SK-N-MC-ga, kõrge glükoosisisaldusega stimuleeritud Aβ sekretsioon ja apoptoos annusest sõltuval viisil. Lisaks suurendas kõrge glükoosisisaldus BACE1 ja APP-C99 ekspressioone, mida reaktiivse hapnikuühendite (ROS) püüdur pööras tagasi. Tõepoolest, kõrge glükoosisisaldus tõstis rakusisese ROS-i taset ja HIF-1a ekspressiooni, mis on seotud BACE1 ja maksa X retseptori α (LXRα) reguleerimisega. Lisaks seostati kõrge glükoosisisaldusega ATP-d siduva kasseti transporteri A1 (ABCA1) allaregulatsiooni LXR-i indutseeritud lipiidide parve ümberkorraldamise ja BACE1 lokaliseerimisega lipiidide parvel. Lisaks näidati, et BACE1 ekspressiooni vaigistamine reguleerib SK-N-MC Ap sekretsiooni ja apoptoosi. Kokkuvõtteks võib öelda, et kõrge glükoosisisaldusega ülereguleerib BACE1 ekspressiooni ja aktiivsust HIF-la ja LXRa / ABCA1 poolt reguleeritud lipiidide parvede ümberkorraldamise kaudu, mis põhjustab Ap tootmist ja SK-N-MC apoptoosi.

Sissejuhatus

Mitmed epidemioloogilised ja bioloogilised tõendusallikad toetavad seost suhkurtõve (DM) ja Alzheimeri tõve (AD) 1, 2, 3, 4 vahel . Lisaks on tõendeid, mis näitavad seost glükoosi metabolismi muutmise ja amüloidi prekursorite kuhjumise vahel diabeedihaigete ajus 5, 6 . Ehkki AD esinemist põhjustavad molekulaarsed ja patofüsioloogilised mehhanismid pole endiselt täielikult kirjeldatud, on mõnede uuringute kohaselt oletatavaks beeta-amüloidi (Aβ) akumuleerumine ja ladestumine, mis tuleneb amüloidi prekursorvalgu (APP) ebapiisavast töötlemisest. AD 7, 8 patogenees. Ehkki mitmed uuringud näitavad, et DM võib olla AD esinemise kofaktor, ei ole selle esinemine AD esinemise tekitamiseks piisav 9, 10 ; hiljutised uuringud on aga teatanud, et kõrge glükoosisisaldusega keskkond võib raskendada AD patogeneesi APP akumulatsiooni, Aβ tootmise ja naastude moodustumise kaudu 11, 12, 13 . Need leiud viitavad sellele, et kõrge veresuhkru profiiliga patsientide AD arenemise ennetamise ja AD ravimise strateegiate väljatöötamiseks on vaja uurida glükoosi osa Aβ tootmises ja APP töötlemises. Beeta-saidi APP lõikav ensüüm 1 (BACE1) on võtmetähtsusega APP-d töötlev ensüüm, mis on seotud membraaniga seotud C-terminaalse fragmendi C99 (APP-C99) ja Ap tootmisega. Mitmed uuringud on teatanud, et BACE1 regulatsioon on seotud AD patogeneesiga, sealhulgas Aβ ladestumine ja Aβ-ga seotud mälukahjustus 14, 15, 16 . Lisaks on BACE1 inhibiitoreid peetud tõhusaks terapeutiliseks kandidaadiks AD raviks 17 . Siiski on vähe teateid, mis kirjeldavad glükoosi mõju BACE1 ekspressioonile. Chen RF jt . teatasid, et hapniku ja glükoosi puudus põhjustab BACE1 akumulatsiooni 18 . Mehhanismi, mille abil kõrge glükoosisisaldus reguleerib BACE1, üksikasjalik kirjeldus võiks olla uudne näpunäide AD esinemise kontrollimiseks DM-patsientidel.

Mitmed aruanded on soovitanud, et DM ja hüperglükeemiaga muudetud kolesterooli metabolism võib mängida olulist rolli neuroloogiliste ja metaboolsete talitlushäirete korral 19, 20 . Maksa X-retseptorid (LXR-id), sealhulgas LXRa ja LXRβ, on peamised transkriptsioonifaktorid, mis reguleerivad rangelt rakusiseseid kolesterooli taset kolesterooli transpordis ja väljavoolus osalevate geenide transkriptsioonilise aktiivsuse reguleerimise kaudu. Hiljuti on teatatud, et membraani lipiidide koostisel on oluline roll AD patogeneesis 21 ; kusjuures membraani kolesterooli lokaalne tõus mõjutab APP töötlemist, mille tulemuseks on Ap tootmise stimuleerimine 22 . Kolesterool on lipiidide parve kriitiline komponent, spetsialiseerunud membraaniga mikrodomeen, mis osaleb valkude kaubitsemises, signaali ülekandmises, neurotransmissioonis ja ligandi-retseptori interaktsioonis 23 . Lisaks sellele on teatatud, et BACE1 asub lipiidide parves ja lipiidide parve kolesterooli muutus võib mõjutada BACE1 aktiivsust ja põhjustada muutusi Ap tootmises. Arvatakse, et lipiidide parve muutmine hüperglükeemia poolt võib olla AD patogeneesi käivitaja 24 . Kuid seosed hüperglükeemiast põhjustatud rakusisese kolesterooli akumuleerumise ja Ap tootmise vahel ning sellega seotud signalisatsiooni rajad jäävad ebaselgeks.

ZF-i rotil, mis on saadud leptiini geeni mutatsioonist ZF-tüves, on kõrge veresuhkru tase ja seda kasutatakse laialdaselt mudeliks inimese DM-i ja selle tüsistuste uurimiseks. Lisaks on hiire hipokampuse neuronit ja SK-N-MC rakke laialdaselt kasutatud in vitro neuronaalse raku mudelina AD 26, 27, 28, 29 neuronaalse patogeneesi uurimiseks. Alkoholi AD esinemist mõjutavate kriitiliste molekulide likvideerimine diabeetilistes tingimustes on oluline AD patogeneesist arusaamise arendamiseks ning võib olla abiks uute AD ravimise ja ennetamise strateegiate väljatöötamisel. Käesolevas uuringus uurisime kõrge glükoosisisalduse mõju BACE1 ekspressioonile ja sellega seotud mehhanismidele, kasutades vastavalt in vivo ja in vitro Zuckeri diabeetilise rasva (ZDF) rotte ja SK-N-MC inimese neuroblastoomi rakke.

Materjalid ja meetodid

Materjalid

Inimese SK-N-MC neuroblastoomi, MEF hiire embrüonaalse fibroblasti ja CACO-2 rakke inimese käärsoole kartsinoomist esitas Korea rakuliini pank (Soul, Korea). Veise loote seerum (FBS) ja seerumi asendaja (SR) kasvatamiseks osteti vastavalt Hyclone'ilt (Logan, TÜ, USA) ja Gibcolt (Grand Island, NY, USA). P-Tau (Ser 396 ), Tau, preseniliin-1, β-aktiin, laminaat A / C, JNK, p-JNK (Thr 183 / Tyr 185 ), β-tubuliin, kaveoliin-1, flotilliin-2, p -GSK3β (Ser 9 ), GSK3β ja kaspaas-9 antikehad osteti firmast Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Ap, BACE-1, APP, HIF-1a, LXR, retinoid X retseptori (RXR) ja ATP-d siduva kasseti transporter A1 (ABCA1) saadi ettevõttelt Abcam (Cambridge, MA, USA). Kaspaas-3 antikeha osteti ettevõttelt Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Mädarõika peroksüdaasiga (HRP) konjugeeritud küüliku hiire- ja kitsevastased sekundaarsed antikehad saadi firmalt Thermo Fisher (Waltham, MA, USA). Ap antikeha spetsiifilisus kinnitati gamma sekretaasi inhibiitori L-685, 458 abil (Sup joonis 3). N-atsetüültsüsteiin (NAC), D-glükoos, L-glükoos, PD98059, SP600125, TO901317, metüül-β-tsüklodekstriin (MβCD), filipiin III, fluorestseiinisotiotsüanaadiga (FITC) konjugeeritud koolera toksiini subühik B (CTB) ja propaan jodiid (PI) saadi ettevõttelt Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Väikesed segavad RNA-d (siRNA - d) bace-1 jaoks ja mittesihtimine osteti firmast Dharmacon (Lafayette, CO, USA). hif-1a siRNA osteti ettevõttelt GenePharma (GenePharma, Shanghai, Hiina). Alexa fluor 488- ja 568-konjugeeritud sekundaarsed antikehad saadi ettevõttelt Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA). Kõik selles uuringus kasutatud reaktiivid olid kõrgeima kvaliteediga kaubanduslikult saadavates vormides.

Rakud

SK-N-MC, MEF ja CACO-2 rakke kasvatati 10% FBS, 1% antibiootikumi-antimükootilise lahusega, mis sisaldas penitsilliini, streptomütsiini ja fungisooni, ning kõrge glükoosisisaldusega Dulbeco olulist söödet (DMEM; Gibco). Rakke kasvatati 6-augulistel plaatidel või 60 mm tassidel inkubaatoris, mida hoiti temperatuuril 37 ° C 5% C02- ga . Rakke inkubeeriti 72 tundi ja pesti seejärel fosfaatpuhverdatud lahusega (PBS). Seejärel muudeti sööde madala glükoosisisaldusega DMEM-ga täiendatud söötmeks 1% SR ja 1% antibiootikumi-antimükootilise lahusega. Pärast 24-tunnist sünkroniseerimist pesti rakke kaks korda PBS-ga ja pandi reagentidega SR-ga täiendatud madala glükoosisisaldusega DMEM-i.

Katseloomad

Isased ja emased heterosügootset tüüpi ( Lepr fa / + ) ZDF rotid saadi firmalt Genetic Models (Genetic Models Inc., Indianapolis, IN, USA) ja paaritati üksteisega, et saada homosügootseid ZDF lahja kontrolli (ZLC) ja ZDF rotte. Selles uuringus kasutati isaseid homosügootseid ZDF ja ZLC rotte. Rotte peeti tavalises loomakasvatusasutuses ja neid hoiti 12-tunnise valguse ja pimeduse tsükliga toatemperatuuri vahemikus 20–25 ° C ja 60% niiskuses. Kõigile rottidele pakuti dieeti Purina 5008 (Purina Korea, Soul, Korea), nagu on soovitanud geneetilised mudelid. Kõik rottidega seotud protseduurid järgisid loomade humaanse kohtlemise riiklikke tervishoiuinstituute; peale selle kiitis protokollid heaks Souli Riikliku Ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise institutsionaalne komitee (SNU-140219–1). Rotid surmati 16 nädala vanuselt. Ajukudeid ekstraheeriti ja fikseeriti 24 tunni jooksul 4% paraformaldehüüdiga 0, 1 M PBS-is. Fikseeritud ajukoed säilitati pärast infusiooni 90% sahharoosiga, et kaitsta neid krüoteraapiaga, ja seejärel need asetati OCT ühendisse (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA). Koeproovid krüoseeriti koronaalselt 10 μm paksuse krüostaadi abil (CM1520; Leica, Wetzlar, Saksamaa) ning värviti Western blot ja immunohistokeemilise (IHC) abil.

Hiire primaarne hipokampuse neuronite kultuur

Hiire hipokampus eraldati 17 päeva hiireembrüote ajust. Pärast hipokampuse koe dissotsiatsiooni 0, 05% trüpsiinilahusega plaadistati 2x105 hipokampuse rakke polü-D-lüsiiniga kaetud 35 mm tassi ja neurobasaalsesse plaadimissöötmesse (neurobasaalne sööde, mis sisaldab B27 lisandit [1 ml / 50 ml], 0, 5 mM glutamiini) Nõusse lisati 25 μM glutamaat, 1 mM HEPES, 10% hobuse seerumit). Rakke inkubeeriti 24 tundi. Neuronaalseid rakke kasvatati 12 päeva jooksul neurobaasilise söötmega (neurobasaalsööde, mis sisaldab toidulisandit B27 [1 ml / 50 ml], 0, 5 mM glutamiini, 1 mM HEPES, 10% hobuse seerumit). Kõik primaarse hipokampuse kultuuriga seotud protseduurid järgisid loomade inimliku kohtlemise riiklikke tervishoiuinstituute; peale selle kiitis protokollid heaks Souli Riikliku Ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise institutsionaalne komitee (SNU-151116-1).

Western blot analüüs

Pärast töötlemist koguti rakud kaabitsat kasutades. Rakke pesti kaks korda külma PBS-iga enne lüüsi RIPA puhvriga (Thermo Fisher) ja proteinaasi ja fosfataasi inhibiitori kokteiliga (Thermo Fisher). Pärast 30-minutist jääl lüüsipuhvris inkubeerimist tsentrifuugiti lüsaate 30 minutit kiirusel 15 000 p / min 4 ° C juures ja supernatant koguti. Valkude kontsentratsiooni määramine proovides viidi läbi bitsinkoniinhappe (BCA) analüüsikomplekti (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) abil. Valguproovid (10 μg) laaditi elektroforeesi jaoks 8–15% naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geeli (SDS-PAGE) ja viidi polüvinülideenfluoriidi (PVDF) membraani. Pärast valgu ülekandmist pesti valguga ülekantud membraani tris-puhverdatud soolalahusega, mis sisaldas 0, 1% Tween-20 (TBST) lahust {150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7, 6) ja 0, 1% Tween-20}. Seejärel blokeeriti membraan 5% lõssi (Gibco) ja 5% veise seerumi albumiiniga (Thermo Fisher) TBST lahuses. Seejärel pesti membraani kolm korda iga 10 minuti järel ja inkubeeriti primaarse antikehaga (lahjendus 1: 1000) üleöö temperatuuril 4 ° C. Pärast inkubeerimist primaarse antikehaga pesti membraani ja inkubeeriti 4 tundi temperatuuril 4 ° C mädarõika peroksüdaasiga (HRP) konjugeeritud sekundaarse antikehaga (lahjendus 1: 10 000). Western blot ribad tuvastati parendatud kemoluminestsentslahuse (Bio-Rad) abil. Densitomeetriline analüüs kvantifitseerimiseks viidi läbi ImageJ tarkvara abil (arendaja Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; //rsb.info.nih.go.kr/ij/). Täispikad geelid ja põhiandmete blotid sisalduvad lisateabes (Sup. Joonised 1 ja 2),

MRNA ekstraheerimine ja pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsioon

SK-N-MC rakke ekstraheeriti, kasutades kaubanduslikku RNA ekstraheerimiskomplekti (TaKaRa Biomedicals, Otsu, Jaapan). Ekstraheeritud RNA (1 μg) transkripteeriti pöördtranskriptsiooni eelsegukomplektiga (iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea) cDNA saamiseks. CDNA amplifitseeriti, kasutades lxr-a , lxr-β ja β-aktiini päri- ja pöördpraimereid .

Reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon

Lxr-α , lxr-β , abca1 , abcg1 ja β-aktiini geenide mRNA ekspressioonitasemeid mõõdeti Rotor-Gene 6000 reaalajas termilise tsüklisüsteemi abil (Corbett Research, Mortlake, NSW, Austraalia) koos Quanti NOVA SYBR rohelise PCR komplekt (Qiagen, Hilden, Saksamaa) koos cDNA (1 μg) ja mRNA praimeritega. Selles uuringus kasutatud mRNA praimerjärjestusi on kirjeldatud lisas tabelis 1. Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) produktide identsust ja spetsiifilisust kinnitati sulamiskõvera analüüsiga. Geeni ekspressioonitasemete normaliseerimiseks kasutati kontrollina β-aktiini geeni.

Immunohistokeemiline värvimine

Fikseeritud ajukoe proovid deparafineeriti ksüleeni ja erinevate kontsentratsioonidega etanooliga (100, 90, 70 ja 50%). Endogeense peroksüdaasi inaktiveerimiseks inkubeeriti parafiinimata kudesid 10% 3% vesinikperoksiidiga metanoolis ja pesti seejärel kaks korda PBS-ga. Järgmisena viidi koeproovid antigeenist välja, inkubeerides kudesid 20 minutit minutis soojendatud (100 ° C) tsitraatpuhvriga (100 mM, 0, 05% Tween 20, pH 6, 0) destilleeritud vees (DW)}. Seejärel pesti proove ja permeabiliseeriti, inkubeerides PBS-is 0, 5% tritooniga X100. Seejärel blokeeriti proovid 30 minutit 5% normaalse kitse seerumiga (Sigma Aldrich) PBS-is. Koeklaase inkubeeriti primaarsete antikehadega (lahjendus 1: 100) üleöö temperatuuril 4 ° C. Pärast kolm korda pesemist PBS-ga inkubeeriti koeklaase Alexa fluor 488 ja konjugeeritud sekundaarsete antikehadega (lahjendus 1: 100) ja PI-ga 2 tundi temperatuuril 4 ° C. Immuunkontrollitud proovid visualiseeriti konfokaalse mikroskoopia abil (Fluoview 3000; Olympus, Tokyo, Jaapan). Kõik skaala ribad on 200 μm. Piltide suurendus on × 100 ja × 200.

Rakusisese reaktiivse hapniku liikide mõõtmine

Rakusiseste reaktiivsete hapnikuühendite (ROS) tuvastamiseks kasutati CM-H2 DCF-DA värvimist (DCF-DA, Life Technologies). Rakud eraldati 0, 25% trüpsiini ja 0, 5 mM EDTA-ga, seejärel loendati, kasutades Petroff-Hausseri loenduskambrit. Seejärel saadi 5x105 rakku ja suspendeeriti 10 μM DCF-DA lahuses PBS-is ja inkubeeriti temperatuuril 25 ° C 1 tund pimedas. Pärast inkubeerimist pesti rakke kaks korda PBS-ga ja laaditi 96 süvendiga mustale plaadile. Rakusisese ROS mõõtmine viidi läbi luminomeetri abil (Victor3, Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA).

Väike segav RNA transfektsioon

Negatiivse kontrollina hif-la- spetsiifiline siRNA või mittesihtimine siRNA transfekteeriti SK-N-MC rakkudesse 24 tundi Turbofect transfektsioonireaktiiviga (Thermo Fisher) enne töötlemist vastavalt tootja juhendile. Transfekteeritud siRNA-de kontsentratsioon oli 20 nM. Kõiki selles uuringus kasutatud siRNA järjestusi on kirjeldatud 2. tabelis.

Kromatiini immunosadestamine

Kromatiini immunosadestamise (CHIP) test viidi läbi, kasutades tootja juhiste järgi EZ-ChIP-kromatiini immunosadestamise komplekti (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Valgu-kromatiini komplekse sisaldavaid proove inkubeeriti öö läbi temperatuuril 4 ° C HIF-la, IgG ja PolIII suhtes spetsiifiliste antikehadega. Negatiivse ja positiivse kontrollina kasutati vastavalt normaalset IgG ja PolIII. Immunosadestatud kompleksid elueeriti elueerimispuhvriga (1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 ja 10 mM EDTA). Eluaate inkubeeriti 5 M NaCl-ga 4 tundi temperatuuril 65 ° C ja inkubeeriti seejärel RNaas A-ga 30 minutit temperatuuril 37 ° C. Seejärel inkubeeriti proove 0, 5 M EDTA, 1 M Tris-HCl ja proteinaas K-ga 2 tundi 45 ° C juures. Proovi DNA ekstraheeriti tarnitud kolonnist ja amplifitseeriti PCR abil kavandatud praimerit kasutades (lisa tabel 3). Sisendina kasutati ühte protsenti kromatiini ekstrakti proovist. Valgu promootoriga seondumise kvantifitseerimine viidi läbi reaalajas PCR abil.

Sahharoosi tiheduse gradiendi fraktsioneerimine

Pärast töötlemist pesti rakke külma PBS-ga ja kraapiti 1 ml lüüsipuhvrisse (500 mM, Na2C03, 10 mM EDTA, pH 11 kaaluvees). Lüsaatidele lisati proteinaasi ja fosfataasi inhibiitori kokteil. Seejärel homogeniseeriti lüsaadid sonikaatori abil (Branson Sonicator 250, Branson Ultrasonic Corp., Danbur, CT, USA) ja inkubeeriti 30 minutit jääl. Pärast valgu kvantitatiivset määramist BCA testi abil reguleeriti sama kogus valku, et moodustuks 2 ml 45% sahharoosi MES-puhverdatud lahuses [MBS: 25 mM MES (pH 6, 5), 0, 15 M NaCl] ja asetati ultratsentrifuugi toru (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). 5–35% -lise katkendliku sahharoosi gradiendi moodustamiseks lisati ultratsentrifuugi tuubi järjestikku 4 ml 35% sahharoosi ja 4 ml 5% sahharoosi sisaldavat MBS-i. Proovi sisaldavaid ultratsentrifuugiklaase tsentrifuugiti 20 tundi kiirusel 40 000 p / min SW41 rootoris (Beckman Coulter). Fraktsioneeritud proovid koguti ja analüüsiti Western blot analüüsiga.

Tuumafraktsiooni ettevalmistamine

Kogutud rakud suspendeeriti tuumafraktsiooni lüüsipuhvris {137 mM NaCl, 8, 1 mM Na2HP04, 2, 7 mM KCl, 1, 5 mM KH2P04, 2, 5 mM EDTA, 1 mM ditiotreitooli, 0, 1 mM PMSF ja 10 mg / ml leupeptiini. (pH 7, 5)}. Rakud suspendeeriti pipeteerimisega ja inkubeeriti 10 minutit jääl. Lüsaate tsentrifuugiti kiirusel 3000 p / min 5 minutit temperatuuril 4 ° C. Tuumavaba fraktsiooni proovi saamiseks koguti lüsaadi supernatant. Tuumajäägi sade lüüsiti 20 minutit jääl RIPA lüüsipuhvriga ja tsentrifuugiti siis 30 minutit kiirusel 15 000 p / min 4 ° C juures. Koguti tuumafraktsiooni sisaldav supernatandi proov.

Immunotsütokeemia

Konfokaalsele tassile (Thermo Fisher) asetatud rakud fikseeriti, inkubeerides 10 minutit PBS-is 80% atsetooniga ja pesti seejärel kolm korda PBS-ga. Seejärel blokeeriti rakud valkude mittespetsiifilise seondumise pärssimiseks 5% FBS-ga PBS-is. Blokeeritud rakke inkubeeriti primaarse antikehaga (lahjendus 1: 100), millele järgnes pesemine PBS-ga ja seejärel inkubeeriti Alexa fluori sekundaarse antikeha, FITC-konjugeeritud CTB ja PI-ga 2 tundi temperatuuril 4 ° C. Pildid saadi Fluoview 300 konfokaalse mikroskoopia (Olympus) abil. Valgu fluorestsentsi intensiivsust analüüsiti Image J tarkvara abil (arendaja Wayne Rasband, Riiklik Terviseinstituut, Bethesda, MD, USA; //rsb.info.nih.gov/ij/). Arvutame korrigeeritud koguraku fluorestsentsi (CTCF, Image J suvaline ühik). CTCF-i määramiseks kasutatakse järgmist võrrandit: CTCF = integreeritud tihedus - (valitud lahtri pindala × maapealsete näitude keskmine fluorestsents).

Trüpaansinise välistamise rakkude elujõulisuse test

Pärast töötlemist koguti rakukonditsioneeritud sööde. Rakke pesti külma PBS-ga, seejärel inkubeeriti ja suspendeeriti 0, 05% trüpsiini (Gibco) ja 0, 5 mM EDTA lahusega (Sigma Aldrich). Seejärel lisati kogutud söötmele suspendeeritud rakud koos rakususpensiooni lahusega. Trüpsiini aktiivsuse kustutamiseks lisati rakususpensiooni lahusele sojaoa trüpsiini inhibiitor (0, 05 mg / ml). Proove tsentrifuugiti kiirusel 3000 p / min 5 minutit temperatuuril 4 ° C. Seejärel supernatant eemaldati ja järelejäänud rakupellet suspendeeriti surnud rakkude värvimiseks PBS ja trüpaansinisega (0, 4%, Sigma Aldrich). Värvitud ja värvimata rakud loendati Petroff-Hausseri loenduskambri abil (Hausser Scientific, Horsham, PA, USA). Rakkude elujõulisuse määramiseks kasutatav võrrand oli rakkude elujõulisus = [{1 - (trüpaani sinisega värvitud rakkude arv / rakkude koguarv)} × 100].

Anneksiin V / PI fluorestsents-aktiveeritud rakusorteeri analüüs

Anneksiin V ja PI värvimine SK-N-MC rakkude apoptoosi hindamiseks viidi läbi anneksiin V / PI apoptoosi tuvastamise komplekti abil (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA) vastavalt tootja juhendile. Lühidalt, SK-N-MC kultuurisööde koguti pärast rakkude töötlemist. SK-N-MC rakud eraldati ja suspendeeriti 0, 25% trüpsiini ja 0, 5 mM EDTA lahusega. Seejärel lisati kogutud sööde rakususpensioonile. Suspendeeritud rakud loendati, kasutades Petroff-Hausseri loenduskambrit (Hausser Scientific). Seejärel resuspendeeriti rakud (1 x 105) sidumispuhvris, mis oli varustatud apoptoosi tuvastamise komplektiga, ja värviti immuunsusega 5 μl FITC-anneksiin V ja 5 μl PI-ga 15 minutit pimedas toatemperatuuril. Apoptoosi analüüs viidi läbi voolutsütomeetria (Beckman Coulter) abil. Rakud (3 x 105), millel oli sarnane külghajumise väärtus ja raku maht, mõõdeti ja analüüsiti tarkvara CXP (Beckman Coulter) abil.

Üldkolesterooli mõõtmine

Rakkude üldkolesterooli tase määrati kaubandusliku kolesterooli mõõtmise komplekti (BioVision, Mountain View, CA, USA) abil vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, raku lipiidide ekstraheerimiseks koguti 1 x 106 rakku, lüüsiti kloroformi, isopropanooli ja NP-40 seguga. Ekstraheeritud rakulised lipiidid kuivatati ja kuivatatud sade suspendeeriti kolesteroolipuhvris koos kolesterooli mõõtmise komplektiga. Järgmisena lisati proovidele kolesterooli mõõtmise komplektiga kaasasolev ensüümide segu, mida seejärel inkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 ° C. Tuvastamiseks kasutati kolorimeetrilist protokolli ja mõõtmised tehti lainepikkusel 570 nm, kasutades mikroplaadilugejat (Bio-Rad).

Filipiini III värvimine kolesterooli mõõtmiseks

Rakud fikseeriti 3% värske paraformaldehüüdiga 1 tund toatemperatuuril. Rakke pesti kaks korda PBS-ga ja inkubeeriti paraformaldehüüdi kustutamiseks 10 minutit toatemperatuuril 1 ml 1, 5 mg glütsiiniga PBS lahuses. Rakke inkubeeriti 2 tundi toatemperatuuril filipiin III (Sigma Aldrich) töölahusega (0, 05 mg / ml PBS-is / 10% FBS). Konfokaalse pildi saamiseks kasutati konfokaalset mikroskoopiat (ergastus 340–380 nm).

Immuunsadestamine

Söötmes sekreteeritud Ap tuvastamiseks koguti SK-N-MC-ga konditsioneeritud söötme töötlemise järgselt. Söötmeproovile lisati proteinaasi ja fosfataasi inhibiitori kokteil (Thermo Fisher). Agar-helmestega konjugeeritud Aβ-spetsiifiliste antikehade tootmiseks teostati immobiliseerimine, kasutades tootja juhistele vastavat kaubanduslikku kaasimmunosadestamise komplekti (Thermo Fisher). Söötmeproove inkubeeriti 6 tunni jooksul 4 ° C juures Ap-konjugeeritud agaroosipärlite suhtes spetsiifilise primaarse antikehaga. Agaroosihelmeid tsentrifuugiti 1 minuti jooksul kiirusel 1000 p / min ja seejärel koguti. Kogutud helmeid pesti kuus korda pesupuhvriga. Valk saadi inkubeerimisega elueerimispuhvris, mis oli kaasas kaasimmunosadestamise komplektiga. Söötmes olev valk määrati BCA valgu kvantifitseerimise testi abil. Sama kogus valku laeti elektroforeesi jaoks 12% SDS-PAGE ja kanti PVDF membraanile. Valguga ülekantud membraane inkubeeriti Ap-spetsiifilise antikehaga. Pärast inkubeerimist HRP-konjugeeritud sekundaarse antikehaga detekteeriti blotid ECL lahuse (Bio-Rad) abil.

Statistiline analüüs

Kõik eksperimentaalsed andmed on esitatud keskmisena ± standardviga. Gruppidevahelisi erinevusi testiti ANOVA abil. Ravirühmade võrdlus kontrollrühmadega viidi läbi Bonferroni Dunn testide abil. Testi tulemust p väärtusega <0, 05 peeti oluliseks.

Tulemused

Kõrge glükoosisisalduse mõju Aβ sekretsioonile ja närvirakkude surmale in vivo ja in vitro

Kõrge glükoosisisalduse mõju Aβ ekspressioonile in vivo määramiseks viisime läbi ZLC kontrolli ja ZDF diabeediga rotimudelite ajukoe hipokampuse piirkonna ( Cornu Ammonis ; CA1-CA3) immunohistokeemilise värvimise. Aβ ja fosforüülitud tau valgu ekspressioonid olid ZDF-i ajukoes paremini nähtavad kui ZLC-ga ajukoes (joonis 1a). Immunohistokeemiliste tulemuste hulgas oli Ap ja fosforüülitud tau-positiivsete rakkude arv ZDF-i ajukoes suurem kui ZLC-ajukoes (joonis 1b). Kõrge glükoosisisalduse mõju uurimiseks in vitro töödeldi SK-N-MC rakke erineva kontsentratsiooniga D-glükoosiga (5–25 mM) 24 tundi. Aβ immuunsadestamisega söötmes täheldasime, et kõrge glükoosidoos (D-glükoos; 25 mM) stimuleeris Ap sekretsiooni. 20 mM töötlemine L-glükoosiga ei mõjutanud aga Ap sekretsiooni (joonis fig 1c). Nagu on näidatud joonisel fig 1d, tõusis p-tau fluorestsentsi intensiivsus seriini 396 jäägis 25 mM D-glükoosiga 206% -ni, mitte 25 mM L-glükoosiga töötlemisel. Lisaks kontrollisime tau fosforüülimist ja sellega seotud kinaase, et määrata kõrge glükoosiga töötlemise tagajärjel suurenenud Aβ sekretsiooni mõju. Meie tulemused näitasid, et D-glükoosiga töötlemine indutseeris GSK-3β ja AKT, peamise kinaasi, fosforüülimist 30, 31, 32, 33, 34, fosforüülimist (joonis 4a, b). Lisaks uurisime D-glükoosi mõju SK-N-MC rakkude apoptoosile. Trüpaansinise välistamise testi tulemused näitasid, et D-glükoos, mitte L-glükoos, vähendas SK-N-MC rakkude elujõulisust annusest sõltuval viisil (joonis fig 1e). Kooskõlas selle tulemusega näitas meie anneksiin V / PI FACS analüüs, et kõrge glükoosisisaldus suurendas anneksiin V-positiivsete või PI-positiivsete SK-N-MC rakke annusest sõltuval viisil (joonis 1f). Järgmisena hindasime BACE1, Presenilin-1 (PSEN1) ja APP-C99 ekspressioone, et uurida kõrge glükoosisisalduse mõju Aβ sekretsioonile ensüümi ekspressiooni reguleerimisele in vivo ja in vitro . Meie Western blot analüüsi tulemused näitasid, et BACE1 ja APP-C99 ekspressioonid olid ZDF rottidel suuremad kui ZLC rottidel (joonis 2a). Immunohistokeemilised tulemused näitasid, et BACE1 ja APP-C99 positiivsete rakkude arv oli ZDF-is oluliselt suurem kui ZLC rotimudelites (joonis 2b). ZLC ja ZDF-i rotimudelite ajukudedes ei olnud PSEN1 ekspressioonitasemes ega PSEN1-positiivsete rakkude arvu osas olulisi erinevusi (vt joonis 5a, b). Meie tulemuste järgi hiire hipokampuse neuroniga indutseeriti BACE1 ja APP-C99 ekspressioonid D-glükoosiga töötlemise teel (joonis 2c). Kooskõlas in vivo tulemustega tõstis kõrge glükoosisisaldus bace1 mRNA ekspressioonitaset (joonis 2d). Ja nii BACE1 kui ka APP-C99 ekspressioone suurendas D-glükoos, kuid L-glükoosiga töötlemine (joonis 2e). Lisaks indutseeris D-glükoos AKT ja GSK-3β fosforüülimise, defosforüleeriti BACE1 siRNA transfektsiooni abil (Sup. Joonis 4b). AKT inaktiveerimine wortmanniini eeltöötlusega vähendas GSK-3β ja tau fosforüülimist (Sup. Joonis 4c). Lisaks leidsime, et ravisime D-glükoosi erinevate rakuliinide, sealhulgas SK-N-MC, MEF ja CACO-2 abil. Meie tulemusel suurendas 25 mM D-glükoosiga töötlemine BACE1 ekspressiooni SK-N-MC-s, kuid on ebaefektiivne MEF-is ja CACO-2-s (Sup. Joon. 6). Meie vivo ja in vitro andmete põhjal soovitame, et kõrge glükoositase stimuleerib BACE1 ekspressiooni ja aktiveerimist, mis viib seejärel Aβ tootmiseni närvirakkudes.

Image

( a ) ZLC ja ZDF ajukudede AP, fosforüülitud tau ja β-aktiini valgu ekspressioonid tuvastati Western blot analüüsi abil. ( b ) Immunohistokeemiliseks objektiklaasiks võetud proovid immuniseeriti AP ja p-tau (Ser 396 ) spetsiifiliste antikehade ja PI abil. Tulemuses olevad pildid on representatiivsed. Kõik skaala ribad, 200 μm (väikese ja suure võimsusega välja suurendus, × 100 ja × 200). ( c ) SK-N-MC söötmest eritunud Aβ tuvastati immunosadestamise testiga. Immunosadestatud Aβ analüüsiti Western blot analüüsiga. ( d ) Rakud immunovärviti p-tau (Ser 396 ) ja PI-ga. Kaalulatid, 50 μm (suurendus, × 800). P-tau fluorestsentsi intensiivsust analüüsiti Image J tarkvara abil (arendaja Wayne Rasband, Riiklik Terviseinstituut, Bethesda, MD, USA; //rsb.info.nih.gov/ij/). Tulemused kujutavad viit sõltumatut katset. Andmed on esitatud kuue sõltumatu katse keskmisena ± SE. * p <0, 05 versus 5 mM ravi D-glükoosiga. ( e ) Rakkude elujõulisust mõõdeti trüpaansinise eksklusioonanalüüsiga. Andmed on esitatud kahe kahepoolsete tassidega sõltumatute katsete keskmisena ± SE. ( f ) Elujõulised rakud tuvastati anneksiin V / PI analüüsi abil. Andmed on esitatud kahe sõltumatu dupleksiahela keskmisena ± SE. Iga näidatud Western blot tulemus on representatiivne pilt kolmest sõltumatust eksperimendist. * p <0, 05 versus 5 mM ravi D-glükoosiga. Kõik Western blot andmed kärbiti ja saadi samades katsetingimustes.

Täissuuruses pilt

Image

( a ) ZLC ja ZDF ajukoe BACE1 ja APP-C99 ekspressioonid tuvastati Western blot analüüsi abil. Kõik tulemuses esitatud andmed on viie sõltumatu katse katsed. ( b ) Immunohistokeemiliste koeproovide immunovärvimiseks määrati BACE1 ja APP-C99 spetsiifilised antikehad. Tulemuses olevad pildid on representatiivsed. Kõik skaala ribad, 200 μm (väikese ja suure võimsusega välja suurendus, × 100 ja × 200). ( c ) Hiire hipokampuse neuronit inkubeeriti 24 tunni jooksul 25 mM D-glükoosiga BACE1, APP-C99 ja hiire hipokampuse neuroni β-aktiini ekspressioonid tuvastati Western blot analüüsi abil. Kõik tulemuses esitatud andmed on viie sõltumatu katse katsepilt. ( d ) SK-N-MC-st ekstraheeritud kogu mRNA transkribeeriti pöördtranskriptsiooniga ja seejärel amplifitseeriti PCR -iga bace1 ja β-aktiini mRNA ekspressioone. Bace1 mRNA ekspressiooni analüüsiti kvantitatiivse reaalaja PCR abil. MRNA ekspressioonitase normaliseeriti β-aktiini mRNA ekspressioonitasemega. Andmed on esitatud kolme sõltumatu dupleksiahela keskmisena ± SE. ( e ) Bace1 ja mittesihtimisega (NT) siRNA transfekteeriti rakus 12 tundi enne D- ja L-glükoosiga töötlemist 24 tunni jooksul. BACE1, APP-C99 ja β-aktiini ekspressioonid tuvastati Western blot analüüsi abil. Iga western blot-pilt kujutab kolme sõltumatut katset. Andmed on esitatud kui keskmine ± SE * p <0, 05 versus 5 mM D-glükoosiga töötlemist. Kõik Western blot andmed kärbiti ja saadi samades katsetingimustes.

Täissuuruses pilt

Kõrge glükoosisisaldusega HIF-1a ekspressiooni kaasamine BACE1 ekspressiooni

Lisaks uurisime rakusisese ROS-i tekke rolli SK-N-MC-rakkude BACE1 ekspressioonis. DCF-DA värvimistesti tulemused näitasid, et rakusisene ROS sisaldus oli 198% 5 mM D-glükoositasemest 25 mM kõrge glükoosiga ravigrupis (joonis 3a). Lisaks vähendas ROS-i püüduri NAC-eeltöötlus 25 mM D-glükoosist põhjustatud BACE1 ja APP-C99 valkude ekspressiooni (joonis 3b). Nagu on näidatud joonisel 3c, d, suurendas kõrge glükoosisisaldusega töötlemine HIF-1a ekspressiooni hiire hipokampuse närvis ja SK-N-MC-s, samal ajal kui HIF-1a ekspressiooni ülesreguleerimist vähendas NAC-eeltöötlus (joonis 3e). Lisaks stimuleeris kõrge glükoosisisaldusega töötlemine HIF-1a tuuma translokatsiooni (joonis 3f, g). Our CHIP results showed that the high glucose treatment stimulated binding of HIF-1α to the hypoxia responsive element (HRE) of the bace1 gene promoter, while silencing of HIF-1α protein expression inhibited high glucose-induced BACE1 expression (Fig. 3h–j). These results indicate that high glucose directly regulates BACE1 expression via HIF-1α.

Image

( a ) DCF-DA–sensitive SK-N-MC cells were visualized by confocal microscopy. Scale bars, 50 μm (magnification, ×600). Intracellular ROS generation was quantified by using luminometer. Data are presented as a mean ± SE of two independent sixth dishes. ( b ) BACE1, APP-C99 and β-actin expressions were detected by western blotting. ( c ) Mouse hippocampal neuron was incubated with 25 mM D-glucose for 24 h HIF-1α and β-actin expressions of mouse hippocampal neuron were detected by western blotting. Each data shown in the result is representative image of five independent experiments. ( d, e ) NAC (5 mM) was pretreated to cells, and then HIF-1α and β-actin expressions of SK-N-MC were detected by western blotting. ( f ) Non-nuclear protein and nuclear expressions were normalized by β-tubulin and lamin A/C repectively. ( g ) Cells were immunostained with HIF-1α and PI. Scale bars, 50 μm (magnification, ×800). ( h ) DNA was immunoprecipitated with RNA polymerase, IgG and HIF-1α antibodies. The immunoprecipitation and input samples were amplified with primers of gapdh and bace1 gene promoters. ( i ) Quantatative data was analyzed by real time PCR of two independent experiments of triple dishes. ( j ) SK-N-MC cells were transfected by siRNAs for 24 h prior to D-glucose treatment. HIF-1α, APP-C99, BACE1 and β-actin were detected by western blotting. Each western blot image shown is representative of three independent experiments. Data are presented as a mean ± SE * p < 0.05 versus 5 mM of D-glucose treatment, # p < 0.05 versus 25 mM of D-glucose treatment. All western blot data were cropped and acquired under same experimental conditions.

Täissuuruses pilt

Role of high glucose-mediated ROS generation in LXR-mediated ABCA1 expression and cholesterol accumulation

To examine the effect of D-glucose on LXR in SK-N-MC cells, we determined the effect of high glucose on mRNA expressions of lxrα and lxrβ in SK-N-MC cells. Both lxrα and lxrβ mRNAs were expressed in SK-N-MC cells; however, their mRNA expression levels were not changed by high glucose treatment (Sup. Fig. 7a, b). We treated with various concentrations of D-glucose (5–50 mM) for 24 h and examined subsequent LXRα and LXRβ protein expressions. High glucose decreased LXRα expression in a dose-dependent manner, but LXRβ expression was not affected by the D-glucose treatment (Fig. 4a). Moreover, high glucose reduced nuclear translocation as well as fluorescence intensity of LXRα (Fig. 4b, c). In addition, based on western blot and immunocytochemistry analyses D-glucose increased RXRα expression in a dose-dependent manner (Sup. Fig. 7c, d). Western blot results from ZLC and ZDF rats showed that LXRα protein expression was lower in ZDF rats than in ZLC rats (Fig. 4d). Immunohistochemical results showed that the number of LXRα-positive cells was lower in ZDF rats than in ZLC rats, but the number of RXR-positive cells was higher in ZDF rats than in ZLC rats (Fig. 4e and Sup. Fig. 7e). Consistent with these results, LXRα expression in mouse hippocampal neuron was reduced by high glucose treatment (Fig. 4f). As shown in Fig. 4g, a decrease in LXRα expression by high glucose treatment was reversed by pretreatment with ROS scavenger NAC. In addition, D-glucose stimulated JNK phosphorylation at the Thr 183 and Tyr 185 residues in a dose-dependent manner (Fig. 4h). High glucose-reduced LXRα expression was reversed by pretreatment with JNK inhibitor SP600125, but not with ERK inhibitor PD98059 (Fig. 4i and Sup. Fig. 8a). Furthermore, we performed immunoprecipitation to investigate the effect of high glucose on LXRα/RXRα heterodimer formation, and the results indicated that high glucose disrupted LXRα/RXRα heterodimer formation (Sup Fig. 8b). Those results suggest that high glucose-induced ROS generation contributes to a decrease in LXRα expression through the JNK pathway, and is followed by inhibition of LXRα nuclear translocation and LXRα/RXRα heterodimer formation. Next, we investigated the role of LXRα in intracellular cholesterol regulation. Our results from cholesterol measurement assaying and filipin III staining showed the intracellular cholesterol level in 25 mM D-glucose-treated SK-N-MC cells increased to 223% of that in 5 mM D-glucose-treated cells (Fig. 5a, b). The high glucose treatment reduced abca1 mRNA expression, but not the abcg1 mRNA expression; moreover, the abca1 mRNA expression was reversed by LXR agonist TO901317 pretreatment (Fig. 5c and Sup. Fig. 9). In addition, D-glucose decreased ABCA1 protein expression in a dose-dependent manner (Fig. 5d). Furthermore, the fluorescence intensity of ABCA1 was decreased by the high glucose treatment (Fig. 5e). By using the CHIP assay, we confirmed high glucose-induced binding of LXR to the LXR element (LXE) region of the abca1 promoter was blocked by TO901317 pretreatment (Fig. 5f, g, and Sup. Fig. 11).

Image

( a ) LXRα, LXRβ and β-actin were detected by western blotting. ( b ) Cells were immunostained with LXRα and PI. Scale bars, 50 μm (magnification, ×800). ( c ) LXRα, lamin a/c and β-tubulin in the non-nuclear and nuclear fractions were detected by western blotting. Non-nuclear protein and nuclear expressions were normalized by β-tubulin and lamin A/C repectively. ( d ) LXRα and β-actin protein expressions of the ZLC and ZDF brain tissues were detected by western blotting. ( e ) Immunohistochemistry with ZLC and ZDF tissues were performed with LXRα-specific antibody and PI. All scale bars, 200 μm (magnification of low and high power field, ×100 and ×200). ( f ) Mouse hippocampal neuron was incubated with 25 mM D-glucose for 24 h LXRα and β-actin expressions of mouse hippocampal neuron were detected by western blotting. Each data shown in the result is representative image of five independent experiments. ( g ) SK-N-MC was incubated with NAC (5 mM) for 30 min before D-glucose treatment. LXRα and β-actin expressions were analyzed by western blotting. ( h ) Phosphorylated JNK, JNK and β-actin expression were detected by western blotting. ( i ) SK-N-MC was incubated with SP600125 (1 μM) for 30 min before D-glucose treatment. LXRα expression was detected by western blotting. Each western blot image is representative of three independent experiments. Data are presented as a mean ± SE * p < 0.05 versus 5 mM of D-glucose treatment, # p < 0.05 versus 25 mM of D-glucose treatment. All western blot data were cropped and acquired under same experimental conditions.

Täissuuruses pilt

Image

( a ) Total cholesterol level is measured by using cholesterol detection kit described in Materials & Methods. Data are presented as a mean ± SE of three independent experiments of duplex dishes. ( b ) Intracellular cholesterol was stained with fillipinIII, and visulalized by confocal microscopy. Scale bars, 50 μm (magnification, ×800). ( c ) TO901317 (1 μM) pretreated to SK-N-MC prior to D-glucose treatment. Total mRNA expressions of abca11 and β-actin were analyzed by quantitative real-time PCR. The mRNA expression level was normalized by β-actin mRNA expression level. Data are presented as a mean ± SE of three independent duplex dishes. ( d ) ABCA1 and β-actin expressions were detected by western blotting. ( e ) Cells were immunostained with ABCA1 and PI. Scale bars, 50 μm (magnification, ×800). ( f ) DNA was immunoprecipitated with RNA polymerase, IgG and LXRα antibodies. The immunoprecipitation and input samples were amplified with primers of gapdh and abca1 gene promoters. ( g ) CHIP data was quantified by real time PCR of two independent experiments of triple dishes. Each western blot image is representative of three independent experiments. Data are presented as a mean ± SE * p < 0.05 versus 5 mM of D-glucose treatment, # p < 0.05 versus 25 mM of D-glucose treatment. All western blot data were cropped and acquired under same experimental conditions.

Täissuuruses pilt

Role of localization of BACE1 on the lipid raft in amyloidogenesis and apoptosis of SK-N-MC

To clarify the effect of high glucose on BACE1 localization, we performed sucrose gradient fractionation and immunocytochemical staining. As shown in Fig. 6a, high glucose stimulated translocation of BACE1 from the non-lipid raft part (fractions #7–#12) to the lipid raft part (fractions #4–#6). BACE1 expression in the lipid raft part (fractions #4-#6) was significantly increased by high glucose treatment (Fig. 6b). In addition, high glucose stimulated BACE1 and APP-C99 localizations in the lipid raft after being disrupted by TO901317 pretreatment (Fig. 6c). In addition, lipid raft disruption by MβCD pretreatment inhibited Aβ secretion (Fig. 6d). To confirm the effect of high glucose-induced BACE1 expression on amyloidogenesis and cell viability, we transfected bace1 siRNA into SK-N-MC cells. As shown in Fig. 6e, high glucose-induced Aβ secretion was reduced by knockdown of BACE1 expression. In addition, we determined the expressions of apoptosis markers caspase-9 and 3 to examine the role of high glucose-induced BACE1 expression in apoptosis of SK-N-MC cells. Our results showed that silencing of BACE1 expression inhibited expressions of cleaved caspase-9 and 3 (Fig. 6f). We confirmed that high glucose-induced apoptosis of SK-N-MC cells was decreased by inhibition of BACE1 expression by performing trypan blue exclusion assays and annexin V/PI FACS analyses (Fig. 6g, h). Based on these results, our findings indicate that high glucose-induced BACE1 localization and expression on the lipid raft is important for Aβ secretion and apoptosis of SK-N-MC cells.

Image

( a ) SK-N-MC was incubated with TO901317 (1 μM) for 30 min prior to D-glucose treatment. Sucrose gradient-fractionized samples were blotted with BACE1, caveolin-1, flotillin-2 and β-actin-specific antibodies. ( b ) The same volumes of lipid raft fraction (#4–6) were loaded to SDS-PAGE gel, blotted with BACE1 and caveolin-1-specific antibodies. ( c ) Cells were stained with APP-C99, BACE1 and CTB, visualized by confocal microscopy. Scale bars, 50 μm (magnification, ×800). ( d, e ) Cells were incubated with MβCD and transfected with bace1 and NT siRNAs prior to D-glucose treatment. Secreted Aβ in medium was analyzed by immunoprecipitation assay. ( f ) The bace1 and NT siRNAs-transfected SK-N-MC samples were blotted with BACE1, cleaved caspase-9, cleaved caspase-3 and β-actin-specific antibodies. ( g ) Cell viability was measured by trypan blue exclusion assay. Data are presented as a mean ± SE of three independent experiments with duplex dishes. ( h ) Viable cells were detected by using annexin V/PI analysis. Data are presented as a mean ± SE of two independent duplex dishes. Each western blot image is representative of three independent experiments. * p < 0.05 versus 5 mM of D-glucose treatment, # p < 0.05 versus 25 mM of D-glucose treatment. All western blot data were cropped and acquired under same experimental conditions.

Täissuuruses pilt

Arutelu

In the present study, we have shown that high glucose-induced BACE1 expression and the reorganization of the lipid raft through cholesterol accumulation stimulate Aβ production (Fig. 7). Our results show that the brain of ZDF rats exposed to high glucose exhibits increases in Aβ deposition and tau phosphorylation levels, which suggest the existence of a connection between two main pathophysiological features of AD; that is, Aβ production/secretion and tau phosphorylation. Thus, we investigated how a high glucose level affects APP processing in neuronal cell with mouse hippocampal neuron and SK-N-MC. Consistent with the ZDF rat model results, high glucose (D-glucose; 25 mM), but not high L-glucose (20 mM), stimulated Aβ production and tau phosphorylation, which suggests that the in vitro experimental model using SK-N-MC cells reflects an in vivo diabetic condition. A low D-glucose level (5 mM) was used as a control, and reflects the normal plasma glucose concentration of non-diabetic individuals. According to previous study, fasting blood glucose level in lean subjects maintains a narrow range of approximately 4.8 ± 0.1 mmol/L, whereas type 2 diabetes patients present a high fasting plasma glucose level of 11.1 ± 0.9 mmol/L 35 . In addition, our results showed that high glucose-induced Aβ production, tau phosphorylation, and apoptosis are mainly dependent on alteration of glucose metabolism rather than on an osmotic effect. Consistent with our findings, previous investigators have reported that the hyperglycemic condition in DM is closely linked to diabetic neuropathy and apoptosis 36, 37 . Moreover, we presented that high glucose induced SK-N-MC apoptosis in a dose dependent manner. In the previous reports, it is suggested that high glucose treatment or hyperglycemic condition induces ROS and BACE1-mediated Aβ production, critical to high glucose-induced neuronal cell apoptosis 38, 39, 40, 41 .

Image

High glucose stimulates ROS production, leads to increase of HIF-1α for nuclear translocation and phosphorylation of JNK. Translocated HIF-1α is bound to HRE promoter region of bace1 gene, subsequently increases BACE1 expression. Phosphorylated JNK stimulates decrease in LXRα expression, reduced binding LXRα to the LXE promoter region of abca1 gene, leads to reduction of ABCA1 expression and intracellular cholesterol accumulation which may be involved in high glucose-induced lipid raft reorganization. In addition, high glucose-lipid raft modification induces BACE1 expression on the lipid raft, stimulates to Aβ secretion in SK-N-MC.

Täissuuruses pilt

In this study, we found that ZDF rats exhibited higher levels of APP-C99 and BACE1 expressions than those in ZLC rats, and that high glucose treatment stimulated APP-C99 and BACE1 expressions in mouse hippocampal neuron and SK-N-MC. These results indicate that a high glucose level itself is a risk factor for AD through the regulation of BACE1. As shown in Sup. Fig. 4a–c, our observation suggest the possibility that high glucose-induced BACE1 expression regulates AKT phosphorylation, involved in GSK-3β phosphorylation at Ser 9 and tau phosphorylation at Ser 396 . It has been reported that phosphorylation of AKT and GSK3β might be associated with tau phosphorylation at Ser 396, and the GSK-3β phosphorylation at Ser 9 is a downstream target of AKT activation 42, 43, 44 . Although the phosphorylation of GSK-3β at Ser 9 has an inhibitory role in GSK3β activity, there have been several reports suggesting induction of oxidative stress and inactivation of PP2A increase GSK-3β phsphorylation at Ser 9 and activity via another alterative pathway such as a calpain activation, which is important for tau phosphorylation in AD brain 31, 45, 46, 47, 48, 49, 50 . In addition, our results indicate that high glucose-induced BACE1 expression is mainly regulated by ROS generation and HIF-1α expression. Oxidative stress, resulting from hyperglycemia-induced ROS generation under diabetic conditions, has been associated with various neurodegenerative diseases including AD 51 . Thus, deciphering the underlying molecular mechanisms involved in the effect of high glucose-induced oxidative stress on AD pathogenesis is necessary for elucidating the linkage between DM and AD. It has been reported that the alteration of glucose metabolism is tied to the activation of the transcription factor HIF-1α, mediated by an increase in ROS generation 51, 52 . Interestingly, both a previous report and our data presented in Sup. Fig. 10 suggest that a functional HRE is present in the bace1 promoter 53 . In addition, another investigation reported that upregulated HIF-1α increased mRNA and protein expression of BACE1, but that hif-1α knock-out mouse exhibit a decrease in BACE1 expression in the hippocampus, suggesting a link between HIF-1α and Aβ processing under diabetic conditions 54 . Consistent with those results, our data showed that ZDF rats exhibit a high level of BACE1 expression, and that a high glucose condition stimulates the binding of HIF-1α to the bace1 gene promoter, and subsequently increases the bace1 promoter transcription level. These findings suggest that a high glucose condition stimulates Aβ production through HIF-1α-dependent direct expression of BACE1, and high glucose-induced oxidative stress has a critical role in the pathogenesis of AD.

Based on our study results, we suggest that high glucose decreases ABCA1 expression through JNK-reduced LXRα expression and binding to the abca1 gene promoter. Although the role of ROS in LXR expression or activation has not been completely described, several researchers have reported that JNK, which can be activated by ROS, regulates LXR activation 55, 56 . In addition, LXR phosphorylation by JNK stimulates the export of liver rich transcription factors, including LXR, which has a nuclear export signal-containing DNA-binding domain from the nucleus and inactivates LXR for degradation in the cytoplasm 57, 58, 59, 60 . These findings suggest the possibility that ROS-induced JNK phosphorylation resulting from high glucose levels stimulates export of inactivated LXR from the nucleus, leading to degradation, and is responsible for high glucose-reduced LXRα expression. Moreover, we found that high glucose reduced LXRα only, not LXRβ, even though high glucose did not affect mRNA expressions of either LXRα or LXRβ. A previous investigation demonstrated that LXRα and LXRβ have similar protein structures, but their nuclear localization is differently controlled 61, suggesting that differently regulated nuclear localization of LXRs could contribute to high glucose-reduced LXRα expression. Furthermore, our results showed that formation of a LXRα/RXRα heterodimer and binding of LXRα to LXE of the abca1 promoter were reduced by high glucose, even though high glucose increased RXRα expression. It has been well documented that activated LXR stimulates formation of a heterodimer with RXR and controls transcriptional activity of the abca1 gene 62, 63 . Indeed, Repa et al . reported pharmacological activation of LXR with an LXR agonist can induce ABCA1 expression via LXR/RXR heterodimer formation 64 . These findings indicate that high glucose-inhibited formation of the LXRα/RXRα heterodimer can control ABCA1 expression. However, additional investigation into the role of increased RXRα by high glucose in AD pathogenesis is needed.

The present study has shown that high glucose can increase the intracellular cholesterol level, and that action is associated with LXR/ABCA1-mediated lipid raft reorganization. Although there are reports that reverse cholesterol transport (RCT) by LXR is involved in the pathological condition in AD, with the exception of atherosclerosis in mice, the role of RCT in AD pathogenesis under diabetic condition has not been fully described 65 . Regardless, previous reports and the results of the present study suggest that high glucose-induced LXR-mediated cholesterol accumulation is closely related to progression in AD. In addition, our results showing that high glucose increases expression of BACE1, located in the lipid raft, suggests the possible role of cholesterol and lipid raft on APP processing by BACE1. As cholesterol serves as a structural part between sphingolipid hydrocarbon chains in the lipid raft, alteration of the cholesterol content of cells can result in lipid raft reorganization. In fact, several previous investigations have demonstrated that altered free cholesterol and plasma membrane cholesterol have an influence on lipid raft structure and functions 66, 67, 68, suggesting that the alteration of intracellular cholesterol level could be an important regulator of lipid raft reorganization. In the present study, high glucose stimulated changes in cholesterol in the lipid bilayer and affected APP processing through regulation of lipid raft reorganization, which elicits BACE1 activity and thus stimulates Aβ production and apoptosis of SK-N-MC cells. Consistent with these results, there is mounting evidence that cholesterol has a critical role in the regulation of BACE1 activity and the cleavage of APP. In addition, it has been reported that an increase in dietary cholesterol uptake stimulates amyloid plaque formation, while the 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA–reductive (HMG-CoA–reductase) inhibitor relieves the neurological symptoms of AD 69 . These previous and current findings suggest that regulation of high glucose-induced lipid raft reorganization plays an important role in Aβ production via regulation of BACE1 activity, and such regulation has potential as a novel therapeutic approach to controlling BACE1 expression and activation thereby leading to neuronal cell death.

Taken together, our observations with ZLC/ZDF rat brain, mouse hippocampal neuron and SK-N-MC cell line suggest the possible role of high glucose in Aβ production as a risk factor associated with AD occurrence in diabetic patients. Furthermore, the high glucose-induced increase in HIF-1α and decrease in LXRα-mediated cholesterol accumulation appear to act as intermediate regulators linking DM and AD. Therefore, those affected pathways could be used in the development of therapeutic strategies and identification of selective targets for prevention of AD occurrence in DM patients. In conclusion, high glucose stimulates BACE1 through HIF-1α expression and LXRα/ABCA1-mediated localization in the lipid raft, actions that are important for high glucose-induced Aβ production and neuronal cell apoptosis.

Lisainformatsioon

How to cite this article : Lee, HJ et al . High glucose upregulates BACE1-mediated Aβ production through ROS-dependent HIF-1α and LXRα/ABCA1-regulated lipid raft reorganization in SK-N-MC cells. Sci. Esindaja 6, 36746; doi: 10.1038/srep36746 (2016).

Kirjastaja märkus : Springer Nature on avaldatud kaartidel ja institutsionaalsetes seostes kohtualluvusnõuete osas neutraalne.

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.