Suurtes annustes kasutatav igg-ravi leevendab sapiteede suunatud põletikku ja obstruktsiooni sapiteede atresia hiiremudelil | laste uuringud

Suurtes annustes kasutatav igg-ravi leevendab sapiteede suunatud põletikku ja obstruktsiooni sapiteede atresia hiiremudelil | laste uuringud

Anonim

Õppeained

  • Sapiteede haigus
  • Immunoteraapia
  • Põletik

Abstraktne

Taust:

Sapiteede atresia (BA) väljapakutud etioloogia hõlmab sapiteede viiruse poolt põhjustatud, progresseeruvat immuunsuse vahendatud kahjustust. Intravenoosne Ig (IVIg) on ​​näidanud kliinilist kasu mitme põletikulise haiguse korral. Selle uuringu eesmärk oli välja selgitada suure annusega IgG ravi terapeutiline toime reesus rotaviiruse (RRV) poolt indutseeritud hiire BA mudelis.

Meetodid:

Vastsündinud hiired nakatati RRV-ga ja kollatõvega hiirtele anti kõrge annuse IgG või albumiini sisalduse kontroll. Analüüsiti ellujäämist, histoloogiat, otsest bilirubiini, maksa immuunrakkude alamhulki ja tsütokiini tootmist.

Tulemused:

RRV-ga nakatunud rühmade üldises elulemuses ei olnud erinevusi, kuid IgG suurtes annustes vähenes bilirubiini sisaldus, sapijuhapõletik ja suurenes ekstrahepaatilise sapijuhade avatus. Suure annusega IgG vähendas vaskulaarsete rakkude adhesioonimolekuli-1, põhjustades immuunrakkude piiratud migratsiooni portaaltraktidesse. Suure annusega IgG vähendas märkimisväärselt interleukiini (IL) -2, interferooni (IFN) -y ja CDN + T-rakkude produktsiooni IFN-γ ning kasvaja nekroosifaktori (TNF) -α ja CD8 + T-rakkude tootmist, samuti suurendas regulatiivsete T-rakkude tase.

Järeldus:

Hiire BA suurtes annustes manustatud terapeutiline ravi vähendas dramaatiliselt Th1 rakkude vahendatud põletikku ja sapiteede obstruktsiooni. See uuring pakub tuge IVIg kliiniliste uuringute kaalumiseks BA-ga imikutega, et vähendada progresseeruvat intrahepaatilist sapijuhakahjustust.

Peamine

Biliaarne atresia (BA) on sapiteede progresseeruv põletikuline haigus, mis põhjustab vastsündinu kolestaasi ja mida iseloomustab ekstrahepaatiliste ja intrahepaatiliste sapijuhade fibroos ja hävimine (1). Vaatamata kirurgilisele sekkumisele Kasai portoenterostoomiga edeneb intrahepaatiline sapijuha vigastus, mis põhjustab enamikul lastel sapiteede maksatsirroosi. 10-aastase ellujäämine loodusliku maksa korral jääb vahemikku ~ 20–50% (2) ja BA on endiselt maksa näidustamisel laste siirdamisel (3). BA etioloogia on ebaselge ning mitmed teooriad hõlmavad arenguhäireid, viirusinfektsioone ja immuunsuse düsregulatsiooni (4). Juhtiv hüpotees on, et perinataalne kolangiopaatiline viirusinfektsioon kutsub esile kroonilise põletikulise vastuse sapiteede epiteelile, põhjustades sapijuha vigastusi ja fibroosi (5, 6).

BA väljakujunenud hiiremudel on olnud abiks selle kõrvalekalduva immuunvastuse mehhanismide selgitamisel. Reesus rotaviirusega (RRV) nakatunud vastsündinud hiirtel areneb välja ekstrahepaatilise sapijuha progresseeruv põletik ja obstruktsioon, mis kajastab BA-patsientide varaseid põletikulisi kahjustusi (7, 8). Põletikulist reaktsiooni iseloomustab Th1 tsütokiinide miljöö (9), mille T-rakkude alamhulk näitab autoreaktiivsust sapijuha epiteeli valkude suhtes (10, 11). Lisaks on BA-s avastatud α-enolaasi autoantikehade suurenenud sisaldus, mis on tavaline teiste autoimmuunsete maksa- ja sapiteede haiguste korral (12). Autoimmuunvastused võivad püsida hiljuti kirjeldatud puuduste tõttu nii hiire kui inimese BA regulatoorsetes T-rakkudes (Tregs) (14, 15, 16).

Otsisime, kas BA-hiirte põletikulist sapijuhakahjustust saaks leevendada suure annusega polüklonaalse IgG-raviga. Inimestel on intravenoosset Ig (IVIg) kasutatud primaarsete immuunpuudulikkuste raviks ning kliiniline kasu on tõestatud mitme autoimmuunse ja põletikulise haiguse korral (17, 18, 19). Inimeste haiguste, näiteks immuunse trombotsütopeenia (20), müasteenia gravis (21), viirusliku müokardiidi (22) ja eksperimentaalse hulgiskleroosi (23), hiiremudelitel on inimese polüklonaalsel IgG-l terapeutiline kasu. On pakutud välja arvukad IVIg põletikuvastase toime mehhanismid, sealhulgas tsütokiinide võrgu segamine, autoantikehade neutraliseerimine, T- ja B-rakkude efektorfunktsioonide moduleerimine ning Tregsi tugevdamine (17, 20, 24). Need mehhanismid ei ole üksikud ja toimivad tõenäoliselt sünergiliselt.

Selle uuringu eesmärk oli välja selgitada, kas BA hiiremudeli suure annusega IgG-ravi vähendab sapijuhakahjustust, ja teha kindlaks võimalikud mehhanismid, mille abil suure annusega IgG moduleerib maksa immuunvastust. IgG võimaliku terapeutilise kasulikkuse hindamine on kliiniliselt oluline, arvestades BA-ga patsientide jaoks praegu pakutavate ravivõimaluste vähesust.

Tulemused

Kõrgdoosiline IgG ei mõjutanud RRV-ga nakatunud hiirte üldist ellujäämist ega kasvu uimastamist

RRV-ga nakatunud hiirtel täheldati esimesel elunädalal kollatõbe ja ahoolset väljaheidet. 1. nädalal suri ~ 15% hiirtest enne 7. päeva, 70% sai kollatõbe ja 15% olid terved. Kõiki kollatõbiseid hiiri ravitakse 7. päeval suurte annuste IgG (RRV-IgG, n = 56) intraperitoneaalsete süstetega, albumiini kontrolliga (RRV-alb, n = 47) või mitte kumbagi (BA-RRV, n = 50). elu jooksul ja seejärel iga 2–3 päeva järel kuue annuse jaoks. Ravi alustati seitsmendal elupäeval hiirtel, keda peeti haigeks (kollatõbi), kuna see oli inimese haiguse suhtes kliiniliselt kõige olulisem. Üldises ellujäämises olulist erinevust ei olnud ja kõik hiired olid 21. elupäevaks aegunud (Kaplani-Meieri analüüs, P > 0, 05) ( joonis 1a ). Sarnasel viisil oli RRV-ga nakatunud hiirte kehakaalu kasv aeglustunud, mis ei paranenud IgG-ga töödeldud hiirtel ( joonis 1b ). Et teha kindlaks, kas viiruse kliirensit mõjutas suurtes annustes kasutatav IgG-ravi, viidi läbi nakkusliku viiruse naastukatsed. Sarnast viiruse kliirensi mustrit täheldati ka RRV-albumi ja RRV-IgG rühmade vahel, mis viitab sellele, et viiruse nakkavuse tase ei mänginud ellujäämistulemites rolli ( täiendav joonis S1 veebis).

Image

Ellujäämine. Vastsündinud hiired said BSS või RRV. Elupäeval 7 said RRV-ga nakatunud kollatõvega hiired albumiini (RRV-alb, (hallid kolmnurgad) n = 47) või IgG (RRV-IgG, (allapoole mustad kolmnurgad) n = 56). Täiendavatesse kontrollrühmadesse kuulusid RRV-ga nakatunud hiired (BA-RRV, n = 50) (peegelpildis RRV-alb ja pole näidatud), BSS-ga süstitud hiired (BSS, (teemandi sümbol), n = 66) ja BSS-ga süstitud hiired, kes said IgG (BSS-IgG, (kriipsjoon) n = 17). a ) ellujäämine. Ülemised mustad kolmnurgad piki x-telge tähistavad albumiini või IgG süstide ajastamist. RRV-ga nakatunud rühmades ellujäämises olulist erinevust ei olnud (Kaplan – Meier; log rank test, P > 0, 05). b ) Kaal. Kogu kehakaalu mõõdeti iga 2–3 päeva tagant BSS, RRV-albumi ja RRV-IgG rühmades. RRV-ga nakatunud hiirtel oli kasv võrreldes BSS-iga edasi lükatud, alustades umbes elupäevast 10. BSS, tasakaalustatud soolalahus; RRV, reesus rotaviirus.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Suure doosiga IgG-ravi parandas sapijuha vigastusi ja obstruktsiooni

Seerumi otsese bilirubiini taset kasutati sapijuhakahjustuse ja obstruktsiooni markerina ( joonis 2a ). Kui Hanki tasakaalustatud soolalahuse (BSS) kontrollhiirtel oli elupäeval praktiliselt tuvastamatu otsese bilirubiini tase 14, siis BA-RRV ja RRV-albumiini rühmades oli otsese bilirubiini tase märkimisväärselt kõrge, mis näitab sapijuha olulist kahjustust (mg / dl: BSS) 0, 19 ± 0, 1; BA-RRV 11, 02 ± 0, 9; RRV-alb 9, 78 ± 1, 0; P <0, 0001). Seevastu RRV-IgG hiirtel oli seerumi otsese bilirubiini tase märkimisväärselt madalam (4, 75 ± 0, 73 mg / dl), võrreldes nii BA-RRV kui ka RRV-alb rühmadega ( P = 0, 0002).

Image

Sapiteede obstruktsioon. a ) seerumi otsene bilirubiin. Näidatud on seerumi otsese bilirubiini taseme keskmine ± SEM, mis saadi 14 elupäeval, mis näitab olulist bilirubiini vähenemist RRV-IgG hiirtel (* P <0, 001; ** P <0, 0001). b ) Maksa ja ekstrahepaatilise sapijuha histoloogia. Näidatud on hematoksüliini ja eosiini histoloogia intrahepaatilistest (portaaltrakt 400) ja ekstrahepaatilistest sapijuhadest (× 200) (nooled tähistavad sapijuhte). Pange tähele vähenenud portinaalse periduktaalse põletiku ja ekstrahepaatilise sapiteede obstruktsiooni puudumist RRV-IgG rühmas. BSS, tasakaalustatud soolalahus; RRV, reesus rotaviirus.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Maksa ja ekstrahepaatilise sapijuha histoloogiat uuriti 14. elupäeval, et visualiseerida sapijuhapõletiku ja obstruktsiooni ulatus ( joonis 2b ). BA-RRV ja RRV-alb rühmade portaaltraktidel ilmnes intrahepaatiliste sapijuhade ümbruses märkimisväärne portaaltrakti põletikuline infiltratsioon, võrreldes minimaalsete periduktaalsete immuunrakkudega BSS kontrolli või RRV-IgG rühmas. Ekstrahepaatilise sapijuha histoloogia näitas sarnast profiili, kus BA-RRV ja RRV-albumiini rühmad näitasid märkimisväärset põletikku ja luminaalset obstruktsiooni, võrreldes minimaalse põletiku ja sapijuha oklusiooni puudumisega 100% BSS ja 70% RRV-IgG hiirtest .

Suure doosiga IgG-ravi vähendas T-rakkude ja makrofaagide portaali infiltratsiooni VCAM-1 inhibeerimise abil

Maksa immuunrakkude immunofenotüüpide erinevuste paremaks kvantitatiivseks määramiseks igas rühmas kasutati voolutsütomeetriat. Maksa immuunrakud tuvastati CD45 (vereloome) rakupinna ekspressiooni põhjal. 10 elupäeval oli maksa immuunrakkude koguprofiil (CD4 + T-rakud, CD8 + T-rakud, CD11b + makrofaagid) kõigis RRV-ga nakatunud rühmades sarnane ja kõiki immuunrakkude alamhulki suurendati võrreldes BSS kontrollrühmaga ( Joonis 3a, b ). Kõige olulisem suurenemine leiti makrofaagide populatsioonis (% CD11b + : BSS 23, 20 ± 1, 94%, BA-RRV 43, 38 ± 3, 77%, P = 0, 0029; absoluutarv CD11b + : BSS 1, 74 ± 0, 11 × 106 rakku / maksa, BA) -RRV 4, 04 ± 0, 22 x 106, P = 0, 0015). Üheski rühmas ei olnud B-rakkude ja NK-rakkude pinnamarkerites olulisi erinevusi (andmeid pole näidatud). Need andmed näitasid, et IgG-ravi ei muutnud immuunrakkude alamhulkade üldist suhtelist arvukust kogu maksas.

Image

RRV-IgG hiirtel on sarnane immuunrakkude profiil, kuid vähenenud sapijuha suunatud põletik. 10-aastastest hiirtest pärit maksa immuunrakkude fluorestsents-aktiveeritud rakusorteerimise (FACS) analüüs. Iga immuunrakutüübi kvantifitseerimist väljendatakse CD45 + rakkude protsendimäärana ( a ) või ( b ), mis olid positiivsed ka spetsiifiliste immuunrakkude alamhulga markerite osas (näidatud kui keskmine ± SEM). Maksa immuunrakkude üldprofiil kõigis RRV-ga nakatunud rühmades oli sarnane ja kõik rakuliinid suurenesid võrreldes BSS kontrollrühmaga (* P <0, 005). c ) Portaaltrakti immuunrakkude fluorestsentsne immunohistokeemia (× 200). Maksakudet värviti sapiteede epiteeli tuvastamiseks AlexaFlor555 anti-TROMA (punane) abil ja topeltvärviti kas fluorestseiini isotiotsüanaadi (FITC) anti-CD4, -CD8 või -CD11b (roheline) ja tuumapiimaga Hoeschtiga (sinine). Põletikuliste rakkude infiltraadid esinevad BA-RRV ja RRV-alb hiirte portaaltraktides, kuid RRV-IgG hiirtel neid nõrgestati. BA, sapiteede atresia; BSS, tasakaalustatud soolalahus; RRV, reesus rotaviirus.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Maksa põletikuliste rakkude lokaliseerimise küsimuse käsitlemiseks kasutati fluorestsents-immunohistokeemiat. CD4 + ja CD8 + T-rakkude ja CD11b + makrofaagide klastrid laienesid BA-RRV ja RRV-alb hiirte portaaltraktides, kuid mitte BSS kontrollides ega RRV-IgG hiirtes. ( Joonis 3c ) Põletiku puudumine portaaltraktides korreleerus hematoksüliini ja eosiini histoloogiaga tuvastatud märkimisväärselt vähenenud periduktaalse põletikuga ( joonis 2b ).

Portaaltrakti põletiku puudumisega seotud mehhanismi uurimiseks RRV-IgG hiirtel analüüsiti maksas kemokiini ja adhesioonimolekule, mis on vajalikud immuunrakkude viimiseks vigastustesse. RRV-IgG hiirtel kemokiini ekspressioonitasemes olulist langust ei täheldatud, võrreldes teiste RRV-rühmadega ( täiendav joonis S2a veebis). Adhesioonimolekuli analüüs näitas märkimisväärselt suurenenud veresoonte rakkude adhesioonimolekuli 1 (VCAM-1) taset pärast RRV nakatumist. VCAM-1 ekspressioon vähenes märkimisväärselt RRV-IgG hiirtel, võrreldes BA-RRV ( P = 0, 02) ja RRV-albumiini rühmadega ( P = 0, 001) ( joonis 4a ). Oluline on see, et VCAM-1 valgu ekspressiooni immunohistokeemilised uuringud maksas näitasid VCAM-1 olulist vähenemist RRV-ga nakatunud hiirte portaaltraktides, kes said suurtes annustes IgG-ravi ( joonis 4b ). On teada, et VCAM-1 ekspresseerub endoteelil ja soodustab lümfotsüütide ja monotsüütide adhesiooni, vahendades nii rakkude migratsiooni kui ka aktivatsiooni (25). Suurtes annustes manustatud IgG-ravi vähendas VCAM-1 ekspressiooni RRV-ga nakatunud hiirte portaalides, inhibeerides sellega aktiveeritud immuunrakkude infiltratsiooni.

Image

Vaskulaarsete rakkude adhesioonimolekul 1 (VCAM-1) reguleeritakse pärast suurtes annustes IgG-ravi alla. ( a ) VCAM-1 mRNA ekspressioon. Tervetest maksadest eraldati kogu RNA ja VCAM-1 mRNA ekspressioon tehti kindlaks majapidamisgeeni aktiini suhtes. RRV-alb hiirtel oli VCAM-1 ekspressioon märkimisväärselt suurenenud, võrreldes BSS kontrollidega, ja kõrge annusega IgG-ravi viis VCAM-1 ekspressiooni olulisele vähenemisele (* P <0, 05, ** P <0, 005). ( b ) VCAM-valgu ekspressioon. Maksakudet värviti AlexaFlor555 anti-TROMA (sapiteed (punane)), fluorestseiini isotiotsüanaadi (FITC) anti-VCAM (roheline) ja tuuma Hoeschtiga (sinine). Kuvatud on tüüpiline portaaltrakti (× 200) VCAM-1 ekspressioon. VCAM-1 ekspressioon esineb RRV-alb hiirte portaaltraktides, kuid seda ei täheldatud BSS ega RRV-IgG hiirtel. BSS, tasakaalustatud soolalahus; RRV, reesus rotaviirus.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Kõrgdoosilise IgG-ravi tulemus oli põletikuliste tsütokiinide märkimisväärselt vähenenud tootmine CD4 + T-rakkudest

On teada, et suures annuses IgG pärsib põletikulist Th1 tsütokiini tootmist (26, 27). Seetõttu käsitlesime järgnevalt küsimust võimalike muutuste kohta efektorrakkude tsütokiini tootmises RRV-IgG hiirtel. Rakusisene tsütokiini tootmine 10-vanuste hiirte maksa immuunrakkudest sisaldas interbooli (IL) -2, IL-17, interferooni (IFN) -y ja tuumorinekroosifaktori (TNF) -α analüüsi pärast forbooli 12-müristaati 13 atsetaadi (PMA) / ionomütsiini stimuleerimine ( joonised 5 ja 6 ). Võrreldes BSS kontrollidega oli BA-RRV hiirtel märkimisväärselt suurenenud CD4 + T-rakkude arv, mis tekitas IL-2 (BSS 0, 25 ± 0, 003%; BA-RRV 2, 95 ± 0, 52%, P = 0, 002), TNF-α (BSS 0, 20 ± 0, 05%). ; BA-RRV 29, 30 ± 5, 18%, P <0, 0001) ja IFN-y (BSS 0, 17 ± 0, 05%; BA-RRV: 20, 93 ± 3, 38%, P <0, 0001) ja IFN-γ (BSS) tootvates CD8 + T rakkudes 0, 25 ± 0, 002%; BA-RRV 30, 16 ± 4, 99%, P = 0, 0003). TNF-α produktsioon CD11b + makrofaagide poolt suurenes samuti märkimisväärselt BA-RRV hiirtel võrreldes BSS-ga (BSS 0, 39 ± 0, 06%; BA-RRV 5, 59 ± 1, 05%, P = 0, 002). RRV-alb hiirte immuunrakud tekitasid proinflammatoorse tsütokiini taseme sarnaselt BA-RRV hiirtega. Teadmata vastupidiselt, olid RRV-IgG hiired vähendanud märkimisväärselt IL-2 CD4 + T-rakkude tootmist (RRV-alb 4, 21 ± 1, 00%; RRV-IgG 1, 27 ± 0, 23%, P = 0, 0036), IFN-y (RRV-alb 31, 65 ± 1, 69%; RRV-IgG 15, 33 ± 1, 75%, P = 0, 0015) ja TNF-α (RRV-alb 27, 10 ± 3, 13%; RRV-IgG 9, 26 ± 0, 62%, P = 0, 007) ja IFN-i tootvates CD8 + T rakkudes y (RRV-alb 31, 15 ± 6, 51%; RRV-IgG 14, 73 ± 2, 44%, P = 0, 029). Suurtes annustes sisalduv IgG ei mõjutanud CD4 + T-raku IL-17 tootmist (RRV-alb 0, 2 ± 0, 13%; RRV-IgG 0, 3 ± 0, 16%, P > 0, 05).

Image

CD4 + Th1 tsütokiini produktsiooni märgatav nõrgenemine suure annuse IgG-ravi korral. Rakusisese tsütokiini produktsiooni kokkuvõte. Maksa immuunrakud värviti rakupinna markeritega (CD45.2 ja CD3 / CD4, CD3 / CD8 või CD11b), stimuleeriti forbooli 12-müristaat-13-atsetaadi (PMA) / ionomütsiini ja interleukiini (IL) -2, interferooniga (IFN) ) -γ, tuumori nekroosifaktor (TNF) -α ja IL-17 kvantifitseeritakse rakusisese värvimise ja fluorestsents-aktiveeritud raku sortimise (FACS) analüüsi abil. Suurtes annustes manustatud IgG-ravi seostati märkimisväärselt vähenenud CD4 + T-rakkude põletikulise tsütokiini tootmisega (* P <0, 05, ** P <0, 005, P <0, 0005, P <0, 0001). BA, sapiteede atresia; BSS, tasakaalustatud soolalahus; RRV, reesus rotaviirus.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid
Image

Tüüpiline fluorestsents-aktiveeritud rakusorteerimise (FACS) analüüs tsütokiini produktsiooni punktidiagrammil. Joonisel on näide rakusisese tsütokiini värvumisest CD4 + ja CD8 + T rakkudest pärast forbooli 12-müristaadi 13-atsetaadi (PMA) / ionmütsiini stimuleerimist. Kvadrandimarkeri paigutus määrati rakkude negatiivse populatsiooni põhjal. Leukotsüütide populatsioonid identifitseeriti uuringuks kolmekordse värava abil (üksikasjad varjamise kohta lisajoonisel S3 on- line). BA, sapiteede atresia; BSS, tasakaalustatud soolalahus; RRV, reesus rotaviirus.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Kõrge doosiga IgG-ravi seostati maksa tregi laienemisega

Järgmisena otsisime välja, kas mehhanism, mille abil IgG vähendas sapijuhapõletikku ja tsütokiinide tootmist, tõi kaasa muutusi Tregides. Tregide määratlemisel võetakse aluseks CD25 + FoxP3 + koekspressioon CD4 + T-raku alamkomplektis ja need on T-raku vahendatud põletiku tugevad inhibiitorid. 10-vanustel BA-RRV hiirtel täheldati CD25 + FoxP3 + tregide protsendi olulist vähenemist CD4 + T raku alamkomplektis võrreldes BSS kontrollhiirtega (BSS 9, 38 ± 0, 49%; BA-RRV 5, 75 ± 0, 52%), P = 0, 0003). Oluline on see, et RRV-IgG hiirtel oli võrreldes RRV-albumiini rühmaga märkimisväärselt suurenenud CD4 + CD25 + FoxP3 + tregid (RRV-alb 7, 51 ± 0, 03%; RRV-IgG 10, 25 ± 0, 75%, P = 0, 0035) ja olid võrreldavad BSS kontrollhiired. ( Joonis 7a, b ) Seega seostati IgG-ravi Tregide olulise laienemisega RRV-ga nakatunud BA hiirtel, taastades Tregi numbrid tagasi BSS kontrollide arvule.

Image

Suurtes annustes IgG on seotud maksa Tregi laienemisega. ( a ) Maksaekstraktide fluorestsents-aktiveeritud rakusorteerimise (FACS) analüüsi kokkuvõte. Percolli gradiendiga puhastatud maksa immuunrakud värviti Tregide tuvastamiseks CD4, CD25 ja FoxP3-ga (* P <0, 005, ** P <0, 0005). b ) Tüüpilised graafikud. Näidatud on CD4 + FoxP3 + tregide tüüpilised punktid graafikutel, mis on piiratud maksa CD4 + rakkudega. Vasakpoolne paneel - RRV-alb: 7, 4% treg, parem paneel - RRV-IgG: 10, 5% Tregs. BA, sapiteede atresia; BSS, tasakaalustatud soolalahus; RRV, reesus rotaviirus; Tregid, regulatiivsed T-rakud.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Arutelu

Uued terapeutilised lähenemisviisid, mis on suunatud põletikulise reaktsiooni pärssimiseks, on õigustatud, et lükata edasi või vältida maksa siirdamise vajadust BA-s. Sel eesmärgil näitas see uuring põhimõtteliste tõendite olemasolu, et IgG kõrge annus võib vähendada intrahepaatilist ja ekstrahepaatilist sapijuha põletikku ja vigastusi RRV-indutseeritud hiire BA mudelis. Seda efekti seostatakse samaaegse maksaekstraktide laienemise ja VCAM-1 ekspressiooni nõrgenemise, portaaltrakti põletiku ja CD4 + Th1 tsütokiini produktsiooniga ( joonis 8 ).

Image

Suure annuse IgG toimemehhanismid hiire sapiteede atreesias (BA). Näidatud on hiire BA suurtes annustes sisalduvate IgG toimete kokkuvõte, sealhulgas veresoonte rakkude adhesiooni molekuli 1 ekspressiooni pärssimine veresoonte endoteelil, mille tulemuseks on T-rakkude ja monotsüütide portaaltrakti vähenenud ekstravasatsioon; Th1 raku aktiveerimise pärssimine, mis viib interferooniga (IFN) seotud y makrofaagide stimulatsiooni, interleukiiniga (IL) -2 seotud T-raku laienemise, tsütotoksilise tuumorinekroosifaktori (TNF) α produktsiooni ja CD4 + T raku vahendatud stimulatsioonini tsütotoksilised CD8 + T-rakud; ja Tregide laienemine, mille tulemuseks on T-rakkude inhibeerimine. Treg, regulatiivne T-rakk; VCAM-1, vaskulaarsete rakkude adhesioonimolekul 1.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Selle uuringu üks piiratus on see, et hoolimata põletiku ja sapiteede obstruktsiooni pärssimisest, ei olnud suure annuse IgG kasutamisel ellujäämine märkimisväärselt paranenud. Suurenenud ellujäämise puudumine RRV-IgG hiirtel ei olnud tingitud püsivast viirusnakkusest, kuna RRV-IgG hiired kustutasid viirust sama tõhusalt kui teised RRV-ga nakatunud kontrollid. On tõenäoline, et RRV-ga nakatunud hiired olid juba esimese IgG-ravi ajal liiga haiged, et suures annuses IgG-ravist mingit kasu saada. Nii see uuring kui ka varasemad teated on näidanud, et RRV-ga nakatunud BA hiired kaaluvad vähem kui BSS kontrollid, kajastades vähenenud suukaudset manustamist, imendumishäireid ja ema tõenäolist hooletussejätmist (9, 10). Seda kasvupuudujääki IgG-ravi ei tühistanud ja see aitas tõenäoliselt kaasa suremusele. Veel üks võimalus on see, et RRV-IgG hiirtel oli samaväärne seerumihaigusega, tsirkuleeriva inimese IgG ja RRV-vastaste antikehade kombinatsioonist. Kuid IgG-d saanud BSS hiirte kontrollrühmas oli 100% ellujäämine, mis kinnitas, et inimese IgG manustamine (ilma nakkuseta) ei olnud kahjulik. Hiire IgG asemel kasutati inimese IgG, kuna varem on näidatud, et inimese IgG-l on hiirtel kõrge afiinsus vastsündinu Fc retseptori suhtes (28, 29). Lisaks on enamikus varasemates uuringutes, milles uuriti IgG mõju inimese haiguse hiiremudelites, kasutatud inimese IgG preparaate (20, 21, 22, 23). Hoolimata avastusest, et suurtes annustes sisalduv IgG ei muutnud ellujäämist, viitab sapijuhapõletiku ja obstruktsiooni märkimisväärne pärssimine sellele, et IgG-ravist võib olla kasu BA-lastel, kes läbivad Kasai protseduuri.

Üks mehhanism, mille abil suurtes annustes IgG võib vähendada portaaltrakti põletikku, on VCAM-1 pärssimine. Tänu interaktsioonile monotsüütides ning T- ja B-lümfotsüütides ekspresseeritud 4 hilise ligandiga, soodustab VCAM-1 põletikuliste rakkude adhesiooni ja transendoteliaalse migratsiooni vigastatud koesse (30). Teatatud on suurenenud VCAM-1 ekspressioonist mitmetes põletikulistes maksaprotsessides, eriti nendes, mida iseloomustab periportaalne põletik (31, 32). Kobayashi jt . (33). varem tuvastanud VCAM-1 suurenenud ekspressiooni sapikanalites, endoteelirakkudes ja hepatotsüütides raske BA-ga inimestel, võrreldes tervete kontrollide ja vähem raskekujulise BA-ga patsientidega. BA hiiremudelis pärssis suureannuseline IgG VCAM-1 ekspressiooni, vähendades sellega lümfotsüütide ja monotsüütide liikumist portaaltraktidesse. Endoteelirakkude poolt VCAM-1 ekspressiooni stimuleerivad põletikulised tsütokiinid, nimelt TNF-α, ja VCAM-1 pärssimine suurtes annustes sisalduva IgG abil võib olla seotud selle samaaegse inhibeeriva toimega põletikuliste tsütokiinide tootmisele (30, 34).

See uuring näitas põletikuliste tsütokiinide IL-2, IFN-γ ja TNF-α ületootmist maksa CD4 + T-rakkude poolt ja IFN-γ RRV-ga nakatunud hiirte CD8 + T-rakkude poolt üleproduktsiooni, mida summutati suurtes annustes IgG-raviga . IFN-y tootvad T-rakud on seotud paljude põletikuliste autoimmuunhaiguste patoloogiaga (35). BA hiiremudelis Shivakumar jt . (10) näitasid IFN-γ olulist rolli sapijuhakahjustuses, kuna RRV-ga nakatunud IFN-γ knockout-hiirtel oli sapiteede obstruktsioon lahendatud ja parem ellujäämine. Käesolevas uuringus seostati suurtes annustes IgG-ravi IFN-γ olulise vähenemise ja kaitsega sapiteede eest. See on kooskõlas varasemate põletikuliste ja autoimmuunhaiguste uuringutega, mis on näidanud, et suure annusega IgG-ravi vähendab IFN-γ, TNF-α ja teiste põletikuliste tsütokiinide taset (22, 36). IFN-y-l on palju allavoolu mõjusid, sealhulgas makrofaagide aktiveerimine koos järgneva tsütotoksiliste molekulide vabastamisega. See uuring näitas, et IFN-γ vähenenud tase RRV-IgG rühmas korreleerus portaaltrakti makrofaagide infiltraatide ja TNF-α-d tootvate makrofaagide vähenemisega, osutades sapiteede kahjustuste eest kaitsmise sünergistlikule mehhanismile. On püstitatud hüpotees, et tsütokiinide produktsiooni vähenemine IgG-raviga võib tuleneda polüklonaalses IgG-s sisalduvatest antikehadest, mis inaktiveerivad need tsütokiinid (37, 38), antigeenide otsese antikeha neutraliseerimisega (39) või võimendades nende tsütokiine. Tregid (40).

Tregid on olulised T-rakkude vahendatud immuunvastuse supresseerimisel patogeenidele, pärssides liiga agressiivset immuunaktiveerimist ja ennetades autoreaktiivsete T-rakkude aktiveerimist. Muud uuringud on näidanud, et suurtes annustes sisalduva IgG kasulik mõju on seotud Tregi populatsioonide laienemisega. Hiire eksperimentaalses autoimmuunse entsefalomüeliidi korral, sclerosis multiplex'i mudel, Ephrem et al . (40) täheldasid, et suurtes annustes IgG-ravi profülaktiline manustamine takistas hiirtel eksperimentaalset autoimmuunset entsefalomüeliiti ning seda seostati suurenenud Tregi arvu ja supresseerimisvõimega. Meie uuringus tuvastatud maksa tregide laienemine pakub ühendavat mehhanismi, kuidas suure annusega IgG vähendas põletikuvastast tsütokiini tootmist CD4 + ja CD8 + efektor-T-rakkude poolt ning vähendas sapiteede kahjustusi. Tregide võimalikku tähtsust BA patogeneesis on hiljuti kirjeldatud. Meie rühm teatas, et vereringes olevad tregid olid diagnoosimise ajal oluliselt madalamad BA-ga imikutel, võrreldes eakohase kontrolliga (15). Samuti on BA hiirte uuringutes teatatud Tregi puudujääkidest ja kaitsest BA eest Tregi lisandiga (14, 16). Neid järeldusi arvesse võttes võib Tregsi stimuleeriva ravi väljatöötamisel olla oluline mõju inimese BA tulemustele.

Kokkuvõtteks oleme näidanud, et suurtes annustes IgG manustamine nõrgestab sapijuhapõletikku ja vigastusi BA hiiremudelis. Meie tähelepanekud peaksid soodustama kõrgete annuste IVIg kliiniliste uuringute arendamist Kasai portoenterostoomia abiaineravina BA-ga imikutel. Kombineeritult kirurgilise raviga võib IVIg muuta haiguse trajektoori ja lükata edasi või vältida maksa siirdamise vajadust.

Meetodid

BA ja IgG ravi RRV-indutseeritud hiiremudel

Ajastatud rasedusega emased BALB / c hiired osteti rotaviirusevabadest kolooniatest firmalt Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Hiirtele süstiti intraperitoneaalselt elu jooksul 12–18 tundi kontrollina kas 1, 5 × 106 pfu / ml RRV või BSS. RRV-ga nakatunud, kollatõve saanud hiired said intraperitoneaalselt süsti kas 2 g / kg inimese IgG (Gammagard, Baxter, Westlake Village, CA), inimese albumiini (Sigma Aldrich, St Louis, MO) või ei saanud ravi iga 2–3 järel. d × 6 annust, alates 7. elupäevast. Päevadel 10–14 koristati seerum, maks ja ekstrahepaatiline sapijuha. Kõiki loomi käsitseti vastavalt Colorado ülikooli Denveri laboratoorsete loomade meditsiini büroo riiklike tervishoiuinstituutide “Laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhend” (väljaanne nr 86-25 1985) kohaselt.

Viirusliku naastu test

Maksakude homogeniseeriti steriilses MEM-is (mass / maht 1: 1) ja kanti MA-104 rakkude ühekihilisele kihile, nagu eelnevalt kirjeldatud (9).

Seerumi bilirubiini test

Veri koguti neeruarterist, ühendati (2–4 hiirt / bassein) ja otsese bilirubiini sisaldust seerumis mõõdeti otsese bilirubiini analüüsiga (Diagnostic Chemicals, Oxford, CT).

Histopatoloogia

Formaliiniga fikseeritud, parafiiniga manustatud maksa- ja ekstrahepaatiliste sapijuha lõigud ( n = 6 igas rühmas) värviti hematoksüliini ja eosiiniga ning visualiseeriti Olympus BX41 laboratoorse mikroskoobiga (Olympus America, Scientific Equipment Group, Center Valley, PA).

Kaudne immunofluorestsents

Kiirelt külmutatud maksakude (igas rühmas = 6) värviti vastavalt tootja juhenditele, kasutades Tyramide System Amplification Direct Kit (PerkinElmer, Waltham, MA). Objekte inkubeeriti anti-TROMA III (CK19 sapiteede epiteelil) ja CD4 (GK1.5), CD8a (5H10), CD11b (M1 / 70), VCAM-1 (429), rotivastase IgG2a ( eBM2a) või anti-roti IgG2b (eB149 / 10H5) (eBiosciences, San Diego, CA) ja vastupidine Hoechsti tuumavärviga (Sigma, St Louis, MO). Fluorestsentssignaali pildistati seadmega Zeiss Axio Imager.A1 (Carl Zeiss, Thornwood, NY) ja kihid kaeti Adobe Photoshop CS2 (Adobe Systems, San Jose, CA) abil.

Maksa immuunrakkude voolutsütomeetria

Maksa immuunrakkude eraldamiseks ühendati kaks kuni neli maksa ja iga katse jaoks analüüsiti ≥ 3 kogumit. Maksade ühe raku suspensioon värviti anti-CD45, anti-CD3 ja anti-CD4, CD8, CD11b, NKG2D, B220 või isotüübi kontrolliga (eBiosciences). Maksa Tregi analüüsiks eraldati immuunrakud Percolli gradiendi abil ja värviti, kasutades tootja juhendi (eBiosciences) Mouse Regulatory T-rakkude värvimiskomplekti. Rakupinna markerite ekspressioon määrati FACSCalibur voolutsütomeetriga, kasutades analüüsimiseks tarkvara CELLQuest (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Leukotsüütide populatsioonid tuvastati CD45 + rakkudele viimisega.

Rakusisese tsütokiini analüüs voolutsütomeetria abil

Maksa immuunrakke stimuleeriti forbooli 12-müristaat-13-atsetaadi (PMA) ja ionomütsiiniga GolgiPlugis (BD Pharmingen, San Diego, CA), inkubeerituna anti-CD45.2 (hematopoeetilist päritolu rakud) ja kas anti-CD4, CD8a-ga või CD11b (e-bioteadused). Rakud permeabiliseeriti ja inkubeeriti kas anti-IL-2, IFN-y, TNF-a, IL-17 või kontrollitud isotüübiga (eBiosciences).

Maksa RNA ja qRT-PCR eraldamine

Maksakude homogeniseeriti TRIZOL puhvris (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja RNA eraldati vastavalt tootja juhistele. RT-PCR viidi läbi, kasutades TaqMani praimereid (Invitrogen) ja qScript 1-Step Fast qRT-PCR komplekti (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD) iCycleri termotsükleril (BioRad, Hercules, CA).

Statistiline analüüs

Kõik tulemused põhinesid ühendatud maksaproovide ≥3 eraldi eksperimendil (2–4 proovi / kogum) ja need olid esitatud keskmisena ± SEM. Gruppidevahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil ja korrigeeriti, kasutades Šidáki korrektsiooni (Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA). Keskmiste erinevusi peeti oluliseks P väärtuste <0, 05 korral.

Finantstoetuse avaldus

Seda uuringut toetasid riiklikud terviseinstituudid; Riiklik diabeedi ning seede- ja neeruhaiguste instituut, R01: DK078195 (PI: Mack CL); CHCO laste maksa uuringute fond, Aurora, CO; ja CHCO teadusinstituut, Aurora, CO.

Avalikustamine

Ühelgi autoril puuduvad majanduslikud huvid, mida võiks tajuda huvide konfliktina.

Täiendav teave

Piltfailid

  1. 1

    Täiendav joonis S1

  2. 2

    Täiendav joonis S2

  3. 3

    Täiendav joonis S3