Foxo3a geneetiline uurimine nõuab erilist tähelepanu seoses järjestuse homoloogiaga foxo3b | Euroopa inimgeneetika ajakiri

Foxo3a geneetiline uurimine nõuab erilist tähelepanu seoses järjestuse homoloogiaga foxo3b | Euroopa inimgeneetika ajakiri

Anonim

Õppeained

  • Geneetiline variatsioon
  • Transkriptsiooni tegurid

Abstraktne

Meie uuring näitab, et inimese valideeritud pikaealisuse geeni kahvlikarbi O3A geeni ( FOXO3A ) geneetilist uurimist takistab oluliselt asjaolu, et selle eksootilistel piirkondadel on 99% järjestuse homoloogia FOXO3B pseudogeeniga. Kui seda ei arvestata, võib see kõrge homoloogia põhjustada tõsiseid genotüpiseerimis- või järjestamisvigu. Siin tutvustame eksperimentaalset ülesehitust, mis võimaldab usaldusväärsete andmete genereerimist väga homoloogiliste piirkondade kohta ja mida saab kasutada testi spetsiifilisuse hindamiseks. Seda kujundust kasutades näitasime näitlikult FOXO3A- spetsiifilisi tulemusi kahe ühetuumalise nukleotiidi polümorfismi (SNP) (rs4945816 ja rs4946936) kohta, mis on meie pikaajalisusega kontrollproovis ( P igaüks = 0, 0008) oluliselt seotud. Kuna mõlemad SNP-d asuvad FOXO3A 3'-tõlkimata piirkonnas, võivad need olla pikaealisuse fenotüübi jaoks funktsionaalselt olulised. Meie eksperimentaalset ülesehitust saab kasutada usaldusväärsete ja reprodutseeritavate andmete genereerimiseks FOXO3A edasiseks järjestamiseks ja genotüüpide määramiseks , eesmärgiga avastada uusi funktsionaalselt olulisi SNP-sid.

Sissejuhatus

Kahvlikarbi O3A geen ( FOXO3A ) on insuliini retseptori / insuliinilaadse kasvufaktori-I signaaliülekandeteede peamine regulaator ja osaleb Caenorhabditis elegans'i ja Drosophila eluea modulatsioonis. 1, 2, 3, 4, 5 Inimestel on erinevates populatsioonides pidevalt näidatud FOXO3A geneetilist varieeruvust, et seda seostatakse ellujäämisega vanaduseni. 6, 7, 8, 9, 10, 11 Selle aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid on siiski veel välja selgitamata, kuna suurem osa analüüsitud pikaealisusega seotud ühe nukleotiidi polümorfismidest (SNP-d) asuvad sisepiirkondades. 6, 7, 8, 9, 10, 11 Geeni funktsionaalsust moduleerivate põhjustavate alleelivariantide tuvastamiseks on vaja läbi viia uuringud, mis uuriksid FOXO3A täielikku geneetilist variatsiooni eksonite, eksoni-introni piiride ja promootor.

Enne selliste uuringute alustamist tuleb arvestada, et pseudogeen nimega FOXO3B asub kromosoomis 17p11. FOXO3B on 99% -liselt identne FOXO3A-ga umbes 7, 1 kb pikkuse eksoonses järjestuses. Pseudogeen hõlmab kõiki kolme FOXO3A NM_001455 eksonit ja neil puuduvad kaks intronit (joonis 1). 12 Kuna FOXO3A ekson 2 ja 3 on suhteliselt suured (vastavalt 1, 4 kb ja 4, 9 kb), ei anna FOXO3A- spetsiifilised sisemised piirkonnad nende kahe eksoni analüüsimiseks piisavalt praimeri sihtmärke. Näiteks Sangeri sekveneerimisega kvaliteetsete lugemiste saamiseks ei tohiks PCR amplikonid ületada 600 alust. Kuna eksonid 2 ja 3 on mõlemad suuremad kui 1400 alust, tuleb nende sekveneerimispraimerid paigutada eksoonilistesse piirkondadesse, hoolimata nende tugevast homoloogiast FOXO3B-ga. Sellegipoolest võib mõne sekveneerimise või genotüübi määramise testi jaoks olla võimalik praimereid paigutada eriti FOXO3A / FOXO3B järjestuste erinevustele (mis moodustavad ainult 1% kriitilistest piirkondadest) (täiendav joonis S1). Terve eksoonilise piirkonna (7, 1 kb) geneetiliseks uurimiseks annaks tavapärane praimeri kujundus, kasutades praimeri paigutamisel homoloogseid eksoonilisi piirkondi, tõenäoliselt mittespetsiifilise genotüpiseerimise või segatud FOXO3A / FOXO3B sekveneeriva amplikoni. Kahjuks ei saa tulemust usaldusväärselt ennustada, näiteks silikoontesti PCR abil enne tegelikku märglabori katset.

Image

FOXO3A geenimudeli illustratsioon, mis näitab kahte kromosoomis 6 isovormi NM_201559 (neli eksonit) ja NM_001455 (kolm eksooni). Eksonid on tähistatud kastidega ja on toodud võrreldes kromosoomi 17 FOXO3B pseudogeeniga. FOXO3B on 99% identne FOXO3A umbes 7, 1 kb seotud järjestuse kohta, mis sisaldab FOXO3A NM_001455 kõiki kolme eksonit, ilma et neil oleks vahepeal kahte introni. Transkriptsioonide füüsikalised positsioonid (kilobaasides) osutavad UCSC genoomibrauserile 2006. aasta märtsi inimkoosseisus.

Täissuuruses pilt

Siin tutvustame eksperimentaalset ülesehitust, mis võimaldab FOXO3A- spetsiifilisel eksootilistel piirkondadel geneetiliselt uurida ilma FOXO3B 'saastumiseta: genereerides pikamaaprodukte, mis hõlmavad umbes 8000 alust, saab eksooni 2 ja 3 võimendada FOXO3A-s - spetsiifilisel viisil, kasutades praimeri paigutamiseks mittehomoloogseid introonilisi piirkondi. Geenitüpiseerimis- ja järjestamiskatseid kirjeldatakse eksonüümi 3 jaoks näitlikult: esiteks amplifitseeriti eksonit 3 pikamaa-PCR abil FOXO3A- spetsiifilise praimeri paigutamisega läheduses asuvatesse ainulaadsetesse sisepiirkondadesse ( lisatabel S3), et tagada FOXO3A eksoonilise piirkonna (st. (puudub FOXO3B järjestus). Järgmisena kasutati pikamaa amplikone mallidena genotüpiseerimiseks ja reaktsioonide järjestamiseks. Testisime selle eksperimentaalse ülesehituse sobivust kahe SNiP jaoks , mis asuvad FOXO3A eksonis 3, nimelt rs4945816 ja rs4946936. Need kaks SNiPi valiti, kuna nad on ainsad eksootilises piirkonnas FOXO3A, mis on loetletud lehel dbSNP tavaliste SNPdena CEU-proovides (//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/).

Tulemused ja arutlus

Järjestuse testi seadistamine: erinevused FOXO3A spetsiifilisuses

Genotüpiseerimine Sequenom tehnoloogiaga (Sequenom, Hamburg, Saksamaa) viidi mõlemal SNP-l läbi 23 isendil, kasutades võrdluseks kolme erinevat malli: FOXO3A ekson 3 pikamaatooted (5, 523 kb), FOXO3B pikamaatooted (8 540 kb) ja genoomne DNA (gDNA). Tabelis 1 on toodud üheksa inimese kohta saadud näidisandmed. Ülejäänud 14 isendi andmed on esitatud täiendavas tabelis S1. Mõlema SNP järjestuse PCR praimerid paigutati FOXO3A / FOXO3B järjestuste erinevustele ( lisajoonis S1). Vaatamata konkreetsele praimeri paigutusele näitab kolmest erinevast mallist saadud SNP rs4945816 genotüpiseerimistulemuste võrdlus, et gDNA matriitsist tuletatud näiliselt heterosügootsed genotüübid (proovid 1, 3, 4, 5 ja 8) on tingitud mittespetsiifilisest tüpiseerimisest ja esindavad segusid FOXO3A ja FOXO3B genotüüpide arv (tabel 1a, täiendav tabel S1a). Fiktiivne heterosügootsus ilmneb ainult siis, kui FOXO3A ja FOXO3B genotüübid erinevad üksteisest, nagu see oli proovide 1, 3, 4, 5 ja 8 korral (tabel 1a). Teisest küljest näitas teine ​​SNP-test (rs4946936) FOXO3A spetsiifilisust, esitades FOXO3A pikamaaprodukti ja gDNA matriitsi korral samad genotüpiseerimise tulemused, mis mõlemad erinesid FOXO3B-st (tabel 1a). Kahe Sequenom testi FOXO3A spetsiifilisuse erinevused näitavad selgelt, et FOXO3A testi spetsiifilisust ei saa enne tegelikku märglabori katset usaldusväärselt ennustada. Ainult gDNA matriitsi genotüpiseerimistulemuste võrdlus FOXO3A ja FOXO3B pikamaaproduktidest saadud tulemustega näitas, et rs4946936 test oli FOXO3A- spetsiifiline, samas kui rs4945816 test ei olnud (tabel 1 ja täiendav tabel S1). Järelikult, et saada FOXO3A- spetsiifilisi tulemusi rs4945816 ja rs4946936 suhtes rakendatud Sequenom testidega, tuleks rs4945816 tüpiseerimine teostada FOXO3A pikamaatoodetega, samas kui rs4946936 võiks uurida gDNA-ga.

Täissuuruses tabel

FOXO3A- spetsiifiline järjestamine

Lisaks näitasime, et meie eksperimentaalne ülesehitus sobib ka FOXO3A- spetsiifiliseks probleemsete homoloogsete eksooniliste piirkondade järjestamiseks. Sel eesmärgil sekveneerisime FOXO3A eksoni 3 samadel 23 isendil, kasutades gDNA asemel praimerite sekveneerimise sihtmärkidena FOXO3A pikamaaprodukte . Järgnev SNP, mis nõudis numbreid rs4945816 ja rs4946936, andis samad FOXO3A- spetsiifilised genotüübid (tabel 1b, lisatabel S1b) nagu varem (tabel 1a, lisatabel S1a).

FOXO3A- spetsiifiline genotüpiseerimine

Suuremahuliste juhtumikontrolli assotsiatsiooni uuringute jaoks võib FOXO3A- spetsiifiliste pikamaa-PCR-toodete valmistamine tuhandete proovide jaoks FOXO3A- spetsiifiliste pikamaa PCR-toodete tootmiseks FOXO3A- spetsiifiliste genotüüpide määramise tulemuste saamiseks olla liiga aja- ja rahamahukas . Selliste toodete vajaduse välistamiseks saab meie uuringu ülesehitust kasutada ka kaubanduslikult saadavate testide (nt TaqMan; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) praimerite spetsiifilisuse testimiseks: esiteks, huvipakkuvad testid trükitakse vähestes proovides, kasutades malle gDNA, FOXO3A ja FOXO3B . Seejärel võrreldakse kolmest erinevast mallist saadud genotüüpe, et hinnata analüüsi spetsiifilisust. Järgmisena, kui gDNA-ga testitud testid näitavad samu genotüüpe kui FOXO3A pikamaatoodetest, saab kohandatud teste kasutada ka suuremate proovide genotüpiseerimiseks, kasutades matriitsina gDNA-d. Me rakendasime seda seadistust FOXO3A spetsiifilisuse hindamiseks ühe kohandatud TaqMani testi (rs4945816; hCV27392797) ja ühe ise kujundatud TaqMani testi (rs4946936; rs4946936_SDA) jaoks. Mõlemad TaqMani testid näitasid FOXO3A spetsiifilisust, saades samasugused genotüpiseerimise tulemused, mis saadi FOXO3A pikamaaproduktilt (tabel 1c, lisatabel S1c). Kuna need kaks testi osutusid normaalsest gDNA-st usaldusväärsete genotüüpide genereerimiseks, otsustasime neid uurida hiljem kogu meie uuringu valimis, mis sisaldas 747 sajandikku ja 1102 kontrolli. Mõlemad SNP-d näitasid alleelipõhises juhtumikontrolli analüüsis väga olulist seost pikaealisusega (rs4945816, P = 0, 0008; rs4946936, P = 0, 0008).

Funktsionaalse tähtsuse in silico uurimine

Kuna mõlemad SNP-d asuvad FOXO3A 3'-tõlkimata piirkonnas, võivad need olla funktsionaalselt olulised. Kasutades silikoanalüüsis erinevaid ennustusvahendeid, testisime kahte SNiP rs4945816 ja rs4946936 potentsiaalselt funktsionaalse tähtsuse osas. Puudusid funktsionaalsed või struktuurilised mõjud, ennustati mikroRNA-ga seondumise saite või splaissimiskohti (lisatabel S2). Ainult need tööriistad, mis analüüsisid splaissingu reguleerimise elemente (SRE), tuvastasid erinevusi referents- ja muteerunud järjestuste vahel. Neid tulemusi tuleb siiski suhtuda ettevaatusega, kuna teadaolevalt on SRE-d vähem konservatiivsed ja järelikult ei anna selline tööriist tõenäoliselt usaldusväärseid ja täpseid tulemusi. 13 Neid kahte SNiP rs4945816 ja rs4946936 on meie seadistuse kontrollimiseks uuritud. Tulevased uuringud, mille eesmärk on tuvastada uusi funktsionaalselt olulisi SNP-sid FOXO3A eksoonilises piirkonnas, peaksid kaaluma siin esitatud aspekte.

Järeldus

Kokkuvõttes näitavad meie tulemused selgelt, et FOXO3A eksooniliste piirkondade usaldusväärse geneetilise uurimise jaoks on FOXO3B järjestuse homoloogia arvestamiseks kohustuslik spetsiaalne uuringu ülesehitus. See leid on eriti oluline, kuna mõnes uuringus on juba kasutatud FOXO3A eksooniliste piirkondade amplifitseerimiseks mittespetsiifilisi praimereid. Näiteks rakendasid Mikse et al 14 mitmesuguseid praimerikomplekte, et määrata FOXO3A deletsioonid kasvajarakkudes qPCR abil. Kui testisime neid paare UCSC- ga silico Test-PCR-is (//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start), näitas väljund nende kahe jaoks täiendavat seondumist FOXO3B-ga (vt lisamaterjalid ja -meetodid) ).

99% FOXO3A / FOXO3B homoloogia ei mõjuta endisi FOXO3A pikaealisuse assotsiatsiooni leide, kuna nagu eespool mainitud, asub enamik seotud ja valideeritud SNP-sid FOXO3A- spetsiifilistes sisepiirkondades . Sellegipoolest tuleb tulevastes FOXO3A geeniuuringutes arvestada pseudogeeniga. Lisaks võiks esitatud strateegiat rakendada ka teiste kõrge järjestusega homoloogiaga geenipaaride või pseudogeenide suhtes, mis muudavad PCR praimerite kujundamise või usaldusväärsete genotüüpide määramise testide keeruliseks, näiteks tsütokroom P450 geenid CYP2D6, CYP2D7, CYP2D8 või RH veregrupi geenid ( RH ). 15, 16

Täiendav teave

Wordi dokumendid

  1. 1

    Täiendav teave

    Täiendav teave on lisatud ajakirja European Journal of Human Genetics veebisaidil (//www.nature.com/ejhg)