Kahe domineeriva kõrghaljastusega preeria liigi geeniekspressioonimustrid erinevad soojenemise ja muutunud sademete tõttu | teaduslikud aruanded

Kahe domineeriva kõrghaljastusega preeria liigi geeniekspressioonimustrid erinevad soojenemise ja muutunud sademete tõttu | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Ökoloogia

Abstraktne

Taimeliikide kliimamuutustele reageerimise aluseks olevate mehhanismide paremaks mõistmiseks võrdlesime kaasomandis olevate C 4 heintaimede, Andropogon gerardii Vitmani ja Sorghastrum nutans (L.) Nash transkriptsiooniprofiile vastusena temperatuuride tõusule ja muutlikumale sademete režiimile pikaajaline põldkatse põlisealise kõrreliste preerias. Kasutasime mõlema liigi isenditelt kogutud lehekoes korrelatsioonide hindamiseks tihedalt seotud mudelliikide ( Zea mays ) mikromõõtmist sondeerimisega (T- leht ) ja leheveepotentsiaaliga (LWP) ning arvukuse muutusi ~ 10 000 lehes. Leiti, et S. nutansi T- lehe ja LWP sisalduse arvukuse muutuse korral on suurem arv ärakirju kui A. gerardii . Ka S. nutans reageeris põua lühiajalisele taastumisele paremini kui A. gerardii . Stressi vältimisega (nt akvaporiinid), samuti kahjustuste ennetamise ja parandamisega (nt antioksüdantsed ensüümid, HSP-d) seotud veevoogu reguleerivad ärakirjad olid ainulaadselt rikkalikumad, reageerides S. nutansi T- lehe suurenemisele. Kaas domineerivate C 4 heintaimede erinev transkriptoomiline vastus viitab sellele, et need liigid saavad erinevatel viisidel hakkama temperatuuri ja veestressiga ning reageerivad sellele molekulaarsel tasemel, mõjutades kõrreliste preeria ökosüsteemi funktsiooni.

Sissejuhatus

Prognoositav kliimamuutus hõlmab kõrgendatud keskmisi temperatuure ja muutuvamat sademete režiimi 1, mis peaks paljude taimekoosluste jaoks suurendama vee- ja temperatuuristressi. Eeldatakse, et sellised keskkonnatingimuste kroonilised muutused põhjustavad fenotüüpse kohanemise üksikisiku tasandil 2, 3 . Näiteks on tõestatud, et sademete sagenenud suurenenud erinevuste arv valib suurema morfoloogilise ja füsioloogilise plastilisuse, mis võib põhjustada evolutsioonilisi muutusi 4 . Taimede fenotüübilised reaktsioonid muutuvatele keskkonnatingimustele saavutatakse geeniekspressiooni reguleerimisega transkriptsiooni ja transkriptsiooni järgsel tasemel, mille tulemuseks on muutused ainevahetuses ja füsioloogias. Seega võiks fenotüübi ja geeniekspressiooni ühendamine anda tundlikuma indikaatori reageerimisel muutunud keskkonnatingimustele ja stressile. Lisaks suurendab taimede funktsionaalsete vastuste hindamine geneetilisel ja biokeemilisel tasandil meie arusaamist kasvu ja ellujäämist piiravate vastuste geneetilistest alustest, mida saab seostada sobivuse varieerimise, valiku ja kohanemisega 5, 6 . Üksikreaktsioonid võivad ka kogukonna ja ökosüsteemi struktuuri ja funktsiooni mõjutada kaskaadina, eriti kui süsteemis domineerivad fookusliigid 2, 7 .

Kuni viimase ajani viidi taimede reageerimine muutuvatele keskkonnatingimustele ja looduslike süsteemide stressidele molekulaarsel alusel tundmatusse nn musta kasti 8 . Siiski saavad genoomilised tööriistad selgitada molekulaarseid mehhanisme ja hinnata nende olulisust reaalses kontekstis 8, 9, 10, 11, 12 . Mikrokiibi profiilide koostamine on analüütiline tööriist, mille abil saab üheaegselt uurida tuhandete geenide ekspressiooni, ning seda on kasutatud globaalse geeniekspressiooni jälgimiseks vastusena abiootilistele stressidele paljudes kõrgemates taimedes 13, 14, 15, 16 . Kuid enamik neist uuringutest on keskendunud mudelliikidele, mille jaoks cDNA mikrokiibid on hõlpsasti kättesaadavad (nt Arabidopsis, mais, Populus , riis ja sojaoad), ning need on lühikese aja jooksul ja kontrollitud tingimustes kehtestanud suhteliselt ekstreemsed tingimused (nt taimed) kasvatatud põuaga pottides või lühiajalise stressi all kannatavates seemikutes). Need uuringud annavad ülevaate transkriptsiooniprofiili muutustest, mis on seotud reageerimisega erinevatele stressidele, ja aitavad meil mõista seotud geenide funktsiooni. Siiski on ebaselge, kuidas nende uuringute järeldused kehtivad looduslikes süsteemides mittemudelike taimede suhtes. Looduslike süsteemide keskkonnamuutused võivad olla peenemad, kui stress koguneb aja jooksul (võimaldades aklimatiseeruda). Nende süsteemide taimed puutuvad kokku ka keskkonnatingimuste suurema muutumisega, aga ka paljude muude teguritega (nt konkurents, taimtoit). Kõik need erinevused võivad muuta geeni ekspressiooni varieerumise ulatust, mida täheldatakse kontrollitavamates seadetes 8 . Seega, kui soovime parandada oma mehhaanilist arusaamist taimede reageerimisest kliimamuutustega seotud muudetud keskkonnatingimustele, on oluline samm edasi mudeli mittekuuluvate taimeliikide genoomiliste uuringute läbiviimisel ökoloogiliselt olulistes välitingimustes.

Väliuuringutes tehtud ärakirjade profiilide lisamist on takistanud mittemudelsete liikide jaoks saadaval olevate genoomiliste ressursside puudumine 10, ehkki uusi ressursse luuakse kiiresti 17 . Enamik kõrgemate taimede jaoks praegu saadaolevaid mikrokiude on mõeldud mudelile ja kaubanduslikult olulistele liikidele 8, 17 . Ehkki hiljutised suure läbilaskevõimega genotüpiseerimisriistad, näiteks RAD-seq, keelavad tervete genoomide järjestamise, nõuavad need tehnikad siiski palju aega ja / või ressursse (näiteks sekveneerimise sügavus) mittemudeliliste liikide väljatöötamiseks. Alternatiivseks lähenemisviisiks on kasutada mudelliikide jaoks kavandatud mikrokiibi ja rakendada neid lähedalt seotud mittemudeliliste liikide (st heteroloogiliste või liikidevahelise hübridisatsiooni) liikide jaoks. Ehkki selliseid puudusi, nagu liigispetsiifiliste järjestuste kadumine ja hübridisatsiooni artefaktid, on olemas 18, 19, on heteroloogseid hübridisatsioone edukalt kasutatud mittemudelsete taimeliikide transkriptoomide uurimisel vastusena keskkonnamõjude 9, 20, 21, 22, 23, 24, sealhulgas võistlus 25, 26 . Muude taimede uuringud loodusliku põllu keskkonnas on siiski harvad (kuid vt 9, 10 ).

Siinkohal tutvustame väliuuringu tulemusi, mille eesmärk on võrrelda kahe loodusliku C 4 rohu liigi, Andropogon gerardii Vitmani (suur sinikas ) ja Sorghastrum nutans (L.) Nash (India rohi) genoomset vastust kahele prognoositud kliimamuutuse aspektile. 1 : kõrgem temperatuur ja sademete režiimide suurem varieeruvus. Varasemad uuringud teatasid, et A. gerardii reageeris eksperimentaalselt muudetud sademete režiimidele fotosünteesiga seotud geenide ekspressiooni alareguleerimisega, mis viitab põua stressiga kohanemise produktiivsuse kuludele või põua stressist tingitud vähenenud jõudlusele 10 . Kui taimed puutusid kokku nii kõrgendatud temperatuuride kui ka muutunud sademerežiimidega, nihutas A. gerardii geenide ekspressioonitasemeid pigem termilise stressi kui veestressi tagajärjel 9 . Kõrgirohumaa preeria ökosüsteemis domineerib A. gerardii koos S. nutansiga ja kaks liiki interakteeruvad, mõjutades kogukonna ja ökosüsteemi ülesehitust ja funktsiooni 27 ning reageerides kliimamuutustele 28, 29, 30 . Mõlemat liiki leidub Põhja-Ameerika kesk- ja idaosas, kuigi ajalooliselt kippusid S. nutans domineerima mesilaslikumate (lõunapoolsete) piirkondade 31 alal . Hoolimata tihedast fülogeneetilisest sugulusest 32, 33, varieeruvad need kaks liiki arvukuses ja erinevad ökofüsioloogiliste reaktsioonide poolest temperatuuri ja vee kättesaadavuse muutustele 30, 34, 35, 36, 37 . Näiteks mõjutas A. gerardii netofotosünteesi ja stomaalset juhtivust temperatuuri tõus, samas kui need ökofüsioloogilised reaktsioonid olid tihedamalt seotud S. Nutansi vee kättesaadavuse muutustega 37 . S. nutansi ökofüsioloogia oli tundlikum ka põllul toimuvate äärmuslike kliimamanipulatsioonide (kuumalainete) suhtes. Teisisõnu, samadel tingimustel ilmnes S. nutansi ökofüsioloogia suurem langus võrreldes A. gerardiiga . Seega viitavad need uuringud sellele, et kaks fookusliiki, mis on eeldatavalt ökoloogiliselt funktsionaalselt sarnased, võivad tegelikult erineda olulisel viisil nende tundlikkusest kliimamuutuste suhtes.

Esialgse sammuna ökofüsioloogilisel tasemel täheldatud tundlikkuse erinevuste aluseks olevate potentsiaalsete molekulaarsete mehhanismide mõistmiseks analüüsisime nende kaasomandis olevate rohuliikide isendite transkriptsiooniprofiile, kes olid avatud nii kõrgendatud temperatuuridele kui ka muutunud sademerežiimidele looduslike põldude proovitükkidel. Kasvuperioodil (sealhulgas juuli keskpaiga põua taastumise sündmus) kasutasime heteroloogseid hübridisatsioone cDNA mikrokihtidega, mis olid mõeldud lähedalt seotud mudelliigi - Zea mays - jaoks , et iseloomustada iga liigi transkriptsioonilisi profiile vastusena eksperimentaalselt põhjustatud temperatuurile ja veele stress põllul. Me eeldasime, et Zea mays pakuvad sobivat malli stressireaktsiooni geenide säilimise tõttu taimedes 38 . Me püstitasime hüpoteesi, et transkriptsioonivastused oleksid erinevalt üles- ja allapoole reguleeritud erinevate geenirühmade jaoks, näiteks A. gerardii ja S. nutansi jaoks , näiteks stressireaktsioonil 11, 16 ja fotosünteesis 39 osalevad. Me eeldasime, et transkriptsioonide (tundlikkuse) absoluutsed erinevused erinevad kasvuperioodi jooksul temperatuurist ja veestressist sõltuvalt, kusjuures A. gerardii on tundlikumad tõusnud temperatuuride suhtes ja S. nutans on tundlikumad suureneva veestressi suhtes. Need leiud aitavad paljastada mehhanisme, mille abil need kaks kaasomandis olevat liiki ja lõpuks kõrgrohukas preeriakooslused reageerivad kliimastressile looduskeskkonnas.

Tulemused

T- lehe ja LWP varieerumine kasvuperioodil A. gerardii ja S. nutans puhul

A. gerardii ja S. nutans ei erinenud oluliselt lehe pinnatemperatuuri (T- leht ; F 1, 25 = 0, 62, p = 0, 439) või leheveepotentsiaali (LWP; F 1, 26 = 1, 74, p = 0, 198) reageeringus. ) soojenemise või muudetud sademete töötlemisega kogu uuringu vältel, ehkki S. nutans kippus juuli keskel ilmutama madalamat (negatiivsemat) LWP-d kui A. gerardii . Üldiselt oli T- leht madalaim kasvuperioodi alguses, saavutas haripunkti põua kõrgusel (18. juuli) ja jäi seejärel ülejäänud kasvuperioodiks vahepealseks (joonis 1A, B). Seevastu LWP muutus kasvuperioodi edenedes negatiivsemaks (joonis 1 C, D), madalaim LWP oli juuli keskel (18. juuli). Mõlema liigi puhul oli soojendatud proovitükkidel üksikute taimede T- leht tavaliselt 1 või 2 ° C kõrgem kui soojendamata proovitükkidel (joonis 1, F gera = 1, 6 = 8, 02, A. gerardii puhul = 0, 030; F 1, 17 = 0, 23, p = 0, 635 S. nutansi puhul ). Kuid see erinevus T- lehtedes vähenes kasvuperioodi edenedes ja õhutemperatuuri tõustes kasvuperioodil hiljem. Võrreldes taimedega, mis puutuvad kokku ümbritseva sademe töötlemisega (vihmasadu rakendati kohe), kaldusid muudetud sademete töötlemisega (ümbritseva sademete hulga vahelise aja suurenemise 50% võrra) taimed madalamale, kuigi mitte oluliselt erinevale LWP ja kõrgemale T- lehele (joonis 1C, D, F 1, 13 = 0, 64, p = 0, 439 A. gerardii korral ; F 1, 40 = 0, 49, p = 0, 486 S. nutans puhul ). Soojendav töötlus vähendas muudetud sademete töötlemise ajal taimede LWP-d järjepidevalt võrreldes soojendamata taimedega (joonis 1C, D). Selle tagajärjel olid muudetud sademete ja soojendava ravi tagajärjed tõenäoliselt segased, eriti kuna vesi muutus piiravaks (nt juuli ja august). Juuli keskpaiga põua ajal oli taimedel madalam LWP (joonis 1C, D) ja neil olid põua ja kuumastressiga seotud fenotüübid (nt kuivade lehtede servad, lehtede veeremine / voltimine). 19. juulil vihma rakendamine nii ümbritseva keskkonna kui ka muudetud töötluste korral viis LWP taastumiseni 24. juulil (põua taastumine), kuid mitte juunis täheldatud tasemele (joonis 1C, D).

Image

Andropogon gerardii ( A, C ) ja Sorghastrum nutans ( B, D ) lehtede temperatuuri (T- leht ) ja lehtede veepotentsiaali (L , D ) reageerimine soojenemis- ja muudetud sademete töötlemisele viiel proovivõtukuupäeval 2006. aastal. U: soojendamata ; W: soojendatud; AMB: keskkonna sademed; ALT: muutunud sademed. Näidatud on kastikesed keskmise joonega ja ülemise 75 ja alumise 25 protsentiiliga. Vea ribad on variatsiooni 5 ja 95 protsentiilid. Tähed näitavad T- lehe või LWP olulist erinevust erinevate töötluste vahel individuaalse proovivõtmise kuupäeva korral (p <0, 05).

Täissuuruses pilt

Transkriptsiooni ekspressioonimustrid vastusena T- lehele, LWP-le ja nende vastasmõjule kasvuperioodil

Suure läbilaskevõimega regressioonianalüüs näitas, et A. gerardii ja S. nutans lehekoes sisalduvate ärakirjade koopia arvukus varieerus oluliselt T- lehe ja LWP varieerumisega ning T- lehe ja LWP koostoimega proovivõtmise kuupäevade vahel. Et tuvastada neid ärakirju, mis reageerivad eraldi T- lehe ja LWP varieerumisele, tuvastasime kõigepealt ärakirjad, mis olid korrelatsioonis T- lehe ja LWP vastastikmõjuga, ja kui paljud neist vastasid ka proovivõtmise kuupäevale. Väikese arvu transkriptide arv oli korrelatsioonis T- lehe ja LWP interaktsiooniga, A. gerardii (311) puhul oluliselt rohkem kui S. nutans (54; χ 2 = 185, 46, p <0, 0001, joonis 2A, B). ). Nende transkriptide hulgas muutis 67 proovikirjet A. gerardii-s ja 11 transkripti S. nutansis proovivõtmise kuupäeva järgi arvukust (joonis 2A, B).

Image

Lehetemperatuuri (T- leht ) ja leheveepotentsiaali (LWP; interaktsioon), proovivõtmise kuupäeva ning T- lehe ja LWP varieerumise kombinatsiooni mõju Andropogon gerardii ( A, C ) ja A Sorghastrum nutans ( B, D ), mis oli 2006. aastal kokku puutunud soojenemise ja muudetud sademete töötlemisega. Väärtused tähistavad olulises arvukuse muutusega ärakirjade arvu (olulised positiivsed või negatiivsed kalded, q-väärtus <0, 05). Kattuvates piirkondades on näidatud ärakirjade arv, mille üksikute efektide vahel on jagatud muutunud arvukus. Kõigil juhtudel oli arvukuse muutusega transkriptsioonide arv kahe liigi vahel Pearsoni tests 2 testides oluliselt erinev (p <0, 0001).

Täissuuruses pilt

Pärast nende transkriptide arvestamist, mis korreleerusid märkimisväärselt T- lehe ja LWP interaktsiooniga, korreleerus suurem arv transkriptsioone T- lehe varieerumisega S. nutans (593) kui A. gerardii (257, χ 2 = 127, 60, p <0, 0001)., Joonis 2C, D). Väike osa ärakirju korreleerus mõlema liigi LWP varieerumisega (1, 5 vs 0, 1%), kusjuures S. nutansi (101) puhul oli jällegi suurem arv kui A. gerardii (11, χ 2 = 64, 86, p <0, 0001). Joonis 2C, D). A. gerardii puhul ei olnud olulist transkripti taseme muutust, mis oleks korrelatsioonis nii T- lehe kui ka LWP-ga, samas kui 2 ja 31 ärakirja arvukus muutus vastavalt proovivõtu kuupäevaga ja LWP ja T- lehe varieerumisega. S. nutansis muutis 31 transkripti arvukust nii LWP kui ka T- lehega, nende hulgas oli ka 10 transkripti arvukus korrelatsioonis proovivõtmise kuupäevaga. Üksteist ja 76 ärakirja olid korrelatsioonis proovivõtu kuupäeva ja LWP ja T lehe varieerumisega.

Diferentsiaalse transkriptsiooni arvukuse muutused A. gerardii ja S. nutansis vastusena T- lehe, LWP, nende koostoime ja proovivõtmise kuupäeva varieerumisele

Image

( A ) Lehttemperatuuri (T- leht ), lehtede veepotentsiaali ( LWP ) muutumise , nende koostoime (koostoime) ja Andropogon gerardii (mustad tulbad) ning Sorghastrum nutans (hallid tulbad) proovivõtmise kuupäevaga oluliste arvukuse muutusega transkriptide arv ). Kõigil juhtudel oli suurenenud või vähenenud arvukuse muutusega transkriptide arv kahe liigi vahel Pearsoni χ 2 testiga (või Fisheri täpse testiga) oluliselt erinev (p <0, 001). ( B ) Oluliste arvukuse muutustega transkriptide jaotus erinevates funktsionaalrühmades vastavalt MapMani geeni ontoloogiale A. gerardii ja S. nutansis vastusena a (b) lehetemperatuuri (T- leht ), (c, d) muutustele lehevee potentsiaal (LWP), (e, f) T- lehe ja LWP kombinatsioon (interaktsioon) ja (g, h) proovivõtu kuupäev. Down = vähendatud arvukusega transkriptide arv (negatiivne kalle). Üles = suurenenud arvukusega (positiivse kaldega) transkriptide arv vastusena T- lehe suurenemisele ja LWP vähenemisele.

Täissuuruses pilt

Täissuuruses tabel

  1. Lehtede temperatuur

    Kasutades MapMani geeni ontoloogia laiendamist Arabidopsisest maisini, liigitati oluliste arvukuse muutustega ärakirjad suuremateks funktsionaalrühmadeks ja jaotati seejärel konkreetseteks funktsioonideks. Pärast proovide võtmise kuupäevast tingitud statistiliste erinevuste arvestamist korduva regressiooni teel oli A. gerardii transkriptide arv, mis oli korrelatsioonis T- lehe varieerumisega positiivselt (suurendas nende arvukust vastuseks suurenenud T- lehele ) vs negatiivselt (vähendas nende arvukust vastuseks) suurenenud T- leheni ) olid sarnased (vastavalt 99 vs 126; joonis 3A). Seevastu enam kui kaks kolmandikku (383 486-st) S. nutansi transkriptsioonist olid positiivses korrelatsioonis T- lehe variatsioonidega (joonis 3A). Enamik neist määrati MapMani ontoloogiaraku-, DNA-, valgu-, redoksi-, stressi- ja transpordirühmadesse (joonis 3B-b; vt lisa S3, S4). T- lehe varieerumise tõttu muutunud arvukusega transkriptide seitsmest transkriptist, mille funktsioonid on arengus, nukleotiidide metabolism, valkude süntees, redoks ja RNA transkriptsiooni regulatsioon, ilmnes muudetud arvukus nii A. gerardii kui ka S. nutans (vt lisa S5). . Märkimisväärne erinevus nende kahe liigi vahel on see, et rohkem stressi, redoksi ja raku funktsionaalrühmade transkripte muutis nende arvukust S. nutansis, võrreldes A. gerardii-ga , seoses T- lehe suurenemisega (joonis 3B-a, b; Tabel 1). Neid transkripte S. nutans'is esindasid peamiselt mitmesugused kuumašoki valgud (vt lisa S5). Redoksrühmas olid enamus superoksiidi dismutaasi ja askorbaadi peroksüdaasi geenid. Kõik need ärakirjad olid positiivses korrelatsioonis T- lehe varieerumisega (tabel 1). Suurim sisemine valk (MIP) ja Tonoplasti sisemine valk (TIP) ning p- / v-ATPaasid moodustasid suurema osa transkriptidest, mille S. Nutansi transpordirühmas oli muutunud arvukus, mis olid jällegi kõik positiivselt korrelatsioonis T- lehega . Kõik „MIP” alarühma transkriptsioonid olid positiivses korrelatsioonis S. nutansi T- lehega, kuid mitte A. gerardii puhul (tabel 1, vt lisa S5). Sarnaselt korreleerusid signaalimisrühmas kaks A. gerardii kaltsiumi ja kaks G-valkudega seotud transkripti T- lehega, samas kui enamik S. nutansi kaltsiumi, G-valgu, retseptori kinaaside ja fosfinositiididega seotud transkripte olid negatiivsed. positiivselt korrelatsioonis T- lehega, välja arvatud üks ärakiri (fosfinositiidid), mis olid T- lehega negatiivselt korreleeritud (tabel 1, vt lisa S5). Fotosünteesi rühmas korreleerus A. gerardii T- lehega ainult kolm transkripti, üks positiivselt ja kaks negatiivselt, samas kui kolm transkripti olid kõik positiivsed korrelatsioonis S. nutansi T- lehega (tabel 1, vt lisa S5).

  2. Lehtede veepotentsiaal

    Muutused transkriptsioonide arvukuses erinesid oluliselt korrelatsioonis madalama LWP-ga (st negatiivsemaga) nii A. gerardii kui S. nutans puhul (joonis 3A). 9-st ärakirjast, milles A. gerardii arvukuse muutused olid olulised, olid 5 negatiivses korrelatsioonis LWP-ga (st suurenenud arvukus vastusena suurenevale veestressile või madalam LWP; joonis 3B-c) ja need olid peamiselt funktsionaalsetes rühmades DNA, lipiidide metabolismi, valkude ja stressi (vt lisa S3, S6). Seevastu enam kui 80% (51 59-st) S. nutansi muutunud arvukusega ärakirjadest olid positiivses korrelatsioonis LWP-ga (st vähenenud arvukus reageerides suurenevale veestressile, joonis 3A), kõige enam funktsionaalrühmades valk ja RNA, millele järgnevad rühmad, näiteks rakkude, arengu, DNA ja hormoonide metabolism (joonis 3B-d, vt lisa S4, S6). Mõlema liigi arvukuse muutust ei leitud (vt lisa S6). Ükski fotosünteesi funktsionaalrühma transkriptsioon ei näidanud vastust kummagi liigi LWP varieerumisele (tabel 1). Kaks stressi ja transpordi rühmade transkriptsiooni olid kõik negatiivselt korrelatsioonis A. gerardii LWP-ga . Üks signaalide rühma transkriptsioon korreleerus S. nutansis negatiivselt LWP-ga (tabel 1, vt lisa S6).

  3. T- lehe ja LWP koostoime

    A. gerardii puhul oli umbes 65% (159 244-st) transkriptsioonist positiivses korrelatsioonis T- lehe ja LWP interaktsiooniga, samas kui umbes 88% transkriptidest (38 43-st) oli negatiivselt korrelatsioonis T- lehe ja LWP interaktsiooniga. S. nutans (joonis 3A) ja ainult üks ärakiri (Spotid 13430, mille järjestus sarnanes 41% -lise riisivalguga Osr40c1 valguga) näitas vähenenud arvukust mõlemas liigis (vt lisa S7). A. gerardii puhul oli enamus DNA, valgu ja RNA sünteesi rühmade transkripte korrelatsioonis LWP ja T- lehe vastastikmõjuga (joonis 3B-e, vt lisa S7). S. nutansi muutunud arvukusega transkriptide väike arv oli hajutatud erinevate funktsionaalrühmade vahel (nt rakusein, DNA, hormoonide metabolism, valkude ja RNA-d), milles enamus valgu ja RNA sünteesi rühmade transkripte oli arvukuses vähenenud (Joonis 3B-f, vaata lisa S7). Ükski fotosünteesi funktsionaalrühma transkriptsioon ei vastanud S. nutansis LWP ja T- lehtede muutumise kombineeritud toimele, samal ajal kui üks A. gerardii transkriptsioon oli positiivselt korrelatsioonis kombineeritud efektiga (tabel 1). Funktsionaalrühmade, nagu redoks, signaalimine, stress ja transport, transkriptsioonid näitasid sarnast regulatsiooni, kuna transkriptide arv suurenes S. nutansi (1 vs 1) ja A. gerardii (14 vs 9) arvukuse vähenemisega võrreldes (tabel 1, vaata lisa S7).

  4. Proovide võtmise kuupäev

    Proovide võtmiseks valiti viis kuupäeva (kaks juuni, kaks juuli ja üks augusti kuupäev), mis hõlmasid suurema osa kasvuperioodist (juuni algusest augusti keskpaigani). Suur osa muudatuste ärakirja arvukuses oli tingitud proovivõtmise kuupäevast (joonis 3A). Mõlema liigi muudetud arvukusega transkriptide hulgas oli suurenenud või vähenenud arvukusega transkriptide arv sarnane: 501 vs 613 A. gerardii puhul , 995 vs 736 S. nutans puhul (joonis 3A). Pärast proovivõtmise kuupäeva muutunud arvukusega transkriptid jagunesid sarnastesse rühmadesse kahe rohuliigi osas, näiteks rakk, areng, DNA, valk, RNA, transport (joonis 3B-g, h, vt lisa S8). Proovikuupäevale reageerimisel muudetud arvukusega transkriptide hulgas oli A. gerardii ja S. nutans'is levinud 159 ärakirja, millest enamik jaotati valgu, transpordi, RNA ja DNA rühmadesse (joonis 3B-g, h vt lisa S8).

Vastulausete arvukuse vastus põua lühiajalisele taastumisele

Kahe rohuliigi lühiajalise põua taastumise reageerimise hindamiseks kasutati ärakirju arvukuse erinevusi kahe juulis võetud proovikuupäeva vahel, kuna põua stressi oli teisel proovivõtupäeval suuresti leevendanud oluline sademete hulk nii ümbritsevale keskkonnale kui ka muudetud ravi. A. gerardii ja S. nutans taastavad lehevee seisundi kiiresti pärast vee puudujääki (joonis 1), seetõttu võimaldas lühike taastumisaken minimeerida muid abiootilisi ja biootilisi muutujaid. S. nutansi puhul muudeti 1639 transkripti (välja arvatud 1829 transkripti, mille arvukuse muutused proovivõtu kuupäeva koostoimel ja sademete muutumisel olid olulised), oli kahe proovivõtmise kuupäeva vahel arvukus märkimisväärselt muutunud - 901 vähenes (vähenes ekspressioon teisel kuupäeval) ja 738 suurenes külluses. Kuid A. gerardii põua (18. juuli) ja taastumise (24. juuli) kuupäevade vahelises arvukuses oli märkimisväärselt muutunud ainult 42 ärakirja (va 3898 ärakirja, mille arvukuse muutused proovivõtmise kuupäeva ja muudetud sademete vahel olid märkimisväärsed). Ainult viiel oli 24. juuli kuupäeval vähendatud arvukus võrreldes 18. juuli kuupäevaga, märkides juurde kolm ärakirja (vt lisa S9). S. nutansi muudetud arvukusega transkriptide suur arv jaotati laias valikus funktsionaalsetes rühmades, nt raku-, DNA-, valgu-, RNA-, signaali- ja stressirühmades (joonis 4A, vt lisa S9). Suurenenud või vähenenud arvukusega transkriptide arv oli sarnane, välja arvatud valgu- ja RNA-rühmades, kus suurenes rohkem transkriptide arvukust (joonis 4A). Rohkemate ümberkirjutuste arv redoksi, stressi ja transpordi rühmas vähenes S. Nutansi põuast taastumisel (47 vs 20). Nende hulka kuulusid askorbaatperoksüdaasi, tioredoksiini, HSP-de, DNA J-sarnaste valkude ja metaboliitide transportijatega seotud ärakirjad (vt lisa S9). Transkriptid, mille arvukus A. gerardii varieerus, kuulusid sellistesse rühmadesse nagu rakk, valk, RNA ja signaalimine, millest enamus suurenes (joonis 4B).

Image

Transkriptide jaotus peamistes funktsionaalrühmades vastavalt MapMan geeni ontoloogiale, kus ( A ) Sorghastrum nutans ja ( B ) Andropogon gerardii lehekoes on arvukuse oluline muutus vastusena juuli keskpaiga põuaperioodist taastumisele. Positiivsed arvud näitavad suurenenud arvukusega transkriptide arvu (positiivne kalle) ja negatiivsed arvud näitavad vähendatud arvukusega transkriptide arvu (negatiivne kalle).

Täissuuruses pilt

A. gerardii ja S. nutansi põua taastumise ajal tehtud transkriptsioonitaseme muutuste võrdlus nende koopiatega , mis korreleerusid märkimisväärselt LWP varieerumisega (hooajaline põud), näitas, et ei olnud ühtegi ärakirja, mis muutuks arvukuses sarnaselt nii pikaajaliselt muudetud pinnases niiskustingimused ja lühiajaline põua taastumine A. gerardii . Siiski mõjutasid S. nutansi pikaajaline põud ja lühiajaline taastumine 11 transkripti arvukust (vt lisa S9) ja need olid hajutatult erinevate funktsionaalrühmade vahel (vt lisa S9).

Mikrokiibi tulemuste valideerimine qRT-PCR abil

Mikrokiibi katse tulemusi kinnitati iga liigi üheksa erinevalt ekspresseeritud geeni qRT-PCR abil (CB833735, CD651724, CB380843, CB833708, CD568792, DV622645, CD001262, DV621372 mõlema liigi puhul ja DV551311 A. gerardii puhul ; CD001612 S. nutans puhul). ; vaata lisa S2). Valitud kloonide ekspressioonimustris (arvukuse suurenemises või vähenemises) saadi püsivad tulemused. Ehkki kahe meetodi vahel täheldati transkriptsiooni kogunemise suhtelise koguse mõningast varieerumist, olid need kaks üldiselt korrelatsioonis (p = <0, 0001, rho = 0, 481) A. gerardii proovides (p = <0, 0001, rho = 0, 559), ja S. nutansi proovides (p = 0, 0003, rho = 0, 418, vt lisa S10).

Arutelu

Nagu ennustatud, leidsime, et A. gerardii ja S. nutans erinesid märkimisväärselt transkriptsioonivastuste korrelatsioonis T- lehe ja LWP hooajaliste erinevustega ning nende kombineeritud koostoimega välitingimustes. S. nutansis oli suurem arv ärakirju, mis üldises arvukuses muutusid, kusjuures enamus ärakirju olid korrelatsioonis kuupäeva ja T- lehe variatsioonidega (joonis 2). Seevastu näitas A. gerardii sarnast transkriptide arvu, mis muutis arvukust (nii positiivset kui ka negatiivset) T- lehe varieerumisega ning T- lehe ja LWP kombineeritud varieerumisega, vähesed reageerisid LWP-le. Huvitav on see, et proovivõtmise kuupäev avaldas suurimat mõju nii A. gerardii kui ka S. nutansi ärakirjadele. See näitab, et mõlemad liigid muudavad oma geeniekspressiooni vastavalt abiootiliste ja biootiliste tingimuste muutumisele kogu kasvuperioodil, sõltumata kliimamuutuste raviviisidest. Ehkki nendes taimedes on seda lehe lehtede küpsemisest ja üksteisest raske eristada, üritasime seda kontrollida, valides morfoloogiliselt ja arengu poolest sarnased isikud (vegetatiivsed, kõigil 3–5 lehte) igal proovikuupäeval. T- lehtede ja LWP-vastastiktoimega korreleerunud transkriptide hulgas vähenes enamus neist S. nutansi arvukuses, samas kui A. gerardii puhul arvukus suurenes (joonis 3). Hooaja keskel kestnud põua taastumise perioodil ilmnesid A. gerardii ja S. nutans taas diferentsiaalse vastusega, mille jooksul varieerusid S. nutansi tuhandete ärakirjade tasemed, võrreldes vähem kui 50 ärakirjaga, millel oli A. gerardii oluliselt muutunud tase . (Joonis 4, lisa S9), millest võib järeldada, et S. nutans oli põuaolude suhtes tundlikum ja reageeris põua leevendamisele rohkem kui A. gerardii . Transkripti vastuste diferentsiaalse korrelatsiooni leidmine T- lehe ja LWP-ga, nii hooajaliselt kui ka hooaja keskel toimuva põua taastumise perioodil, on kooskõlas varasemate uuringutega, mis näitavad tõendusmaterjali vastuste erinevuste tundlikkust temperatuuri ja vee kättesaadavuse kohta A-s. gerardii 9 ja ökofüsioloogilised vastused A. gerardii ja S. nutansi samade isendite kohta proovisid samaaegselt 37 ja teistes katsetes 30 .

Samuti täheldasime erinevaid üles- ja allareguleerimise mudeleid ning leiti, et A. gerardii ja S. nutansi arvukuses on erinevad transkriptide funktsionaalsed rühmad muutunud. Pealegi oli harva märkimisväärselt reageerinud transkriptide identiteedis kahe liigi kattuvus (joonis 3; lisa S3, S4). Nende kahe liigi vahel täheldati mitmete funktsionaalrühmade erinevat regulatsiooni vastusena kõrgema T- lehe ja madalama LWP kombinatsioonile (enamikul A. gerardii transkriptidel oli suurenenud transkriptsiooni arvukuse tase vs S. Nutans'i vähenenud arvukuse tase), LWP (madalam) LWP, mis on seotud transkriptide suurenenud arvukusega ainult S. nutansis ), T- leht (kõrgem T- leht, mis on seotud transkriptide suurenenud arvukusega ainult S. nutansis ) ja põua taastumisperiood ( A. gerardii mulla suurema niiskusega seotud transkriptide suurem arvukus) . Neid suuri erinevusi täheldati eeskätt transkriptides, mis on seotud erinevat tüüpi protsessidega, nagu näiteks rakk, glükolüüs, valk, redoks, RNA, signaalimine, stress, transport. Vastupidiselt meie ootustele täheldasime vastupidiselt fotosünteesiga seotud transkriptide vähe vastuseid ja kui olulisi vastuseid oli, olid need enamasti seotud T- lehe, mitte LWP varieerumisega. Teised uuringud on näidanud, et fotosünteesiga seotud geenid võivad põua taastumisel reageerida mitmetes taimesüsteemides üle 40 . Varasemad uuringud A. gerardiiga leidsid paljude fotosünteesiga seotud geenide alareguleerimise hooajaliselt kestvaks põuaks 10 . Fotosünteesiga seotud geenide reageerimise puudumine meie uuringus võib olla seotud eksperimentaalse ravi suhteliselt peene olemusega ja ekstreemse vee- või temperatuuristressi puudumisega uuringuperioodil.

Erinevad regulatsioonimustrid, eriti stressireaktsioonis osalevate geenide osas, viitavad sellele, et kaks liiki võivad kasvavate temperatuuride ja veestressi ning nende koosmõjude ilmnemisel põllul toimetulemiseks ja / või neile reageerimiseks kasutada erinevaid strateegiaid. Ehkki nende kahe liigi puhul ei leitud stressitunnetusega seotud transkriptide, näiteks ABA sünteesi raja geenide või transkriptsioonifaktori kaskaadide diferentseeritud regulatsiooni, tuvastasime stressi vältimises osalevate ja kahjustuste ennetamise ja parandamisega seotud geenide diferentsiaalse reguleerimise. Näiteks sahharoosi süntaasi kodeerivaid ärakirju, mis on seotud osmootse kohanemisega stressi vältimiseks 41, leiti A. gerardii puhul ainult LWP-ga seotud suurenenud arvukuses. Antioksüdantsed ensüümid, näiteks glutatioonreduktaas ja superoksiidi dismutaas, ning HSP-d mängivad olulist rolli stressist reageerimisel. Antioksüdantsed ensüümid osalevad üldiselt kahju 42 ja HSP ennetamisel kahjustuste parandamisel, aidates valkude voltimisel ja stabiliseerimisel 43 . Meie uuringus näitasid antioksüdantseid ensüüme ja HSP-sid kodeerivad transkriptid järjekindlat vastuse suurenemist T- lehe suurenemisele S. nutansis , kuid mitte A. gerardii . Nende kahe transkriptide rühma suurenenud tase vastuseks T- lehe suurenemisele S. nutansis viitab sellele, et see rohi võib põhjustada temperatuuristressiga seotud kahjustusi, samas kui A. gerardii ei pruugi stressi tekkida või reageerib stressile erineval viisil, näiteks aklimatiseerumise 44 ja osmootse reguleerimise kaudu.

Akvaporiinide transkriptsiooni arvukuse tasemed muutusid oluliselt ka S. nutans, kuid mitte A. gerardii osas vastusena T- lehe varieerumisele, kus üldiselt oli T- lehe suurenemisega arvukus suurenenud. Taimsed akvaporiinid, mis toimivad vee läbilaskvuse suurendamiseks membraansete veekanalitena, on valkude rühm, mida arvatakse tavaliselt kaasavat stressi vältimisse 45 . Akvaporiine, mida on enamasti uuritud Arabidopsises, on seostatud mitmesuguste abiootiliste stressivastustega, sealhulgas vee, toitainete, külma stressi ja muude biootiliste stressidega. Kuid akvaporiinide reguleerimine stressivastuses on kirjanduses ebajärjekindel. Mõnes uuringus leiti, et ABA ja veestress suurendavad akvapiini transkriptsiooni arvukust 46, 47, teistes aga 47, 48 . Niipalju kui me teame, puuduvad akvaporiinide ja nende alarühmade ning isovormide reguleerimise vastused taimede soojenemisele reageerimine. Sõltumata sellest, akvaporiinide reguleerimine S. nutansis, kuid mitte A. gerardii'is, viitab taas sellele, et S. nutansi üheks strateegiaks temperatuuristressi vältimiseks võib olla akvaporiinide ekspressioonitaseme suurendamine, samas kui A. gerardii puhul see nii ei olnud . .

Üldiselt näitavad T- lehe ja LWP-ga seotud transkriptsiooni arvukuse mustrid koos mõlema liigi ökofüsioloogiliste näitajatega 30, 37, et S. nutans on tundlikum ja reageerib temperatuuride tõusule HSP-de, akvaporiinide suurenenud transkriptsioonide rohkuse tõttu, superoksiidi dismutaas ja askorbaatperoksüdaas. Seevastu näib A. gerardii vähem tundlik temperatuuride ja vee kättesaadavuse muutuste suhtes selles katses. Sarnast transkripti arvukuse muutuste mustrit täheldati mõlema liigi lühiajalise põua taastumise vastuse korral. S. nutansis muutus arvukalt paljude funktsionaalrühmade transkriptide arvukust, sarnaste transkriptide arvuga suurendati või vähendati transkriptide arvukust, samas kui A. gerardii osas muutus arvukuses vähem harva . Me ei saa järeldada, millised liigid reageerivad põua lühiajalisele taastumisele paremini, kuna pole selge, kas mõlemad liigid reageerisid sama kiirusega. Seda tuleks kontrollida mõlema liigi üksikasjalikuma reageerimisega põua taastumisest.

Taime stressist reageerimine on ajaline protsess, mille käigus stressi kõigepealt ära tuntakse ja seejärel võetakse vastu erinevad strateegiad stressi vältimiseks või sellele reageerimiseks, ennetades ja / või parandades kahjustusi. Konkreetsete ärakirjade taseme muutuste võrdlus hooajapikkuse veetressi ja lühiajalise, hooaja keskel kestva põua taastumise perioodil näitas, et 1639 ärakirja, mis muutus põua taastumise perioodil arvukuses, ja 101 ärakirja, mis olid seotud S. nutansi LWP variatsiooni suhtes oli nende kahe vahel tavaline ainult 11. Samamoodi oli kiiresti dehüdreerunud (~ 6 h) odrajuurte võrrelduna järk-järgult dehüdreeritud (~ 7 päeva) odrajuurtega vaid 10% geenidest 49 . See on osaliselt tingitud erinevatest geeniekspressioonivastustest ägeda ja kroonilise stressi korral 50, 51, 52 . Meie uuringus kasvas stress aja jooksul järk-järgult ja hõlmas suure osa kasvuperioodist. See võis võimaldada taimede aklimatiseerumist, mis selgitas kogu kasvuperioodil reguleeritud ärakirjade väikest arvu, võrreldes lühikese põua taastumise perioodil reguleeritud suure ärakirjaga. Ehkki tuhandete ärakirjade koopiad muutusid põuaga taastumise ajal märkimisväärselt, reageeris S. nutansi jaoks muutuvate sademete ja soojenemisprotseduuridega seotud veevarude hooajapikkuse varieerumise korral palju vähem ja väga vähesed ärakirjad olid nende kahe tüübi kohta tavalised. stressist.

Selles uuringus uurisime kaas domineerivate kõrgrohumaade preeria C 4 rohu liikide, A. gerardii ja S. nutans , transkriptsiooniprofiile, mis olid avatud varieeruva vihmasaju režiimi ja kõrgendatud temperatuuri korral välitingimustes. Ehkki meie heteroloogse hübridisatsiooni kasutamisel maisi cDNA mikrokihtidega (mis oli eksperimendi ajal kõige kättesaadavam tehnika) on piiranguid, mis tulenevad fookusliikide ja näidisliikide järjestuse erinevusest 8, 18, 19, kasutasime rangeid kriteeriume nende minimeerimiseks. Esiteks jäeti edasises analüüsis kvaliteedikontrolli käigus täpid, mille signaali ja müra suhe oli alla 10, et vähendada risthübridisatsiooni artefaktide kaasamist 53 . Nende sõeluuringute tulemusel jäi mõlemal liigil statistiliseks analüüsiks umbes 70% taustteabe tuvastamisega transkriptidest (vt lisa S1), mis näitab, et heteroloogiline hübridiseerimine on nende kahe liigi transkriptsiooni regulatsiooni analüüsimiseks teostatav, kaotamata üldistust. Teiseks, iga liigi üheksa transkripti mikrotiivri tulemused olid üldiselt kooskõlas liigispetsiifiliste qRT-PCR tulemustega (vt lisa S10), kinnitades heteroloogiliste hübridisatsioonide käigus täheldatud ekspressioonimuutusi. Lisaks sellele leiti kahes liigis, mis reageerisid meie poolt seatud keskkonnamõjudele, mitmeid märkimisväärselt üles- või allapoole reguleeritud geene, mis on MapMani ontoloogia kohaselt ühised stressivastuseks või kahjustuste parandamiseks. Nende spetsiifiliste muutuste tuvastamine annab kindluse heteroloogiliste hübridisatsioonide tulemuste osas. Lõpuks otsiti selles eksperimendis kasutatud maisi mikrokiibi SAM1.2 (18862 järjestused) cDNA järjestusi A. gerardii ja S. nutansi koondamatute transkriptide andmekogumi (avaldamata andmed) alusel. Kui E-väärtuse piirväärtus oli <1E-10, oli ~ 75% ja 73% sondidest vastavalt üks või mitu tabamust vastavalt A. gerardii ja S. nutans transkriptide andmekogumile. See vastab umbkaudu maisi hübridiseeritud omaduste protsendimäärale (vastavalt 75, 14% ja 78, 60% A. gerardii ja S. nutans puhul). Hübridisatsiooni andmed viitavad sellele, et nende kolme liigi puhul on stressireaktsiooni geenid tõenäoliselt säilinud. RNA-seq meetodid võivad anda täiendava ülevaate geeniekspressioonimuutustest, sealhulgas transkriptidest, mis on konserveeritud liikide lõikes, aga ka liigispetsiifilistest transkriptidest. Ehkki liigispetsiifilised ärakirjad võivad anda ülevaate nende looduslike heintaimede ainulaadsetest kohanemisviisidest, on vähem tõenäoline, et selliste ärakirjade ärakirjaga funktsioon on teada.

Kokkuvõtlikult võib öelda, et selle uuringu kaks fookusliiki , A. gerardii ja S. nutans , domineerivad kõrreliste preeriataimede kooslustes. Nad on fülogeneetilised lähedased sugulased 32, 33, keda peetakse üldiselt ökoloogiliselt ja funktsionaalselt ekvivalentseteks ning samamoodi kohandatud kõrge kuumuse ja põuaga. Kuid meie uuringus leiti, et need rohud erinevad oluliselt transkriptsiooniliste reageeringutega muutuvatele keskkonnatingimustele; need erinevused hõlmasid ärakirjade koopiate arvu, mustrit ja funktsionaalrühmi, mille arvukus muutus olulisel määral vastavalt lehetemperatuuri ja leheveepotentsiaali muutustele. Eelkõige suurendati S. nutansi lehekoes arvukalt stressireaktsiooni ja teiste oluliste funktsioonirühmade (rakufunktsioon, signaalimine, transport) seotud ärakirjade vastust mõlemale vähenevale vee kättesaadavusele (nt LWP hooajal) -pikk stress) ja temperatuuri tõus. Reguleeritavates geenitüüpides ilmnes kahe liigi vahel vähe kattuvust korrelatsioonis lehtede taseme temperatuuri ja veesisalduse muutustega. A. gerardii ja S. nutansi erinev tundlikkus üksikute stressitekitajate suhtes, mis on kooskõlas ökofüsioloogilisel, kogu taime ja kogukonna tasandil täheldatud erineva tundlikkusega (nt 30, 34, 35, 37 ), tähendab, et need kaks omavahel tihedalt seotud liigid võivad keskkonnastressoritega toimetulemiseks ja / või neile reageerimiseks kasutada erinevaid strateegiaid. Nende kaasomandis olevate liikide erinev transkriptoomiline vastus võib mõjutada indiviidi jõudlust (füsioloogilist ja kasvu) ning lõppkokkuvõttes mõjutada kõrgeharilise preeria ökosüsteemi struktuuri ja funktsiooni, kuna need kaks liiki annavad ökosüsteemi funktsioonile ja struktuurile ebaproportsionaalselt 27, 54 . Kuna see uuring viidi läbi valdkonnas, annab see väärtusliku ülevaate mehhanismidest, mida need kaasomandis olevad liigid kasutavad looduslikus keskkonnas. Me arvame, et S. nutansi suurenenud tundlikkus võib kaasa aidata halva kohanemisvõimega plastilisusele 55, mis võib viia A. gerardii suuremasse domineerimisse kogukonnas. Pole teada, kas põua suhtes resistentsete genotüüpide valimine toimus juba selles välikatses, kui isendite proovid võeti, ehkki genotüüpide pikaajalise valiku kohta on tõendusmaterjal 56 . Sõltumata sellest, kas selektsioon toimus, arvame, et nende liikide reageerimisel järkjärgulistele kliimamuutustele on oluline nii plastilisus kui ka valitud genotüüpide erinev reageerimine.

Arvestades, et sademete ja soojenemisprotseduuridega kaasnevad suhteliselt väikesed temperatuurimuutused ja vee kättesaadavus ning temperatuuri ja veetressi mõju on sageli keeruline eristada, on järgmised sammud mõistmiseks, kuidas need kaks rohuliiki erinevad tundlikkuses kliimamuutuste suhtes: kehtestada erinevatel ravitasemetel 57 raskem temperatuur ja veestress ning integreerida proteoomilised ja metaboomilised analüüsid koos järgmise põlvkonna järjestamistehnikate (nt RNAseq) kasutamisega. See võimaldab meil parandada mehaanilist arusaamist temperatuuri tõusmise ja veestressi mõjust kaasomandis olevate heintaimede reageeringutele ja teha kindlaks, kas nende vastustes on läve.

Meetodid

Saidi kirjeldus

Uuring viidi läbi sademete manipuleerimise proovitükkidel (RaMPs) - pikaajalises kliimamuutuste välikatses, mida on rakendatud alates 1998. aastast ja mis asub Konza Prairie bioloogilises jaamas Kirde-Kansases 58 . RaMP-de katse koosneb 12-st asukohast fikseeritud varjualusest (14 × 9 m), mis asuvad üle 6 × 6 m kõrgusel asuvatel kõrgharilistel preeriakruntidel, mis jagunevad neljaks 2 × 2 m suuruseks krundiks, millest kahes on paigaldatud infrapunaküttelambid. The RaMPs shelters allow for the manipulation of growing season precipitation in either an ambient (rainfall immediately applied) or altered pattern (50% increase in time between ambient rainfall events). On average, the altered precipitation treatment reduces volumetric soil moisture by ~15% 58 . Warming treatments (unwarmed, warmed) are nested within the precipitation treatments and are applied year-round to achieve on average a + 2 °C increase in ambient air temperature 58 . Thus, both treatments result in moderate changes in water availability and temperature in the experimental plots.

Focal species and field sampling

We focused on the two co-dominant tallgrass prairie species, A. gerardii and S. nutans , both of which are C 4 grasses that reproduce primarily vegetatively via buds on belowground rhizomes 59, forming dense intermixed stands of tillers (individuals). As clones grow and spread, they sever their root and rhizome connections 60, and as a consequence individual tillers of sufficient distance apart are independent of each other. Because the RaMPs experiment is located in an annually burned area, tillers typically emerge in early-mid April (after burning) and grow vegetatively until mid-July/August when some (but not all) individuals initiate flowering 61 . Individuals typically increase in size vegetatively from mid-Apr to mid- to late-June (unpubl. data). We did not control for plant genotype due to an interest in average species-level response, although this approach can create additional noise in transcriptional response.

We sampled a single tiller of each species within the control (unwarmed) and a randomly selected warmed subplot in paired (based on adjacency) ambient and altered RaMPs. Sampling occurred five times during the growing season in 2006: June 1, June 7, July 18, July 24 and August 22. June 1 was chosen to capture early growing season conditions when water and temperature stress are typically minimal. However, due to less than ideal conditions (lower PAR (photosynthetically active radiation)), June 7 also was chosen to capture early growing season conditions with higher light availability. The two dates in July were chosen specifically to capture a drought and recovery period; the first (July 18) when soil moisture was low and the second (July 24) five days after rainfall events were applied to both the altered and ambient precipitation treatments. Finally, August 22 was chosen to capture late growing season conditions. For each sampling date, morphologically similar vegetative (non-flowering) tillers (3–5 fully expanded leaves) of each species were identified in each of the subplots. At each sampling date, one individual of each species was selected from each replicate plot subjected to the precipitation (n = 2, ambient, altered) and warming (n = 2, control, warmed) treatments, for n = 2 species × 4 treatment combinations × 3 replicates per treatment combination = 24 individuals per five sample periods, n = 120 total. Because timing discrepancies may affect gene expression 12, leaf tissue was collected from individuals located in paired ambient and altered RaMPs within five minutes of each other. The first or second fully expanded leaf was randomly selected for genomic analysis from each individual to ensure leaves had finished developing but were not old enough to be senescing or have reduced cellular activity. The entire leaf was clipped and immediately flash-frozen and stored in liquid nitrogen until brought to the laboratory. Immediately after collection of the first leaf, we measured leaf surface temperature (T leaf ) on the remaining leaf, as part of intensive physiological measurements reported elsewhere (see Nippert et al . 37 ). The whole leaf was then collected for determination of leaf water potential (LWP) using a Scholander-type pressure chamber (PMS Instruments, Inc., Corvallis, OR, USA). LWP reflects the xylem pressure required to continue the flow of water from roots to leaves, where more negative water potentials generally represent plant water stress. We focused on T leaf as an indicator of the warming treatment and temperature stress, as it is highly correlated with canopy temperature 37 and was significantly elevated in response to the warming treatment (Fig. 1A, B). Focusing on LWP as an indicator of the precipitation treatment and water stress was due to its highly correlation with soil water content at 25, 50 and 75 cm (r = 0.64, 0.61 and 0.57, respectively, with p-values < 0.0001), which was measured on a bi-weekly basis with neutron probes located in the warmed and unwarmed subplots within each RaMP. In addition, LWP was significantly reduced with the altered precipitation treatment (Fig. 1C, D). The ranges of both T leaf and LWP captured included levels considered stressful and potentially inhibitory for ecophysiology for the two species 30 .

Mixed-model ANOVAs were implemented in SAS (SAS/STAT Software version 9.1.3, SAS Institute, Cary, NC, USA) to assess the effects of sampling date (five dates during the growing seaon) and the precipitation (ambient, altered) and warming (control, warmed) treatments on T leaf and LWP between the two grass species (Fig. 1). Precipitation was treated as a fixed effect, with warming treated as a random effect nested within precipitation. Sampling date was treated as a random effect.

RNA preparation and microarray hybridization

Leaf tissue samples were stored in an −80 °C freezer for less than one year prior to RNA extraction. Total RNA was extracted from each of the 240 leaf samples (two species) using TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 62, and purified with the RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). RNA quantity was measured by a NanoDrop spectrophotometer (Nanodrop products, Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). The verification of RNA quality, preparation of cDNA, and subsequent steps leading to hybridization and array scanning were performed by the Keck Biotechnology Resource Facility at Yale University (//keck.med.yale.edu/). We used maize spotted cDNA arrays (SAM 1.2, GEO platform GPL4521) produced by the Center for Plant Genomics at Iowa State University for hybridization. The arrays included 15, 680 maize cDNA clones (14, 118 informative) isolated from maize ear tissue. The sample pairing for microarray hybridization followed Design C of Milliken et al . 63, in which pairs were assigned within a level (ambient vs. altered precipitation) of the whole plot treatment and across levels (unwarmed vs. warmed) of the subplot treatment.

Quality control of heterologous hybridizations

In total, there were hybridizations for 47 leaf samples of A. gerardii and 49 leaf samples of S. nutans . Some samples had to be discarded due to low RNA quality. Array image data were collected using GenePix software (Version 6, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA) and normalized using the ratio of medians. Prior to the normalization, features with obvious abnormality and saturated signal were flagged as uninformative and excluded from statistical analysis. Because the signal intensity of some spots was low as a consequence of the heterologous hybridization, stringent criteria concerning signal to noise ratios were applied during quality control of the images. Features with signal to noise ratios (for both channels, 635 nm and 532 nm) less than 10 were excluded from further normalization. After quality control (see Appendix S1 in Supporting Information), there were 10, 607 features in total for further analysis for A. gerardii , while 11, 095 features were included for S. nutans , among which 10, 329 were common for both species. Considering the different hybridization efficiencies (Appendix S1), we focused the following statistical analysis on only the common features of A. gerardii and S. nutans , discarding 278 unique transcripts from A. gerardii and 766 from S. nutans .

Statistical analysis of microarray data

The microarray data were analyzed for each species separately using high-throughput regression 9 to assess how gene expression varied among individual plants as a consequence of altered precipitation and temperatures over the entire growing season. Specifically, multiple regression analysis was used to capture the linear relationship between gene expression levels, as the dependent variable, and T leaf, LWP, together with their interaction, and date (representing the five sampling dates) as the independent variables. The inclusion of date was used to distinguish responses of the transcriptome that are due to changes in temperature or water availability from those due to sampling time. Prior to regression analysis, the microarray data were normalized following Travers et al . 9 .

Regression analysis was conducted for each species separately with the residuals from the normalization analysis. Data was subset so only the common hybridized features (10, 329) represented by all five sampling dates were included in the regression analyses: 10, 309 (99.8% of the common hybridized features) features in total for both species. Statistical significance of either positive (increased transcript abundance associated with higher T leaf or decreased transcript abundance associated with lower LWP) or negative (decreased transcript abundance associated with higher T leaf or increased transcript abundance associated with lower LWP) slopes was tested against the null hypothesis that the slope was zero. Significant differences in the number of transcripts with abundance change in response to T leaf, LWP, their interaction, and sampling date between the two species were tested by Pearson χ 2 test.

To assess genes responding to drought vs. recovery, we subsetted the data focusing on the two sampling dates in July. Specifically, mixed-model ANOVA was used to assess alteration of transcript levels under drought conditions (July 18) vs. drought recovery (July 24). There were 8, 662 and 10, 776 (82% and 97% of hybridized features) transcripts analyzed for A. gerardii and S. nutans respectively, among which 7869 features were common for both species. Similarly, we focused on these common features in the drought-recovery analysis. The normalized expression data (residuals from the normalization analyses above) were used as the dependent variable, with precipitation and warming treatments, sampling date and their interactions as independent variables (fixed effects), and RaMP as random effect.

The normalization analyses, high-throughput regression analyses, mix-model ANOVA for drought recovery evaluation, and Pearson χ 2 test were implemented in SAS (version 9.1.3). For regression analyses and mix-model ANOVA, statistical significance was further evaluated using the q-statistic to control the experiment-wise false discovery rate (FDR) 64 . A q-value of less than 0.05 was chosen to identify significant changes in transcript levels. The transcripts with significant abundance changes were grouped into major functional groups using an extension of MapMan gene ontology 65 to maize using protein sequence identity to Arabidopsis.

Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)

We used qRT-PCR to validate the microarray results for the same RNA samples used in the heterologous hybridization (see Appendix S2). Because leaf tissue of A. gerardii and S. nutans was often limited and a relatively large amount of RNA was utilized for the microarray hybridizations, RNA samples were not available for qRT-PCR analysis for all individuals or for all sampling dates. Therefore, we focused on only those sampling dates in which there were adequate samples available for a subset of individuals (June 7 and July 18 for A. gerardii , June 7 and August 22 for S. nutans ). Nine annotated transcripts with significant response to variation in LWP or T leaf according to microarray analysis and which have been shown to be involved in stress response (eg, superoxide dismutase, HSP 90) were selected and cloned (Appendix S2). Expression levels of these transcripts were analyzed for each species with qRT-PCR, with β-tubulin and Elongation factor (EF) 1α as the internal standard for A. gerardii and S. nutans , respectively. The range of the primer amplification efficiency was between 90% and 98%, and correlation coefficiency was between 99.1% and 100.0% as determined by serial dilution of cDNA templates.

Additional Information

How to cite this article : Smith, MD et al . Gene expression patterns of two dominant tallgrass prairie species differ in response to warming and altered precipitation. Sci. Rep . 6, 25522; doi: 10.1038/srep25522 (2016).

Liitumised

Gene Expression Omnibus

  • GSE35492

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.