Foksotranskriptsioonifaktorist sõltuv p15ink4b ja p19ink4d ekspressioon | onkogeen

Foksotranskriptsioonifaktorist sõltuv p15ink4b ja p19ink4d ekspressioon | onkogeen

Anonim

Abstraktne

FOXO (Forkhead box O) transkriptsioonifaktorid osalevad rakutsükli peatamises või apoptoosi esilekutsumises vastavalt rakutsükli inhibiitori p27 KIP1 või apoptoosiga seotud geenide transkriptsiooni abil. Akt / proteiinkinaas B soodustab rakkude vohamist ja pärsib apoptoosi osaliselt fosforüülides FOXO-sid. Fosforüülitud FOXO-del ei olnud tuumaekspordi tõttu võimalik transkriptsioonilist aktiivsust. Siin näidatakse, et p15 INK4b ja p19 INK4d transkriptsioon on seotud FOXO-vahendatud Gl-rakutsükli peatamisega. Akt-signaali ülekande pärssimine PI3K inhibiitorite, PDK1 inhibiitori või dominantnegatiivse Akt-transfektsiooni abil suurendas p15 INK4b ja p19 INK4d ekspressiooni, kuid mitte p16 INK4a ja p18 INK4c . Metsiktüüpi või aktiivse FOXO, kuid mitte inaktiivse vormi emakaväline ekspressioon suurendas ka p15 INK4b ja p19 INK4d taset. FOXO-d seondusid promootorpiirkondadesse ja indutseerisid nende geenide transkriptsiooni. INK4b - / - või INK4d - / - hiire embrüonaalsetes fibroblastides ei täheldatud PI-K inhibiitori LY294002 vahendatud Gl-arreteeritud rakupopulatsiooni suurenemist. Kokkuvõtlikult võib öelda, et FOXO-d osalevad p1 INK4b ja p19 INK4d transkriptsiooni kaudu Akt-i inaktiveerimise põhjustatud G1 peatamises.

Sissejuhatus

Akt (tuntud ka kui proteiinkinaas B, PKB) signaaliülekande rada kontrollib paljusid raku funktsioone, näiteks rakkude ellujäämist, rakutsükli kulgu, rakkude proliferatsiooni, apoptoosi pärssimist, valkude sünteesi ja glükoosi metabolismi (Matsushima-Nishiu et al., 2001; Tsuruo) et al., 2003; Katayama jt, 2005). On teada, et suur arv vähktõbe aktiveerib seda rada aberrantselt, põhjustades vähirakkude ellujäämist ja vohamist. Selle raja aktiveerimine sõltub tavaliselt kasvufaktori stimuleerimisest. Kasvufaktorid aktiveerivad fosfatidüülinositiid-3-OH kinaasi (PI3K) ja viivad seejärel 3-fosfoinositiidist sõltuva proteiinkinaasi 1 (PDK1) ja Akt värbamiseni plasmamembraanil (Vanhaesebroeck ja Alessi, 2000; Tsuruo jt, 2003). PDK1 ja muud kinaasid muudavad Akt inaktiivsest vormist fosforüülimise teel aktiivseks vormiks.

FOXO (nimetatud Forkhead box O nime all) transkriptsioonifaktorid, nagu FOXO1a, FOXO3a ja FOXO4 (vastavalt tuntud ka kui FKHR, FKHRL1 ja AFX), tuvastati inimese kasvajate kromosomaalsetes murdepunktides (Woods and Rena, 2002). FOXO-d on Akt-i fosforüülimise otsesed sihtmärgid ja Akt reguleerib neid negatiivselt (Brunet jt, 1999; Woods ja Rena, 2002). FOXO-de Akt-sõltuv fosforüülimine põhjustab nende tsütoplasmaatilist lokaliseerumist, võib-olla seostatuna 14-3-3 valguga, ja suutmatust näidata nende geeni transkriptsioonilist aktiivsust (Brunet et al., 1999; Woods ja Rena, 2002). On väidetud, et FOXO-d osalevad apoptoosi esilekutsumises või rakutsükli peatamises seotud geenide transkriptsiooni teel (Medema jt, 2000; Rokudai jt, 2002; Stahl jt, 2002; Suhara jt, 2002).

Eukarüootset rakutsükli progresseerumist reguleerib ja soodustab tsükliinist ja tsükliinist sõltuvast kinaasist (CDK) koosnevate faasispetsiifiliste kinaasikomplekside aktiivsus. Tsükliini D – CDK4 / 6 kompleksid soodustavad keskmist G 1 faasi ja seejärel tsükliini E – CDK2 kompleks soodustab G 1 faasi. CDK inhibiitorid (CKI) koosnevad INK4 ja CIP / KIP perekondadest ja kutsuvad esile tsükli peatamise, blokeerides tsükliini-CDK komplekside aktiivsust (Sherr ja Roberts, 1995; LaBaer et al., 1997). INK4 perekond (p16 INK4a , p15 INK4b , p18 INK4c ja p19 INK4d ) seob ja pärsib spetsiifiliselt tsükliini D – CDK4 / 6 komplekse, samas kui CIP / KIP perekond (p21 CIP1 , p27 KIP1 ja p57 KIP2 ) seob ja pärsib tsükliini E – CDK2 kompleks, samuti muud tsükliini – CDK kompleksid, mis töötavad kogu rakutsükli vältel. Vaiknevates rakkudes on CKI-sid üle tsükliini-CDK komplekside, seega hoitakse rakke prolifereerumata olekus. Seetõttu on CKI-d proliferatsioonivastaste signaalide, rakutsükli peatamise, DNA parandamise, terminaalse diferentseerumise ja vananemise kriitilised vahendajad.

10. kromosoomis (PTEN) kustutatud tuumori supressorigeeni produkti fosfataas ja tensiini homoloog on lipiidfosfataas. PTEN inhibeerib PI3K funktsiooni ja hoiab ära PDK1 ja Akt värbamise plasmamembraanile, põhjustades Akt signaaliraja inaktiveerimise. On teatatud, et PTEN adenoviiruse transduktsioon PTEN-puudulikesse HEC-151 rakkudesse soodustab p15 INK4b mRNA ekspressiooni DNA mikrokiibi ja pöördtranskriptsiooni (RT) –PCR analüüsides (Matsushima-Nishiu et al., 2001). Siiski pole teada, kas p15 INK4b valk on tegelikult kaasatud G1 peatamisse ja kuidas Akt signaalirada reguleerib p15 INK4b ekspressiooni. Selles uuringus näitasime, et FOXO transkriptsioonifaktorid transkripteerivad mitte ainult p15 INK4b, vaid ka p19 INK4d geene. Lisaks ei suutnud PI3K inhibiitor LY294002 põhjustada G1 seiskumist p15 INK4b - või p19 INK4 - hiirest saadud embrüonaalsetes fibroblastides ( INK4b - / - või INK4d - / - hiire embrüonaalsed fibroblastid (MEF)). Seega on FOXO-vahendatud p15 INK4b ja p19 INK4d transkriptsioon seotud Akt pärssimisest põhjustatud Gl-rakutsükli peatamisega.

Tulemused

Akt pärssimine põhjustab G1 seiskumist p15 INK4b ja p19 INK4d ekspressiooni ülesreguleerimise kaudu

INK4 perekonna valgu ekspressiooni reguleerimise selgitamiseks Akt signaali abil uurisime kõigepealt INK4 perekonna valgu ekspressiooni muutust enne ja pärast 293T rakkude töötlemist 24 tunni jooksul PI3K inhibiitori Wortmannin või PDK1 inhibiitori tselekoksiibiga. Kooskõlas eelnevate aruannetega (Sherr ja Roberts, 1995; Medema jt, 2000), pandi K27 ekspressiooni ülesreguleeritud Akt signaali pärssimist (joonis 1a). Lisaks täheldasime p15 INK4b ja p19 INK4d valgu järsku suurenemist, samal ajal kui Akt signaali pärssimine ei näidanud mingit mõju p16 INK4a ja p18 INK4c valgu tasemele (joonis 1a). Nende leidude kinnitamiseks ravisime 293T, HepG2 ja Raji rakke 24 tunni jooksul teise PI3K inhibiitoriga LY294002. Western bloti ja RT-PCR analüüs näitas selgelt, et PI3K inhibeerimine LY294002 poolt põhjustas p15 INK4b ja p19 INK4d valkude ja mRNA ekspressioonid igas rakuliinis (joonised 1b ja c). LY294002 ei mõjutanud p16 INK4a ja p18 INK4c ekspressioonitaset.

Image

Akt signaaliülekande pärssimine põhjustab G1 seiskumist p15 INK4b ja p19 INK4d ekspressiooniga. ( a ) 293T rakke töödeldi ainult söötmega (jätkub), 100 n M Wortmanniniga (Wort.) või 50 μM tselekoksiibiga (Celeco.). Pärast 24-tunnist töötlemist eraldati tuuma lüsaadid ja neile viidi läbi Western blot analüüs näidatud antikehadega. ( b ) 293T, HepG2 ja Raji rakke töödeldi (+) või ilma (-) 50 μM LY294002-ga 24 tundi ja seejärel analüüsiti Western blot-analüüsi abil, nagu on kirjeldatud punktis ( a ). Tärn tähistab taustriba. ( c ) 293T, HepG2 ja Raji rakke töödeldi (+) või ilma (-) 50 μM LY294002-ga 6 tundi ja seejärel analüüsiti RT-PCR abil. ( d ) 293T rakke töödeldi 24 tunni jooksul (+) või ilma (-) 50 μM LY294002-ga ja seejärel sadestati tuuma lüsaatidest CDK4 või CDK6 valk. CDK4 ja CDK6 aktiivsusi analüüsiti in vitro kinaasi testiga, kasutades substraadina rekombinantset C-terminaalset Rb. ( e ) 293T, HepG2 ja Raji rakke töödeldi 24 tunni jooksul (LY294002) või ilma (kontroll) 50 μM LY294002-ga. Rakulise DNA sisaldus määrati voolutsütomeetria abil. G 1 faasi protsent on kolme sõltumatu katse keskmine (sisestus). CDK, tsükliinist sõltuv kinaas; RT, pöördtranskriptsioon.

Täissuuruses pilt

Kuna INK4 perekonna valgud seovad spetsiifiliselt tsükliin D – CDK4 / 6 komplekse ja inhibeerivad neid, võib Akt-i signaaliraja pärssimine põhjustada rakutsükli seiskumist. Me kinnitasime CDK4 ja CDK6 kinaasi aktiivsust enne ja pärast 293T rakkude töötlemist LY294002-ga. In vitro kinaasi test näitas, et LY294002 reguleeris nii CDK4 kui ka CDK6 kinaasi aktiivsust, kuna retinoblastoomi (Rb) valgu CDK4 / 6-vahendatud fosforüülimist vähendas LY294002 ravi võrreldes raviga (joonis 1d). LY294002 mõju uurimiseks rakutsükli kulgemisele viisime läbi voolutsütomeetria. Kui 293T, HepG2 ja Raji rakke töödeldi LY294002-ga 24 tundi, täheldati igas rakuliinis Gl-peetud rakupopulatsiooni suurenemist (joonis 1e). Need tulemused viitavad sellele, et Akt-signaaliülekande raja allasurumine PI3K ja PDK1 inhibiitorite poolt võib põhjustada p1 INK4b ja p19 INK4d ekspressiooni ülesreguleerimise kaudu Gl seiskumist .

FOXO-d võimendavad p15 INK4b ja p19 INK4d transkriptsiooni

Järgmisena demonstreerisime p15 INK4b ja p19 INK4d ülesreguleerimist, pärssides spetsiifiliselt Akt signaaliülekande rada. Pärast metsiktüüpi (WT) - või dominantnegatiivsete (AAA) - akt cDNA-de transfekteerimist 293T või HepG2 rakkudesse uurisime INK4 perekonna mRNA-de ja valkude ekspressioonitasemeid RT-PCR ja Western blot analüüsi abil. P15 INK4b ja p19 INK4d geenide mRNA tasemed tõusid AAA- akt transfektantides, võrreldes tühjade vektori transfektantidega (Mock) (joonis 2a). Seevastu need mRNA tasemed olid WT- akt- transfekteeritud rakkudes alareguleeritud. Mõlemas transfektandis ei täheldatud p16 INK4a ega p18 INK4c mRNA taseme muutust (joonis 2a). Paralleelselt nende tulemustega avastasime p15 INK4b ja p19 INK4d valgu ekspressiooni suurenemise AAA- akt- transfektantides ja nende valgu ekspressiooni vähenemist WT- akt- transfektantides (joonis 2b).

Image

Akt ja FOXO-de kaasamine p15 INK4b ja p19 INK4d ekspressiooni. ( a ja b ) 293T ja HepG2 rakud transfekteeriti pFLAG-CMV-2 vektoriga, mis ei kodeeri ühtegi (Mock) või WT- või AAA-Akt. Pärast 24-tunnist transfektsiooni viidi läbi RT – PCR ( a ) või Western blot ( b ) analüüs, nagu on kirjeldatud joonisel 1. Tärnid tähistavad taustariba. ( c ja d ) 293T rakud transfekteeriti pcDNA3 vektoriga, mis ei kodeeri ühtegi (Mock) või WT-, AAA- või HR-FOXO1a / 3a. Pärast 24-tunnist transfektsiooni viidi läbi RT – PCR ( c ) või Western blot ( d ) analüüsid, nagu eespool kirjeldatud. Tärnid tähistavad taustaribasid. CMV, tsütomegaloviirus; FOXO, kahvelpea kast O; RT, pöördtranskriptsioon; WT, metsik tüüp.

Täissuuruses pilt

FOXO-d on Akt-i signaaliraja transkriptsioonifaktorid allavoolu ja inaktiveerivad seda fosforüülimisest sõltuvas tsütoplasmaatilises translokatsioonis (Brunet et al., 1999; Woods ja Rena, 2002). Selle nähtuse kinnitamiseks viisime läbi Western blot analüüsi, kasutades tühja vektori (Mock) või WT- või AAA- akt- transfektantide tsütoplasmaatilisi ja tuuma lüsaate. Nii FOXO1a kui ka FOXO3a tuumaekspressioon vähenes WT- akt- transfektantides võrreldes imiteeritud transfektantidega, samas kui AAA- akt- transfektantides suurenes mõlema valgu tuumaekspressioon (täiendav joonis S1). Järgmisena, et hinnata FOXO-de ja p15 INK4b või p19 INK4d geeni ekspressiooni vahelist seost, jälgisime p15 INK4b ja p19 INK4d mRNA ja valgu ekspressioone WT-s või muteeritud FOXO1a või FOXO3a ekspresseerivates rakkudes. Katsetes kasutasime FOXO-de aktiivset vormi (AAA, mutandil puuduvad kolm Akt fosforüülimise saiti tuumaekspordi jaoks) ja inaktiivset vormi (HR, mutandil puudub transkriptsioonivõime, kuna ta pole võimeline DNA-ga seonduma). WT- või AAA-FOXO-de üleekspressioon 293T-rakkudes kutsus esile p15 INK4b ja p19 INK4d mRNA ja valgu ekspressioonid (joonised 2c ja d). Kuna HR-FOXO1a ega HR-FOXO3a ei mõjutanud p15 INK4b ja p19 INK4d mRNA ja valgu ekspressioone (joonised 2c ja d), näisid FOXO1a ja FOXO3a transkriptsioonilised aktiivsused ekspressioonide jaoks olulised. FOXO ekspressioon ei mõjutanud p16 INK4a ja p18 INK4c ekspressioonitasemeid.

FOXO-d seonduvad p15 INK4b ja p19 INK4d promootorpiirkondadega ja reguleerivad nende transkriptsiooni üles

FOXO-d reguleerivad teadaolevalt FasL ja insuliinitaolist kasvufaktorit siduva valgu 1 ( IGF-BP1 ) transkriptsiooni (Cichy jt, 1998; Brunet jt, 1999; Suhara jt, 2002). Nendest leidudest on toodud FOXO konsensuslikud seondumiskohad, nagu on näidatud joonisel 3a (Brunet jt, 1999; Rokudai jt, 2002). Otsisime p15 INK4b ja p19 INK4d geenide promootorregioonidest Forkhead-reageerivaid elemente (FHRE). INK4b promootori piirkonnas p15 leidsime kolm kattuvat domeeni, mis olid FOXO konsensussiduvate saitide suhtes väga homoloogsed (joonised 3a ja b). Samuti leidsime p19 INK4d promootoripiirkonnas domääni, millel oli kõrge homoloogia FOXO konsensussiduva saidiga (joonised 3a ja b).

Image

FHRE-de identifitseerimine p15 INK4b või p19 INK4d geeni promootoris. ( a ) Teatatud Xenopuse ja inimese konsensuslike FHRE-de ning FasL-is , IGF-BP1 ( IRS ), p15 INK4b või p19 INK4d promootoris leitud FHRE-de võrdlus . Allajoonitud nukleotiidid vastasid ennustatud FOXO konsensusjärjestusele. ( b ) p15 INK4b või p19 INK4d genoomsed struktuurid. Mustad kastid tähistavad eksonite asukohti ja suhtelist suurust. Võimalike FOXO-d siduvate järjestuste asukohad on näidatud eksoni 1 (E1) ülesvoolu. ( c ja d ) Tuumaekstrakte 293T rakkudest, mida oli transfekteeritud pcDNA3 vektoriga, mis ei kodeeri ühtegi (-) või WT- või HR-FOXO1a / 3a, inkubeeriti biotiiniga märgistatud kaheahelaliste WT- või Mut- p15 INK4b oligonukleotiididega ( vasakpoolsed paneelid) või WT- või Mutp19 INK4d oligonukleotiidid (parempoolsed paneelid). Mõnes eksperimendis viidi reaktsioonid läbi märgistamata WT- p15 INK4b (vasakpoolne paneel) või WT- p19 INK4d (parempoolsed paneelid) oligonukleotiidide 100-kordses liias (+) või puudumisel (-). DNA-valgu kompleksid eraldati polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga ja visualiseeriti mädarõika peroksüdaasiga konjugeeritud streptavidiini abil. FHRE, kahvlile reageeriv element; FOXO, kahvelpea kast O; IGF-BP1, insuliinitaolist kasvufaktorit siduvat valku 1; WT, metsik tüüp.

Täissuuruses pilt

Tõestamaks, et FOXO-d seostusid ennustatud saitidega, viisime läbi elektroonilise liikuvuse nihketesti (EMSA) kaheahelaliste oligonukleotiididega, mis sisaldasid FHRE-sid p15 INK4b (WT- p15 ) või p19 INK4d (WT- p19 ). Nagu eeldatud, saime liikuvuse nihkunud ribasid tuvastada, inkubeerides iga oligonukleotiidi WT-FOXO1a või WT-FOXO3a 293T rakkudest üleekspresseerivate tuumaekstraktidega (joonised 3c ja d). FOXO1a seondumine WT- p15 või WT- p19 oligonukleotiidiga oli spetsiifiline, kuna liikuvuse nihkunud ribasid ei tuvastatud iga konkurendi 100-kordses ülejäägis (märgistamata DNA), inkubeerimisel HR- FOXO1a transfektantide tuumaekstraktidega või inkubeerituna muteeritud p15 või p19 oligonukleotiidiga (Mut- p15 või Mut- p19 , milles ennustatud FHRE-des olid kolm nukleotiidi muteerunud; joonis 3c). Sarnased tulemused näitasid, et FOXO3a seondumine WT- p15 või WT- p19 oligonukleotiidiga oli spetsiifiline (joonis 3d). Et uurida täiendavalt FOXO1a seondumist konserveerunud FHRE-dega p15 INK4b ja p19 INK4d promootoripiirkondades 293T rakkudes, viisime kromatiini immuunsadestamise testi FLAG-märgistatud WT-, AAA- või HR- FOXO1a- transfektantidega. WT- ja AAA-FOXO1a seondusid p15 INK4b ja p19 INK4d promootoripiirkondade FHRE-dega, samas kui HR-FOXO1a ei saanud elementidega seonduda (lisajoonis S2). Need tulemused näitavad, et tuumade FOXO-d, millel on DNA-ga seondumisvõime, võivad spetsiifiliselt seonduda p15 INK4b ja p19 INK4d promootorite FHRE- dega in vitro ja in vivo .

FOXO-de osalemise kinnitamiseks p15 INK4b ja p19 INK4d transkriptsioonis konstrueerisime pGL3 promootorvektorid, mis sisaldasid 1560 aluspaari pikkust DNA fragmenti p15 INK4b geeni 1. eksooni ülaosas ( p15 ) ja 975 aluspaari pikkust DNA fragmenti p19 INK4d geenide 1. eksooni ülesvoolu osa ( p19 ), mis mõlemad sisaldasid oletatavaid FHRE-sid. PGL3 reporteri plasmiidid transfekteeriti 293T rakkudesse koos pcDNA3 vektoriga, mis ei kodeeri mitte midagi (Mock) ega WT-, AAA- või HR-FOXO1a. Nagu on näidatud joonisel 4a, suurendas WT- ja AAA-FOXO1a ekspressioon p15 ja p19 lutsiferaasi aktiivsust märkimisväärselt. HR-FOXO1a ekspressioon ei mõjutanud reporteri tegevust. Oletatavate FHRE-de rolli edasiseks kinnitamiseks p15 INK4b ja p19 INK4d geeniekspressioonides koostasime pGL3 reportervektorid, mis sisaldasid p15 INK4b geeni (WT- p15 ) oletatava FOXO-le reageeriva elemendi neli- tandemikoopiaid või p19 INK4d geeni element (WT- p19 ). Samuti genereerisime pGL3 reportervektoreid, mis sisaldasid muteerunud FHRE-sid (Mut- p15 ja Mut- p19 ). WT- või AAA-FOXO1a ekspressioon, kuid mitte HR-FOXO1a, suurendas märkimisväärselt WT- p15 ja WT- p19 reporteri aktiivsust (joonis 4b). Sarnased tulemused saime IGF-BP1 geeni ( IRS-1 ) varem teatatud FHRE - dega (joonis 4b). Reporteri tegevust Mut- p15 ja Mut- p19- ga transfekteeritud rakkudes ei täheldatud (joonis 4b). FOXO3a transfekteerimisel saime sarnaseid tulemusi (joonis 4c). Nendest tulemustest järeldame, et FOXO-d osalevad p15 INK4b ja p19 INK4d geeni transkriptsioonis identifitseeritud FHRE-dega seondumise kaudu.

Image

P15 INK4b ja p19 INK4d geeni transkriptsiooni reguleerimine FOXOs. ( a ) 293T rakud transfekteeriti pGL3 vektoriga, mis ei sisaldanud ühtegi (pGL3), p15 INK4b promootoripiirkonnast pärit 1560 aluspaari pikkust DNA fragmenti ( p15 ) või p19 INK4d promootoripiirkonnast ( p19 ) saadud 975 aluspaari pikkust DNA fragmenti; koos pcDNA3 vektoriga, mis ei sisalda ühtegi (Mock) ega WT-, AAA- või HR-FOXO1a. Samuti transfekteeriti efektiivsuse kontrollina phRL-TK plasmiidi. Pärast 24-tunnist transfektsiooni mõõdeti lutsiferaasi aktiivsused dual-lutsiferaasi reporteri testimissüsteemiga. ( b ja c ) 293T rakud transfekteeriti pGL3 vektoriga, mis sisaldab oligonukleotiidi tandemkoopiaid, millel on potentsiaalne FOXO-siduv järjestus p15 INK4b geenis (WT- p15 ) või selle mutantses järjestuses (Mut- p15 ), järjestus p19 INK4d geen (WT- p19 ) või selle mutantjärjestus (Mut- p19 ) või IGF-BP1 geeni järjestus ( IRS-1 ). 293T rakke transfekteeriti ka pcDNA3 vektoriga, mis ei kodeeri ühtegi (Mock) või WT-, AAA- või HR-FOXO1a / 3a. Samuti transfekteerimise efektiivsuse kontrollina transfekteeriti ka phRL-TK plasmiidi. Pärast 24-tunnist transfektsiooni mõõdeti lutsiferaasi aktiivsused dual-lutsiferaasi reporteri testimissüsteemiga. FOXO, kahvelpea kast O; WT, metsik tüüp.

Täissuuruses pilt

Järgnevalt uurisime Akt rolli p15 INK4b ja p19 INK4d geeni ekspressioonis. 293T rakke transfekteeriti FOXO-dega koos pFLAG-CMV-2 vektoriga, mis ei sisaldanud midagi (Mock) ega WT- või AAA-Akt. WT-Akt üleekspressioon surus veidi alla WT-FOXO1a või WT-FOXO3a põhjustatud reporterite aktiivsuse WT- p15 ja WT- p19 (joonised 5a ja b). Ei WT ega AAA-Akt ei mõjutanud lutsiferaasi AAA-FOXO indutseeritud aktiveerimist (joonised 5a ja d). Akt-signaaliülekandetee spetsiifiline pärssimine AAA-Akt-ekspressiooni poolt suurendas märkimisväärselt WT- p15 ja WT- p19 lutsiferaasi aktiivsust nii WT-FOXO1a kui ka WT-FOXO3a transfektantides (joonised 5a ja b). Need tulemused viitavad sellele, et Akt surub konstitutiivselt FOXO indutseeritud p15 INK4b ja p19 INK4d transkriptsiooni 293T rakkudes.

Image

Akt reguleerib negatiivselt p15 INK4b ja p19 INK4d geeni transkriptsiooni, fosforüülides ja inaktiveerides FOXO-sid. ( a ja b ) 293T rakke transfekteeriti koos pGL3 vektoriga, mis sisaldas oligonukleotiidi tandeemkoopiaid, mis sisaldasid potentsiaalset FOXO-d siduvat järjestust p15 INK4b (WT- p15 ) või p19 INK4d geenist (WT- p19 ) koos phRL-TK plasmiid kui transfektsiooni efektiivsuse kontroll. 293T rakke transfekteeriti ka pcDNA3 vektoriga, mis ei kodeeri mitte ühtegi (Mock) ega WT-, AAA- või HR-FOXO1a / 3a koos pFLAG-CMV-2 vektoriga, mis ei kodeeri ühtegi (Mock) või WT- või AAA-Akt. Pärast 24-tunnist transfektsiooni mõõdeti lutsiferaasi aktiivsused dual-lutsiferaasi reporteri testimissüsteemiga. CMV, tsütomegaloviirus; FOXO, kahvelpea kast O; WT, metsik tüüp.

Täissuuruses pilt

p15 INK4b või p19 INK4d null-MEF-id näitavad vähenenud reageerimisvõimet LY294002-vahendatud G1 peatamise suhtes

Esmalt uurisime p15 INK4b ja p19 INK4d ekspressioonitasemeid immortaliseeritud WT MEFides , p15 INK4b knockout MEF- des ( INK4b - / - MEF) või p19 INK4d knockout MEF-is ( INK4d - / - MEF), mida raviti LY294002-ga või ilma 24 h. Nagu arvata võis, ei ekspresseerinud INK4b - / - MEF- id p15 INK4b , samas kui INK4d - / - MEF- del puudus p19 INK4d ekspressioon (joonis 6a). Ravi LY294002 pärssis PI3K aktiivsust ( lisajoonis S3) ja indutseeris p27 KIP1 ekspressiooni (joonis 6a) igas rakuliinis. Akt signaalraja allasurumine LY294002 poolt ülesreguleeritud p15 INK4b ekspressiooni WT ja INK4d - / - MEF-is, samas kui see ülesreguleeris p19 INK4d ekspressiooni WT ja INK4b - / - MEF- ides (joonis 6a). Selle tingimuse korral hindasime CDK4 ja CDK6 kinaasi aktiivsust. WT MEF-ide korral surus LY294002 alla nii CDK4 kui ka CDK6 kinaasi aktiivsuse (joonis 6b). Vastupidiselt, LY294002 pärssis pisut CDK4 aktiivsust, kuid mitte CDK6 aktiivsust INK4b - / - ja INK4d - / - MEF- ides (joonis 6b). Järgmisena analüüsisime p15 INK4b ja p19 INK4d rolli Akt inaktiveerimise põhjustatud G1 peatamises GC peatamises rakutsüklit voolutsütomeetria abil pärast immortaliseeritud WT MEFide, INK4b - / - MEF või INK4d - / - MEF töötlemist LY294002-ga. 24 tundi. WT MEF-ide töötlemine LY294002-ga suurendas oluliselt raku arvu Gl-arreteeritud rakupopulatsioonis, võrreldes töötlemata rakkudega (joonised 6c ja d). Seevastu rakutsükli muster oli INK4b - / - ja INK4d - / - MEF- ide puhul enne ja pärast ravi LY294002-ga peaaegu sama (joonis 6c). INK4b - / - ja INK4d - / - MEF-ide puhul ei suudetud LY294002 vahendatud G1-arreteeritud rakkude kogunemist vaeva näha (joonis 6d). Need tulemused näitavad, et LY294002 indutseerib Gl arreteerimise, suurendades p15 INK4b ja / või p19 INK4d geeniekspressioone ja et FOXO aktiveerimine Akt inaktiveerimisega on seotud nende geeniekspressioonidega.

Image

Resistentsus LY294002 põhjustatud G1 peatamise suhtes INK4b - / - ja INK4d - / - MEF- ides . ( a ) Immortaliseeritud metsiktüüpi INK4b - / - või INK4d - / - MEF-sid töödeldi 24 tunni jooksul (+) või ilma (-) 50 μM LY294002-ga. Rakkude tuuma lüsaadid eraldati ja viidi läbi Western blot analüüs näidatud antikehadega. ( b ) Metsiktüüpi INK4b - / - või INK4d - / - MEF-sid töödeldi (+) või ilma (-) 50 μM LY294002-ga 24 tundi ja seejärel sadestati tuuma lüsaatidest CDK4 või CDK6 valk. CDK4 ja CDK6 aktiivsusi analüüsiti in vitro kinaasi testiga, kasutades substraadina rekombinantset C-terminaalset Rb. c ) Metsiktüüpi INK4b - / - või INK4d - / - MEF-sid töödeldi (alumised paneelid) või ilma (ülemised paneelid) 50 μM LY294002-ga. Pärast 24-tunnist töötlemist määrati raku DNA sisaldus voolutsütomeetria abil. G1-faasirakkude protsent, mida kirjeldatakse igas paneelis, on kolme sõltumatu katse keskmine (sisestus). ( d ) Gl, S ja G 2 / M rakutsükli populatsiooni protsent arvutati kolme sõltumatu katse abil, mis on näidatud punktis ( c ). Iga vertikaalne riba tähistab katsete SD-d. MEF-id, hiire embrüonaalsed fibroblastid.

Täissuuruses pilt

Arutelu

PTEN geeni mutatsiooni täheldatakse suure sagedusega, peaaegu samal määral kui kasvaja supressori p53 geeni mutatsiooni vähirakkudes (Bonneau ja Longy, 2000), mis viib Akt signaaliraja hälbiva aktiveerumiseni ning tagab rakkude suure ellujäämise ja vohamise tegevused. FOXO-d on Akti otsesed sihtmärgid ja neid reguleerib see fosforüülimisest sõltuval viisil negatiivselt (Brunet jt, 1999; Woods ja Rena, 2002). FOXO-d pärsivad rakkude proliferatsiooni apoptoosiga seotud ja / või rakutsükli inhibiitorite geenide transkriptsiooniga. p27 KIP1 on FOXOs transkriptsiooni sihtmärk (Medema jt, 2000; Stahl jt, 2002) ja see kutsub esile rakutsükli peatamise ükskõik millises faasis. Lisaks pärsib p21 CIP1 ja p27 KIP1 funktsioone Akt-sõltuv fosforüülimine ja translokatsioon tuumadest tsütoplasmasse (Collado et al., 2000; Rodier jt, 2001; Zhou jt, 2001; Fujita et al.)., 2002). Seega saab Akt-signaaliraja aktiveerimisega vähirakkude rakutsükli peatamist vältida. Raja inhibiitorid võivad vastupidi indutseerida nende geeniproduktide aktiveerimise ja kõrvaldada rakutsükli kulgemise. Tegelikult on täheldatud, et PI3K inhibiitor LY294002 põhjustab nii Gl kui ka G2 / M peatamist (joonis 1e; Collado et al., 2000). Varasemate uuringute kohaselt peetakse LY294002 põhjustatud G 1 seiskumist p21 CIP1 ja p27 KIP1 aktiveerimise tõttu, samas kui inhibiitori poolt põhjustatud G 2 / M seiskumine võib tekkida WEE1Hu aktiveerimise tagajärjel lisaks p21 CIP1 ja p27 KIP1 (Collado jt, 2000; Rodier jt, 2001; Zhou jt, 2001; Fujita jt, 2002; Katayama jt, 2005).

Matsushima-Nishiu jt. (2001) on näidanud, et PTEN geeniprodukti adenoviiruse transduktsioon kutsub esile p15 INK4b mRNA ekspressiooni, mis on sama nagu p27 KIP1 mRNA ekspressioonil, nagu on näha DNA mikrokiibil ja RT-PCR analüüsil. PTEN-indutseeritud p15 INK4b molekulaarseid mehhanisme ei ole aga täpsustatud. Selles uuringus proovisime seejärel uurida p15 INK4b ekspressiooni regulatiivseid mehhanisme Akt signaaliraja kaudu. Töötlemine Akt signaaliülekande raja inhibiitoritega indutseeris p15 INK4b geeniprodukti ja samal ajal ülesreguleeritud p19 INK4d geeniprodukti (joonis 1). Akt või WT- ja aktiivsete FOXO-de domineeriv-negatiivne vorm kutsus esile ka p15 INK4b ja p19 INK4d ekspressiooni (joonis 2). Need andmed näitavad, et Akt signaaliülekande raja pärssimisega indutseeritud G1 peatamine on põhjustatud p15 INK4b ja p19 INK4d ekspressioonist koos p21 CIP1 ja p27 KIP1 ekspressiooniga.

Täiendav uurimine näitas, et FOXO- sid seondusid geenide p15 INK4b ja p19 promootorpiirkondadega ja nende transkriptsioon ülereguleeris märkimisväärselt (joonised 3, 4 ja 5). FOXO1a aktiveeris tugevalt p15 INK4b transkriptsiooni ja p19 INK4d transkriptsiooni, samal ajal kui FOXO3a näitas suuremat p19 INK4d transkriptsiooni aktiivsust kui p15 INK4b transkriptsiooni aktiivsus (joonis 4). Need tulemused näitavad, et p19 INK4d transkriptsiooni vahendavad nii FOXO1a kui FOXO3a, kuid p15 INK4b transkriptsiooni võib reguleerida peamiselt FOXO1a. Lisaks vähendas WT-Akt veidi WT-FOXO indutseeritud lutsiferaasi aktiveerimist, samas kui domineeriv-negatiivne Akt suurendas selgelt lutsiferaasi aktiivsust WT-FOXO-ga transfekteeritud 293T rakkudes. WT- või AAA-Akt üleekspressioon ei mõjutanud AAA-FOXO-indutseeritud lutsiferaasi aktiveerimist. Seetõttu surus Akt fosforüülimise teel FOXO-vahendatud p15 INK4b ja p19 INK4d geeni transkriptsiooni. Ehkki LY294002 peatas rakutsükli G1 faasis 293T, HepG2, Raji ja WT MEF rakkudes (joonised 1 ja 6), ei olnud G1 peatamist võimalik INK4b - / - või INK4d - / - MEF- ide puhul (joonis 6). . Seega on p15 INK4b ja p19 INK4d ekspressiooni indutseerimine FOXO- dega LY294002 poolt indutseeritud Gl-rakutsükli peatamise kriitiline sündmus.

Selles uuringus kasutasime nelja erinevat rakuliini, 293T, HepG2, Raji ja MEF. Rb on CDK4 / 6/2 substraat ja rakutsükli negatiivne regulaator. G 1 / S ülemineku ajal on rakutsükli kulgemiseks vajalik CDK4 / 6/2 vahendatud fosforüülimine ja Rb inaktiveerimine. 293T rakkudes ilmnevad Rb düsfunktsioonid adenoviirusvalgu ja SV40T antigeeni poolt ning 293T rakud avaldavad resistentsust Rb-vahendatud Gl peatamise suhtes. Tegelikult peatati LY294002 rakutsükkel G1 faasis 293T rakkudes kergelt (joonis 1e). LY294002 indutseeris seevastu drastiliselt G1 seiskumist HepG2, Raji ja WT MEF rakkudes (joonised 1e ja 6), mis sisaldavad normaalset Rb kui kasvaja supressori geeniprodukti (Puisieux et al., 1993; Wells et al., 2003). Need leiud viitavad sellele, et LY294002 vahendatud Gl seiskamine on indutseeritud Rb-sõltuvatest ja sõltumatutest radadest. Rb-sõltumatu G1 peatamise korral võib võtmemolekuliks olla Smad3. Smad3-l on põhifunktsioon kasvufaktori β signaaliülekande muundamise vahendamisel, mis pärsib rakutsükli kulgu G1 faasis. Smad3 ülesreguleerib p15 INK4b ekspressiooni ja reguleerib c-Myc ekspressiooni alla, mille tulemuseks on rakutsükli peatamine G1 faasis (Matsuura et al., 2004). CDK4 / 2 fosforüülib ja inaktiveerib Smad3 ja hoiab ära G1 rakutsükli peatamise (Matsuura et al., 2004). LY294002 võib samuti aktiveerida Smad3 ja pärssida rakutsükli kulgu G1 faasis koostöös FOXO-p15 INK4b / p19 INK4d- CDK rajaga, eriti 293T rakkudes.

CpG saare metüleerimist, deletsiooni ja mutatsiooni kromosoomis (Ch.) 9p21, mis kodeerib p15 INK4b , p16 INK4a ja p14 ARF geene, täheldatakse sageli paljude vähivormide korral (Ruas ja Peters, 1998). p14 ARF on p53 aktivaator ja indutseerib kaudselt p21 CIP1 ekspressiooni (Stott et al., 1998). Ch. Defekt 9p21 põhjustab seetõttu vähirakkudes rakutsükli hälbe progresseerumist. Seevastu p18 INK4c (ptk 1p32) ja p19 INK4d (ptk 19p13) deletsioone või ümberkorraldusi pole vaevalt täheldatud (Zariwala et al., 1996). Eriti p19 INK4d mutatsioon on eriti haruldane. Seetõttu on vähi kemoteraapias kasulik indutseerida p18 INK4c ja / või p19 INK4d- sõltuvat G1 seiskumist nii p15 INK4b kui ka p16 INK4a- puudulikes vähirakkudes.

Mdm2 on p53 ubikvitiin E3 ligaas. Akt fosforüülib ja translokeerib ka Mdm2 tsütoplasmast tuumasse, põhjustades p53 lagunemist ja rakutsükli peatamist (Mayo ja Donner, 2001). Normaalset p53 sisaldavates rakkudes suurendab Akt signaaliradade allasurumine p53 ekspressiooni ja tühistab selles mehhanismis rakutsükli kulgemise. Seevastu on p53-p21 CIP1 raja kaudu rakutsükli peatamist raske esile kutsuda p53-puudulikes vähirakkudes. 293T rakkude p53 talitlushäireid põhjustab ka SV40T antigeen, kuid LY294002 võib rakutsükli progressiooni kaotada p15 INK4b , p19 INK4d ja p27 KIP1 ülesreguleerimise ja CDK4 / 6 kinaasi aktiivsuse pärssimisega. Seetõttu võivad Akt signaaliülekande raja inhibiitorid olla kasulikud paljude vähirakkude jaoks, sõltumata p53 mutatsioonist.

Kokkuvõtlikult demonstreerime, et FOXO-d peatavad rakutsükli G1 faasis p15 INK4b ja p19 INK4d ekspressiooni otsese induktsiooni abil transkriptsioonimehhanismide kaudu. Akt seevastu pärsib p15 INK4b ja p19 INK4d ekspressiooni Akt-sõltuva fosforüülimise ja FOXO-de inaktiveerimise kaudu.

materjalid ja meetodid

Reaktiivid ja rakukultuuri tingimused

Wortmannin, LY294002 ja Celecoxib osteti vastavalt Merck Calbiochemilt (San Diego, CA, USA), Sigmalt (St Louis, MO, USA) ja LKT Laboratories (St Paul, MN, USA). Inimese embrüonaalse neeru 293T rakke ja inimese hepatoblastoomi HepG2 rakke kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle söötmes, millele oli lisatud 10% veise loote seerumit. Inimese Burkitti lümfoomi Raji rakke kasvatati RPMI-1640-s, millele oli lisatud 10% veise loote seerumit. INK4b - / - ja INK4d - / - MEF-e andsid lahkelt dr Mariano Barbacid (Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid, Hispaania) ning Drs Martine F Roussel ja Charles J Sherr (St Jude'i lasteuuringute haigla, Memphis, TN, USA) vastavalt, ja neid kasvatati vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Latres et al., 2000; Zindy et al., 2000). Neid MEF-sid immortaliseeriti, kasvatades neid meie laboris 2–3 kuud ja seejärel kasutati neid mingite analüüside jaoks.

Plasmiidid

Inimese WT ja dominantnegatiivsed (AAA, K179A / T308A / S473A) akt1 cDNA-d pFLAG-CMV-2 vektoris (Sigma) loodi meie laboris (Fujita et al., 2002). Inimese FLAG-märgisega WT- FOXO1a , AAA (T24A / S256A / S319A) - FOXO1a ja HR (H215R) - FOXO1a pcDNA3 vektoris (Invitrogen, San Diego, CA, USA) esitas lahkelt Drs Eric D Tang (University of University). Michigan Medical School, Ann Arbor, MI, USA) ja Frederic G Barr (Pennsylvania ülikool, meditsiinikool, Philadelphia, PA, USA) (Tang jt, 1999). Inimese WT- FOXO3a cDNA pcDNA3 vektoris genereeriti PCR-i abil IMAGE klooniga (ID: 4137370, Invitrogen) matriitsina. AAA (T32A / S253A / S315A) - FOXO3a ja HR (H212R) - FOXO3a cDNA-d viidi läbi QuickChange saidi poolt juhitava mutageneesi komplekti abil (Stratagene, La Jolla, CA, USA).

Voolutsütomeetriline analüüs

Rakke töödeldi 24 tunni jooksul 50 uM LY294002-ga. Voolutsütomeetrilised analüüsid viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Katayama et al., 2005).

Mööduv transfektsioon ja Western blot analüüs

Rakud transfekteeriti sobivate plasmiididega, kasutades Superfect transfektsiooni reagenti (Qiagen, Valencia, CA, USA). Western blot analüüs viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Katayama et al., 2005). Tuumafraktsioon ekstraheeriti, kasutades NE-PER ekstraheerimiskomplekti (Pierce, Rockford, IL, USA). Kasutasime p16 INK4a (F-12), p15 INK4b (K-18) või p18 INK4c (M-20) antikehi (Santa Cruzi biotehnoloogia, Santa Cruz, CA, USA); inimese p19 INK4d (DCS-100) antikeha (Lab Vision, Fremont, CA, USA); antikeha hiire p19 INK4d (ZP002) (Invitrogen) vastu; P-aktiini (AC-15) antikeha (Sigma); ja p21 CIP1 või p27 KIP1 antikehad (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Semikvantitatiivne RT – PCR analüüs

Me ekstraheerisime rakkudest kogu RNA Trizoli reagendiga (Invitrogen). RT – PCR katsed viidi läbi vastavalt lisamaterjalides ja meetodites kirjeldatule.

In vitro CDK test

Rakke töödeldi 24 tunni jooksul 50 μM LY294002-ga või ilma, seejärel sadestati endogeensed CDK4 ja CDK6 rakulüsaatidest immunosades, kasutades vastavalt CDK4 (C-22) ja CDK6 (C-21) (Santa Cruzi biotehnoloogia) antikehi. In vitro CDK test viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (Ogasawara et al., 2004). Rekombinantne C-terminaalne Rb (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) ja immunosadestatud CDK4 ja CDK6 tuvastati Western blot analüüsiga. Me kasutasime Rb ja fosfo-Rb vastaseid antikehi (Ser807 / 811; Cell Signaling Technology); ja antikehad CDK4 (DCS-35) ja CDK6 (B-10; Santa Cruzi biotehnoloogia) vastu.

PGL3 promootorvektorite kloonimine

P15 INK4b promootoripiirkonna 1560 aluspaari pikkune DNA fragment, −1557 kuni +3 ja p19 INK4d promootoripiirkonna −975 kuni −1 975 aluspaari pikkune DNA fragment, mis sisaldab potentsiaalset FOXO-d siduvat järjestust, amplifitseeriti PCR abil ja klooniti pGL3 promootorvektorisse (Promega, Madison, WI, USA), nagu on kirjeldatud lisamaterjalides ja meetodites.

Oletatava FOXO-le reageeriva elemendi tandemkoopiaid sisaldavate pGL3 reportervektorite kloonimine

Kaheahelalised oligonukleotiidid, mis sisaldavad potentsiaalset FOXO-d siduvat järjestust, genereeriti PCR abil ja ligeeriti pGL3 promootorvektorisse, nagu on kirjeldatud lisamaterjalides ja meetodites. PGL3-3xIRS vektorist (IRS-1) on varem teatatud (Rokudai et al., 2002).

Elektroonilise liikuvuse nihkeanalüüs

293T rakke transfekteeriti WT- või HR- FOXO cDNA-ga ja rakkude tuumaekstraktsioone kasutati EMSA-s. Üksikasjalikke katseprotseduure kirjeldati lisamaterjalides ja meetodites.

Kromatiini immunosadestamise test

293T rakke transfekteeriti pcDNA3 vektoriga, mis ei kodeeri ühtegi, või FLAG-märgistatud WT-, AAA- või HR-FOXO1a. Üksikasjalikke katseprotseduure kirjeldati lisamaterjalides ja meetodites.

Lutsiferaasi test

293T rakke transfekteeriti koos pGL3 promootorvektoriga, mis ei kodeeri ühtegi, või FOXO konsensus p15 INK4b , p19 INK4d või IRS-1 järjestusega ja pcDNA3 vektoriga, mis kodeerib mitte ühtegi või FOXO koos akt1 cDNA-dega või ilma. Kõigi lutsiferaasi aktiivsuste kvantifitseerimine viidi läbi duaalse lutsiferaasi reporteri testimissüsteemiga (Promega). Aktiivsused normaliseeriti tümidiini kinaasi juhitud Renilla lutsiferaasi kontrollplasmiidi phRL-TK (Promega) kontrolltransfektsiooni teel.

PI3K test

Rakke töödeldi 24 tunni jooksul 50 μM LY294002-ga ja seejärel mõõdeti PI3K aktiivsus QTL valguse kiiruse I klassi fosfoinositiidi 3-kinaasi (PI3K-α, PI3K-β, PI3K-δ ja PI3K-γ) lõpp-punkti komplekti abil ( QTL Biosystems, Santa Fe, NM, USA). Üksikasjalikke katseprotseduure kirjeldati lisamaterjalides ja meetodites.

Täiendav teave

Wordi dokumendid

  1. 1

    Täiendavad materjalid ja meetodid

PDF-failid

  1. 1

    Täiendavad tabelid

  2. 2

    Täiendavad arvnäitajad

    Täiendav teave on lisatud paberkandjal Oncogeeni veebisaidil (//www.nature.com/onc).