Suutmatus tuuma gsk3β inaktiveerida ser389-fosforüülimise teel põhjustab fokaalse neuronite surma ja pikaajalist hirmuvastust | neuropsühhofarmakoloogia

Suutmatus tuuma gsk3β inaktiveerida ser389-fosforüülimise teel põhjustab fokaalse neuronite surma ja pikaajalist hirmuvastust | neuropsühhofarmakoloogia

Anonim

Õppeained

  • Rakusurm
  • Rakkude signalisatsioon
  • Õppimine ja mälu
  • Molekulaarbioloogia
  • Molekulaarne neuroteadus
  • Fosforüülimine

Abstraktne

GSK3β mängib olulist rolli rakusurma soodustamisel ja on kujunemas neuroloogiliste haiguste potentsiaalseks sihtmärgiks. Neuronaalset GSK3β kontrollivate mehhanismide mõistmine on kriitiline. Üldlevinud mehhanism GSK3β represseerimiseks hõlmab Ser 9 Akt-vahendatud fosforüülimist. Siin näitame, et p38 MAPK vahendatud GS 383 fosforüülimine Ser 389-s inaktiveerib spetsiifiliselt tuuma GSK3β ajukoores ja hipokampuses. Kasutades GS mutandiga hiirtele GSK3β Ser 389, näitasime, et tuuma GSK3β inaktiveerimise ebaõnnestumine Ser 389 fosforüülimise tagajärjel põhjustab närvirakkude surma hipokampuse ja ajukoore alampiirkondades. Kuigi see fookusneuronaalne surm ei mõjuta ärevuse / depressioonitaolist käitumist ega hipokampusest sõltuvat ruumilist õppimist, viib see võimendatud ja pikaajalise hirmureaktsioonini. See fenotüüp on kooskõlas posttraumaatilise stressihäire (PTSD) mõne aspektiga. Meie uuringud näitavad, et tuuma GSK3β inaktiveerimine Ser 389 fosforüülimise teel mängib võtmerolli hirmu reageerimisel, paljastades uusi potentsiaalseid terapeutilisi lähenemisviise PTSD sihtmärgiks.

Sissejuhatus

Glükogeeni süntaasi kinaas (GSK) -3 on kõrge ekspressiooniga seriini-treoniini proteiinkinaas, mis esineb kõigis rakkudes, kuid on eriti rikkalikult kesknärvisüsteemis (KNS) (Woodgett, 1990). GSK3β on peamiselt tsütoplasmaatiline valk. Siiski on näidatud, et see akumuleerub tuumas vastusena teatud stiimulitele, ehkki tuuma-GSK3β funktsioon pole hästi arusaadav (Bijur et al., 2000; Bijur ja Jope, 2003). On kaks GSK3 isovormi, GSK3a ja GSK3β, mida kodeerivad eraldi geenid. Ehkki neil on kinaasidomeenis oluline homoloogia, ei ole nende funktsioon ja / või ekspressioon täielikult ülearune, tuginedes leiule, et GSK3β, kuid mitte GSK3a kustutamine põhjustab embrüonaalset letaalsust (Hoeflich et al, 2000). GSK3 tuvastati kõigepealt kinaasina, mis fosforüülib ja reguleerib negatiivselt glükogeeni süntaasi (Embi et al, 1980; Frame ja Cohen, 2001), kuid paljudes süsteemides, kus seda on uuritud, on aktiivse GSK3β üheks peamiseks tagajärjeks rakusurm (Jacobs et al., 2012). Kesknärvisüsteemis põhjustab GSK3 kaotamine aju kõrvalekaldeid, neuronite hüperproliferatsiooni ja ülemäärast elulemust (Kim et al, 2009). Lisaks suurendab GSK3β hüperaktiveerimine närvirakkudes rakusurma vastusena raku stressile (Bijur et al, 2000). Arvatakse, et suurenenud GSK3 aktiivsusest põhjustatud neuronaalsete rakkude surm võib aidata kaasa inimese neuroloogilistele häiretele, nagu Huntingtoni tõbi, Alzheimeri tõbi ja bipolaarsed häired (Carmichael et al., 2002; Cai et al., 2012; Cole, 2013). On tõestatud, et suurenenud GSK3β aktiivsus vahendab tau hüperfosforüülimist, β-amüloidi indutseeritud neurotoksilisust ja mutantse preseniliin-1 patogeenset toimet Alzheimeri tõve korral (Jope ja Johnson, 2004). GSK3 inhibiitorid on näidanud paljulubavust Alzheimeri tõve hiiremudelites (Noble jt, 2005; Rockenstein jt, 2007; Eldar-Finkelman ja Martinez, 2011) ning mõnda neist on testitud Alzheimeri tõve kliinilistes uuringutes (Lovestone jt, 2015). ). Liitium, mida tavaliselt kasutatakse bipolaarse häire ravis, stabiliseerib meeleolu osaliselt GSK3 aktiivsuse pärssimise kaudu (Jope, 2011). GSK3β inaktiveerimine on seotud ka metaanselt ketamiini antidepressantse toimega (Beurel jt, 2011; Liu jt, 2013; Chiu jt, 2015). Seega on GSK3 aktiivsust kesknärvisüsteemis reguleerivate mehhanismide määramine väga oluline.

Erinevalt enamikust kinaasidest on GSK3 konstitutiivselt aktiivne. Laialdaselt uuritud GSK3 inhibeerimismehhanism on SerK fosforüülimisel GSK3β-l ja Ser 21 fosforüülimisel GSK3a-l peamiselt Akt poolt (Cross et al, 1995). GSK3β fosforüülitud N-ots Ser9 juures toimib konkureeriva inhibiitorina, voldituna aktiivsesse kohta ja hoides ära substraadi sidumise (Frame et al, 2001). Ser 9 / Ser 21 fosforüülimist saab enamikus rakkudes tuvastada konstitutiivselt, kuid seda saab veelgi suurendada insuliini, kasvufaktorite ja rakulise stressisignaali kaudu (Doble ja Woodgett, 2003). Topeltkopsokiini (KI) hiirtega tehtud uuringud, kus SerK GSK3β-s ja Ser 21 GSK3a-s olid muteeritud Ala-le, on näidanud selle mehhanismi olulisust lihaste glükogeeni süntaasi inaktiveerimiseks insuliini poolt (McManus et al., 2005), kuid mitte GSK3 inaktiveerimine WNT / β-kateniini signaaliülekande kaudu (McManus jt, 2005). WNT signaalimine soodustab GSK3 sekvestreerumist multiveerunud endosoomides ja lipoproteiiniretseptoritega seotud valgu pseudo-substraatide teket (Niehrs ja Acebron, 2010). Huvitaval kombel ei mõjutanud seriini inhibeeriva fosforüülimise kaotamine GSK3 Ser 9 Ala / Ser 21 Ala kahekordse KI hiirtel neuronite ellujäämist in vitro ega in vivo (Hongisto et al., 2008; Eom ja Jope, 2009), toetades veelgi alternatiivi olemasolu. neuronaalne kaitsemehhanism GSK3β reguleerimiseks ajus.

Hiljuti tuvastasime veel ühe otsese inhibeeriva fosforüülimise raja GSK3β jaoks, kuid mitte GSK3α jaoks (Thornton et al, 2008). p38 MAPK inaktiveerib GSK3β inimese Thr 390 fosforüülimisel inimese GSK3β-s või Ser 389- l hiire GSK3β-s (Thornton et al., 2008). See p38 MAPK-ga toimuv fosforüülimine põhjustab GSK3β aktiivsuse pärssimise samasugust määra kui Ser 9 fosforüülimine Akt abil (Thornton et al, 2008). Thr 390 / Ser 389 asub GSK3β C-otsa lõpus, mis on samuti väga elastse struktuuriga, sarnaselt N-otsaga, kus Ser 9 asub (Dajani et al, 2001). Seega on inaktiveerimise mehhanism fosforüülimisel C-otsas tõenäoline ka aktiivsesse kohta voltimise ja substraadi sidumisel konkureerimise kaudu. Need kaks GSK3β inaktiveerimise mehhanismi on siiski sõltumatud, reageerivad erinevatele stiimulitele ja on suunatud GSK3β erinevatele kogumitele (Thornton et al, 2016). Kui Ser 9 fosforüülimine on enamikus kudedes üldlevinud, piirdub Ser 389 fosforüülimine füsioloogiliste tingimuste korral spetsiifiliste kudedega (nt aju, harknääre ja põrn) (Thornton et al, 2008). Lisaks toimub GSK3β Ser 9 fosforüülimine peamiselt tsütosoolis, kuid hiljuti näitasime, et Ser 389 fosforüülimine on suunatud tuuma GSK3β (Thornton et al, 2016). Oluline on see, et GSK3β fosforüülimine Ser 389-s käivitatakse spetsiifiliselt vastusena väliste stiimulite, aga ka V (D) J rekombinatsiooni ja klassilüliti rekombinatsiooni tagajärjel tekkivate DNA kaheahelaliste katkestuste (DSB), samuti T- ja B-lümfotsüütide poolt looduslikult genereeritud DSB-ga. (Thornton jt, 2016). Ser 389 GSK3β fosforüülimise peamine ülesanne nendes rakkudes on rakusurma ärahoidmine, peamiselt DSB põhjustatud nekroptoosi kaudu (Thornton et al, 2016).

Ehkki GSK3β fosforüülimine Ser 389 juures on füsioloogilistes tingimustes selektiivselt ajus (Thornton et al, 2008), ei ole aju GSK3β reguleerimise selle mehhanismi funktsioon teada. Siin näidatakse, et GSK3β fosforüülimine Ser 389 juures on mehhanism, mis inaktiveerib ajus GSK3β tuumavaru. Tuuma GSK3β inaktiveerimise puudumine Ser 389 Ala mutantsetel hiirtel põhjustab ajukoores ja hipokampuses neuronite alamrühma surma. Ehkki ruumimälu ja ärevus- / depressioonitaolist käitumist ei kahjustata, on Ser 389 Ala GSK3β KI hiirtel tugevdatud hirmu vähendav käitumine - fenotüüp, mida tavaliselt täheldatakse stressiga seotud haiguste, näiteks traumajärgse stressihäire (PTSD) korral. Seega võiks GSK3β inaktiveerimine Ser 389 fosforüülimise kaudu olla uudne lähenemisviis PTSD-sarnaste sümptomite raviks.

materjalid ja meetodid

Hiired

C57BL / 6 GSK3β KI hiiri on varem kirjeldatud (Thornton et al, 2016). Metsikut tüüpi hiired (WT) osteti firmast Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Hiired, kellel puudus p38a MAPK spetsiifiliselt neuronites (p38αA-N), genereeriti vastavalt kirjeldusele (Colié et al, 2017). p38a vooderdatud homosügootsed hiired ristati p38a vooderdatud homosügootsete CAMKII-CRE positiivsete hiirtega, et genereerida p38a vooderdatud homosügootsed hiired pluss (p38αA-N) või miinus (WT) CAMKII-CRE transgeeni üks eksemplar. Kõik protseduurid kiitis heaks Vermonti ülikooli loomahoolduse ja kasutamise komitee.

Käitumisülesanded

Allpool kirjeldatud käitumisülesannetes uuriti isaste ja emaste WT ja GSK3β KI hiirte ( n = 5 emast, 5 isast genotüübi kohta) kohordi. Testimise järjekord oli akustiline ehmatus, avaväli, null labürint, kuulmishirmu konditsioneerimine, lõpetamine sunnitud ujumisega. Veelabürindi katses kasutati eraldi kohordi ( n = 8 emast, 7 meest genotüübi kohta). Tehti järgmised käitumisülesanded: (1) avamaa ja null labürint, (2) vee labürint, (3) sunnitud ujumine ja (4) kuulmishirmu reguleerimine. Katse üksikasjad on esitatud täiendava teabe jaotises „Laiendatud meetodid”.

Western blot analüüs

Terverakulised ekstraktid valmistati Tritoni lüüsipuhvris ja neid kasutati Western blot analüüsi jaoks, nagu me varem kirjeldasime (Derijard et al, 1994; Rincon et al, 1997). Tuuma- ja tsütosoolsed ekstraktid valmistati vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Schreiber jt, 1989; Tugores jt, 1992). Kaasimmunosadestamiseks valmistati tuumaekstraktid vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Jamil et al, 2010). Küüliku antikehadega immunosadestamiseks / Western blot analüüsiks kasutati ExactaCruz F immunosadestamise komplekti (Santa Cruz Biotechnology). Antiaktiin, anti-GAPDH ja anti-GSK3β osteti firmast Santa Cruz Biotechnology. Anti-fosfo-Ser 9 GSK3β, anti-fosp-Mcl1 ja anti p38a MAPK osteti firmast Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-fosfo-S 389 GSK3β ja anti-TUJ1 osteti ettevõttelt Millipore (Billerica, MA). Kirjeldatud on küüliku polüklonaalset antikeha fosfor-Thr 390 GSK3β (Thornton et al, 2016). Sekundaarsete antikehadena kasutati küülikuvastast HRP ja hiirevastast HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories) ja kitsevastast HRP (Santa Cruzi biotehnoloogia). Riba intensiivsuse kvantifitseerimiseks kasutati NIH ImageJ.

GSK3p kinaasi aktiivsuse testid

Et teha kindlaks, kas S 389 fosforüülimine reguleeris GSK3β aktiivsuse selget komponenti, viidi läbi kinaasi testid. Ajukoore valgu lüsaatidest sadestati GSK3β immunosadestatuna ja kinaasi aktiivsus määrati vastavalt eelnevalt avaldatud kirjeldusele (Thornton et al, 2008).

Immunomärgistamine

Kasutatavate primaarsete antikehade hulka kuulusid küüliku anti-fosp-Ser 389 või anti-fosfo-Thr 390 GSK3β polüklonaalsed antikehad, Anti-NeuN (Millipore), anti-TUJ1, küülikuvastane Alexa Fluor 568 (Invitrogen) või Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Tuumaplekkina kasutati DAPI-d. Rakkude pildid saadi seadmel Zeiss LSM-510. Inimese kude värviti vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Long et al, 2011). Pildid saadi samasuguste särituse sätetega, kasutades SPOT RT digikaamerat. Fluoro-Jade C (Millipore) värviti vastavalt tootja juhistele.

Statistiline analüüs

Andmeid väljendatakse keskmisena ± keskmise standardviga. Käitumisanalüüsis kasutati segatud ANOVA mudeleid, millele järgnes LSD-ga kaitstud t- test. Esialgne analüüs hõlmas seksi. Kuid soolisi erinevusi ei täheldatud; seetõttu jäeti seks järgnevast analüüsist välja. Tulemusi analüüsiti SPSS tarkvara versiooniga 22 (IBM; Armonk, NY). P <0, 05 peeti statistiliselt oluliseks.

Tulemused

Ser 389 GSK3β fosforüülimine selektiivselt sihib ajus GSK3β tuumavarusid

GSK3β reguleerimine Ser 9 fosforüülimise teel toimub kõigis kudedes GSK3β aktiivsuse piiramise vaikimisi rajana (Jope ja Johnson, 2004). Seevastu fosfor-Ser 389 GSK3β on ajus väga rikkalikult (Thornton et al, 2008). Fosfo-Ser 389 GSK3β jaotuse määramiseks ajus viidi läbi Western blot analüüs, kasutades aju erinevatest piirkondadest pärit lüsaate. Kui fosfo-Ser 9 GSK3β oli kõigis uuritud ajupiirkondades rohkesti, tuvastati ajukoores ja hipokampuses kõrgem fosfo-Ser 389 GSK3β tase (joonis 1a). Et uurida, kas Ser 389 fosforüülimine ja Ser 9 fosforüülimine olid alternatiivsed viisid GSK3β kahe sõltumatu ruumilise kogumi kontrollimiseks, viisime läbi immunosadestamise analüüsi. Ajukoore täisrakulisi ekstrakte kasutati fosfo-Ser 9 GSK3β immunosadestamiseks ja nii immunosadet kui ka läbivoolu uuriti Western blot analüüsiga. Nagu arvata võis, oli fosfo-Ser 9 rikkalikult immunosades, kuid mitte läbivoolus (joonis 1b). Seevastu fosfo-Ser 389 ei tuvastatud fosfo-Ser 9 immuunsadestudes, kuid seda oli rikkalikult läbivoolus (joonis 1b), mis näitab, et fosfo-Ser 9 GSK3β kogum ei ole fosforüülitud Ser 389 juures . Kogu GSK3β analüüs näitas, et Ser 9-l fosforüüliti tegelikult vaid murdosa GSK3β, kuna pärast fosfo-Ser 9 immunosadestamist oli läbivoolus endiselt suur kogus GSK3β (joonis 1b). Seega on GSK3β fosforüülimine Ser 389-l suunatud aju sõltumatule GSK3β kogumile, mida ei ole fosforüülitud Ser 9-l .

Image

Ser 389 / Thr 390 tuuma GSK3β fosforüülimine ajupiirkondades. (a) Metsiktüüpi (WT) hiire aju (BS, ajutüvi; Cb, väikeaju; Ctx, peaajukoore; Puusa-, hipokampuse moodustumine; Str, striatum; Thl, talamus) erinevatest piirkondadest pärit tervete rakkude lüsaate uuriti P-Ser 389 GSK3β, P-Ser 9 GSK3β ja kogu GSK3β Western blot analüüsi abil. GAPDH on kuvatud laadimiskontrollina. Võrdluseks on näidatud P-Ser 389 ja P-Ser 9 suhe. (b) P-Ser9 GSK3β sadestati hiire ajukoore ekstraktidest immuunosades. P-Ser 389 GSK3β, P-Ser 9 GSK3β ja kogu GSK3β immunosades (PS 9 IP) või vasakpoolses läbivoolus (Flow Thr) uuriti Western blot analüüsiga. (c) P-Ser 389 (punane) ja DAPI tuumavärvuse (sinine) esinemist hiire ajukoores uuriti immunovärvimise ja mikroskoopia abil. Valgete kastide lahtrid on suurendatud, et näidata rakkude lokaliseerimist. (d) P-Thr 390 (punane) ja DAPI tuumavärvuse (sinine) esinemist tapajärgses inimese peaajukoores uuriti immunovärvimise ja mikroskoopia abil. Valgete kastide lahtrid on suurendatud, et näidata rakkude lokaliseerimist. (e) Western blot analüüsi, kasutades hiire ajukoore tuuma (N) ja tsütosoolseid (C) ekstrakte, analüüsiti Western blot analüüsiga P-Ser 389 GSK3β, P-Ser 9 GSK3β ja kogu GSK3β suhtes. GAPDH ja histooni näidatakse vastavalt tsütoplasmaatiliste ja tuumafraktsioonide kontrollidena.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Oleme hiljuti näidanud, et Ser 389 fosforüülimine reguleerib peamiselt tuuma GSK3β lümfotsüütides (Thornton et al, 2016). Seetõttu uurisime fosfo-Ser 389 GSK3β subrakulist jaotust hiire ajukoores immunovärvimise ja konfokaalse mikroskoopia abil. Immuunvärvimine näitas fosfo-Ser 389 GSK3β punktuaalset tuumajaotust rakkude alamrühmas (joonis fig 1c). Sarnaselt näitas surmajärgse inimese ajukoe immunofluorestsentsvärvimine fosfo-Thr 390 GSK3β (hiire Ser 389 inimese ekvivalent) peamiselt tuumavärvi (joonis fig 1d). Lisaks kinnitasid Western blot-analüüsid ajukoore tuuma- ja tsütosoolsete ekstraktide abil veelgi fosfo-Ser 389 GSK3β esinemist tuumafraktsioonis, samas kui see oli tsütosoolis praktiliselt tuvastamatu (joonis 1e). Seega, erinevalt Ser 9 fosforüülimisest, on Ser 389 fosforüleerimine suunatud aju GSK3β tuumavarudele.

GSK3β fosforüülimine Ser 389-l on vajalik tuuma GSK3β aktiivsuse piiramiseks ajus

GSK3β Ser 389 fosforüülimise rolli uurimiseks ajus kasutasime GSK3β Ser 389 Ala knockin (GSK3β KI) hiiri, kus Ser 389 asendati Alaga, et vältida selle jäägi fosforüülimist ja blokeerida GSKβ reguleerimine selle mehhanismi abil (Thornton et al., 2016). Western blot analüüs kinnitas, et homosügootsetes GSK3β KI hiirtes puudub kogu ajus fosfo-Ser 389 GSK3β, samas kui heterosügootsetes GSK3β KI hiirtes olid normaalsed tasemed (joonis 2a). Ser 389 Ala mutatsioon ei mõjutanud GSK3β Ser 9 fosforüülimist (joonis 2a), näidates täiendavalt, et need kaks rada on üksteisest sõltumatud. GSK3β KI hiirte ja WT hiirte vahel aju üldises anatoomias märgatavaid erinevusi ei täheldatud (joonis 2b). Immunovärvimisanalüüs neuronite kahe standardmarkeri NeuN ja III klassi β-tubuliini / Tuj1 abil ei näidanud WT ja GSK3β KI hiirte neuronite tiheduses järske erinevusi ajukoores ja hipokampuses (joonis 2c). Seega ei avalda Ser 389 fosforüülimise blokeerimine suurt mõju aju neuronaalsele homöostaasile.

Image

Suurenenud tuuma GSK3β aktiivsus GSK3β Ser 389 Ala KI hiirte ajus. (a) WT aju, heterosügootsete (Het) ja homosügootsete GSK3β KI hiirte täisrakulüsaate analüüsiti Western blot analüüsi abil P-Ser 389 GSK3β, P-Ser 9 GSK3β ja kogu GSK3β suhtes. (b) WT ja GSK3β KI hiirte ajud. c) Immunvärvimine NeuN ja Tuj1 (II klassi β-tubuliin) jaoks kui küpste neuronite markerid WT ja GSK3β KI ajukoores ja hipokampuses. Näidatud on CA1, CA3 ja dentate gyrus (DG). Valged kastid tähistavad piirkondi, mis vastavad suurendusega piltidele. (d) GSK3β kinaasi aktiivsus, kasutades lülisateid WT ja GSK3β KI hiirte ajukoorest ( n = 9). (e) GSK3β kinaasi aktiivsus WT ja GSK3β KI hiirte hipokampuse tuuma- ja tsütosoolsetes ekstraktides ( n = 3). (*) tähistab P- väärtust <0, 05, mis on määratud t- testiga.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Näitamaks, et Ser 389 fosforüülimine aitab ajus hoida GSK3β kinaasi aktiivsust, mõõtsime WT ja GSK3β KI hiirte GSK3β kinaasi aktiivsust ajukoes. Vaatamata niigi kõrgele kinaasi aktiivsusele, suutsime GSK3β KI hiirte ekstraktides tuvastada kinaasi aktiivsuse märkimisväärset suurenemist võrreldes aktiivsusega WT hiirtel (joonis 2d). Et käsitleda GSK3β Ser 389 fosforüülimise rolli tuuma aktiivsuses vs GSK3β tsütosoolset kogumit, uurisime GSK3β aktiivsust WT ja GSK3β KI hiirte aju tuuma- ja tsütosoolsetes ekstraktides. Kooskõlas fosfo-Ser 389 GSK3β tuuma lokaliseerimisega oli tuuma GSK3β aktiivsus GSK3β KI hiirtes märkimisväärselt kõrgem kui WT hiirtel (joonis 2e). Seevastu ei olnud GSK3β KI hiirtel tsütosoolse GSK3β aktiivsus suurenenud (joonis 2e). Seega on GSK3β fosforüülimine Ser 389-l mehhanism ajus toimuva GSK3β inaktiveerimiseks.

Ajukoores ja hipokampuses asuva neuronaalse alamkomplekti ellujäämiseks on vajalik GSK3β fosforüülimine Ser 389-l

On tõestatud, et tugevdatud GSK3β aktiivsus soodustab närvirakkude surma (Bijur et al, 2000). Ehkki GSK3β KI aju üldist anatoomiat ei muudetud (joonis 2b), selgus hematoksüliini ja eosiiniga (H&E) värvitud lõikude histoloogilisel uurimisel mõnede eosinofiilsete (tumedamate) neuronite olemasoluga püknootiliste tuumadega GSK3β KI teatud ajupiirkondades. hiired (joonis 3a). Eosinofiilsed neuronid olid eriti silmatorkavad tsingulaarses ja eesmises korteksis (joonis 3a - ajukoored 1 ja täiendav joonis S1), CA1 piirkonnas (joonis 3a) ja dentaadiga gyrus (lisajoonis S2) hipokampuse moodustumisel, amügdala ja entorinaalses ajukoores (joonis 3a - joonis 3a) ja joonis 3 Täiendav joonis S3) ja stria terminaali ja hüpotalamuse voodituum (andmeid pole näidatud). GSK3β KI hiirtel aga eosinofiilsed neuronid puudusid teistes ajupiirkondades, näiteks parietaalses ajukoores (joonis 3a, ajukoores 2) ja hipokampuse CA3 piirkonnas (joonis 3a). Nende rakkude morfoloogia on iseloomulik sellele, mida inimese aju patoloogias määratletakse kui "tumedaid neuroneid" ja tähistab neurodegeneratiivseid rakke (Garman, 2011). Pimedate neuronite piiratud jaotus viitab sellele, et määratletud neuroniringis olevad neuronid on mõjutatud.

Image

Neuronite halvenenud ellujäämine GSK3β Ser 389 Ala KI hiirtel. (a) WT H- ja E-värvitud osa (madal suurendus). 1. lahter tähistab 'Cortex 1' piirkonda ja 2. Lahtrit. 'Cortex 2' piirkonda. Näidatud on CA1, CA3 ja dentate gyrus (DG). WT ja GSK3β KI ajukoore H & E-ga värvitud lõikude (1 ja 2) ning hipokampuse CA1 ja CA3 alampiirkondade suurem suurendus. (b) Immunvärvimine fosfo-Ser 389 GSK3β jaoks WT ja GSK3β KI ajukoores ja CAI hipokampuse alampiirkonnas. c) WT ja GSK3β KI ajukoore ja hipokampuse CA1 alampiirkonna lõikude fluoro-Jade C (roheline) ja DAPI (sinine) värvimine. (d) P-Ser 389 (punane), yH2AX (roheline) ja DAPI tuumavärvimise (sinine) jaoks WT-koore immuunvärvimine. Nii P-Ser 389 kui ka γH2AX (valge) koosvärvimisega rakud on tähistatud tärniga (*).

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Uurimaks, kas Ser 389 fosforüülitud GSK3β jaotus WT hiirtes oli korrelatsioonis alampiirkondadega, kus tumedad neuronid eelistatavalt akumuleeruvad GSK3β KI hiirtes, viisime läbi fosfo-Ser 389 GSK3β immunovärvimise. Kõrgeim fosfo-Ser 389 GSK3β immunovärvimine leiti WT hiirte peaajukoores ja hipokampuse piirkonnas, mis korreleerusid GSK3β KI hiirte piirkondadega, kus tumedate neuronite sagedus oli kõrgem (joonis 3b). Fosfo-Ser 389 GSK3β värvimise spetsiifilisust näitas selle puudumine GSK3β KI hiirte ajus (joonis 3b).

Näitamaks, et GSK3β KI ajudes esinevad tumedad rakud esindavad degeneratiivseid neuroneid, värviti WT ja GSK3β KI hiirte aju sektsioonid Fluoro-Jade C-ga, neurodegeneratsiooni visualiseerimiseks kasutatava kuldstandardi värviga (Schmued et al., 2005). WT hiirte ajudes oli fluoro-Jade värvumine praktiliselt tuvastamatu (joonis 3c). Seevastu GSK3β KI ajus oli peaajukoore ja hipokampuse piirkondades olemas selge fluoro-Jade värvumine (joonis 3c) ja need piirkonnad korreleerusid piirkondadega, kus tumedaid rakke oli rikkalikumalt. Oleme varem näidanud, et vastusena endogeensele DNA-le DSB fosfo-Ser 389 GSK3β lokaliseerub γH2AX-ga, mis on DSB väljakujunenud marker (Thornton et al, 2016). Mitmed hiljutised uuringud on näidanud DSB olemasolu neuronites isegi normaalse aju aktiivsuse ajal (Suberbielle et al, 2013; Madabhushi et al, 2015). Et teha kindlaks, kas fosfo-Ser 389 GSK3β suhtes positiivsed rakud sisaldavad DSB, viisime läbi fosfo-Ser 389 GSK3β ja γH2AX kaasimmunomärgistamise. Phospho-Ser 389 GSK3β ja yH2AX paiknesid tsingulaarse ajukoore rakkudes koos, osutades sellele, et fosfo-Ser 389 GSK3β suhtes positiivsed rakud sisaldavad ka DSB (joonis 3d ja täiendav joonis S4). Seega aitab tuuma GSK3β inaktiveerimine Ser 389 fosforüülimise kaudu aju selektiivsetes piirkondades jaotatud DSB-d potentsiaalselt läbivate neuronite alamhulga sobivusele.

P38a MAPK tingliku kustutamise tulemused neuronaalse alamkomplekti degeneratsioonil

Ehkki GSK3β Ser 9 fosforüülimist vahendab Akt, vahendab GSK3β Ser 389 fosforüülimist p38 MAPK (Thornton et al., 2008, 2016). Uurisime, kas GSK3β inaktiveerimise nurjumisel p38 MAPK kaudu võib olla sarnane mõju neuronite ellujäämisele. Kasutasime geneetiliselt muundatud hiirte p38a MAPK geeniga, mis oli neuronites spetsiifiliselt häiritud (p38αΔ-N) Cre rekombinaasi ekspressiooni kaudu kaltsiumist / kalmododuliinist sõltuva proteiinkinaasi II (CAMKII) geeni promootori kontrolli all (Colié et al, 2017). . Western blot analüüs kinnitas p38a MAPK ekspressiooni vähenemist nii ajukoores kui ka hipokampuses (joonis 4a). P38αA-N hiirtel aju üldmorfoloogia ei muutunud (joonis 4b). Western blot analüüs näitas p38αA-N hiirte lüsaatide fosfo-Ser 389 GSK3β märkimisväärset vähenemist võrreldes WT hiirtega, mis näitab, et GSK3β fosforüülimine ajus Ser 389 on p38α MAPK-st sõltuv (joonis 4c). H&E värvimise uurimisel selgus p38aΔ-N hiirte ajukoores tumedate neuronite suurem sagedus võrreldes WT hiirtega (joonis 4d). Lisaks tuvastati p38αA-N-hiirte ajukoores suurenenud arv fluoro-Jade-positiivseid rakke (joonis 4e ja täiendav joonis S5). Need tulemused näitavad koos, et p38a MAPK kadu korreleerub GSK3β Ser 389 vähenenud fosforüülimisega ja neuronite alamhulga vähenenud ellujäämisega, mis on sarnane GSK3β KI hiirtel.

Image

Neurodegeneratsioon neuronispetsiifilistes p38a MAPK KO hiirtes. (a) WT ja p38αA-N hiirte ajukoorest ja hipokampusest saadud rakulüsaate analüüsiti p38a MAPK Western blot analüüsi abil, kasutades laadimiskontrolliks aktiini. (b) WT ja p38αA-N hiirte aju representatiivsed pildid. (c) Metsiktüüpi WT ja p38aA-N hiirte aju täisrakulüsaate analüüsiti P-Ser 389 GSK3β, p38α MAPK, P-Ser 9 GSK3β ja kogu GSK3β Western-blot analüüsiga. (d) WT ja p38αΔ − N ajukoore ja CA1 H&E-ga värvitud lõigud. Kastiga piirkonnad näitavad ajukoore pindala suurendatuna (keskmised paneelid). (e) fluoro-Jade C (roheline) ja DAPI (sinine) sektsioonid WT ja p38αΔ-N ajukoorest.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Aju Ser 389 fosforüülimise kaudu GSK3β inaktiveerimise ebaõnnestumine soodustab surma nekroptoosiga

Kõige paremini iseloomustatud mehhanism GSK3β rakusurma vahendamiseks on β-kateniini fosforüülimine tsütosoolis, mis põhjustab selle valgu kiiret lagunemist APC kompleksi poolt (Filali et al., 2002; Liu et al., 2002). Uurisime, kas ß-kateniini tasemed GSK3β KI hiirte ajus on vähenenud. Western blot analüüs ei näidanud erinevust β-kateniini tasemetes WT ja GSK3β KI aju vahel (joonis 5a). GSK3β võib soodustada ka rakusurma, säilitades ellujäämise soodustava teguri Mcl-1 lagunemise läbi selle fosforüülimise Ser 159-l (hiire Ser 140 ) (Maurer et al., 2006). Kuna on tõestatud, et Mcl-1 puudulikkus soodustab ka neuronaalsete rakkude surma vastusena DSB-le (Arbor et al, 2008), uurisime Wlot ja GSK3β KI hiirte Mcl-1 taset ajus Western blot analüüsi abil. Huvitav on see, et erinevalt β-kateniinist, olid Mcl-1 tase GSK3β KI hiirtel silmatorkavalt vähenenud võrreldes WT hiirtega (joonis 5a). GSK3β suurenenud aktiivsuse edasiseks näitamiseks nendel hiirtel uurisime GSK3β sihtmärgiks oleva Mcl-1on Ser 140 fosforüülimist. Vaatamata GSK3β KI hiirtel tuvastatud väga madalale Mcl-1 tasemele oli fosforüülitud Mcl-1 suhe suurem kui WT hiirtel (joonis 5b). Seega põhjustab tuuma GSK3β inaktiveerimise läbi selle raja suurenenud fosforüülimine ja Mcl-1 lagunemine ajus. Kuna mitokondriaalne Mcl-1 kaitseb apoptoosi eest, uurime Western blot analüüsi abil aktiivse kaspaas 3 olemasolu. Kuid aktiivse kaspaas 3 sisaldus oli ajus väga madal ning WT ja GSK3β KI hiirte vahel polnud erinevusi (joonis 5c), mis viitab sellele, et GSK3β KI hiirtel täheldatud neurodegeneratsioon ei pruugi toimuda apoptoosi kaudu.

Image

Vähenenud Mcl-1 ja suurenenud nekroptoos GSK3β S 389 Ala KI hiirte ajudes. (a) β-kateniini, Mcl-1, P-Ser 389 GSK3β ja kogu GSK3β uuriti Western blot analüüsi abil aju lüsaatides WT ja GSK3β-KI hiirtelt. GAPDH on kuvatud laadimiskontrollina. (b) Graafik, mis näitab P-Mcl-1 ja Mcl-1 suhet Western blot analüüside densitomeetriast, uurides P-Mcl ja Mcl aju lüsaatides WT ja GSK3β-KI hiirtelt. (c) WT ja GSK3β-KI hiirte aju lüsaatide kaspaas 3 Western blot analüüs. GAPDH on kuvatud laadimiskontrollina. (d) RIPK3 (punane) ja DAPI tuumavärvuse (sinine) esinemist hiire ajukoores uuriti immunovärvimise ja mikroskoopia abil. (e) WT ja GSK3β-KI hiirte aju lüsaatide fosfor-MLKL Western blot analüüs. GAPDH on kuvatud laadimiskontrollina. Parempoolsel paneelil kuvatakse fosfo-MLKLi densitomeetria.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

GSK3β KI hiirte B-rakkudes on tuuma Mcl-1 vähenenud taset seostatud suurenenud nekroptoosiga (Thornton et al, 2016), mis on alternatiivne surmatee, mis ei sõltu mitokondritest, kuid sõltub seriin-treoniini kinaasidest RIPK1 ja RIPK3 (Tait et al., 2014). Nekroptoosi on leitud mõnedest neuronitest, kus RIPK3 valikuliselt siirdub tuuma (Tait jt, 2014; Vitner jt, 2014). Seetõttu uurisime RIPK3 GSK3β KI hiirte ajudes immunovärvimise ja konfokaalse mikroskoopia analüüsi abil. Võrreldes WT hiirtega tuvastati RIPK3 suurenenud tuumavärvimine GSK3β KI hiirte ajukoores (joonis 5d ja täiendav joonis S6), toetades GSK3β KI hiirte nekropoosi suuremat ulatust. Nekroptoosi korral fosforüülib aktiveeritud RIPK3 MLKL, mis on üks membraanile siirduvate nekroptoosi vahendajatest, põhjustades membraani purunemist ja surma (Rodriguez et al, 2015). Fosfo-MLKL analüüs Western blot analüüsiga näitas suurenenud fosfo-MLKL taset GSK3β KI hiirtel võrreldes WT hiirtega (joonis 5e). Seega viitavad need andmed kokku, et GSK3β inaktiveerimise ebaõnnestumine Ser 389 fosforüülimise kaudu põhjustab mõnes aju alampiirkonnas suurenenud nekroptoosi.

Ruumimälu ja ärevus- / depressioonitaoline käitumine ei muutu GSK3β KI hiirtel

Püknootiliste rakkude olemasolu H&E värvimise ja fluoro-jade märgistamise teel GSK3β KI hiirte hipokampuses ja ajukoores on kooskõlas lokaliseeritud neuronaalse degeneratsiooniga. Arvestades tuvastatud hipokampuse neurodegeneratsiooni, hindasime töötulemusi ves labürindis, mis oli hipokampusest sõltuv õppeülesanne (Morris jt, 1982). WT ja GSK3β KI hiiri õpetati 8 päeva jooksul sukeldatud platvormi leidmiseks neli katset päevas. Toimivus paranes seansside (päev f (2, 56) = 80, 75, P <0, 0001) jooksul, ehkki genotüübil (genotüüp f (1, 28) = 1, 338, P > 0, 05) ega interaktsioonil (päev × genotüüp f (2 ) puudus mõju , 56) = 1, 37, P > 0, 05), mis näitab, et hipokampuse ruumiline õppimine oli WT ja GSK3β KI hiirtel sarnane (joonis 6a). Veelabürindis saab ruumimälu mõõta ka sondikatse abil, mille käigus platvorm eemaldatakse ja kvantitatiivselt arvutatakse platvormi üldises piirkonnas veedetud aeg. GSK3β KI ja WT hiired kulutasid platvormi kvadrandis otsimisel sarnast aega ( t (28) = 0, 45, P > 0, 05) (joonis 6b). Lisaks oli sobivas kvadrandis otsimiseks kulunud aeg igas rühmas suurem kui tõenäosus (WT t (14) = 3, 61, P <0, 01, KI t (28) = 3, 36, P <0, 01) (joonis 6b). Lisaks, kui platvorm viidi uude kohta, toimisid hiired taas samamoodi. Nelja uuringu jooksul vähendati läbitud vahemaad ( f (3, 84) = 9, 97, P <0, 0001), kuid WT ja GSK3β KI hiirte vahel erinevust ei olnud ( f (1, 28) = 0, 44, P > 0, 05) või interaktsioon ( f (3, 84) = 0, 63, P > 0, 05) (joonis 6c).

Image

Hipokampusest sõltuv ruumiline mälu ning ärevus- ja depressioonitaoline käitumine GSK3β Ser389 KI hiirtel ei mõjuta. a) Veelabürint on ruumiline navigeerimisülesanne, mis sõltub hipokampuse terviklikkusest. Hiired koolitati peidetud platvormi leidmiseks nelja katse jooksul iga päev 8 päeva jooksul. b) Sondi katset, mille käigus platvorm eemaldatakse, saab kasutada platvormi asukoha mälu hindamiseks (punktiirjoon tähistab juhuslikku jõudlust). c) Kognitiivse paindlikkuse mõõtmiseks viidi platvorm ümberpööramiskatsete uude asukohta. d) Lokomotoorse aktiivsuse ja e) keskpunkti aeg avakatsel. f) Aeg avatud kvadrandis ja g) ja sisenemised avatud kvadrandisse null-labürindi katse ajal. h) sunnitud ujumisperioodil mõõdetud liikumatuse aeg. Andmed on keskmised ± SEM.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Mõned aruanded osutavad hipokampuse mahu vähenemisele, mis näitab närvi atroofiat, hipokampuses inimestel, kellel on stressiga seotud haigused, näiteks depressioon (Sheline et al, 1999). Seetõttu võib GSK3β KI hiirtel täheldatud neuronaalne kaotus mõjutada ka ärevust ja depressioonilaadset käitumist. Avatud katses hinnatakse nii lokomotoorset aktiivsust kui ka ärevusetaolist käitumist. 10-minutise avaväljakatse korral läbisid GSK3β KI ja WT hiired sarnaseid vahemaid ( t (18) = 0, 61, P > 0, 05) (joonis 6d), mis näitab, et GSK3β KI hiirte liikumist ei mõjutanud. Edasi sisenes iga rühm samaväärselt areeni keskpunkti ( t (18) = 0, 71, P > 0, 05) ja veetis võrdselt aega avatud välja keskpunkti uurimisel ( t (18) = 1, 70, P > 0, 05) (joonis 6e ), mis näitab sarnast ärevuse taset WT ja GSK3β KI hiirte vahel. Null labürint on veel üks ärevuse test, mille käigus hiired uurivad suletud osadega tõstetud ümmargust rada vastassuunalistes kvadrantides 5 minuti jooksul. Ärevust määratletakse kui vähendatud avatud kvadrandi aega või vähendatud avatud kvadrandi sisestust. Nii avatud kvadrandi sisestused ( t (18) = 0, 63, P = 0, 54) (joonis 6f) kui ka avatud kvadrandi aeg ( t (18) = 0, 85, P = 0, 41) (joonis 6g) olid GSK3β KI ja WT hiirte vahel sarnased, pakkudes veelgi kinnitus, et ärevuslaadne käitumine oli tüvede vahel sarnane.

Sunnitud ujumiskatse on depressiooni levinum mudel, mis mõõdab liikumatuse kaudu käitumuslikku meeleheidet, kusjuures suurenenud liikumatuse aeg viitab suurenenud depressioonile (Bogdanova et al, 2013). Umbes minutilise sundkäitumise analüüs näitas, et liikumatus suurenes 6-minutise testi hilisemates osades (Minute f (5, 90) = 24, 54, P <0, 0001), kuid GSK3β KI hiirte ja WT hiirte vahel ei olnud erinevust ( f (1, 18) = 0, 23, P > 0, 05) (joonis 6h). Seega ei avalda GSK3β KI hiirtel täheldatud piirkondlik neuronaalne degeneratsioon lokomotoorset aktiivsust, üldist ärevust ega depressioonitaolist käitumist.

Ser 389 fosforüülimise kaudu GSK3β inaktiveerimise ebaõnnestumine põhjustab liialdatud ja püsivat konditsioneerimishirmu

Vähenenud hipokampuse mahtu on kirjeldatud ka PTSD põdevatel inimestel (Gilbertson et al, 2002). Hirmu konditsioneerimine on väga konservatiivne käitumine, mida määratletakse hirmureaktsioonina (nt näriliste külmetamine) varem mitteohtlikule stiimulile (konditsioneeritud stiimul), mis on ühendatud aversiivse stiimuliga (tingimusteta stiimul). Düsreguleeritud hirmurežiim on iseloomulik stressiga kokkupuutumise mudelitele, mida kasutatakse närilistel selliste häirete modelleerimiseks nagu PTSD (Izquierdo jt, 2006; Baran jt, 2009; Hoffman jt, 2014). Hirmu konditsioneerimine sõltub amügdalast (LeDoux, 2003; Davis, 2006; Kim ja Jung, 2006; Duvarci ja Pare, 2014), kuid seda mõjutab ka hipokampus kahe piirkonna vastastikuste seoste kaudu (Maren, 2001). Seetõttu uurisime GSK3β KI hiirte reageerimist kuulmishirmu ilmnemisele võrreldes WT hiirtega. Selles käitumiskatses anti hiirtele rea tooni sidumisi, millele järgnes vahetult kerge jalgade löök eristatavas kontekstis (st treenimiskambris). Nii GSK3β KI hiirtel kui ka WT hiirtel ilmnes pärast esimest tooni suurenev hirmureaktsioon tooni esitamisele ( f (5, 90) = 27, 99, P <0, 0001) ja kahe rühma vahel polnud erinevust ( f (1, 18) = 1, 06, P > 0, 05) või interaktsioon ( f (5, 90) = 1, 70, P > 0, 05) (joonis 7a). Seega kulges konditsioneeritud hirmu saamine GSK3β KI ja WT hiirtel samaväärselt. Konditsioneeritud hirmu testimiseks tehti mäluhiirtele paar testi, alustades 24 h pärast konditsioneerimist ja eraldades 24 h. Treeningkambri ja jalgade löögi vahelise seose (kontekstipõhise hirmu konditsioneerimise) testimiseks paigutati hiired treeningkambrisse ja neil lubati uurida ilma tooni esitamata. Huvitav on see, et GSK3β KI hiired külmutasid treeningkambrisse selgelt rohkem kui WT hiired ( t (18) = 3, 18, P <0, 01) (joonis 7b). Seost tooni ja jalgade šoki vahel (kuulmishirmu reguleerimine) uuriti uues kambris, kus 2-minutilisele lähtejoonele eelnenud perioodile järgnes toon, mis oli varem olnud seotud jalahooga. Ka GSK3β KI hiirtel ilmnes suurem tingimuslik hirm, kui toon oli esitatud uudses kontekstis ( t (18) = 2, 68, P <0, 05) (joonis 7c). Need tulemused kokku viitavad sellele, et võimetus fosforüülida Ser 389 GSK3β KI hiirtel põhjustab liialdatud hirmu muutumist nii kontekstuaalseteks kui ka kuuldavaks.

Image

GSK3β S 389 Ala KI hiirtel on ägenenud hirmureaktsioon. a) Hirmu vähendamise omandamine treeningu ajal, kus on viis heli-šoki paari. (b) Kontekstuaalne hirmu väljendus pärast koolituskonteksti naasmist. c) Toonkartuse väljendus tooni esitluse ajal uudses kontekstis. d) hirm väljenduse ees vahetult pärast kokkupuudet treeningkontekstiga, võrreldes väljendiga uudsesse konteksti paigutamisel. e) Toonist ajas sõltuvad muutused kardavad väljendit 3-minutise tooni esitluse ajal ja vahetult pärast seda uudses kontekstis. Andmed on keskmised ± SEM, olulisus määrati t- testiga (* P <0, 05, ** P <0, 01).

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

PTSD üks komponent on patoloogiline protsess, mille käigus kattuvad tunnused turvalises keskkonnas põhjustavad hirmu ülekandumist traumaatilisest sündmusest (üldistamine) (American Psychiatric Association, 2000). Seega, et täiendavalt uurida GSK3β KI hiirte liialdatud hirmukäitumist, võrdlesime käitumise esimesi 2 minutit pärast hiirte treenimiskambrisse toomiseelset algperioodi algust uudses kambris. Treeningkontekstiga uuesti kokkupuute esimese 2 minuti jooksul külmetasid GSK3β KI hiired rohkem kui WT hiired ( t (18) = 2, 87, P <0, 01) (joonis 7d). Ehkki uudse kambri ja treeningkambri vaheline diskrimineerimine oli ilmne mõlemas rühmas (GSK3β KI, t (9) = 4, 25, P <0, 01; WT, t (14) = 3, 86, P <0, 01), oli hirm selgelt üle kantud. GSK3β KI hiired (joonis 7d). GSK3β KI hiired kulutasid pärast uue konteksti tutvumist rohkem aega külmutamist kui WT hiired ( t (9) = 2, 53, P <0, 05) (joonis 7d). Seega on GSK3β KI hiirtel täheldatud tugevdatud hirmu konditsioneerimine samaaegselt hirmu ennetamise kogemuse üldisema üldistumisega.

Konditsioneeritud hirmu avaldumise püsivus on iseloomulik ka stressiga seotud häiretele, näiteks PTSD (Wessa ja Flor, 2007). Tingitud hirmu püsivuse uurimiseks GSK3β KI hiirtel analüüsiti uutes kambris 3-minutise tooni blokeerimise igal minutil, samuti pärast testi lõppu pärast tooni lõppemist. Toon tingis olulise külmumise peale ja väljaspool ainuüksi uudses kontekstis esile toodud joonis (joonis 7e). GSK3β KI ja WT hiired külmusid sarnaselt esimese 2 minuti tooni esitamisega. Kuigi toon-hirm vähenes WT hiirtel kiiresti, püsis hirm märkimisväärselt GSK3β KI hiirtel ( t (18) = 3, 62, P <0, 01) (joonis 7e). See püsiv hirm ilmnes isegi minuti jooksul pärast tooni lõppemist ( t (18) = 2, 22, P <0, 05) (minut 4; joonis 7e). Need tulemused näitavad koos, et üldine hirmu parandamise vastus on GSK3β KI hiirtel tugevalt võimendatud ja pikenenud - see on kaalukas fenotüüp, arvestades fookuskaugust hipokampuse neurodegeneratsiooni täheldatud GSK3β KI ajusid.

Arutelu

Ehkki GSK3 tuvastati peaaegu kolm aastakümmet tagasi, on sellest vaid viimastel aastatel saanud üks silmapaistvamaid terapeutilisi sihtmärke, peamiselt neuroloogiliste haiguste ja vähi valdkonnas, nagu näitab ravimitööstuse huvi ja avaldatud arv patendid (Palomo ja Martinez, 2016). Enamik lähenemisviise GSK3 aktiivsuse reguleerimisele põhineb kõige paremini iseloomustatud mehhanismil, mille abil Akt fosforüülitakse SerK (GSK3β) või Ser 21 (GSK3α) kaudu GSK3 inaktiveerimiseks (Stambolic ja Woodgett, 1994; Cross et al., 1995). Kuid me oleme varem näidanud, et GSK3β, kuid mitte GSK3α, saab inaktiveerida ka p38 MAPK poolt fosforüülimisel C-terminaalses Ser 389 (hiir) / Thr 390 (inimene) ja selle mehhanismi inhibeerimise suurus on võrreldav Ser 9 Akt-vahendatud fosforüülimine (Thornton et al, 2008). Huvitav on see, et vastupidiselt Ser 9 fosforüülimisele on GSK3β Ser 389 / Thr 390 fosforüülimine tuvastatav ainult spetsiifilistes kudedes, ajus on kõrgeim fosfo-Ser 389 GSK3β sisaldus (Thornton et al, 2008). Meie leiud siin näitavad, et GSK3β Ser 389 fosforüülimisel on kindel roll GSK3β aktiivsuse piiramisel ja neuronite elujõulisuse säilitamisel, mis ei sõltu Ser 9 fosforüülimisest. Kui GSK3β Ser 9 fosforüülimine tuvastatakse nii tsütoplasmas kui ka tuumas, siis GSK3β Ser 389 fosforüülimine on peamiselt tuuma. Ser 9 fosforüülimine ja Ser 389 fosforüülimine tuvastatakse GSK3β erinevates kogumites ja Ser 9 fosforüülimine ei suuda korvata Ser 389 fosforüülimise kaotust ajus. Ser 389 Ala GSK3β KI hiirtest leitud neurodegeneratiivset fenotüüpi ei ole Ser 9 Ala GSK3β KI hiirtel registreeritud (Hongisto et al., 2008; Eom ja Jope, 2009). Seega reguleerivad GSK3β Ser 389 ja Ser 9 inhibeerivad fosforüülimised GSK3β eraldiseisvaid kogumeid, mis kontrollivad ajus erinevaid signaaliülekande teid.

Fakt, et Ser 389 ja Ser 9 fosforüülimine on suunatud GSK3β erinevatele füüsikalistele kogumitele, viitab sellele, et need reageerivad erinevatele stiimulitele. Meie hiljutised uuringud on näidanud, et GSK3β inaktiveerimise Ser 389 fosforüülimise teel käivitab spetsiifiliselt DSB, mis on loodud välistest stiimulitest või endogeensetest protsessidest (nt T-raku retseptori geenide V (D) J rekombinatsioon tümotsüütides) (Thornton et al, 2016 ). See selgitab, miks fosfo-Ser 389 GSK3β ei tuvastatud enamikus kudedes normaalsetes füsioloogilistes tingimustes (Thornton et al, 2008). Ehkki DNA DSB-d on normaalses ajus keeruline tuvastada, usuti, et DSB-d tekivad, kuid ülitõhus DNA parandamise süsteem takistas DSB-de kogunemist ajus (McKinnon, 2009). Hulk hiljutisi uuringuid on andnud kindlaid tõendeid DSB olemasolu kohta ajus. Normaalse neuronaalse aktiivsuse tulemuseks on DSB teke, ehkki DSB induktsiooni mehhanismi ei uuritud (Suberbielle et al, 2013). Pealegi nõuab neuronite varajase reageerimise geenide alamhulk DSB moodustumist nende ekspressiooniks, mis on kriitiline mälu ja õppimisega seotud kogemuspõhiste muutuste jaoks (Madabhushi et al, 2015). On tõestatud, et neuraalsed tüvi- / eellasrakud sisaldavad korduvaid DSB-klastrid pikkade närvigeenide sees (Wei et al, 2016). Siin näidatakse, et piirkonnas, kus tuvastame rikastatud tumedaid neuroneid GSK3β KI hiirtel, lokaliseerub fosfo-Ser 389 GSK3β koos DSB markeriga γH2AX. It is possible that cells within the regions where dark neurons are detected in the GSK3β KI mice may define a circuit that contains cells more prone to DSB, thus more sensitive to failure to inactivate GSK3β through phosphorylation on Ser 389 . This could explain why only specific regions and not all neurons are affected in the GSK3β KI mice. In the context of the stress-associated fear conditioning phenotype that we show here, it is interesting that exposure to stress hormones can also lead to DSB accumulation (Hara et al, 2011). Thus, the constitutive phosphorylation of GSK3β on Ser 389 in the brain is likely maintained by the ongoing generation of DSB in neurons to attenuate the abundant GSK3β activity present in the brain.

Normally DSB are associated with cell death. However, we have shown that phosphorylation of GSK3β at Ser 389 leads to increased cell survival and protecting cells from cell death caused by DSB generated by external stimuli and internal processes (Thornton et al, 2016). While a number of studies have addressed DSB in the brain, none have addressed how cells survive this constant generation of DSB. Here we show that inactivation of GSK3β through phosphorylation at Ser 389 can be a novel mechanism to provide protection to prevent neuronal cell death during DSB repair. The increased cell death found in certain regions of the brain in Ser 389 Ala GSK3β KI mice has not been reported in Ser 9 Ala GSK3β KI mice, indicating that this is a unique mechanism to control survival in the brain. Interestingly, similar to the death induced by endogenously generated DSB in B cells, the death observed in the brains of GSK3β Ser 389 Ala KI mice seems to be through necroptosis more than apoptosis. Necroptosis has also been reported to occur in the brain in other studies (Vitner et al, 2014; Zhao et al, 2015). Since DSB have been reported to promote necroptosis (Biton and Ashkenazi, 2011; Tenev et al, 2011), failure to inactivate GSK3β through Ser 389 phosphorylation in response to DSB likely contributes to the increased necroptosis found in the brains of GSK3β Ser 389 Ala KI mice.

Despite the presence of hippocampal neuronal degeneration in the GSK3β Ser 389 Ala KI mice, no impact on spatial memory or learning was observed. Locomotor activity was also normal. Failure to phosphorylate GSK3β at Ser 389 did not affect anxiety or depression-like behavior either. However, we show that GSK3β Ser 389 Ala KI mice display overgeneralized and persistent fear. This suggests that there may be undetermined specificity to the subset of affected neurons in GSK3β KI mice. Overgeneralization of fear and failure to extinguish responses to fear-associated cues is common in PTSD (Wessa and Flor, 2007). These altered fear responses are also found in rodent stress exposure models used to model this human disorder (Izquierdo et al, 2006; Baran et al, 2009; Hoffman et al, 2014). A brain circuit with the amygdala at its core and involving the hippocampus and several cortical areas (eg, frontal, entorhinal, piriform, infralimbic) is involved in fear learning and extinction. Thus, disruption of this circuit caused by dispersed neurodegeneration in GSK3β KI mice may be the underlying cause of the persistent and generalized fear phenotype. Mice with alanine substitutions blocking N-terminal Ser 9 inhibitory phosphorylation of both GSK3β and GSK3α have been shown to have a complex behavior phenotype with an increased anxiety and depression-like phenotype (Polter et al, 2010). The relative contributions of the individual isoforms to this complex behavior phenotype have not been reported.

Taken together our data show that phosphorylation of GSK3β at Ser 389 by p38 MAPK promotes the survival of a subset of neurons critical for modulating the conditioned fear response. It is important to note that there is a common polymorphism (around 48% allele frequency) in the human GSK3β gene that results in the expression of a GSKβ protein lacking the Thr 390 regulatory site (Rs6438552). The T allele is associated with altered splicing such that exon ll (containing the coding region for Thr 390 ) is deleted (Kwok et al, 2005). This allele is associated with enhanced GSK3β activity and has been linked to neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease, bi-polar disorder, and major depressive disorder (Kwok et al, 2005; Kalinderi et al, 2011; Liu et al, 2012; Lin et al, 2013; Yuan et al, 2013). Therefore, increased expression of GSK3β lacking the Thr 390 inhibitory phosphorylation site in humans may impair neuronal survival and contribute to neurological disease. While interest in targeting GSK3 to treat neurological disease has been growing in recent years, the selectivity of this pathway for nuclear GSK3β (in the context of DSB) and the PTSD-like behavior observed make it a more appealing target to manipulate cell survival for specific neurodegenerative diseases. The design of new therapies that specifically target C-terminal Thr 390 phosphorylation of nuclear GSK3β could facilitate the development strategies with potentially greater specificity.

Rahastamine ja avalikustamine

This work was supported by NIH grant R01 AI051454 (to MR) and the Consolider grant CSD2010-00045 from the Spanish Ministerio de Economia y Competitividad (MINECO) (to ARN). Autorid ei kuuluta huvide konflikti.

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav materjal

    Supplementary Material accompanies the paper on the Neuropsychopharmacology website (//www.nature.com/npp)