Emx2 vaigistatakse epigeneetiliselt ja see pärsib inimese kopsuvähi kasvu | onkogeen

Emx2 vaigistatakse epigeneetiliselt ja see pärsib inimese kopsuvähi kasvu | onkogeen

Anonim

Õppeained

  • Rakkude signalisatsioon
  • DNA metüülimine
  • Kopsuvähk
  • Kasvaja supressorvalgud
  • Selle artikli parandus avaldati 4. novembril 2010

Abstraktne

Kopsuvähk on levinud vähk ja vähiga seotud surma peamine põhjus kogu maailmas. WNT signaalide hälbiv aktiveerimine on seotud kopsu kartsinogeneesiga. Drosophila tühjade spiraalide geeni inimese homoloog EMX2 on homodomeeni sisaldav transkriptsioonifaktor. EMX2 funktsioon on seotud hiirtel embrüonaalse mustriga WNT signaalimisteega. EMX2 rollist inimese kasvajageneesis on siiski vähe teada. Selles uuringus leidsime, et EMX2 oli kopsuvähi koeproovides dramaatiliselt reguleeritud ja see alandatud seostamine oli seotud EMX2 promootori metüleerimisega. EMX2 ekspressiooni taastamine kopsuvähirakkudes, kus puudub endogeenne EMX2 ekspressioon, pärssis rakkude proliferatsiooni ja invasiivseid fenotüüpe, pärssis kanoonilist WNT signaaliülekannet ja sensibiliseeris kopsuvähi rakke kemotsütotoksilise ravimi tsisplatiini raviks. Teisest küljest soodustas endogeenset EMX2 ekspresseerivate kopsuvähirakkude EMX2 ekspressiooni peatamine rakkude vohamist, invasiivseid fenotüüpe ja kanoonilist WNT signaaliülekannet. Kokkuvõtlikult viitab meie uuring sellele, et EMX2-l võib olla oluline roll inimese kopsuvähi uue supressorina.

Peamine

Ameerika vähiliit loetleb kopsuvähi peamise vähisurma põhjustajana Ameerika Ühendriikides, ületades kõik järgmise nelja kõige surmavama vähktõve, st rinna-, jämesoole-, eesnäärme- ja kõhunäärmevähi kõik ühendatud surmad (American Cancer Society, 2008). Enam kui 80% kopsuvähkidest on mitteväikerakuline kopsuvähk, mis hõlmab selgeid histoloogilisi alatüüpe: adenokartsinoom, lamerakk-kartsinoom ja suurrakuline kartsinoom (Travis, 2002). Tavapärase ravi alustalad on pakkunud patsientidele vaid piiratud ja üldiselt lühiajalist kasu. Üldiselt on viieaastane elulemus kahe aastakümne jooksul püsinud halva ∼ 15% juures (Travis, 2002; Jemal jt, 2008). Kopsuvähi molekulaarset kartsinogeneesi iseloomustavad geeniekspressiooni ja funktsiooni mitmed muutused. Need tulenevad hulgast molekulaarsetest ja morfoloogilistest sündmustest, mis mõjutavad onkogeene nagu K-ras ja EGFR (Fong jt, 2003) ja tuumori supressorgeene nagu p53 ja p16 (Zochbauer-Muller et al., 2000), mis kõik viivad vääramatult edasi. raku signaaliülekande radade ebanormaalsetele muutustele.

Homeoboxi geeniperekond kodeerib transkriptsioonifaktoreid, mis reguleerivad embrüogeneesi ajal morfogeneesi ja rakkude diferentseerumist, aktiveerides või surudes alla sihtgeenide ekspressiooni (Boersma et al., 1999). Lisaks on hiljuti näidatud, et mitmed homeoboxi geenid on seotud vähiga (Raman jt, 2000; Abate-Shen, 2002; Samuel ja Naora, 2005; Yoshida jt, 2006). EMX2 on Drosophila tühjade spiraalide geeni (ems) inimese homoloog, kododomeeni sisaldav transkriptsioonifaktor, millel on varases arengujärgus olulised funktsioonid. Näiteks hiirtel, kellel on EMX2 (EMX2 - / -) homosügootsed mutatsioonid, on väikesed aju poolkerad ja haistmissibulad (Dalton et al., 1989). EMX2 mõjutab täiskasvanu närvi tüvirakkude vohamist, reguleerides sümmeetriliste jaotuste sagedust, mis tekitavad täiskasvanu närvi tüvirakkude populatsioonis kahte tüvirakku, ja EMX2 üleekspressioon vähendab sümmeetriliste jaotuste sagedust (Galli et al., 2002). EMX2 kontrollib imetajate paljunemist, kohandades endomeetriumi rakkude proliferatsiooni, ilma et see mõjutaks diferentseerumist (Taylor ja Fei, 2005). Veelgi enam, on teatatud, et EMX2 funktsiooni kaotamine põhjustab emakavälise WNT1 ekspressiooni areneva imetaja telekehalonis, põhjustades kortikaalset düsplaasiat (Ligon et al., 2003). WNT rajal on teadaolevalt oluline roll embrüogeneesis, tüvirakkude uuenemises ja onkogeneesis (Klaus ja Birchmeier, 2008), sealhulgas kopsuvähi puhul (Mazieres jt, 2004; You jt, 2004; He jt.)., 2005; Huang jt, 2008; Akiri jt, 2009). Viimastel aastatel on olnud vaid piiratud arv uuringuid, mis viitavad EMX2 võimalikule kaasamisele inimese vähki. Näiteks võib EMX2 olla endomeetriumis proliferatsioonivastane ja selle ekspressioon on vähenenud endomeetriumi tuumorites (Noonan jt, 2001, 2003). EMX2-l on samuti metüleerimine, kuid mitte-seminoomides harva (Lind jt, 2006). EMX2 roll tuumorigeneesis on siiski endiselt suuresti teadmata. Selles uuringus soovime uurida EMX2 rolli inimese kopsuvähis.

Esmalt uurisime 64 kopsuvähiga patsiendilt saadud EMX2 mRNA taset inimese kopsuvähi koeproovides ja nende ühilduvates normaalsetes kudedes. Võrdluseks leiti, et analüüsitud 71, 8% -l (46–64) kopsuvähi proovidest oli EMX2 ekspressioon väiksem kui nende vastavate külgnevate normaalsete kudede korral (joonis 1a) ja see allareguleerimine oli statistiliselt oluline (EMX2 ekspressiooni keskmised väärtused mõõdeti kvantitatiivse RT-PCR abil olid vähi kudedes 3, 78 ja 18, 01 ja nende külgnevates normaalsetes kudedes vastavalt ( P <0, 001). EMX2 ekspressiooni vähenemist / puudumist seostati nendel juhtudel järjepidevalt EMX2 promootori hüpermetüleerimisega qMSP abil (joonis 1b näitas 10 paaris koeproovi). Nende tulemuste kontrollimiseks analüüsisime ka EMX2 ekspressiooni ja EMX2 promootori metüleerimise staatust 12 kopsuvähi rakuliinil. Kokku leiti, et 12-st uuritud joonest 10 puudus EMX2 ekspressioon (joonis 1c). Kasutades qMSP, leidsime, et sama 10 rakuliini EMX2 promootor oli samuti metüleeritud (joonis 1d). Järgmisena taastasime metüülimisreaktiivi, 5-asa-2'-desoksütsütidiini (DAC) abil EMX2 ekspressiooni rakuliinides algselt vaigistatud EMX2-ga (joonis 1e). Need andmed näitavad, et epigeneetiline modifikatsioon võib olla üks olulisi mehhanisme EMX2 geeni vaigistamiseks kopsuvähis. Huvitav on see, et hiljuti teatati mitme teise vähiga seotud homeoboxi geeni pereliikme metülatsiooni vaigistamisest. Näiteks tuvastati HOXA5 kasvaja supressori p53 otsese transkriptsiooni aktivaatorina ja HOXA5 summutamise hüpermetüleerimise teel, mille tagajärjel p53 ekspressioon oli piiratud rinnavähi korral (Raman jt, 2000). Leiti, et HOXA9 promootor on sageli mitte-seminomatoomses TGCT-s metüleeritud (Lind jt, 2006). Meie andmed näitasid ka, et mõnel juhul ei olnud EMX2 promootori hüpermetüleerimine korrelatsioonis vähenenud EMX2 ekspressiooniga, mis viitab sellele, et alternatiivsed mehhanismid võivad põhjustada EMX2 alareguleerimist. Tõepoolest, aruanne näitas, et EMX2 transkriptide arvu vähenes endomeetriumi vähkide alarühmas, mille LOH esinemissagedus oli 35% 10Q25, 3 – q26, 1 piirkonnas, mis sisaldas EMX2 geeni. Järjestusanalüüs paljastas mitu EMX2 varianti, sealhulgas somaatilised mutatsioonid ja polümorfismid (Noonan jt, 2001).

Image

EMX2 ekspressioon oli kopsuvähi kudedes ja rakuliinides metüleerimise teel allapoole reguleeritud. Värsked proovid (kopsuvähi kude ja sellega külgnev normaalne kude) koguti patsientidelt, kellele tehti kirurgiline resektsioon, San Francisco California ülikooli inimuuringute komitee (UCSF) heakskiidul. Proovid külmutati kiiresti vedelas lämmastikus ja enne kasutamist hoiti neid temperatuuril –170 ° C. Kogu RNA ekstraheeriti, kasutades TRIzol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kõik inimese kopsuvähi rakuliinid osteti American Type Culture Collectionist (ATCC, Manassas, VA, USA) ja kultiveeriti RPMI 1640 koos 10% veise loote seerumiga, penitsilliini (100 RÜ / ml) / streptomütsiiniga (100 μg / ml) 37 ° C niisutatud 5% CO 2 inkubaatoris. cDNA süntees ja Taqman PCR viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (Raz et al., 2008). Hübridisatsioonisondid ja praimerid (täiendava teabe tabel S1) osteti ettevõttelt Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA, USA). Proovide EMX2 ekspressioon arvutati, kasutades 2- ddCt meetodit (normaliseerides nende majapidamisgeeni GAPDH ja seejärel võrreldes täiskasvanu normaalse kopsukoe kogu RNA-ga (BioChain, Hayward, CA, USA)). Kvantitatiivne metüleerimisspetsiifiline PCR (qMSP) viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Fackler jt, 2004; Grote jt, 2005, 2006). Genoomne DNA ekstraheeriti Qiagen DNeasy komplektidega (Qiagen, Valencia, CA, USA) ja genoomse DNA bisulfit-modifitseerimine viidi läbi EZ DNA Methylation-Gold komplektide abil (Zymo Research, Orange, CA, USA). Praimerid ja sondid (täiendav tabel S1) konstrueeriti, kasutades Primer Expressi ja Methyl Primer Express Software v1.0 (ABI) ning osteti firmalt Operon (Huntsville, AL, USA). Suhtelise EMX2 metülatsioonitaseme määramiseks kasutati 2- dCt meetodit (normaliseerimine majapidamisgeeni ACTB suhtes (Raz et al., 2008)) ja seejärel arvutati suhe (tuumor / kudede normaalne normaalrakud; rakuliin / täiskasvanu normaalne kopsukoe) (BioChain) rakuliinide jaoks). Nii kvantitatiivne RT-PCR kui ka qMSP tehti kolmes eksemplaris, kasutades ABI 7300 reaalajas PCR süsteemi. a ) 64 kasvaja ja nende külgnevate normaalsete kopsukudede kvantitatiivne RT-PCR. Y- telg tähistab normaliseeritud suhtelist EMX2 mRNA ekspressiooni (suvaline ühik). b ) 10 esindusliku kasvaja (mustad ribad) kvantitatiivne RT-PCR (ülemine paneel) ja kvantitatiivne MSP (alumine paneel) võrreldes nende ühilduvate normaalsete kopsukoega (hallid ribad). c ) Kvantitatiivne RT-PCR analüüs ja d ) Kvantitatiivne MSP analüüs kopsuvähi rakuliinides. Kontrollina kasutati täiskasvanu normaalset kopsukoe. Tulemused on keskmised ± sd (vearibad). e ) Kopsuvähi rakuliinide DAC-ravi. Rakuliinide töötlemine 5 μM DAC-ga (Sigma, St Louis, MO, USA) viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Mazieres et al., 2004). Kogu RNA eraldati, kasutades Qiagen RNeasy komplekti, 72 tundi pärast töötlemist ja EMX2 ekspressiooni uuriti poolkvantitatiivse RT-PCR abil (praimereid (täiendav tabel S1) osteti ettevõttest Operon). GAPDH oli RNA kvaliteedi ja laadimise kontroll.

Täissuuruses pilt

Järgmisena uurisime EMX2 rolli kopsuvähirakkude kasvus, milles EMX2 metülatsioon vaigistati. Nädal pärast transfektsiooni ja sellele järgnenud G418 selektsiooni leidsime, et EMX2 taastamine H1299-s põhjustas olulist proliferatiivset supressiooni (MTS: P <0, 001; kolooniate moodustumise testid: P <0, 001) ilma dramaatiliste morfoloogiliste muutusteta (joonised 2a – c). Vastupidiselt, kui endogeenset EMX2 ekspressiooni A427-s vaigistasid anti-EMX2 shRNA-d, stimuleeriti rakkude proliferatsiooni (MTS: P <0, 001; kolooniate moodustumine: P = 0, 04) dramaatiliste morfoloogiliste muutustega (rakud olid suuremad, kui EMX2 shRNA-ga töötlemise järel oli rohkem harusid) ) (Joonised 2a – c). Need tulemused täiendavad ja toetavad H1299 rakkudes täheldatud andmeid. Lisaks uurisime EMX2-ga stabiilselt transfekteeritud H1299 kasutades uurisime EMX2 ja tsisplatiini, kliinikus laialt levinud kemoravimi kopsuvähi raviks kasutatava kemo-sünergistliku efekti vahel (joonis 2d). Vaatasime, et tsisplatiini mõõdukate annuste supresseeriv potentsiaal suurenes märkimisväärselt EMX2 uuesti ekspresseerimisega H1299 rakkudes ( P <0, 0001), mis näitab EMX2 potentsiaalset terapeutilist rolli tulevikus koos kopsuvähiga koos praeguste tsütotoksiliste ainetega.

Image

EMX2 surus maha kopsuvähirakkude proliferatsiooni ja sensibiliseeris kopsuvähirakud tsisplatiini suhtes. H1299 rakud transfekteeriti imetaja ekspressioonivektoriga pcDNA 3.1 / EMX2 (subkloonitud vektorist pCMV6-XL5 / EMX2 (Origene, Rockville, MD, USA)). A427 rakke transfekteeriti EMX2 shRNA-dega (5'-TCAAGCCATTTACCAGGCTTCGGAGGAAG-3 'ja 5'-CGGTGGAGAATCGCCACCAAGCAGGCGAG-3') ja vaigistamata shRNA-ga (kõik pRFP-C-RS vektoris). Transfektsioon viidi läbi kasutades Lipofectamine2000 (Invitrogen). Transfekteeritud rakud plaaditi G418-ga (500 μg / ml; Invitrogen) kuue auguga plaatidelt 10 cm tassidele. Enne analüüse hoiti stabiilseid transfektante tavalises söötmes G418-ga (300 μg / ml). a ) Morfoloogia valgusmikroskoobi all (× 40). ( b ) EMX2-ga (tahked teemandid) stabiilselt transfekteeritud H1299 rakkude MTS-test ja tühja pCDNA3.1 vektori kontroll (tahked ruudud); ja A427 rakud, mis on stabiilselt transfekteeritud EMX2 shRNA (tahked ruudud) ja summutamata shRNA kontrolliga (tahked teemandid). Kontrollid seati 100% -le. Proliferatsioonianalüüs viidi läbi, kandes stabiilselt transfekteeritud rakud 96-augulistele plaatidele tihedusega 500–1000 rakku süvendi kohta 100 μl G418 söötmes. Keskmist vahetati iga päev. Rakkude elujõulisust hinnati kolmes eksemplaris CellTiter 96 AQueous (Promega, Madison, WI, USA). c ) kolooniate moodustumise test. Kokku külvati 500 üksikut stabiilselt transfekteeritud rakku 10 cm tassidesse ja kasvatati 10 päeva. Seejärel fikseeriti kolooniad 10% formaliiniga, värviti 0, 5% kristallvioletiga ja loendati. ( d ) EMX2 ja tsisplatiini sünergistlik toime H1299-s. Teemandid, ruudud, kolmnurgad ja ristandid on ainult kontrollvektori töötlemine, vastavalt kontrollvektor + tsisplatiin (0, 3 ng / ml), ainult EMX2 cDNA ja EMX2 cDNA + tsisplatiin (0, 3 ng / ml). Kõik tulemused on keskmised ± sd (vearibad). Erinevusi rühmade vahel võrreldi kahepoolse õpilase t- testiga. P- väärtust 0, 05 peeti oluliseks.

Täissuuruses pilt

EMX2 funktsiooni edasiseks hindamiseks kopsuvähi progresseerumisel viisime läbi rakkude sissetungi testi ja leidsime, et EMX2-ga stabiilselt transfekteeritud H1299 rakkude sissetung protsent oli märkimisväärselt vähenenud ( P <0, 05) ja stabiilselt transfekteeritud EMX2 shRNA sissetungimise protsent A427 rakud olid märkimisväärselt suurenenud ( P <0, 05) (joonis 3a). Järk-järgult, kasutades 3D-sfäärilise mudeli abil in vivo mikrokeskkonna jäljendamist, täheldasime, et EMX2-ga stabiilselt transfekteeritud H1299 moodustasid väiksemad sferoidid ( P <0, 05) ja EMX2 shRNA-ga stabiilselt transfekteeritud A427 moodustasid suuremad sferoidid ( P <0, 05) (joonis 3b). . Veelgi olulisem on see, et kontrollrakud (mitte-EMX2 ekspresseerivad) H1299 rakud moodustasid 3D-sferoidid, millel oli mitu invasiivset rakulist harukujulist struktuuri, mis osutas purustatud basaalmembraanile. EMX2-ga stabiilselt transfekteeritud H1299 moodustas aga vähem invasiivse ümarama fenotüübi ( P <0, 001) (joonis 3c). Kontroll-shRNA-ga töödeldud A427 rakud moodustasid vastupidiselt ümaraid / vähem invasiivseid sferoide kui EMX2 shRNA-ga töödeldud ( P <0, 001) (joonis 3d). Meie tulemused koos viitavad sellele, et EMX2-l võib olla roll kopsu pahaloomuliste kasvajate progresseerumise või metastaaside uue supressorina. Selle hüpoteesi kontrollimiseks ja kopsuvähi EMX2 funktsioneerimisega seotud mehhanismide uurimiseks uurisime kanoonilist WNT signaaliülekande rada, mis teadaolevalt on kopsuvähis aberrantselt aktiveerunud ja oluline kopsuvähirakkude proliferatsiooni, ellujäämise ja metastaaside tekkeks (Mazieres et al., 2004; Te jt, 2004; He jt, 2005; Huang jt, 2008; Akiri jt, 2009; Nguyen jt, 2009). EMX2 cDNA ja anti-EMX2 shRNA transfekteeriti stabiilselt vastavalt nii H1299 rakkudesse, milles puudus EMX2 ekspressioon, kui ka vastavalt EMX2 ekspresseerivatesse A427 rakkudesse. Pärast stabiilsete transfektantide loomist kasutasime EMX2 ekspressiooni uurimiseks reaalajas PCR-i. EMX2 ekspressioonitaseme kontrollina kasutati H1703 rakuliini, mis ekspresseerib endogeenset EMX2 täiskasvanu normaalse kopsukoega sarnastel tasemetel (joonis 1c). Me kinnitasime, et EMX2 ekspressioon EMX2-ga stabiilselt transfekteeritud H1299-s ühildub füsioloogilise ekspressiooniga normaalses kopsus ja tuvastasime, et shRNA-ga stabiilselt transfekteeritud A427 EMX2 tasemed olid oluliselt allareguleeritud (joonis 4a). Huvitaval kombel täheldasime, et EMX2 taastamine H1299 rakkudes vähendas WNT signaalimisest sõltuvat transkriptsiooni aktiivsust (joonis 4b). Seevastu EMX2 summutamine shRNA abil A427 rakkudes suurendas kanoonilise WNT signaaliraja transkriptsiooni aktiivsust (joonis 4c). Nendes stabiilsetes ridades kinnitas kanoonilise WNT pärisuunalise efektortsütosoolse β-kateniini ja selle sihttsükliini D1 analüüs seost EMX2 ja kanoonilise WNT raja vahel kopsuvähi korral (joonis 4d). Pärast H1299 rakkude töötlemist de-metüülimisvahendiga DAC, leidsime, et nii tsütosoolne β-kateniin kui ka tsükliin D1 olid alareguleeritud, kinnitades meie hüpoteesi (joonis 4e). Pärast DAC-ravi A427 rakkudes täheldasime ka nende WNT pärisuunaliste efektorite mõningast allareguleerimist (joonis 4e). Meie tõlgendus on see, et DAC ei ole spetsiifiline de-metüülimisagens ühe geeni nagu EMX2 jaoks. Seega tuleks pärast kopsuvähki vaigistatud metüülatsiooni vaigistavate muude tuumori supressorite, näiteks WNT raja antagonistide WIF-1 ja SFRP, ekspressioon (Mazieres et al., 2004; Fukui et al., 2005) uuesti aktiveerida. DAC-ravi. See aitaks kaasa nende WNT allavoolu efektorite allareguleerimisele. Veelgi enam, meie mikrokiibi analüüs näitas, et EMX2 ekspressiooni taastamine kopsuvähirakkudes reguleeris metastaaside geene, näiteks S100P ja S100A4, mis on EF-käega kaltsiumi siduva valgu perekonna liikmed (joonis 4f). On teada, et need valgud kutsuvad esile metastaase näriliste rinnavähi mudelisüsteemides ja on ilmselt seotud patsiendi halva tulemusega rinna-, käärsoole-, kopsu- ja söögitoru kartsinoomides (Donato, 2001; Heizmann jt, 2002; Zimmer jt, 2003; Marenholz jt, 2004). Võimalik, et EMX2 reguleerib nende metastaaside geenide transkriptsiooni kopsuvähis, alandades otseselt või kaudselt kanoonilist WNT signaaliülekannet. Seda toetavad hiljutised tõendid, et S100P ja S100A4 võivad olla kanoonilise WNT signalisatsiooni otseseks sihtkohaks (Stein jt, 2006; Ganesan jt, 2008). Kokkuvõttes viitavad meie tulemused sellele, et EMX2 võib kopsuvähki suruda kas otseselt või kaudselt WNT signaali ülekande aktiivsuse reguleerimise kaudu. Lisaks toetas mitme WNT perekonna geeni koos EMX2 ekspressiooni esialgne analüüs kopsuvähi rakuliinides (lisajoonis S1) võimalikku seost vähendatud EMX2 ekspressiooni ja WNT kanoonilise aktiveerimise vahel kopsuvähi korral. Võimalik, et EMX2 toimib kopsuvähi korral transkriptsioonilise repressorina sarnaselt embrüonaalse arengu ajal. Kuid teistel kaasteguritel võib olla oluline roll EMX2-ga seotud transkriptsiooni regulatsioonis. EMX2 ja selle interakteeruvate valkude otsese (te) sihtmärgi (te) tuvastamine on vajalik, et täiendavalt selgitada EMX2 funktsiooni ja selle seost kopsuvähi kanoonilise WNT signaaliülekandega.

Image

EMX2 surus alla kopsuvähirakkude invasiivsed fenotüübid. ( a ) Invasioonianalüüs, kasutades trans- süvendi kambrit koos matrigeliga ja ilma (BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber, BD Biosciences, Lexington, KY, USA), viidi läbi kolmes eksemplaris iga stabiilse transfektandi kohta vastavalt tootja juhistele. Iga sisestusmembraani viiest erinevast väljast pärit rakud loendati valgusmikroskoobiga (× 40) ja sissetungi protsent määrati järgmiselt: sissetungiprotsent = (läbi Matrigeli sisestusmembraani tunginud rakkude keskmine arv / kontroll-sisestusmembraani kaudu rändavate rakkude keskmine arv #) ilma matrigelita) × 100. ( b, c ) stabiilselt transfekteeritud rakkude 3D kultuuride analüüsid. Kaheksakambrilised kultuurislaidid (BD) kaeti süvendi kohta 35 μl kasvufaktoriga vähendatud Cultrexi keldrimembraani ekstraktiga (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) ja jäeti 15 minutiks tahkuma. H1299 või A427 rakke töödeldi trüpsiiniga ja resuspendeeriti regulaarses söötmes seerumiga. Cultrex lisati kogukontsentratsioonini 2% ja 500 μl rakususpensiooni lisati igasse matrigeliga kaetud slaidi kambrisse. Söödet vahetati iga 2 päeva tagant. Pärast 1 nädala möödumist mõõdeti 100+ acini suurust ja sorteeriti häirete jaoks. b ) Sfääride suuruse kvantifitseerimine. ( c ) ja ( d ) Sferoidide (H1299 ja A427) fenotüübid jaotati kolme tüüpi (ümmargused (tahke täidis), asümmeetrilised (tihedad punktiiriga) ja lõhutud (hõredalt täpilised)) ja kvantifitseeriti. Samuti näidati igas ravis esindavaid fenotüüpe. Sümbol (*) igas graafikus tähistab statistilist olulisust ( P <0, 05) kahepoolse õpilase t- testiga.

Täissuuruses pilt

Image

EMX2 surus alla kanoonilise WNT signaaliülekande kopsuvähirakkudes. a ) EMX2 ekspressiooni kvantitatiivne RT-PCR rakuliinides, mis on stabiilselt transfekteeritud kontroll- või EMX2 ekspressioonivektoriga (H1299-s) ja vaigistamatu kontrolli või EMX2-spetsiifilise shRNA-ga (A427-s). H1703 toimis EMX2 ekspressioonitaseme kontrollina. ( b, c ) TOP / FOP-lutsiferaasi testid (viidi läbi 24 tundi pärast transfektsiooni, nagu on varem kirjeldatud Clement jt, 2008) H1299 rakkudes, mis on stabiilselt transfekteeritud EMX2 cDNA-ga, ja A427 rakkudes, mis on stabiilselt transfekteeritud vastavalt EMX2 shRNA-ga. ( d ) võtme kanoonilise WNT pärisuunalise efektori (tsütosoolne β-kateniin; antikeha BD Biosciences) ja sihtvalgu (tsükliin D1; antikeha firmalt Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) Western blot analüüsiga. Valgu kontrolliks kasutati β-aktiini (antikeha firmalt Sigma). Tsütosoolsed valgud valmistati NE-PER tuuma- ja tsütoplasmaatilise ekstraheerimise reagentide abil (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) vastavalt tootja juhistele. e ) DAC-i mõju põhilistele kanoonilistele WNT-alamjooksu efektoritele. EMX2 ekspressiooni taasaktiveerimise kinnitamiseks pärast rakuliinide töötlemist 10 μM DAC-ga kasutati poolkvantitatiivset RT-PCR-i. DAC-ravi ja poolkvantitatiivne RT-PCR viidi läbi vastavalt joonisel 1e kirjeldatule. GAPDH oli RNA kvaliteedi ja laadimise kontroll. Tsütosoolse β-kateniini ja tsükliini D1 Western blot analüüs tehti vastavalt joonisel 4d kirjeldatule. Valgu kontrolliks kasutati β-aktiini. f ) EMX2-ga stabiilselt transfekteeritud kopsuvähi rakuliini H1299 mikrokiibi profiilide määramine ja tühi vektori kontroll. Kuvatakse osaline soojuskaardi diagramm hierarhilisest klastrist, sealhulgas S100A4 ja S100P. RNA üldkvaliteeti hinnati Pico kiibi abil Agilent 2100 Bioanalyzeril (Agilent, Santa Clara, CA, USA). RNA amplifitseeriti ja märgistati Cy3-CTP või Cy5-CTP-ga, kasutades Agilent madala RNA sisendiga fluorestsentsi lineaarse amplifikatsiooni komplekte, järgides tootja protokolli. Märgistatud cRNA-d hinnati Nandrop ND-100 abil ja võrdses koguses Cy3- ja Cy5-märgistatud sihtmärki hübridiseeriti Agilent terve inimese genoomi 44 K tindipritsi massiividega. Hübridisatsiooniproovid randomiseeriti 3 × 44 K vormingus, et korrigeerida partii nihkeid. Hübridisatsioonid viidi 14 tundi läbi vastavalt tootja juhistele. Massiivid skaneeriti Agilenti mikroribaskanneri abil ja tooresignaali intensiivsus ekstraheeriti tarkvara Feature Extraction v9.5 (Agilent) abil.

Täissuuruses pilt

Kokkuvõtteks võib öelda, et see on esimene näide EMX2 tähtsusest kopsukartsinogeneesi supressorina. EMX2 ekspressiooni epigenetiline vaigistamine võib olla oluline kopsuvähki kanoonilise WNT signaali hälbe aktiveerimise ning sellest tuleneva kopsuvähirakkude proliferatsiooni ja metastaaside korral.

Täiendav teave

Powerpointi failid

  1. 1

    Täiendav teave

    Täiendav teave on lisatud Oncogeeni veebisaidil (//www.nature.com/onc) olevale paberlehele