Nos-isovormide geeni kohaletoimetamise mõju intimaalsele hüperplaasiale ja endoteeli regeneratsioonile pärast õhupalli vigastamist | geeniteraapia

Nos-isovormide geeni kohaletoimetamise mõju intimaalsele hüperplaasiale ja endoteeli regeneratsioonile pärast õhupalli vigastamist | geeniteraapia

Anonim

Abstraktne

Endoteelirakkude kaotus on vigastatud veresoone patoloogilise paranemise kriitiline sündmus. Endoteeli funktsiooni halvenemine põhjustab veresoonte peamiste vahendajate, näiteks lämmastikoksiidi (NO) vähenenud tootmist veresoone seinas, mis viib silelihasrakkude suurenenud proliferatsiooni ja migratsioonini ning lõppkokkuvõttes sisemise hüperplaasia tekkeni. Käesoleva uuringu eesmärk oli otseselt võrrelda kahe lämmastikoksiidi süntaasi (NOS) isovormi, eNOS ja iNOS, adenoviiruse vahendatud geenide kohaletoimetamise tulemusi endoteeli regenereerimisel ja sisemise hüperplaasia korral pärast endoteeli vigastamist küüliku unearteris. Uus-Meremaa valgete küülikute paremad unearterid devitati, viies 3French Fogarty õhupallikateetri mööda arteri kolm korda läbi. Seejärel tarniti intraluminaalselt 1 x 109 PFU adenoviiruse (Ad) eNOS, AdiNOS või Ad β- galaktosidaasi (Ad β- Gal) ja lasti seista 20 minutit. Transgeeni ekspressiooni taotleti 3 päeva pärast immunohistokeemia ja 7 päeva pärast kvantitatiivse pöördtranskriptaasi PCR abil. Mõju intimaalsele hüperplaasiale otsiti histoloogilise värvimisega 14 päeva pärast. Endoteeli regenereerimisele mõju määramiseks kasutati Evansi sinist värvimist. eNOS ja iNOS ekspressioon tuvastati transdutseeritud arterites. Neointima / söötme suhted olid eNOS (0, 07 ± 0, 044) ja iNOS (0, 087 ± 0, 086) transdutseeritud arterites märkimisväärselt vähenenud võrreldes Ad β- Gal (0, 332 ± 0, 14) transdutseeritud arteritega ( n = 7). Lisaks parandas AdeNOS-ravi (4, 21 ± 3, 12% deoteloteeritud pindalast) endoteeli regeneratsiooni võrreldes Ad β- Gal-raviga (10, 05 ± 4, 98), samal ajal kui AdiNOS-ravi (25, 17 ± 11, 92) pärssis endoteeli regeneratsiooni vigastatud küüliku unearteris ( n = 7–8). Need tulemused rõhutavad NOS-i geeniteraapia potentsiaali, eriti eNOS-i geeniteraapiat kui potentsiaalset terapeutilist strateegiat restenoosi ennetamiseks pärast veresoonte vigastusi.

Sissejuhatus

Ateroskleroos on läänemaailmas endiselt kõige levinum surmapõhjus. Perkutaanset transluminaalset koronaarangioplastikat (PTCA) on edukalt kasutatud oklusiivse pärgarteri haigusega patsientide ravimisel juba üle 20 aasta. Kuid angioplastikajärgne restenoos kujutab endast protseduuri olulist piirangut - enam kui 20% patsientidest vajab 6 kuu jooksul täiendavat revaskularisatsiooni protseduuri. 1 Neointimaalne paksenemine pärast veresoonte kahjustust on peamine angioplastikajärgse restenoosi soodustav tegur - protsess, mis tuleneb silelihasrakkude düsreguleeritud proliferatsioonist ja migratsioonist. 2 Endoteelikihi katkemine pärast angioplastika protseduure on seotud ka vigastatud veresoonte patoloogilise paranemisega. 3 Endoteeli funktsiooni halvenemine põhjustab peamiste vaskulaarsete vahendajate, näiteks lämmastikoksiidi (NO) produktsiooni vähenemist, mille tulemuseks on suurenenud silelihasrakkude proliferatsioon ja migratsioon, trombotsüütide adhesioon ja halvem endoteelist sõltuv vasorelaksatsioon (EDVR). 4 Kõik ülaltoodud protsessid on olulised elemendid vigastatud arteri patoloogilises paranemises pärast angioplastika protseduure, mille tulemuseks on intimaalne hüperplaasia.

Paljud uurijad on uurinud neointimaalse moodustumise parandamise võimalust silelihasrakkude vohamise ja migratsiooni pärssimisega, mille tulemuseks on arvukalt väljaandeid. Enamik edukaid strateegiaid on vähendanud neointimaalset hüperplaasiat, kuid paljud kahjustavad ka endoteeli funktsiooni, põhjustades suurenenud tromboosi riski. Ent kuna endoteeli funktsiooni halvenemine mängib vigastatud veresoonte patoloogilises paranemises olulist rolli, on hüpoteesiks seatud, et strateegiatest, mis üritavad edendada vigastatud veresoonte endoteeli regeneratsiooni, võib olla olulist terapeutilist kasu. Sellised strateegiad põhjustaksid NO ja teiste veresoonte vahendajate suurenenud tootmist, mis omakorda vähendaks silelihasrakkude vohamist, vähendaks veresoone seina oksüdatiivset stressi, parandaks veresoonte toonust ja pärsiks lõpuks neointimaalset moodustumist. Ideaalne terapeutiline sekkumine intimaalse hüperplaasia ja restenoosi ennetamiseks oleks strateegia, mis ühelt poolt pärsiks silelihasrakkude proliferatsiooni, soodustades samal ajal endoteelirakkude proliferatsiooni ja vigastatud endoteeli regeneratsiooni. Soovitav on vähemalt strateegia, mis pärsib silelihasrakkude vohamist, kuid ei kahjusta endoteeli regeneratsiooni. Sel eesmärgil püstitame hüpoteesi, et lämmastikoksiidi süntaasi (NOS) geeni viimine vigastatud veresoone seinale pärast angioplastika protseduure võib olla üks selline terapeutiline lähenemisviis, mis võib neid ühiseid eesmärke saavutada.

NO on peamine vahendaja vaskulaarse homöostaasi säilitamisel, kuna sellel on mitmeid anti-aterogeenseid omadusi, sealhulgas vereliistakute ja monotsüütide adhesiooni pärssimine, 6, 7 ning silelihaste rakkude proliferatsioon ja migratsioon. 8, 9 NO on samuti tugev vasodilataator, mis säilitab veresoonte toonust ja funktsiooni veresooneseinas. Paljud vaskulaarsed haigused on seotud vähenenud NO biosaadavusega ja NOS-geeniteraapia on sellistele haigustele paljutõotav terapeutiline lähenemisviis, kuna see võimaldab funktsionaalsete NOS-geenide kohaletoimetamist veresoonte lokaalsesse segmenti, et suurendada NO biosaadavust veresoonte seina sees. 10 Oleme varem teatanud eNOS-i geeni kohaletoimetamise kasulikust mõjust mitmetes haigusseisundites, sealhulgas hüperkolesteroleemia, suhkurtõbi, ateroskleroos, hüpoksia, aju vasospasm ja subaraknoidne hemorraagia. 11, 12, 13, 14, 15, 16

Käesoleva uuringu eesmärk oli otseselt võrrelda kahe NOS isovormi, eNOS ja iNOS adenoviiruse vahendatud üleekspressiooni mõju endoteeli regeneratsioonile ja intimaalsele hüperplaasiale pärast küüliku unearteri denudatsiooni.

Tulemused

NOS isovormi ekspressiooni tuvastamine

Adenoviiruse β- galaktosidaasiga (Ad β- Gal) ja adenoviiruse eNOS (AdeNOS) või adenoviiruse iNOS (AdiNOS) transdukteeritud unearterid koristati 1 nädal pärast vigastust. Pärast kvantitatiivset pöördtranskriptaasi PCR-analüüsi, mis normaliseeris NOS-i isovormi transkripti taset majapidamisgeeni ja Ad β- Gal-kontrollide suhtes, võis 5/7 uuritud arteris täheldada iNOS-i ja eNOS-i ekspressiooni kõrget taset (joonis 1). Nendest koeproovidest saadud RNA näitas kvantitatiivse pöördtranskriptaasi PCR-i abil testitud 6/7 arterites sobiva suurusega riba olemasolu nii iNOS kui ka eNOS (andmeid pole näidatud).

Image

Kvantitatiivne PCR-analüüs 2 (−ΔΔ C (T)) meetodil ( a ) eNOS-i transkriptsiooni ekspressiooniks AdeNOS-i transdutseeritud arteritest ( n = 4) ja ( b ) iNOS-transkriptsiooni ekspressiooniks AdiNOS-iga transdutseeritud arteritest ( n = 3). Kõik väärtused normaliseeriti majapidamisgeeni suhtes ja arvutati kordade muutused võrreldes Adp-Gal-ülekantud kontrollidega. AdeNOS-iga edastatud arterite 1 ja 4 korral on täheldatud eNOS-i transkriptide arvu suurenemist ja iNOS-i transkriptide arvu suurenemist tuvastati kõigis uuritud AdiNOS-i edastatud arterites. Tumedad ribad tähistavad pöördtranskriptaasi juuresolekul läbi viidud reaktsioone, heledad ribad tähistavad reaktsioone, mis viiakse läbi ilma pöördtranskriptaasita.

Täissuuruses pilt

Β- gaali ekspressiooni histoloogiline lokaliseerimine ja tase

Vigastatud unearterid transdukteeriti 1 x 109 PFU / ml Ad- P- gaali kohta 200 μl PBS-is. Kolm päeva pärast geeni kohaletoimetamist otsiti β- gaali ekspressiooni, kasutades X-Gal värvimist. β -Gal ekspressioon tuvastati vigastatud unearteri luminaalsel pinnal denudedse laeva ülemises mediaalses kihis, mida kinnitavad sinised rakud (joonised 2a ja c). Tuvastati ka β- Gal teatud juhuslik ekspressioon, mis oli tõenäoliselt tingitud viiruselahuse manustamisel tekkinud ületarbimisest. Kontrollsektsioonides β- gaali ekspressiooni seevastu ei tuvastatud (joonised 2b ja d). Arterite pikisuunalise avamise korral täheldati transgeeni ekspressiooni üle 6, 5% luminaalsest pinnast (joonis 2e). Märkimisväärset väljendust võib näha ka juhuslikus kihis.

Image

Β- gaali ekspressiooni demonstreerimine 3 päeva pärast transduktsiooni. Histoloogilised lõigud värvitakse X-Gal-ga ja kontrastvärvitakse eosiiniga ( ad ). Positiivne β -Gal ekspressioon tuvastati Ad β -Gal ( a, c ) abil transdutseeritud arterites, samas soolalahusega töödeldud unearterites ( b, d ) ekspressiooni ei tuvastatud. Positiivset värvumist beeta- Gal ekspressioonil demonstreeriti ka veresoone luminaalpinnal (6, 5%) ja ka juhuslikul pinnal, kui pikisuunas lõigatud nooled näitavad positiivset värvumist ( e ). Suurendus × 40 ( a, b ) ja × 100 ( c, d ).

Täissuuruses pilt

NOS geeni ekspressiooni lokaliseerimine

ENOS-i ja iNOS-i ekspressiooni lokaliseerimise uurimiseks vigastatud unearteris viidi immunohistokeemia külmunud kudede lõikudesse 3 päeva pärast vigastust. eNOS ja iNOS ekspressioon tuvastati vastavalt AdeNOS ja AdiNOS poolt ülekantud arterite söötmes ja juhuslikult. Seevastu Ad β- Gal-transdutseeritud arterites ei värvunud ei eNOS ega iNOS (joonis 3).

Image

ENOS-i ja iNOS-i immunohistokeemiline lokaliseerimine vigastatud küüliku unearteris 3 päeva pärast transduktsiooni. Nooled näitavad eNOS ( a ) ja iNOS ( c ) positiivset värvumist arterites, mis on üle kantud vastavate vektoritega. Ad β- Gal-ülekantud arterites ( b, d ) positiivset värvumist ei tuvastatud. Suurendus × 20.

Täissuuruses pilt

ENOS ja iNOS geeniülekande mõju endoteeli regeneratsioonile

Kaks nädalat pärast vigastust ja kohaliku geeni kohaletoimetamist hinnati endoteeli regeneratsiooni Evansi sinise värvimisega (joonis 4). Evansi sinise värvumine luminesaaliga näitas, et kirurgiline protseduur kahandas unearterit täielikult (joonis 4a). Kaks nädalat pärast vigastust tuvastati AdeNOS-transdukteeritud (4, 21 ± 3, 12%, n = 7) arterite ja Ad β- Gaal-transdukteeritud arterite (10, 05 ± 4, 97%, n = 7) statistiline erinevus siniselt värvitud pinna osas ( P = 0, 025). Seevastu AdiNOS-iga edastatud arterites (25, 17 ± 11, 92%, n = 8) tuvastati sinisega värvitud ala oluline suurenemine ( P = 0, 001) võrreldes AdeNOS-iga edastatud arteritega. Samuti täheldati olulist erinevust ( P = 0, 025) Ad β- Gal-ülekantud kontroll arterite ja Ad-iNOS-iga edastatud arterite vahel. See näitab, et iNOS-i adenoviiruse vahendatud geeni kohaletoimetamine vigastatud küüliku unearterisse kahjustab vigastatud laeva endoteeli regeneratsiooni, samas kui eNOS-i adenoviiruse vahendatud kohaletoimetamine parandab uuesti endoteeliseerumist (joonis 4b).

Image

Unearterite värvumine Evansi sinise värviga kaks nädalat pärast vigastust, kui pole teisiti öeldud ( a ): 1, vigastamata; 2, 30 minutit pärast vigastust; 3, Ad- P- gaaliga töödeldud; 4, AdeNOS-iga töödeldud; 5, AdiNOS-iga töödeldud. Ad β- Gal ( n = 7), AdeNOS ( n = 9) ja AdiNOS ( n = 8) kaudu transoteeritud unearterite endoteelimata ala (Evansi sinist värvi pind) kvantifitseerimine 2 nädalat pärast vigastust ( *, **), P <0, 05) ( b ).

Täissuuruses pilt

ENOS ja iNOS geeniülekande mõju intimaalsele hüperplaasiale

2 nädalat pärast vigastust ja geeni kohaletoimetamist otsisime eNOS-i ja iNOS-i üleekspressiooni mõju intimaalsele hüperplaasiale. Lõigud värviti Verhoffsi elastiini peitsiga ja loendur värviti Van Giesons peitsiga. Iga katserühma jaoks arvutati neointima / söötme suhe. Kaks nädalat pärast vigastust vähenesid nii AdeNOS-ülekantud arterite (0, 072 ± 0, 044, n = 7) kui ka AdiNOS-iga transdutseeritud arterite (0, 086 ± 0, 086, n = 7) neointimaalsuse ja söötme suhted (mõlema korral P = 0, 002). Ad P- Gaal-transdutseeritud arterid (0, 332 ± 0, 135, n = 7). Need arvud näitavad nii eNOS-i kui ka iNOS-i geeni kohaletoimetamise võimet märkimisväärselt pärssida neointima moodustumist küüliku unearteris (joonis 5).

Image

Küülikute unearterite neointimaalse hüperplaasia morfomeetriline analüüs 2 nädalat pärast vigastust ( a ), kasutades transduktsiooni; AdeNOS (1, 4; n = 7), AdiNOS (2, 5; n = 7) ja Ad- P- Gal (3, 6; n = 7). Suurendus × 4 (1–3) ja × 20 (4–6). Nooled näitavad neointima. AdeNOS-, AdiNOS- ja Ad β- Gal-transdutseeritud arterite neointimaalsete ja söötme suhete kvantifitseerimine 2 nädalat pärast vigastust ( *, ** P <0, 05) ( b ).

Täissuuruses pilt

Arutelu

Suurenenud silelihasrakkude vohamine ja endoteeli funktsiooni halvenemine mängivad olulist rolli vigastatud laevade patoloogilises paranemises pärast angioplastika protseduure. 2, 3 Vaskuloprotektiivsete vahendajate, näiteks NO , vähenenud tootmine on selle patoloogilise protsessi peamine toetav tegur. Hüpoteesime, et NOS-i geenide adenoviiruse vahendatud geeniülekanne vigastatud unearterisse suurendab NO-i biosaadavust veresoone seinas, mis omakorda suurendab endoteeli regeneratsiooni ja pärsib intimaalset hüperplaasiat. Selles uuringus uurisime kahe NOS isovormi, eNOS ja iNOS ning ka reportergeeni β- Gal adenoviiruse vahendatud geenide kohaletoimetamist küüliku unearterisse. Me täheldasime eNOS-i ja iNOS-i transkriptide taseme tõusu enamikus sobivalt transdutseeritud arterites (5/7). Valgu ekspressiooni kinnitamiseks tuvastasime lisaks adenoviiruse vahendatud geeniülekandele vigastatud unearteri nii söötmes kui ka juhuslikult positiivse eNOS-i, iNOS-i ja P- Gal-i värvumise. Histoloogilise värvimisega tõestasime ka, et nii eNOS kui ka iNOS üleekspressioon vigastatud veresoone seinas pärsib neointima moodustumist pärast denekteerimist õhupalli kateetriga. Lõpuks teatame, et iNOS-i adenoviiruse vahendatud geenide kohaletoimetamine pärssis märkimisväärselt endoteeli regeneratsiooni võrreldes β- Gal-ga töödeldud küülikutega, samal ajal kui eNOS-i geeniülekanne suurendas vigastuse järgselt märkimisväärselt re-endoteliaalseks muutumist.

Varem avaldatud andmed on näidanud geeniteraapia lähenemisviiside tõhusust neointimaalse moodustumise pärssimisel mitmesuguste geenide kohaletoimetamise meetodite ja paljude huvipakkuvate geenide abil. 17, 18, 19, 20 Need uuringud on näidanud, et sekkumine vähendas neointima moodustumist, kuid ei uurinud mõju reoteloteerimisele. NOS-i geenide kohaletoimetamine veresoonkonda on ratsionaalne lähenemisviis paljude veresoonkonna haiguste korral, kuna NO-l on mitmeid anti-aterogeenseid omadusi, näiteks silelihasrakkude proliferatsiooni ja monotsüütide adhesiooni pärssimine, samuti on see tugev vasodilataator. Käesolevas uuringus põhjustas adenoviiruse geeni kohaletoimetamine pärast vaskulaarset vigastust transgeeni ekspressiooni meediumis ja juhuslikkust. Kasutatud viiruse doos oli 1 x 109 PFU, mis on kirjanduses kirjeldatud vahemikus. 10 Näitame, et nii eNOSi kui ka iNOSi adenoviiruse vahendatud geeniülekanne põhjustab NOS-valgu ekspressiooni vigastatud küüliku unearteris, põhjustades neointimaalse moodustumise pärssimist pärast arteriaalset denudatsiooni. Arteriaalse paksenemise vähenemine tuleneb arvatavasti NO võimest pärssida silelihasrakkude proliferatsiooni - tulemus on kooskõlas varem avaldatud in vitro 21, 22, 23 ja in vivo andmetega. 24, 25, 26 von der Leyen jt. 24 kasutasid HVJ liposoome eNOSi üleekspresseerimiseks vigastatud roti unearteris, Varenne jt. 26 kasutasid adenoviirusvektoreid eNOS-i manustamiseks sigadele pärast koronaarangioplastikat. Mõlemad uuringud andsid neointmaalse hüperplaasia kohta samasugused kasulikud tulemused kui käesolev uuring. Samamoodi on Shears jt. 27 näitasid, et iNOS adenoviiruse vahendatud geeni kohaletoimetamine vigastatud sea- ja roti arteritesse viis neointima moodustumise vähenemiseni. Nendes dokumentides ei uuritud siiski eNOS-i üleekspressiooni mõju vigastusejärgsele endoteeli regeneratsioonile. Lisaks on see esimene aruanne kahe NOS-isovormi mõju otsesele võrdlusele sisemisele hüperplaasiale, kusjuures mõlemad isovormid on selle nähtuse vähendamiseks tõhusad.

Ehkki silelihasrakkude proliferatsiooni ja migratsiooni pärssimine kui angioplastikajärgse restenoosi parandamise vahend on juba mõnda aega olnud paljude uurijate eesmärk, on endoteeli regeneratsiooni edendavad strateegiad saanud suhteliselt vähe tähelepanu. 5 Hiljuti avaldatud andmed on näidanud, et re-endotlialiseerumise edendamisel rakuravi meetodil küüliku unearteril võib olla kasulik mõju ka intimaalse hüperplaasia 4, 28 pärssimisel ja veresoonte reaktsioonivõime parandamisel. 29 Sarnaselt demonstreerime siin, et eNOS-i üleekspressioon parandas re-endotlialisatsiooni ja vähendas lisaks intimaalset hüperplaasiat, samal ajal kui iNOS-i üleekspressioon vigastatud unearteris pärsib endoteeli regeneratsiooni. See tähelepanek oli huvitav mitmest aspektist. Esiteks oli huvitav märkida kahe NOS-isovormi märkimisväärset erinevust endoteeli taastumisel. eNOS toodab teadaolevalt väiksemas koguses NO kui iNOS, samal ajal kui isovormid erinevad ka kaltsiumisõltuvuse ja sõltuvuse suhtes kaasfaktoritest nagu tetrahüdrobiopteriin. 30 Lisaks on iNOS altid "lahtihaakimisele", mis võib seda stimuleerida superoksiidi anioonide tekitamiseks. Varasemates uuringutes oleme näidanud, et eNOS-i geeni kohaletoimetamine parandas endoteeli funktsiooni, samal ajal kui iNOS kahjustas hüperkolesteroleemilise küüliku unearteri endoteeli funktsiooni. 12, 31 Viimases uuringus põhjustas iNOS-i geeni kohaletoimetamine suurenenud superoksiidi tekke veresoonte seinas. ENOS-i ja iNOS-i geeni kohaletoimetamise mõju erinevused endoteeli regenereerimises võivad olla tingitud asjaolust, et viimastest tekkinud kõrgemad NO kontsentratsioonid võivad pärssida endoteelirakkude vohamist või et „lahtihaakimine“ võib põhjustada suurenenud superoksiidi produktsiooni ja edasist oksüdatiivset stressi laeva sein. Fakt, et iNOS üleekspressioon pärssis neointimaalset moodustumist, kahjustades samal ajal endoteeli taastumist, on samuti huvitav leid, kuna see näitab, et ehkki re-endoteliaalseks muutmine võib kindlasti parandada neointimaalset moodustumist, ei ole see intimaalse hüperplaasia vähendamiseks absoluutne nõue. See järeldus endoteelialiseerumise ja neointimaalse hüperplaasia vahelise dihhotoomia osas on kooskõlas varasemate aruannetega, milles leiti, et NOS-substraatide suurenenud sisaldus inhibeerib neointimaalset hüperplaasiat, kuid ei võimenda reoteloteeliseerumist. 32 Olukord on analoogne ravimielueerivate stentidega, mis vähendavad intimaalset hüperplaasiat, kuid halvendavad endoteeli regeneratsiooni. Kooskõlas Six et al. 32 Meie tulemused väidavad ka NO rolli taaskehtestamises. Varasemates uuringutes on jälgitud muutusi endogeenses NOS-isovormis ja superoksiiddismutaasis (SOD) vastusena ballooni kahjustusele küülikul. 33, 34 Kooskõlas meie uuringu järeldustega viitavad nad sellele, et NO-i tootmine vastusena vigastusele võib ära hoida neointimaalse hüperplaasia, samal ajal kui SOD võib samaaegselt kaitsta NO-de sisaldust, mis tekitatakse NO-st kombineerimisel peroksünitriti moodustamiseks.

Kokkuvõtteks võrdlesime otseselt eNOS-i ja iNOS-i geeni kohaletoimetamise terapeutilist toimet endoteeli denudatsiooni mudelis ja näitasime esimest korda mõlema NOS isovormi adenoviiruse vahendatud geeniülekande võimet pärssida küüliku unearteri vigastatud intima hüperplaasiat. Lisaks suurendas eNOS-i üleekspressioon endoteeli regeneratsiooni, samas kui iNOS-il oli kontrollidega võrreldes inhibeeriv toime. Meie tulemused toovad esile geeniteraapia strateegiate potentsiaali, mis on suunatud NOS-isovormide vaskulaarsele ekspressioonile, kuid viitavad sellele, et eNOS-il võib olla eeliseid, kuna see avaldab kasulikku mõju reoteloteerimisele võrreldes iNOS-iga.

Meetodid

Adenoviirusvektorite konstrueerimine, paljundamine ja puhastamine

Tsütomegaloviiruse promootori poolt juhitud veise eNOS-geeni kodeeriv rekombinantne adenoviirus genereeriti nagu eelnevalt kirjeldatud. 21 Viirus puhastati kahekordse tseesiumkloriidi gradiendiga ultratsentrifuugimisega ja dialüüsiti 4 tundi temperatuuril 4 ° C 10 mmol / l Tris, 1, 0 mmol / l MgCl2, 1, 0 mmol / l HEPES ja 10% glütserooliga. Viiruse tiiter määrati naastuanalüüsiga. Tsütomegaloviiruse promootorite poolt juhitud inimese iNOS geeni kodeeriv rekombinantne adenoviirusvektor oli Imve Kovesdi (Genvec) lahus kingitus ja see loodi vastavalt eelnevalt kirjeldatule. 23 Negatiivse kontrollina kasutati rekombinantse replikatsiooni defektset adenoviirusvektorit, mis kodeeris CMV promootori juhitud Escherichia coli β- Gal geeni. Seda paljundati, eraldati ja tiitriti nagu ülalpool. Viirusevarusid hoiti temperatuuril –80 ° C.

Loomad

Kõik loomadega seotud uuringud kiitis heaks loomade hooldamise ja kasutamise institutsionaalne komitee vastavalt asjakohastele õigusaktidele. Nendes katsetes kasutati kokku 68 täiskasvanud Uus-Meremaa valge küülikut (kehakaal 2, 5–3, 5 kg). Loomi peeti individuaalselt roostevabast terasest traatpõhjaga puuridesse ruumis, kus oli 12-tunnine valguse ja pimeduse tsükkel ning kontrollitud temperatuur ja niiskus. Küülikutele söödeti standardset toitu ja vett ad libitum .

Küüliku unearteri denudatsioon ja geeniülekanne

Loomadele tuimastati ketamiini (35 mg / kg), ksülasiini (5 mg / kg) ja atseepromasiini (2, 3 mg / kg) intramuskulaarse süstimisega. Parameediku emakakaela sisselõiked tehti kaela esiosale ja mõlemad tavalised unearterid paljastati nüri dissektsiooniga. Hepariini (300 Ü / kg) süstiti intravenoosselt läbi kõrvaveeni. Vaskulaarsed klambrid rakendati parema ühise unearteri (RCA) proksimaalsesse otsa ja välisele paremale unearterile. Parempoolne sisemine unearter seoti ajutiselt vaskulaarsete sidemete abil kinni. Paremas välises unearteris tehti arteriotoomia ja tühjendatud 3French Fogarty õhupalli kateeter (Baxter Healthcare, Berkshire, Suurbritannia) sisestati läbi välise unearteri ja juhiti kolm korda mööda ühise unearteri eraldatud segmenti. 24 G angiokateeter sisestati välise unearteri kaudu ühisesse unearterisse. Veri eemaldati arteri isoleeritud segmendist angiokateetri lahtises otsas oleva marli tahtga. Teine klamber kinnitati hargnemispiirkonna vahetus läheduses asuvale unearterile. Seejärel sisendati kateetri kaudu intraluminaalselt eNOS-i, iNOS-i või β- Gal-i kodeerivaid adenoviirusvektoreid (200 μl 1x109 PFU / ml), kateeter eemaldati ja viirusvektoritel lasti 20 minutit seista. Väline unearter ligeeriti. Pärast 20 minutit eemaldati vaskulaarsed klambrid ja vool taastati läbi sisemise unearteri. Sisekontrolliks olid vasakpoolsed unearterid (LCA), mis ei läbinud ühtegi arteriotoomiat.

Geeniekspressiooni histokeemiline ja immunohistokeemiline analüüs

Β- Gal ekspressiooni histokeemiliseks värvimiseks koristati arterid 3 päeva pärast geeni kohaletoimetamist. Seejärel fikseeriti arteriaalsed rõngad 4% paraformaldehüüdis ja 0, 4% gluteraldehüüdis 15 minutit temperatuuril 4 ° C ja loputati kaks korda PBS-ga. Seejärel värviti rõngad öö läbi temperatuuril 37 ° C 500 μg / ml 5-bromo-4-kloro-3-indolüül- P -D-galaktopüranosiidi (X-Gal; Boehringer-Mannheim Biochemicals, Mannheim, Saksamaa) lahuses. Seejärel kinnitati arteriaalsed rõngad OCT-sse (koe-Tek) ja lõigati seejärel 5 μm ristlõiked ja asetati slaididele. Seejärel värviti lõigud eosiiniga. Näo peal uuritud arterid värviti ülalkirjeldatud X-Gal lahusega.

ENOS-i ja iNOS-i ekspressiooni immunohistokeemiliseks värvimiseks olid ÜMT ühendisse põimitud koristatud arteritel ( n = 4 iga rühma kohta) 5 μm pikkused ristlõiked ja asetatud slaididele. Pärast sukeldamist fikseerimist atsetoonis (4 ° C) ja kuivatamist inkubeeriti objektiklaase 0, 1% naatriumasiidis / 0, 3% vesinikperoksiidis ja inkubeeriti seejärel 5% kitse seerumiga / PBS-Tween 20, et blokeerida mittespetsiifilised valkudega seondumise saidid. eNOS ja iNOS monoklonaalsed antikehad (mõlemad lahjendusega 1:50; Transduction Laboratory, Lexington, KY, USA) kanti 60 minutit sobivatele slaididele 2 tundi toatemperatuuril, millele järgnesid inkubatsioonid küüliku biotinüülitud hiirevastase F-ga (ab '). 2 sekundaarset antikeha (1: 200, inkubatsiooniaeg 1 tund; DAKO) ja peroksidaasiga konjugeeritud streptavidiin (1: 200, inkubatsiooniaeg 1 tund; DAKO). eNOS-i immunoreaktiivsust visualiseeriti diaminobensidiini ja hematoksüliini värviga.

Geeniekspressiooni kvantitatiivne pöördtranskriptaasi PCR-analüüs

RNA ekstraheeriti küüliku arteritest 1 nädal pärast kokkupuudet AdeNOS, AdiNOS või Ad β- Gal (vastavalt n = 4, 3 ja 2), kasutades RNeasy komplekti (Qiagen, Crawley, UK). RNA proove töödeldi DNaasiga (Invitrogen, Paisley, Suurbritannia), et eemaldada viiruse genoom või genoomne DNA.

RNA-le (200 ng) viidi läbi kvantitatiivne PCR koos pöördtranskriptsiooniga ja ilma selleta, kasutades Quantitect SYBR Green RT-PCR komplekti (Qiagen) koos ABI 7000 järjestuse tuvastamise süsteemiga (ABI). (50 ° C, 30 minutit; 94 ° C, 15 minutit; 35 tsüklit temperatuuril 94 ° C, 15 sekundit; 60 ° C 1 minut). PCR produktid visualiseeriti agaroosgeelidel. Suhtelised ekspressioonitasemed arvutati kasutades 2 (−ΔΔ C (T)) meetodit 35, kasutades hüpoksantiini fosforibosüültransferaasi (HPRT) ekspressiooni RNA taseme normaliseerimiseks ja võrreldes NOS isovormi ekspressiooni AdiNOS-iga või AdeNOS-ga transdutseeritud arterites Ad β- Gal-ga töödeldud arterites arterid.

PCR praimerid kavandati veiste eNOS-i või inimese iNOS-i amplifitseerimiseks ilma küüliku endogeensete ortoloogide võimendamata. Veise eNOS (NM_181037) 5′-GAGAGGCTGCATGACATTGAGA-3 'ja 5'-GGTAGAGATGGTCGAGTTGGGA-3' eeldatav produkti suurus 94 aluspaari. Inimese iNOS (NM_000625) 5′-GACTCACAGCCTTTGGACCTCA-3 'ja 5'-GGCTGGATGTCGGACTTTGTA-3', eeldatav produkti suurus 109 aluspaari. Praimerid olid samuti kavandatud küüliku maja pidava geeni HPRT jaoks vastavalt Lund et al. 36 (AF020294) 5′-CTCAACCTTAACTGGAAAGAATGTC-3 'ja 5'-CCTTTTCACCAGCAGGCT-3', loodetav toote suurus 135 aluspaari. 36

Endoteelialiseerumise hindamine

Kaks nädalat pärast unearteri vigastamist anesteseeriti loomad nagu ülalpool ja neile süstiti intravenoosselt 5 ml 0, 5% Evans sinist (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA). 30 minuti pärast surmati küülikud 2 ml Dolethali intravenoosse süstimisega. Koristatud arterid ( n- 7 Ad β- Gal ja AdeNOS rühmade jaoks ja n = 8 AdiNOS rühmade jaoks) lõigati kohe pikisuunas, et paljastada luminaalne pind, ja loputati külma, (4 ° C) modifitseeritud Krebsi lahusega järgnevaga koostis (m M): 1, 2 KH2P04, 4, 7 KCl, 2, 5 CaCl2, 1, 2 MgS04, 25 NaHC03, 118, 3 NaCl ja 11, 1 dekstroos. Tehti fotod unearterist. Piirkondi, millel oli (mitte Evansi sinise värvusega ala) ja ilma endoteelita (Evansi sinisega värvitud ala), analüüsiti Image J tarkvara abil.

Intimaalse hüperplaasia morfomeetriline analüüs

Neointimaalse hüperplaasia hindamine viidi läbi 2 nädalat pärast arteriaalse denudatsiooni. Pärast 2-tunnist 30% sahharoosi sukeldamist ja fikseerimist 4% paraformaldehüüdis koristati arteriaalsed rõngad külmutatud OCT ühendisse. Slaididele lõigati ristlõiked (5 μm ). Intimaalset hüperplaasiat visualiseeriti slaidide värvimisega Verhoffsi elastiini peitsiga ja loenduri abil, mis värviti Van Giesons peitsiga. Igast arterist analüüsiti neli juhuslikku ristlõiget ( n = 7 iga katserühma kohta). Neointima / meediumi suhe arvutati pimeda vaatleja analüüsi tarkvara analySIS (Soft Imaging System) abil iga ristlõike kaheksas juhuslikus punktis.

Statistiline analüüs

Andmed on esitatud keskmisena ± sd. Töötluste üldiste erinevuste tuvastamiseks kasutati ANOVA testi. Selliseid erinevusi uuriti seejärel rühmade vahel täiendavalt t- testi abil. P- väärtusi <0, 05 peeti statistiliselt oluliseks.