Uue regulatiivse võrgu tekkimist soodustab tingliku transkriptsioonifaktori dubleerimine | loodusside

Uue regulatiivse võrgu tekkimist soodustab tingliku transkriptsioonifaktori dubleerimine | loodusside

Anonim

Õppeained

  • Geeniregulatsioon
  • Molekulaarne evolutsioon
  • Selle artikli parandus avaldati 26. veebruaril 2015

Seda artiklit on värskendatud

Abstraktne

Uute geenide ilmumine evolutsiooni vältel nõuab juhtmete ühendamist ja regulatiivsete võrkude laiendamist. Uute geenikoopiate transkriptsioonilise regulatsiooni kujunemise molekulaarsed üksikasjad jäävad siiski suuresti uurimata. Näitame siin, kuidas transkriptsioonifaktori geeni dubleerimine võimaldas kahe sõltumatu regulatiivse vooluahela tekkimist. Huvitav on see, et esivanemate transkriptsioonifaktor oli paljutõotav ja võis siduda selle sihtpromootorites erinevaid motiive. Pärast dubleerimist arenes üks paraloog suurenenud seondumise spetsiifilisusest, nii et see seob ainult ühte tüüpi motiive, samas kui teises eksemplaris vähenes aktiivsus, nii et see aktiveerib ainult promootoreid, mis sisaldavad mitut seondumiskohta. Huvitav on see, et kahe võrgu järkjärguliseks lahtiühendamiseks olid vaja ainult mõned mutatsioonid nii DNA-d siduvates domeenides kui ka promootorit siduvates saitides. Need tulemused näitavad, kuidas ühekordse transkriptsioonifaktori dubleerimine, millele järgneb kooskõlastatud cis- ja trans- mutatsioonid, võimaldab regulatiivset võrku laiendada.

Sissejuhatus

Arvatakse, et geenide dubleerimine on oluline evolutsiooni edasiviiv jõud, kuna dubleeritud geenid lahknevad ja arendavad uusi funktsioone 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 . Selliseid geeni dubleerimise sündmusi esineb suhteliselt sageli, vähemalt 50% prokarüootsetest geenidest ja üle 90% eukarüootsetest geenidest on tekkinud geeni dubleerimise teel 11, 12, 13, 14 .

Uute funktsioonidega geenide ilmumine võib vajada regulaatori võrgu ümberprogrammeerimist ja / või laiendamist, et tagada uute paraloogide õige ekspressioon 9, 12, 15, 16, 17 . Täpsemalt, värskelt dubleeritud geenide diferentsiaalne reguleerimine võib olla oluline, et vältida nn paraloogilisi häireid - olukorda, kus duplikaadid segavad üksteise funktsiooni 17 . Gu et al. 15 pakkus välja paraloogi geenide asümmeetrilise regulatiivse arengu mudeli pärast dubleerimist, kus ühe geenikoopia regulatsioon areneb kiiresti, samas kui teise eksemplari puhul säilitatakse esivanemate ekspressiooniprofiil. Selle teooria kohaselt kinnitavad mitmed ülemaailmsed genoomi hõlmavad uuringud, et paraloge väljendatakse sageli diferentseeritult ja nende ekspressioonierinevus on suurenenud. See peegeldab tõenäoliselt rakkude vajadust töötada välja spetsiifilised regulatsiooniprogrammid esivanemate ja uudsete geenifunktsioonide jaoks, mis ilmnevad pärast dubleerimise sündmust 8, 12, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22 .

Kuigi paraloogide lahknevat transkriptsioonilist regulatsiooni näitavate uuringute arv kasvab, on vähestes uuringutes uuritud regulatiivsete erinevuste aluseks olevaid molekulaarseid detaile. Mõned autorid rõhutavad cis- regulatoorsete elementide kadumise ja saavutamise olulisust paraloogiregulatsiooni 19, 22, 23, 24, 25, 26 arengus . On tõestatud, et kuigi kahe paralleeli vahel jagatud cis- regulatoorsete elementide arv väheneb koos vanusega, jääb nende promootorites regulatiivsete elementide koguarv samaks, mis tähendab, et regulatiivsete motiivide kaotamine kompenseeritakse uute regulatiivsete motiivide saamisega 23 . Samamoodi on Ihmels jt. 22 teatasid spetsiifilise cis- regulatoorse elemendi ulatuslikust kaotusest kümnete geenide promootorite poolt pärast kogu genoomi dubleerimist pärmi liinis. See sündmus viis ulatusliku transkriptsioonivõrgu ümberprogrammeerimiseni ja võimaldas Saccharomyces cerevisiae anaeroobset kasvu optimeerida.

Lisaks cis- muutuste olulisusele dubleeritud geenide promootorites, võivad paraloogi geeniregulatsiooni kujunemises olulist rolli mängida ka trans- aktiivsete tegurite muutused (see tähendab paraloge reguleerivad transkriptsioonifaktorid). On näidatud, et vaid 2–3% erinevustest paraloogi väljenduses on seletatav muutustega cis- regulatiivsetes motiivides 27 . Mitmed uuringud näitasid lisaks, et transkriptsioonifaktorite dubleerimine võib olla oluline mehhanism, mis võimaldab olemasolevate regulatiivsete võrkude ümberjuhtimist või uute regulatiivsete vooluringide väljatöötamist .

Teichmann ja Babu 12 pakkusid välja geeniregulatsiooni kolm põhistsenaariumi pärast dubleerimist, mis kaalub muutusi nii cis kui ka transregulatiivsetes elementides. Esimese stsenaariumi korral võivad mõlemad geeni koopiad jääda sama transkriptsioonifaktori reguleerimise alla, mis on eeldatav tulemus, kui paraloogid ei arenda erinevaid funktsioone, vaid on konserveeritud annusefektide tõttu 7, 11, 30 . Teise võimalusena võib värskelt dubleeritud paraloog muutuda mõne teise (olemasoleva) regulatiivse võrgu osaks, näiteks pärast uue cis- regulatoorse elemendi saamist (see tähendab transkriptsioonifaktori sidumissaiti, mida esivanema geeni promootoris ei esinenud). Mõni neofunktsionaliseerimise juhtum, kus üks paraloogidest omandab täiesti uue funktsiooni, võib siiski vajada täiesti uudset regulatsioonisüsteemi. Kolmas stsenaarium hõlmab seetõttu uue regulatiivse kaskaadi genereerimist olemasoleva transkriptsioonifaktori dubleerimise ja funktsionaalse lahknemise teel, nii et mõlemat paraloogilist sihtgeeni reguleerib üks kahest äsja dubleeritud transkriptsioonifaktorist. Sihtmärgi ja selle transkriptsioonifaktori kooskõlastatud dubleerimine ja evolutsioon näib siiski ebatõenäoline ja nõuab intuitiivselt suurt hulka kooskõlastatud evolutsioonisündmusi, välja arvatud võib-olla terve genoomi dubleerimise sündmus 2, 31, 32, 33, 34, 35 .

Nende stsenaariumide uurimiseks keskendume MAL-i geenide reguleerimisele pärmis. MAL-i geenid hõlmavad kolme geeni alamperekondi ( MALT , MALS ja MALR ), mis võimaldavad mitmesuguste disahhariidide omastamist ja metabolismi, kusjuures igas alamperekonnas on mitu korduvat dubleerimist ja neofunktsionaliseerumist 36 . MALT alamperekond kodeerib transportervalke, mis võimaldavad suhkruid aktiivselt importida. Pärast raku seesmist hüdrolüüsitakse disahhariidid MalS glükosidaaside abil. Arvatakse, et mõned rakusisesed disahhariidid seovad MalR regulaatorvalke ja need kompleksid aktiveerivad MALS ja MALT geenide ekspressiooni 37 .

Oleme varem näidanud, et S. cerevisiae MALS-i geenid läbisid mitu dubleerimist, kusjuures mõned paraloogid saavutasid uudse hüdrolüüsimise aktiivsuse α 1-6 glükosiidsidemete suhtes (leidusid näiteks isomaltoosis ja palatinoosis), teised MalS-i paraloogid säilitas esivanemate eelistamise α 1-4 glükosiidsidemete suhtes (näiteks maltoosis) 7, 36 . Sarnaselt toimusid MalT-i transportijad dubleerimise ja funktsionaalse lahknemisega: mõned tänapäeva paraloogid importisid α 1-6 substraate, teised aga säilitasid esivanemate selektiivsuse α 1-4 glükosiidide suhtes 36 .

Siin uurisime, kuidas arenesid MALT ja MALS geenide regulatsioonid pärast nende dubleerimist ja funktsionaalset lahknemist. Näitame, et tänapäevased S. cerevisiae MAL geenid on spetsiifiliselt reguleeritud; see tähendab, et palatinoos-spetsiifilised geenid aktiveeritakse ainult vastusena palatinoositaolistele suhkrutele, kuna maltoosile omaseid paraloge aktiveerivad ainult maltoositaolised suhkrud. Näitame, et see kahe paraloogirühma spetsiifiline reguleerimine sai võimalikuks, kuna esivanemate transkriptsioonifaktor MalR, mis reguleeris esivanemate MALS-i ja MALT-i geene, tegi samuti dubleerimist. Üks uus MalR-i paraloog aktiveerib palatinoosi kasutamise eest vastutavate uudsete MALS-i ja MALT-i ekspressiooni, teine ​​MalR-i paraloog aktiveerib maltoos-spetsiifilisi sihtgeene. Lisaks loome mutatsioonitee, mis selgitab, kuidas oleks paralleelsete sihtgeenide mõlema klassi diferentsiaalregulatsioon saanud areneda ilma paraloogi sekkumiseta. Koos annavad meie tulemused üksikasjaliku molekulaarse ülevaate sellest, kuidas geenide dubleerimine võib põhjustada uue transkriptsioonivõrgu tekkimist.

Tulemused

MAL-i regulatiivvõrk võimaldab konkreetset regulatsiooni

Laboratoorse tüve S. cerevisiae KV5000 genoomis on kaks funktsionaalset MALT (transporter) ja neli funktsionaalset MALS (maltaas / isomaltaas) geeni. Pärast dubleerimist MalS-i paraloogide aktiivsus lahkus - Mal12 ja Mal32 näitasid aktiivsust α 1-4 glükosiidide, näiteks maltoosi suhtes, ning Ima1 ja Ima5 hüdrolüüsisid α 1-6 glükosiide nagu isomaltoos ja palatinoos. Kahel MalT paraloogil on madalam spetsialiseerumisaste: Mal31 veab ainult α 1-4 glükosiide ja Mal11 veab nii α 1-4 kui ka α 1-6 disahhariide 7, 36 .

Esmalt uurisime, kas erinevate MALS- ja MALT- geenide ekspressiooni reguleerib konkreetselt suhkur, mille aktiivsus neil on. Seetõttu märgistasime fluorestsentsi abil neli nelja MALS ja kaks MALT sihtgeeni metsiktüüpi (wt) tüves ja hindasime fluorestsentsi abil nende ekspressiooni söötmes, mis sisaldas kas maltoosi (α 1-4 disahhariidi) või palatinoosi (α 1-6 disahhariidi). mikroskoopia. Jooniselt fig 1a on näha, et MAL geeni regulatsioon S. cerevisiae's on spetsiifiline: enamik geene aktiveeritakse ainult nende vastavate substraatsuhkrute (maltoos või palatinoos) juuresolekul ja mitte suhkru juuresolekul, mille aktiivsus neil puudub. Üks tähelepanuväärne erand on MAL12 hüdrolaasi geen, mis näitab aktiivsust α 1-4 disahhariidide suhtes, kuid näib aktiveeritavat ka α 1-6 disahhariidide paletinoos. Sellel geenil on aga kahesuunaline promootor MAL11 transportergeeniga, mis transpordib mõlemat tüüpi disahhariide. Seega võib MAL12 spetsiifiline aktiveerimine palatinoosis olla tingitud vajadusest aktiveerida MAL11 , mis kodeerib ainukest transportijat, mis võimaldab omastada α 1-6 disahhariide nagu paletinoos.

Image

Erinevate fluorestsentsmärgisega MALS- või MALT- geenidega pärmirakkude tüüpilised erevälja ja fluorestsentsmikroskoopia kujutised on toodud wt-rakkude ( a ) ja tüvede jaoks, mis kannavad transkriptsioonilisi regulatoreid kodeerivate geenide deletsioone ( b: MALX3 ja c: YFL052W ). Rakke kasvatati kas paltinoosi (α 1-6 disahhariid) või maltoosi (α 1-4 disahhariid) juuresolekul, nagu on näidatud piltide kohal. Geeninimed on loetletud esimeses veerus ja mõlemat tüüpi suhkrute (maltoos või palatinoos) valkude aktiivsus on märgitud teises ja kolmandas veerus. Skaalariba on vasakpoolses ülaservas ja see on 10 μm. Katse korrati vähemalt kolm korda.

Täissuuruses pilt

Oleme varem näidanud, et MALR-i transkriptsioonifaktori geenid MALX3 ja YFL052W on maltoosi ja palatinoosi kasvu jaoks üliolulised 36 . Täpsemaks uurimiseks, milline neist transkriptsiooniregulaatorigeenidest vastutab selle (te) geeni (de) aktiveerimise eest, kustutasime need MALR-i geenid ja uurisime mõju MALT-i ja MAL S-i aktiveerimisele. MALX3 kustutamine (joonis 1b) kaotab maltoos-spetsiifiliste hüdrolaasigeenide MAL12 ja MAL32 ning maltoos-spetsiifilise transportergeeni MAL31 ekspressiooni . Lisaks ei ekspresseerita enam ka maltoosi juuresolekul MAL11 geeni, mis kodeerib ähvardavat transporterit, mis on võimeline transportima nii α 1–4 kui ka α 1–6 disahhariide, kuigi see on endiselt aktiveeritud palatinoosis. Α 1-6 hüdrolaase kodeeriva IMA1 ja IMA5 ekspressiooni MALX3 deletsioon ei mõjuta . Seevastu teise MALR geeni YFL052W kustutamine kaotab IMA1 ja IMA5 ekspressiooni (joonis fig 1c), samas kui maltoosist indutseeritud geenide, mis kodeerivad α 1-4-spetsiifilisi valke ( MAL12 , MAL32 ja MAL31 ), ja paljukordset ekspressiooni. MAL11 ei mõjuta.

Erinevad MalR regulaatorid seovad erinevaid DNA saite

Eelnevad tulemused näitavad, et MALS ja MALT geene reguleerivad kaks eraldiseisvat regulatiivset võrku, mida vastuseks erinevatele disahhariididele reguleerivad erinevad MalR transkriptsioonifaktorid. Kahe regulatiivse võrgu vaheline piiratud läbilõige viitab sellele, et maltoosi- ja palatinoos-spetsiifilised MalR regulaatorid seovad erinevaid DNA-d siduvaid saite. Selle testimiseks määrasime kromatiini immunosadestamise (ChIP) ekso-tehnika 38 abil palatinoos-spetsiifilise regulaatori Yfl052w DNA-d siduvad saidid ja võrdlesime neid maltoos-spetsiifilise regulaatori Malx3 teadaolevate sidumissaitidega (viide 39). . ChIP-exo analüüs toetab joonisel 1 toodud tulemusi ja näitab, et mõlemad transkriptsioonifaktorid seovad erinevaid saite. Täpsemalt, kui α 1–6 disahhariidi paletinoos on olemas, seob Yfl052w palatinoos-spetsiifiliste geenide ( IMA1 , IMA5 ja YFL052W ) promootorpiirkondi ja MAL11 juhuslikku transporterit, kuid mitte maltoosile spetsiifiliste geenide promootoreid (täiendav joonis 1 ). Selle asemel seostatakse Malx3-ga neid maltoos-spetsiifilisi geene maltoos 39 juuresolekul.

Lisaks tuvastati ChIP-exo katses Yfl052w kaks uut mittekanoonilist sihtmärki - YHR210C ja YJL217W (täiendav joonis 1). Näib, et mõlemal geenil puudub roll a-disahhariidi metabolismis ja nad ei näita järjestuse sarnasust MAL-i geenidega. Ükskõik kumma kahe kustutamine ei muuda teiste MAL-i geenide ( IMA5 ja MAL32 ) rakkude kasvu ega ekspressioonimustreid palatinoosis ega maltoosis (täiendav joonis 2).

MalR regulaatorid kuuluvad seente Zn-sõrme transkriptsioonifaktorite perekonda, mis seovad tavaliselt lühikesi kolme nukleotiidi CG-rikkaid motiive, mis on eraldatud fikseeritud pikkusega 40 vahekaugiga. Joonis 2 näitab, et palatinoos-spetsiifilise Yfl052w regulaatori DNA-sidumiskoht on väga sarnane maltoos-spetsiifilise Malx3 regulaatori omaga. Täpsemalt, Yfl052w seondumissait koosneb kahest CG G motiivist, mis on eraldatud üheksa nukleotiidist (nt) AT-rikkast speisserist (joonis 2a), samas kui Malx3 DNA-d siduvad saidid sisaldavad CG C motiivi, üheksa nt specerit ja CGN motiivi. (Joonis 2b). Erinevate MalR-i regulaatorite (Malx3 ja Yfl052w) seondumissaitide kinnitamiseks kustutasime kõigepealt seondumiskohad tüvest, mis kandis maltoos-spetsiifilise sihtgeeni ( MAL32 ) fluorestsents-reporteri liitmist, ja tüvest, mis kandis palatinoosi reporterit -spetsiifiline geen ( IMA5 ). Mõlemal juhul kaotas vastavate sidumissaitide kustutamine sihtgeeni induktsiooni selle vastava substraadisuhkru poolt (joonis 3a: jooned 1 ja 2 ja joonis 3b: jooned 1, 2 ja 3). Veelgi enam, ühe sidumiskoha asendamine teisega vahetab promootorite suhkruspetsiifilisust ja reportergeeni aktiveerimiseks vajalikku spetsiifilist transkriptsioonifaktorit (joonis 3), viidates täiendavalt sellele, et need veidi erinevad sidumissaidid eraldavad kahte regulatiivset vooluringi. Lõpuks, selleks et täiendavalt kinnitada, et see ühe nukleotiidi erinevus on tõepoolest vastutav mõlema klassi transkriptsioonifaktorite erineva sidumise eest, viisime MAL32 geeni promootorpiirkonda kahepunktilise mutatsiooni, nii et mõlemad CG C motiivid Malx3 sidumissaidis muudeti CG G motiivideks. Nagu on näidatud joonisel 4a, b, põhjustavad need mutatsioonid MAL32 geeni ekspressiooni paletinoosi juuresolekul ja see toime sõltus YFL052W geenist.

Image

( a ) Yfl052w DNA-d siduva saidi CGG (9N) CGG järjestuse logo. ( b ) Malx3 DNA-d siduva saidi CGC (9N) CGN järjestuse logo. ( c ) Järjestuste mitmekesisuse diagramm, mis edastab erinevusi ja sarnasusi Yfl052w (sinine) ja Malx3 (punane) seondumissaitide vahel. Piirkonnad, kus kaks rühma kattuvad, on näidatud lillaga. Joone paksus näitab joondatud järjestuste suhtelist osakaalu. Kahte rühma eristavad positsioonid identifitseeritakse sinise ja punase joone eraldamisega. Allpool olevad rõngad on põhilised soojuskaardid ringikujuliselt, mis näitavad positsioonide infosisu. Mida värv on küllastunud, seda suurem on infosisu, näidates seega konserveerunud piirkondi. Vastastikune teave (MI) tähistab positsioonide kovariatsiooni ja seda kuvatakse ringide sees hallide joontena. Kõrge MI näitab ühe positsiooni sõltuvust teisest.

Täissuuruses pilt

Image

Maltoosispetsiifilise geeni MAL32 (punane blokeeritud nool) või palatinoos-spetsiifilise IMA5 (sinine blokeeritud nool) promootorites oleva fluorestsentsreporteri tüvede populatsioonide representatiivsed voolutsütomeetrilised histogrammid, mis on kasvatatud maltoosis või palatinoos. Palatinoos-spetsiifiliste geenide promootorites leiduvad CGG-d sisaldavad seondumiskohad on kujutatud siniste ristkülikutena, maltoos-spetsiifiliste geenide promootorites leiduvad CGC-d sisaldavad DNA-sidumiskohad on kujutatud punaste ristkülikutena. ( a ) Palatinoos-spetsiifilise regulaatori Yfl052w DNA-ga seonduv spetsiifilisus. (1) Fluorestsentsmärgistatud IMA5 geen oma loodusliku promootori all näitab If-5 ekspressiooni normaalset taset, mida palatinoosis aktiveerib Yfl052w. (2) Yfl052w seondumissaidi kustutamine kaotab IMA5 ekspressiooni . (3) Fluorestsentsmärgistatud maltoos-spetsiifiline MAL32 oma loodusliku promootori all ei avalda palatinoosil ekspressiooni ja seda kasutatakse autofluorestsentsi kvantifitseerimiseks. Yfl052w seondumissaidi sisestamine IMA5 (4) või IMA1 (5) promootorist fluorestsentsmärgistatud MAL32 geeni ette muudab selle geeni ekspressiooni reageerimaks paletinoosile . (6) YFL052W kustutamine kaotab MAL32 geeni ekspressiooni punktist (4). ( b ) Maltoos-spetsiifilise regulaatori Malx3 DNA-ga seonduv spetsiifilisus. (1) Fluorestsentsmärgisega MAL32 oma loodusliku promootori all näitab MAL32 ekspressiooni normaalset taset, mille Malx3 aktiveerib maltoosis. (2) Ühe Malx3 siduva saidi kustutamine vähendab fluorestsentsmärgisega MAL32 ekspressioonitasemeid. (3) Kõigi kolme Malx3 seondumissaiti kustutamisel kaotatakse MAL32 ekspressioon. (4) Autofluorestsentsi näitamiseks kasutatakse fluorestsentsmärgistatud IMA5 geeni oma loodusliku promootori all. Ühe (5), (6), kahe (7) (9) või kolme (10) Malx3 siduva saidi sisestamine fluorestsentsmärgistatud IMA5 geeni promootoripiirkonda muudab selle geeni ekspressiooni reageerivaks maltoosile, suurenedes sidumissaitide tulemuseks on kõrgemad ekspressioonitasemed. (11) - (13) Maltoos-spetsiifilise regulaatori MALX3 kustutamine kaotab tüvede ekspressiooni punktidest 7, 8 ja 10. Iga katset korrati vähemalt kolm korda kahe bioloogilise kordusega.

Täissuuruses pilt

Image

( a ) Maltoosist indutseeritavas promootoris olevad kaks punktmutatsiooni annavad palatinoosist indutseeritava promootori. (1) YECitriiniga märgistatud MAL32 geeniga tüve fluorestsentssignaali histogramm. See maltoos-spetsiifiline reportergeen ei ekspresseeri palatinoosis ja seda saab kasutada taustfluorestsentsi taseme hindamiseks. (2) Üksiku nukleotiidi C kuni G asendamine mõlemas CGC motiivis MAL32 promootori Malx3 sidumispaiga ülesvoolu, põhjustab selle geeni ekspressiooni palatinoosis. (3) Palatinoos-spetsiifilise regulaatori Yfl052w kustutamine kaotab mutandi promootori ekspressiooni. ( b ) sama tüvede fluorestsentsmikroskoopia kujutised, mis on esitatud punktis a. ( c ) CGG-d sisaldavate seondumissaitide arvu suurendamine palatinoosist indutseeritavas promootoris annab promootori, mis reageerib maltoosile. ( d ) c- kujul näidatud tüvede fluorestsentsmikroskoopia representatiivsed kujutised maltoosis. ( e ) CGG-d sisaldavate seondumissaitide arvu suurendamine ei mõjuta palatinoosist indutseeritava geeni IMA5 ekspressiooni palatinoosis. ( f ) c- ga näidatud tüvede representatiivsed fluorestsentsmikroskoopia kujutised palatinoosis. Skaalariba on lisatud b, d, f vasakpoolsesse ülemisse pilti ja võrdub 10 μm. Iga katset korrati vähemalt kolm korda kahe bioloogilise kordusega.

Täissuuruses pilt

Peale sidumismotiivide ühe nukleotiidi erinevuse, märkasime ka, et maltoosile spetsiifiliste geenide promootorid ( MAL12 , MAL32 ja MAL31 ) ja kergekäeline MAL11 transporter sisaldavad alati kolme Malx3 sidumissaiti, samas kui palatinoos-spetsiifilised geenid ( IMA1 , IMA5 ja YFL052W ) sisaldavad ainult ühte Yfl052w seondumissaiti. Huvitaval kombel viitavad joonisel 3 näidatud tulemused sellele, et kõik kolm Malx3 seondumissaiti on vajalikud allavoolu geeni täielikuks aktiveerimiseks, kusjuures üks või isegi kaks seondumissaiti annavad ainult osalise aktiveerimise.

Yfl052w kaks peamist mutatsiooni muudavad selle seondumiseelistust

Järgnevalt pöörasime tähelepanu MalR-i transkriptsioonifaktoritele. Selleks, et teha kindlaks, millised palatinoos-spetsiifilise regulaatori Yfl052w aminohappejäägid võiksid vastutada selle muutunud DNA-ga seondumise spetsiifilisuse eest, modelleerisime Yfl052w ja Malx3 kolmemõõtmelisi struktuure nende DNA-ga seondumiskohtadega kompleksi (joonis 5). Meie mudel viitab sellele, et positsioonis 12 olev aminohape võib seletada erinevust Malx3 ja Yfl052w vahel DNA-ga seondumise osas. Malx3-s hõivab positsiooni 12 Arg, mis ei osale aluspaaride äratundmises, kuid interakteerub DNA negatiivselt laetud fosfaadiga. Yfl052w korral võtab positsiooni 12 Cys-jääk, mis erinevalt Malx3 Arg-jäägist interakteerub DNA-d siduva motiivi alustega ja nõuab konkreetselt G olemasolu CGG-motiivi kolmandas positsioonis (joonis fig. 5b). Lisaks on Malx3 positsioonis 13 asuv Val asendatud ühendiga Yfl052w Ile. Nii Val kui ka Ile tagavad positsioonis 12 asuva aminohappe jaoks vajaliku hüdrofoobse keskkonna. Siiski peab Cys-jäägiga kaasnema hüdrofoobsemat aminohapet, mis võib seletada Vali (hüdrofoobsuse indeks 79) vahetust Ile-ga (100).

Image

( a ) Malx3 ja Yfl052w DNA-d siduvate domeenide joondamine. Aminohapped, mis eeldatavalt interakteeruvad DNA-ga seonduva saidiga, on tähistatud musta ristkülikuga. Võtmepositsioon 12, mis Malx3 ja Yfl052w vahel erineb, on esile tõstetud sinise noolega. ( b ) Zn-sõrme domeeni ja selle DNA-d siduva saidi vahelise interaktsiooni molekulaarne modelleerimine. Olulised aluspaarid on esindatud kollaste ja magenta pulgadega, olulised aminohapped on esindatud siniste pulgadega. Arg15 on jagatud mõlema transkriptsioonifaktori vahel ja vastutab G äratundmise eest CGG sidumismotiivis keskel. Malx3 arg12 ei osale CGG motiivi äratundmises, kuid Yfl052w koosnev Cys12 interakteerub DNA-ga ja vastutab G-nukleotiidi eelistamise eest motiivi kolmandas positsioonis. ( c ) Palatinoos-spetsiifilise Yfl052 aktivaatori (Cys12Arg ja Ile13Val) muteeritud versioon on võimeline osaliselt aktiveerima MAL32 promootori vastusena palatinoosile ja säilitab ka oma võime aktiveerida IMA5 promootorit. ( d ) Maltoos-spetsiifilise Malx3 aktivaatori (Arg12Cys ja Val13Ile) muteeritud versioon ei ole võimeline aktiveerima vastusena maltoosile MAL32 või IMA5 . ( e ) Maltoos-spetsiifilise Malx3 aktivaatori (Arg12Cys ja Val13Ile) muteeritud versioon on võimeline osaliselt aktiveerima IMA5 promootorit, mis sisaldab täiendavat Yfl052w seondumissaiti. Iga katset korrati vähemalt kolm korda kahe bioloogilise kordusega.

Täissuuruses pilt

Et kinnitada, kas Yfl052w eelistamine CGG motiividele on tõesti kahe ülalnimetatud jäägi poolt dikteeritud, muteerisime Yfl052w-s Cys12 Argiks ja Ile13 Valiks ning testisime selle muteerunud Yfl052w sidumisspetsiifilisust. Nagu on näidatud joonisel 5c, on muteerunud Yfl052w võimeline osaliselt aktiveerima maltoos-spetsiifilise geeni MAL32 ekspressiooni palatinoosis. Veelgi enam, nende rakkude fluorestsentsprofiil sarnaneb fluorestsentsmärgistatud IMA5-ga wt-rakkude omale , mida aktiveerib ka Yfl052w. Huvitav on see, et muteerunud Yfl052w aktiveerib ilmselt endiselt ka oma loomuliku sihtmärgi promootori, mis juhib IMA5 .

Sarnaselt tutvustasime Malx3 regulaatoris Arg12 Cys ja Val13 Ile mutatsioone. See muteerunud Malx3 regulaator ei saa enam aktiveerida loodusliku sihtmärgi MAL32 promootori ekspressiooni (sisaldab CGC motiive) ega aktiveerida paletinoos -spetsiifilist IMA5 geeni (joonis 5d). Kuid me näitasime varem, et Malx3 vajab oma sihtgeenide ekspressiooni aktiveerimiseks mitmeid DNA-d siduvaid saite (joonis 3b). Tõepoolest, kui fluorestsentsmärgisega IMA5 reporteritüve promootorisse viidi teine ​​CG G-d sisaldav seondumissait, suutis muteerunud Malx3 aktiveerida IMA5 ekspressiooni maltoosis, mis on kooskõlas tähelepanekuga, et Malx3 vajab mitmekordset seondumist saidid (joonis 5e).

Malx3 seob nii CGC kui ka CGG motiive

DNA-ga seotud Malx3 struktuurimudel ennustab, et Malx3 on juhuslik ja suudab siduda nii CG C kui ka CG G motiive. See vähendatud sidumisrangus, võrreldes Yfl052w-ga, tuleneb arvatavasti Arg12 jäägist Malx3 seondumisdomeenis, mis võimaldab nii C kui ka G seondumismotiivi kolmandas positsioonis. Seda ennustust toetab tähelepanek, et Cys12Arg-asendust kandev Yfl052w aktiveerib endiselt selle loodusliku sihtmärgi IMA5 ekspressiooni, mis kannab promootoris CG G- motiive (joonis 5c). Teisest küljest näitavad joonisel 1 näidatud tulemused, et Malx3 ei aktiveeri in vivo ekspressiooni palatinoosi-spetsiifiliste sihtgeenide CG G sisaldavatest promootoritest. Joonisel 3b toodud tulemused näitavad siiski, et Malx3 nõuab ekspressiooni aktiveerimiseks rohkem kui ühe seondumissaidi olemasolu ja palatinoos-spetsiifiliste geenide promootorid sisaldavad ainult ühte MalR-i sidumissaiti. Teisisõnu, kuigi Malx3 on võimeline siduma nii CG G kui ka CG C motiive, ei pruugi Malx3 olla võimelised aktiveerima CG G sisaldavaid palatinoosi-spetsiifilisi promootoreid, kuna need sisaldavad ainult ühte sidumissaiti; arvestades, et maltoosile iseloomulikud promootorid sisaldavad mitut saiti. Selle hüpoteesi kontrollimiseks võtsime kasutusele fluorestsentsmärgistatud IMA5 geeni promootoripiirkonnas teise CG G-d sisaldava Yfl052w seondumissaidi ja mõõtsime selle palatinoos-spetsiifilise geeni ekspressiooni maltoosi juuresolekul. Nagu on näidatud joonisel 4c, d, viib täiendava seondumissaidi lisamine IMA5 geeni ekspressiooni aktiveerumiseni maltoosil tasemeni, mis sarnaneb selle tavapärase aktiveerimisega palatinoosis, isegi juhul, kui Yfl052w transkriptsioonifaktor puudub, mis tavaliselt aktiveerib IMA5 .

Need tulemused näitavad koos, et Yfl052w spetsiifiline seondumine paletinoos-spetsiifiliste sihtgeenide promootorpiirkondadega on määratud CGG motiivide olemasoluga. Maltoos-spetsiifiliste geenide promootorid sisaldavad CGC motiive ja seega ei saa Yfl052w siduda, kuna selle regulaatori DNA-d siduvas domeenis olev Cys12 jääk takistab CGC saitide sidumist. Teisest küljest on Malx3 võimeline seonduma mõlemat tüüpi motiividega (CGG ja CGC), kuid täieliku geeni aktiveerimise saavutamiseks nõuab samas promootoripiirkonnas mitmete sidumissaitide olemasolu. See takistab Malx3 aktiveerimas paletinoos-spetsiifiliste geenide ekspressiooni, mille promootorites on ainult üks MalR-i sidumissait.

Kahe regulatiivse võrgustiku lahknemise evolutsioonimudel

Kokkuvõttes paljastavad meie tulemused kahe eraldi ja spetsiifilise regulatsiooniringluse tekkimise aluseks olevad mehhaanilised üksikasjad: üks reguleerib maltoosi metabolismi ja teine ​​isomaltoosi ja palatinoosi metabolismi. Järgmisena tahtsime kindlaks teha tõenäolise evolutsioonitee esivanematest, dubleerimiseelsest vooluringist tänapäevase olukorra juurde.

Säilinud pärmiliikide ühisel esivanemal oli MAL-i geenide kolmest tüübist ( MALS , MALT ja MALR ) 7, 36 ainult üks eksemplar. Mõnede liikide, sealhulgas S. cerevisiae , MAL geenid läbisid mitu dubleerimist. Teistes liikides, nagu L. elongisporus , MAL geene ei dubleeritud ja iidne lihtne kolme geeni võrk näib olevat säilinud (täiendav joonis 3). Veelgi enam, L. elongisporus MalS valgu aktiivsus sarnaneb antiproduktsiooni eelse ensüümi aktiivsusega ja võib hüdrolüüsida nii maltoosi- kui ka paletinoositaolisi disahhariide 7 . See viitab sellele, et selle MalR regulaator võib olla võimeline aktiveerima nii kergekäelise MalS kui ka kergekäelise MalT ekspressiooni ükskõik millise kahe suhkrutüübi juuresolekul. Selle hüpoteesi kontrollimiseks võrdlesime MALSi ja MALTi geenide mRNA taset L. elongisporus rakkudes, mis olid kasvatatud maltoosist, palatinoosist või glükoosist. Nagu on näidatud lisajoonisel 4, aktiveeritakse MALTi ja MALS-i ekspressioon nii maltoosi kui ka palatinoosi, kuid mitte glükoosi juuresolekul.

Järgmisena uurisime MALS ja MALR geenide dubleerimise ja lahknemise ajakava (täiendav joonis 3). Oleme varem näidanud, et MALS-i geenid dubleerisid ja omandasid uue funktsiooni vähemalt Kluyveromyces thermotolerans 7 hargnemisel. Sarnane analüüs näitab, et MALR-i geenide funktsionaalne mitmekesistamine leidis aset evolutsiooni hiljem, S. bayanuse hargnemise ümber Saccharomyces'e kladest. Täpsemalt, S. bayanuse genoom sisaldab ainult ühte MALR- i tüüpi MALX3 tüüpi (Arg positsioonis 12) ja puudub palatinoos-spetsiifiline Yfl052w-laadne regulaator (sisaldab Cys12Arg mutatsiooni), mis esineb S. cerevisiae , S paradoxus , S. mikatae ja S. kudriavzevii . Ekspressioonianalüüs näitab, et erinevate MALS-i geenide reguleerimine S. bayanuses ei ole spetsiifiline, see tähendab, et maltoosi- ja palatinoos-spetsiifilised MALS- geenid aktiveeritakse võrdselt maltoosi ja palatinoosi, kuid mitte glükoosi juuresolekul (täiendav joonis 5). Lisaks on MALR-i sidumissaitide nukleotiidijärjestused S. bayanuse , S. mikatae , S. paradoxuse ja S. kudriavzevii genoomides märkimisväärselt konserveerunud. Sarnaselt S. cerevisiae saitidega jagunevad nad kahte klassi: CGG ja CGC sisaldavad (lisaandmed 1). Analoogselt S. cerevisiae'ga leidub S. mikatae, S. paradoxus ja S. kudriavzevii (see on liik, kus nii MALR regulaator kui ka MALS geenid on dubleerinud ja mitmekesistunud) CGG-d sisaldavaid saite paletinoos-spetsiifilised geenid ja CGC-d sisaldavad saidid asuvad maltoosispetsiifiliste geenide homoloogidest ülesvoolu. Seevastu S. bayanuses (mis sisaldab mitut MALS-i , kuid ainult ühte Arg12-tüüpi MALR-i ) jaotuvad CGG ja CGC saidid juhuslikult nii maltoosi- kui ka paletinoosispetsiifiliste geenide homoloogide promootorites juhuslikult ( lisateave 1), mis nõustub nende geenide mittespetsiifilise reguleerimisega S. bayanuses .

Need tähelepanekud koos näitavad, et MAL-i geenivõrk arenes nii, nagu on kujutatud joonisel 6. Selle mudeli puhul toimus MALS-i geenide dubleerimine ja funktsionaalne lahknemine juba K. thermotolerans ja S. cerevisiae ühises esivanemas (joonis 6, sündmused). 1 ja 2), kuid neid geene kontrollis ikkagi üks ähvardav MalR-i regulaator, mis sarnanes tänapäevase S. bayanus Malx3 valguga (mille Argi jääk asub 12. positsioonil). Sarnaselt tänapäevase Malx3 regulaatoriga suutis esivanemate regulaator siduda nii CGG kui ka CGC motiive ja indutseerida mõlemat tüüpi suhkrute juuresolekul nii maltoosile kui ka paletinoosile omased geenid. Nende geenide promootorid tõenäoliselt veel ei lahknenud, nii CGC kui CGG motiivid olid kohal maltoosist ülesvoolu, aga ka paletinoos-spetsiifilised geenid, mis on sarnased tänapäevase S. bayanuse genoomiga . Yfl052w-sarnased regulaatorid ilmusid evolutsioonis tõenäoliselt hiljem dubleerimise (joonis 6, sündmus 3) ja sellele järgnenud mutatsioonide, sealhulgas võtme Arg12Cys mutatsiooni tagajärjel (joonis 6, sündmus 4). See muteerunud Yfl052w-sarnane paraloog ei saa enam siduda CGC motiive, mis on valitud maltoos-spetsiifiliste geenide promootorites. Seevastu Malx3-taoline regulaator arendab nõrgemat aktiivsust, nii et see kaotab võime aktiveerida palatinoosi-spetsiifiliste geenide ekspressiooni, millel on valitud ainult üks CGG-d sisaldav sidumissait, säilitades samal ajal võime aktiveerida maltoos-spetsiifilisi promootorid, mis sisaldavad kolme CGC seondumissaiti (joonis fig 6, sündmused 5 ja 6).

Image

a ) seeneliigi lihtsustatud fülogeneetiline puu. Numbrid vastavad peamistele evolutsioonisündmustele, mis on loetletud punktis b . WGD tähistab dokumenteeritud dokumente kogu genoomi dubleerimise juhtumist seeneliinis. ( b ) MAL-i regulatiivse võrgu tõenäoline arengutee. Tee algab L. elongisporus , S. bayanus ja S. cerevisiae ühiselt esivanemalt ja lõpeb tänapäeva S. cerevisiae'ga . L. elongisporuse , S. bayanuse ja S. cerevisiae ühises esivanemas ei ole maltoosi ja isomaltoosi ensümaatilised aktiivsused eraldatud ja eksisteerivad koos ühes esivanemate MalS ensüümis, mida reguleerib üksainus kergekäeline MalR-i regulaator. S. cerevisiae ja K. thermotolerans ühises esivanemas dubleeriti ja funktsionaliseeriti MALSi geenid (1, 2), nii et kohal olid mõlemat tüüpi sihtgeenid (maltoosi- ja palatinoosispetsiifilised) ning neid reguleerib üks paljutõotav Malx3-laadne transkriptsioon. faktor, millel on Argi jääk positsioonis 12, mis võimaldab sellel siduda nii CGG kui ka CGC motiive. Regulatsioon pole sel hetkel spetsiifiline, see tähendab, et paletinoosi- ja maltoos-spetsiifilised geenid ekspresseeritakse võrdselt nii nende vastava substraadi kui ka mittespetsiifilise disahhariidi juuresolekul (nagu see on S. bayanuse puhul ). Kaks eraldi regulatiivset vooluringi, mis ilmnevad S. bayanuse kõrvalekalde ümber Saccharomyces'e puust. MALR geen on dubleeritud (3) ja sellele dubleerimise sündmusele järgnevad kaks ühe nukleotiidi mutatsiooni Arg12 ja Val13 koodonite esimestes positsioonides, muutes need Cys ja Ile ühes paraloogides (4), hoides sellega ära selle siduvad CGC motiivid maltoos-spetsiifiliste geenide promootorites. Ainult ühte tüüpi MALR geeni kandvate genoomide analüüs näitab, et esivanemate pärmis jaotati CGG ja CGC motiivid juhuslikult maltoosi- ja palatinoos-spetsiifiliste geenide vahel. See tähendab, et neid seondumissaite oli vaja muuta koos MALR-i paraloogide mutatsioonidega, nii et palatinoos-spetsiifilised geenid sisaldasid ainult ühte CGG-saiti ja maltoos-spetsiifilised geenid sisaldasid kolme CGC-motiivi, nii et nõrgenenud neid saaks ikkagi aktiveerida. Malx3 paraloog (5, 6).

Täissuuruses pilt

Arutelu

Mitmete uuringutega on uuritud liikide vahelist regulatiivset erinevust genoomi tasandil 8, 12, 18, 20, 22, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 . Need uuringud koos näitavad, et muutused geeniregulatsioonis toimuvad sageli ja on funktsionaalse ja morfoloogilise evolutsiooni olulised edasiviijad 26, 46, 47 . See kehtib eriti äsja dubleeritud geenide regulatsiooni arengu kohta. Kuna paraloogidel on sageli erinevad funktsioonid, tuleb neid funktsionaalselt lahknevaid duplikaate vajada iseseisvalt reguleerimine. Vaatamata geeniregulatsiooni arengu ja lahknemise olulisusele jäävad täpsete molekulaarsete mehhanismide ja mutatsiooniteede, mis viivad selliste uudsete regulatoorsete võrkude tekkimiseni, suures osas teadmata.

Meie tulemused näitavad, kuidas ühekordse transkriptsioonifaktori ja selle sihtgeenide dubleerimine viis kahe eraldi regulatiivse võrgu väljaarendamiseni, kusjuures üks transkriptsioonifaktori paraloog reguleeris maltoosi omastamises ja metabolismis osalevate sihtgeenide komplekti ning teine ​​vastutab reguleerivate sihtgeenide eest palatinoosi tarbimiseks. Täpsemalt leiame, et sihtmärkgeenide promootorpiirkondades on ainult kaks punktmutatsiooni koos kahe üksiknukleotiidmutatsiooniga transkriptsioonifaktori paraloogide DNA-d siduvas domeenis piisavad tagamaks, et iga transkriptsioonifaktori paraloog aktiveerib spetsiifiliselt oma sihtpromootorid., häirimata teise paraloogi sihtgeenide regulatsiooni.

Kuigi valdkonnas on domineeriv arvamus, et areng normatiivsel tasemel eelneb sihtgeenide 8, 10, 18, 18, 21, 22, 25, 49 valgujärjestuse tegelikele muutustele, näitavad meie andmed, et ka vastupidine on võimalik. Tundub tõenäoline, et esivanemate MAL-i geenireguleerimise eelne dubleerimise eeldus oli väga lihtne ja meenutas võrku tänapäevases L. elongisporus (täiendav joonis 3). L. elongisporus MalR regulaator on lühiajaline ja aktiveerib (bifunktsionaalse) MalS hüdrolaasi ja transporteri ekspressiooni vastusena maltoosile või palatinoosile. Mitmed MALS-i geenide dubleerimise sündmused, millele järgnes kas maltaasi või palatinase aktiivsuse optimeerimine erinevates paraloogides, viisid MalS-i hüdrolaaside kahe funktsionaalse klassi tekkimiseni S. cerevisiae 7-s . Huvitaval kombel viitavad meie analüüsid sellele, et palatinoos-spetsiifiliste MalR-i regulaatorite spetsialiseerumine ja kahe regulatoorse võrgu eraldamine leidis aset tõenäoliselt pärast MALS-i sihtgeenide deofunktsionaliseerimist, S. bayanuse ja S. cerevisiae küünte hargnemise ümber (täiendav joonis 3 ). MalS ensüümide funktsionaalne erinevus tekitas olukorra, kus rakkude jaoks oli kasulik reguleerida iga MalS ensüümi eraldi, nii et iga ensüüm aktiveerus ainult selle õige substraadi abil ja välditaks paraloogilisi häireid. Selle hüpoteesi kohaselt oleme varem näidanud, et MAL-i geenide aktiveerimine tingimustes, kus neid ei vajata, maksab märkimisväärse vormisoleku hinnaga 50 .

Meie uurimuses kirjeldatud arengutee toob välja, kuidas täpsus (või piiratud seondumiskoha spetsiifilisus) võib transkriptsioonifaktorite „arendatavust” suurendada, hõlbustades eraldiseisvate regulatiivsete moodulite tekkimist. Tõepoolest, pärast dubleerimise toimumist võivad järjestikused mutatsioonid võimaldada äsja dubleeritud transkriptsioonifaktori paraloogide spetsiifilisust järk-järgult suurendada ja soodustada kahe sõltumatu regulatiivse vooluringi sujuvat tekkimist, vältides samal ajal sihtgeenide valesti seadmist (st. - välditakse nn fitness orgu). Oluline on see, et Yfl052w paraloogi sidumisspetsiifilisuse suurendamiseks on vaja ainult kahte võtmemutatsiooni Zn-sõrme DNA-d siduvas domeenis. Together, these observations reveal how the seemingly unlikely model for the emergence of a new regulatory module through duplication of a transcription factor proposed by Teichmann and Babu 12 can in fact really occur. However, in contrast with the theory that regulation evolves asymmetrically, with only the regulation of the new function diverging from that of the ancestral function 15, we find that in this case the evolution of two separated regulatory networks depends on concerted changes in both networks (one regulating α 1–4 glycoside metabolism and the other regulating α 1–6 glycoside metabolism).

Interestingly, the importance of promiscuity also emerges from other studies that investigate the evolution of other proteins, such as enzymes and receptors. For example, the ancestral pre-duplication maltase showed activity towards both α 1–4 glycosides like maltose, but also a (trace) activity for α 1–6 glycosides such as isomaltose. Similarly, promiscuity has also been shown in other pre-duplication ancestral genes 2, 51, 52 . Hence, whereas promiscuity and 'side activities' are often regarded as imperfections, they are emerging as crucial factors that promote 'evolvability' because the side activities can be selected for and drive the evolution of a paralogue after duplication 53 .

It is especially interesting to compare our results to those reported in a recent elegant study by Baker et al. 17 These researchers showed how duplication of the ancestral fungal Mcm1 transcription factor resulted in two paralogues that each evolved to regulate a subset of the original target genes. In contrast to the MAL gene system, the Mcm1 target genes were not duplicated, and duplication of the Mcm1 factor did not lead to the development of a completely separate regulatory circuit, but rather resulted in subfunctionalization and rewiring of the existing network, with the two paralogues diverging to regulate a subset of the original target genes. Moreover, whereas the MalR paralogues evolved different DNA-binding sites, the Mcm1 paralogues primarily evolved specificity through mutations that restrict their interaction with other transcription factors (Arg81 and Matα1), showing that this is a possible alternative route to rewire networks.

At first, the scenario of the evolution of the MAL genes, where both a transcription factor and its targets are duplicated, might seem rare. However, such situations may occur relatively frequently, either independently, or as a result of whole-genome duplication events 8, 19, 54, 55 . Interestingly, the fungal lineage shows evidence for at least one whole-genome duplication event 34, 56 (see Supplementary Fig. 3). Several authors suggested that post whole-genome duplication networks may undergo functional partitioning, with the paralogues forming two independent subnetworks, which resembles the MAL gene scenario 8, 19 . Moreover, a number of studies report that after the whole-genome duplication, the regulatory genes are preferentially retained compared with other functional classes of genes 2, 31, 32, 33, 35 . However, in the case of the MAL genes, the observed duplication events do not coincide with the reported whole-genome duplication event and instead seem to be the results of (multiple) independent duplications of smaller chromosomal regions. Interestingly, Lynch and Katju 57 proposed that such small-scale duplications might result in misregulation of the duplicated gene when the respective promoter region is not duplicated. However, in the case of the MAL genes, the duplication events probably included the regulatory regions of the duplicated genes, as well as a (subsequent) duplication of the gene encoding the Mal regulator. While such events may be more rare than those associated with whole-genome duplications, they may occur relatively frequently in subtelomeric regions 36 . Moreover, many transcription factors show some level of promiscuity in their recognition of target sites 58, 59 . As detailed above, such promiscuity may greatly facilitate the expansion and rewiring of transcriptional networks. Hence, whereas the molecular details may differ, the general themes uncovered in this study of the MAL regulatory circuit may be representative for a large number of similar events throughout the tree of life.

Meetodid

Strain construction

A complete list of strains and plasmids used in this study is listed in Supplementary Data 2. The primers used to make and confirm these strains can also be found in Supplementary Data 2. All constructs were verified by Sanger sequencing and/or PCR.

Microbial strains, plasmids and growth conditions

We showed earlier that the S. cerevisiae feral isolates RM11 (from a vineyard) and YJM789 (from an AIDS patient) as well as laboratory strain EM93, ancestral to S288c, can ferment maltose due to the presence of a MALX3 regulator in their genomes 36 ; whereas S. cerevisiae strain S288c lost its MALX3 regulator together with the ability to grow on maltose. We re-introduced MALX3 in the genome of S. cerevisiae S288c to restore its ability for growth on maltose and named the resulting strain KV5000. Therefore, KV5000 represents a reconstituted wild-type S. cerevisiae strain, and for this reason, we refer to this strain as the wt strain.

Yeast cultures were grown in rich yeast extract and peptone (YP) media consisting of 2% peptone (Difco), 1% yeast extract (Difco) and 2% sugar (Sigma-Aldrich) at 30 °C in a rotating wheel or shaking incubator. The sugars used in this study were purchased to their highest available purity and were filter-sterilized before adding to rich media. Plasmid sets were obtained from EUROSCARF ( //web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/) for reusable markers (Deletion Marker Plasmids) and overexpression/epitope tagging 60 . Plasmids were used as indicated by the manufacturer.

Fluorescent microscopy imaging

Cell were pre-grown overnight in YP 2% glucose medium and then transferred to YP media supplemented with either palatinose (2%) or maltose (2%) for another 16 h. The acquisition of the images was done with the Optomorph software (version 1.0.2) in combination with a Nikon Eclipse Ti microscope equipped with a DL-604M-#VP camera (Andor technology). Images were processed and scaled with ImageJ software.

Flow cytometry to measure gene expression levels

Cell were grown in YP medium supplemented with maltose (2%) or palatinose (2%) till the OD 600 =0.1. Fluorescent histograms were acquired using a BD Biosciences Influx flow cytometer with 488 nm laser coupled to 530–540 nm detector.

RNA isolation and quantitative PCR

RNA was isolated with phenol/chloroform. Genomic DNA elimination and reverse transcription was performed using the QIAGEN QuantiTech Reverse Transcription kit according to manufacturer's instructions. AB Power SYBR Green PCR master mix was used for quantitative PCR.

Modelling

To investigate the difference between the MalR proteins, homology models were constructed. As there are no homologoes template structures available for the C-terminal domain, only the N-terminal DNA-binding region was investigated. Sequence comparison and fold recognition using Phyre2 indicated pdb entry 1D66 (Gal4-DNA complex) as the most suitable template 40, 61 . All complexes were modelled using the homology implementation in the Molecular Operating Environment (Chemical Computing group, Montreal, Canada) with the implemented CHARMM force field in the presence of the 1D66 DNA structure 62 . Prior to modelling complexes, the base pair sequence of 1D66 sequence was adapted according to the MalR recognition motifs. Following the homology modelling incorporating the DNA structures the complex was optimized by steepest descent minimization in the presence of explicit water molecules.

ChIP-exo

ChIP-exo was performed following the Pugh's lab protocol 63 by Peconics LLT, USA and independently repeated by EMBL GeneCore, Germany. KP54 strain with haemagglutinin-tagged Yfl052W was used for analysis. Untagged strain KP52 served as a control. DNA–protein complexes were precipitated using the Roche Anti-haemagglutinin high affinity rat monoclonal antibody (clone 3F10).

Chip-exo data analysis

Pärast Illumina sekveneerimist kärbiti esmalt madala kvaliteediga lugemisi (q <30) ja adapterijärjestusi Trim Galore abil! (//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/). Seejärel kaardistati saadud lugemid vaikeparameetritega BWA versiooniga 0.7.4 (viide 64) S. cerevisiae referentsgenoomiks (S288C, R64-1-1). Seejärel genereeriti BAM-vormingus failid, kasutades samtoolide versiooni 0.1.18 (järjestuse joondamise / kaardivorming ja SAMtools) ning sorteeriti kromosoomijärjestuse järgi pikardi versiooni 1.100 abil (//picard.sourceforge.net). Positiivse piigi ja motiivi avastuse tuvastamiseks kasutati genoomi hõlmavat sündmuste leidmist ja motiivi avastamist (GEM) versiooni 2.41. Kasutati vaikeparameetreid, välja arvatud - k_min seati väärtusele 5, - k_max seati väärtusele 15, - väärtus seati väärtusele 10 000 000 ja - vaikne seati väärtusele 3. Pärast eksperimentaalse proovi võrdlemist kontrolliga saadi saadud piikide koordinaadid seejärel visualiseeritakse täpsuse kinnitamiseks IGV 2.3 abil.

Bioinformaatika analüüsid

S. cerevisiae S288C , S. mikatae IFO 1815 (AABZ00000000.1), S. kudriavzevii IFO 1802 (AACI00000000.3), S. paradoxus NRRL Y-17217 (AABY00000000.1), L. elongisporus NRRL YB-4239 genoomsed järjestused (AAPO00000000.1) laaditi alla Riiklikust Biotehnoloogia Teabekeskusest. S. bayanus CBS7001 genoomne järjestus on alla laaditud saidilt www.SaccharomycesSensuStricto.org. Erinevate MalR, MalS ja MalT geenide homoloogid identifitseeriti kohaliku BLAST + komplektiga. MalR DNA-d siduvate saitide määramiseks kasutati leitud homoloogide ülesvoolu piirkondi (–800; 0 nt translatsiooni algusest). Valkude joondamine ja K skoori arvutused viidi läbi tarkvara MEGA (versioon 5.2) abil.

Autorite kaastööd

KJV ja KP kavandasid ja kavandasid uuringu. KP viis katsed läbi. Kõik autorid andsid oma panuse tulemuste analüüsimisse ja tõlgendamisse ning käsikirja kirjutamisse. KP, BB ja VB tegid ChIP-exo eksperimente, BZ analüüsis andmeid. AV modelleeris MALR kompleksid DNA-ga. KP ja FAK töötasid välja evolutsioonimudeli ja viisid läbi vastavad bioinformaatilised analüüsid.

Lisainformatsioon

Ühinemiskoodid. ChIP-exo eksperimendis genereeritud järjestused on hoiustatud geeniekspressiooni Omnibus andmebaasis liitumiskoodi GSE57902 all.

Kuidas seda artiklit tsiteerida: Pougach, K. jt. Uue regulatiivse võrgu tekkimist soodustab korduv transkriptsioonifaktori dubleerimine. Nat. Kommuun. 5: 4868 doi: 10.1038 / ncomms5868 (2014).

Muutuste ajalugu

Liitumised

Geeniekspressiooni omnibus

  • GSE57902

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendavad joonised ja täiendavad viited

    Täiendavad joonised 1-5 ja täiendavad viited

Exceli failid

  1. 1

    Täiendavad andmed 1

    S. cerevisiae, S. kudryavzevii, S. bayanuse, S. mikatae, S. paradoxus maltoos- või palatinoos-spetsiifiliste geenide promootorites leiduvad transkriptsioonifaktori seondumissalad . Geeni- ja liiginimed on loetletud esimeses veerus; nende geenide promootorpiirkondades leiduvad transkriptsioonifaktori seondumiskohad (TFBS) on toodud veergudes 2, 3 ja 4. Veenide identifikaatoritena teistes liikides peale S. cerevisiae kasutatakse vastava kontiignumbri viimast 4 või 3 numbrit . Maltoos-spetsiifilised geenid ja CGC-d sisaldavad (Malx3 sarnased) seondumiskohad on esile tõstetud punaselt, palatinoos-spetsiifilised geenid ja CGG-d sisaldavad (Yfl052w sarnased) seondumiskohad on siniselt esile tõstetud.

  2. 2

    Täiendavad andmed 2

    Tüvede ja praimerite loetelu. Leht 1 sisaldab täielikku tüvede loendit koos täielike üksikasjadega tüve ehituse kohta. Lehel 2 on loetletud kõik praimid, mida kasutatakse tüve ehitamiseks.

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.