Dokosaheksaeenhape indutseerib hpb e6 / e7 onkoproteiinide lagunemise, aktiveerides ubikvitiin-proteasoomisüsteem | rakusurm ja haigus

Dokosaheksaeenhape indutseerib hpb e6 / e7 onkoproteiinide lagunemise, aktiveerides ubikvitiin-proteasoomisüsteem | rakusurm ja haigus

Anonim

Õppeained

  • Vähiravi
  • Kasvajaviiruse infektsioonid

Abstraktne

Inimese onkogeense papilloomiviiruse (HPV) E6 / E7 valgud on olulised HPV-ga seotud pahaloomuliste kasvajate tekkeks ja säilitamiseks. Siinkohal teatame, et raku ubikvitiin-proteasoomsüsteemi (UPS) aktiveerimine oomega-3 rasvhappe, dokosaheksaeenhappe (DHA) poolt põhjustab E6 / E7 viirusevalkude proteasoomide vahendatud lagunemist ja apoptoosi esilekutsumist HPV- nakatunud vähirakud. UPS aktiivsuse suurenemist ja E6 / E7 onkoproteiinide lagunemist seostati mitokondrite reaktiivsete hapnikuühendite (ROS) DHA-indutseeritud ületootmisega. Eksogeensel oksüdatiivsel stressil ja mitokondriaalse ROS-i farmakoloogilisel esilekutsumisel ilmnesid DHA-ga sarnased toimed ning ROS-i tootmise pärssimine kaotas UPS-i aktiveerimise, E6 / E7 viirusevalgu destabiliseerumise ja apoptoosi. Need leiud tuvastavad DHA uue rolli UPS-i ja viirusvalkude reguleerimisel ning pakuvad tõendusmaterjali DHA kasutamise kohta mehaaniliselt ainulaadse vähivastase ainena HPV-ga seotud kasvajate keemilises ennetamises ja ravis.

Sissejuhatus

Inimese onkogeenne papilloomiviirus (HPV) on tihedalt seotud mittegenitaalsete ja suguelundite pahaloomuliste kasvajate tekkega. Onkogeensetest HPV-dest on pahaloomulises biopsias kõige sagedamini tuvastatud genotüübid HPV-16 ja HPV-18. 1 HPV-ga seotud vähivormide progresseerumise ajal integreerub kogu HPV genoom või selle fragmendid juhuslikult peremeesraku kromatiini DNA-sse, mis viib kahe varajase viirusvalgu: E6 ja E7, konstitutiivse ekspressioonini. 2 Onkogeensete HPV-de poolt toodetavate peamiste muundavate valkudena aitab E6 / E7 kaasa kartsinogeneesile nende pöörderakkude signaaliülekande komponentide modulatsiooni kaudu, sealhulgas tuumori supressorid p53 ja retinoblastoom (Rb). 3, 4 Kui E6 on suunatud p53 lagunemisele, kahjustades selle kasvu pärssivat ja apoptoosi indutseerivat toimet, inaktiveerib E7 Rb, soodustades seeläbi rakutsükli kulgu. 5 Kuna p53 ja Rb püsiv inaktiveerimine soodustab raku dereguleeritud kasvu, on E6 / E7 atraktiivsed terapeutilised kandidaadid HPV-ga seotud kasvajate ravis. 6 Tõepoolest, E6 / E7 inhibeerimine taastab p53 ja Rb funktsiooni, kutsudes sellega esile kasvu pidurdamise ja surma HPV-16/18 nakatunud rakkudes. 7, 8, 9

HPV E6 / E7 laguneb kiiresti ubikvitiini-proteasoomi süsteemi (UPS) abil. 10, 11, 12, 13 UPS-is substraadivalgud ubikvitineeritakse esmalt järjestikuse ensümaatilise kaskaadi kaudu ja seejärel lagundatakse ubikvitineeritud konjugaadid (Ub-konjugaadid) proteasoomi abil. Need sündmused on võrdselt olulised ja ükskõik millise neist blokeerimine võib kahjustada UPS-i substraatvalkude lagunemist. 15 Lisaks ubikvitineeritud valkude lagundamisele vastutab proteasoom ka teatavate mittekvitsineeritud valkude, näiteks ornitiindekarboksülaasi (ODC) proteolüüsi eest. 14, 16 peamised UPS-i komponendid, sealhulgas proteasoomid ja kõik ubikvitineerimisega seotud ensüümide klassid, on redoksitundlikud, 17 ja UPS-i substraatide ubikvitinatsioon ja proteasoomne lagunemine on seotud reaktiivsete hapnikuühenditega (ROS). Näiteks tugevdatakse vastusena mitmesugustele ROS indutseerijatele ubikvitiini-konjugatsioonisüsteemi ensümaatilist aktiivsust, mille tulemuseks on Ub-konjugaatide taseme tõus, 18, 19 ja ROS-i pärssimine kahjustab vähirakkudes proteasoomset aktiivsust; Need leiud viitavad sellele, et ROS-il võib olla positiivne mõju UPS-i funktsioonidele.

On tõestatud, et dokosaheksaeenhappel (DHA), mis on kõige küllastumatumad oomega-3 rasvhapped, proapoptootiline toime tuumorirakkude vastu. 21, 22 Samuti oleme teatanud, et DHA vallandab HPV-16 ekspresseerivates SiHa vähirakkudes apoptoosi, mida proteasoomide inaktiveerimisega saab osaliselt päästa, 23 mis viitab sellele, et UPS osaleb onkogeensete HPV-ga nakatunud rakkude DHA põhjustatud surmas. Siin kirjeldasime DHA UPS-iga seotud vähivastase toime aluseks olevat molekulaarset mehhanismi HPV-positiivsetes vähirakkudes, kasutades GFP-põhiseid UPS-i reporterisubstraate. Nende reporterite rakusisesed püsiseisunditasemed, sealhulgas GFP-CL1 (16-aminohappeline CL1 lagunemise signaalpeptiid, mis on sulandatud GFP karboksüotsaga) 16 ja Ub G76V -GFP (muteerunud kustutamatu ubikvitiini osa, mis on sulandunud aminoterminaali GFP) 24 peegeldab UPS-i üldist voogu; UPS-i funktsioonide häirimine viib nende kuhjumiseni. 15 Meie tulemused näitavad, et DHA soodustas E6 / E7 lagunemist ROS-vahendatud UPS-i aktiveerimise kaudu, indutseerides sellega apoptoosi HPV-ga nakatunud vähirakkudes. See on esimene uuring, mis annab tõendusmaterjali DHA-indutseeritud viiruse onkoproteiinide translatsioonijärgse regulatsiooni kohta ja leiud aitavad paremini mõista, kuidas DHA mõjutab UPS-i.

Tulemused

DHA-indutseeritud apoptoos HPV-ga nakatunud vähirakkudes hõlmab E6 / E7 repressiooni

DHA indutseerib apoptoosi HPV-16 nakatunud SiHa rakkudes. 23 Et teha kindlaks, kas DHA mõjutab teiste onkogeensete HPV tüüpidega nakatunud rakkude saatust, võrdlesime HPV-18 ekspresseerivate HeLa rakkude elujõulisust ja morfoloogilisi muutusi ning DHA-ga töödeldud SiHa rakke. DHA vähendas nii HeLa kui ka SiHa rakkude elujõulisust (joonis fig 1a) ja kutsus esile sarnased morfoloogilised muutused kahes rakuliinis (täiendav joonis 1a). Lisaks suurenes pärast DHA-ga kokkupuudet tuumafragmente ja DNA ahela purunemisi sisaldavate HeLa rakkude arv märkimisväärselt (täiendavad joonised 1b ja c). Kahe tavalise apoptootilise molekulaarse markeri, lõhustatud kaspaas 3 ja polü (ADP-riboos) polümeraasi (PARP) ekspressioon oli DHA-ga inkubeeritud HeLa rakkudes ülesreguleeritud, kuid mitte rakkudes, mida oli inkubeeritud teiste kõrgelt küllastumata rasvhapetega, sealhulgas eikosapentaeenhape ja arahhidoonhape. (Lisajoonis 1d). Need leiud kinnitavad, et apoptoos on surmaviis, mille on põhjustanud oomega-3 rasvhappe spetsiifiline tüüp DHA vähirakkudes, mis ekspresseerivad onkogeenset HPV.

Image

DHA-indutseeritud E6 / E7 repressioonid on seotud apoptoosiga onkogeensetes HPV-ga nakatunud vähirakkudes. ( a ) SiHa (vasakul) ja HeLa (paremal) rakke inkubeeriti DHA suurenevate kontsentratsioonidega (0, 25, 50 ja 75 μM) 6, 12 ja 24 tundi ning rakkude elujõulisust mõõdeti MTT testidega. ( b ) HeLa (vasakul) ja SiHa (paremal) rakke inkubeeriti näidatud aja jooksul 50 μM DHA-ga ja PARP ja E6 / E7 ekspressioonitasemeid hinnati Western blot analüüsiga. c ) Faasikontrast ja ühendatud kujutised HeLa rakkudest, mida on töödeldud vehiikuliga või 50 μM DHA-ga 6 tundi ja värvitud p53 (ülemine) ja Rb (alumine) (roheline). Tuumad värviti DAPI-ga (skaalariba, 10 μm ). ( d ja e ) A549 rakud, mis olid külvatud 96-augulistele plaatidele või 10-cm tassidele, transfekteeriti ajutiselt kontrolltühja vektori (EV) või HPV-18 E6 / E7 ekspressioonivektoritega. 36 tundi pärast transfektsiooni töödeldi rakke või mitte, 50 μM DHA-ga 6 tundi ja seejärel viidi läbi MTT testid ( d ) või Western blot ( e ). Tulemused on esitatud keskmiste ± SD väärtustena. Vearibad näitavad SD-d ( n = 3). * P <0, 05; # P <0, 001

Täissuuruses pilt

E6 / E7 omavad olulist rolli HPV-ga nakatunud vähirakkude pahaloomulise fenotüübi säilitamisel; 3 seetõttu uurisime järgnevalt DHA mõju E6 / E7-le. Ehkki DHA põhjustas lõhestatud PARP suurenemist HeLa ja SiHa rakkudes, vähendas see E6 / E7 taset (joonis 1b). E6 / E7 pärssimine taastab nende esmaste rakuliste sihtmärkide, p53 ja Rb, funktsioonid. 7 Sellega kooskõlas oli p53 / Rb tuumavärvimine kontrollrakkudes peaaegu tuvastamatu, kuid DHA-ga töödeldud HeLa rakkudes suurenes see märkimisväärselt (joonis 1c). Pidev E6 / E7 ekspressioon on oluline HPV-ga nakatunud vähirakkude ellujäämiseks. 5 Kuna meie tulemused näitavad E6 / E7 repressioonide osalemist DHA põhjustatud apoptootilises protsessis, püstitasime hüpoteesi, et DHA võib E6 / E7 pärssimisega indutseerida apoptoosi. Sel juhul peaks E6 või E7 rakkudesse viimine nõrgendama DHA põhjustatud apoptoosi. Tõepoolest, DHA mõju tsütotoksilisusele ja lõhustatud PARP ekspressioonile (joonised 1d ja e) vähenes märkimisväärselt, kui HPV-18 E6 või E7 ekspresseeriti ajutiselt HPV-puudulikes A549 vähirakkudes. Need andmed näitavad, et DHA nõrgestab E6 / E7, soodustades seeläbi apoptoosi HPV-ga nakatunud vähirakkudes.

DHA stimuleerib UPS-st sõltuvat E6 / E7 lagunemist

Kuna E6 / E7 laguneb proteasomaalselt, inaktiveerisime laktatsüstiini kasutades proteosoomi 12 ja 13 ning uurisime mõju E6 / E7 DHA-vahendatud regulatsioonile HeLa rakkudes, mida on eelinkubeeritud translatsiooni inhibiitorina tsükloheksamiidiga (CHX). Laktatsüstiin kõrvaldas CHX-i indutseeritud E6 / E7 ammendumise ja hoiti ära CHX ja DHA inhibeerivad toimed E6 / E7-le (joonis 2a). Laktatsüstiini võime ära hoida E6 / E7 vähenemist näis olevat proteasoomi pärssimise spetsiifiline tagajärg, kuna lüsosoomi inhibiitoril NH4 Cl ja erinevatel proteaasi inhibiitoritel, sealhulgas leupeptin, E64d ja pepstatin A, oli vaid väike (või puudus) löök (joonis 2b). Need tähelepanekud viitavad sellele, et DHA alandab E6 / E7 translatsioonijärgsel tasemel, kiirendades nende proteasomaalset lagunemist. Selle kinnitamiseks eksponeeriti HeLa rakud veel kahe erineva klassi proteasoomi inhibiitoritega, MG262 või MG132, 15 enne DHA-ravi ja E6 / E7 taseme jälgimist (joonised 2c ja d). Ravi MG262 ja MG132-ga põhjustas E6 / E7 algtaseme märkimisväärset tõusu, mis kinnitab, et E6 / E7 laguneb proteasoomi toimel. Lisaks blokeerisid need inhibiitorid sarnaselt laktatsüstiiniga ka DHA põhjustatud E6 / E7 kaotuse; siiski ei olnud blokeerimine täielik, kuna DHA ja MG262 (või MG132) abil koos töödeldud rakkude E6 / E7 sisaldus oli madalam kui neil, mida raviti ainult inhibiitoritega.

Image

DHA indutseerib viiruse onkoproteiinide E6 / E7 UPS-st sõltuvat lagunemist. ( a ) HeLa kultuure eeltöödeldi laktatsüstiiniga (5 μM) 1 tund enne CHX (0, 5 μg / ml), DHA (50 μM) või nende kahe kombinatsiooni lisamist. Rakud koguti 6 tundi hiljem ja neile tehti Western blot analüüs. ( b ) HeLa rakke ei töödeldud või töödeldi 6 tunni jooksul 50 μM DHA-ga, eeltöötledes 1 tunni jooksul 5 μM laktatsüstiini, 10 μM leupeptiini, 2, 5 μg / ml E64d, 1 μM pepstatiini A ja 10 mM NH Vastavalt 4 Cl. Täisrakulised lüsaadid ekstraheeriti ja blotiseeriti antikehadega E6 / E7. ( c ) HeLa rakke eelinkubeeriti tund aega 0, 5 μM MG262-ga või ilma, enne kui lisati 50 μM DHA. 6 tunni pärast blotteeriti täisrakulised lüsaadid anti-E6 / E7 antikehadega. ( d ) HeLa rakke eeltöödeldi 1 tunni jooksul 5 μM või 10 μM MG132-ga või mitte, seejärel töödeldi 6 tundi 50 μM DHA-ga. Seejärel uuriti näidatud valkude ekspressioonitasemeid Western blot meetodil (WB). ( e ) DHA suurendab E6 / E7 üldlembust. Kontrollvektorit või FLAG-ubikvitiini plasmiidi ajutiselt ekspresseerivaid HeLa rakke eeltöödeldi või mitte, 5 μM MG132-ga 1 tund ja seejärel töödeldi 50 μM DHA-ga 6 tundi. Täisrakulistele lüsaatidele viidi immunosadestamine (IP) anti-E6 (vasakul) või -E7 (keskmine) antikehadega, nagu on näidatud, millele järgneb WB anti-FLAG (ülemine) või anti-E6 / E7 (alumine) antikehadega. Õigeid täisrakulisi lüsaate blotteeriti ekspressioonitasemete uurimiseks anti-FLAG, -ubiquitin (Ub-konjugaadid) ja -E6 / E7 antikehadega

Täissuuruses pilt

Enne proteasoomide lagundamist valgud tavaliselt ubikvitineeritakse. 14, 15 Seetõttu uurisime DHA mõju E6 / E7 ubikvitinatsiooni staatusele, eeldades, et suurenenud ubikvitineerimine proteasoomi inhibiitori juuresolekul näitab, et DHA põhjustatud lagunemist vahendab ubikvitineerimine. HeLa rakud transfekteeriti ajutiselt kontrollvektoriga või FLAG-märgistatud ubikvitiini kodeeriva plasmiidiga ja töödeldi seejärel DHA-ga MG132 juuresolekul. Seejärel hinnati E6 / E7 ubikvitinatsiooni E6 / E7 immunosadestamisega, millele järgnes Western blot-analüüs anti-FLAG antikehadega (joonis 2e). Kooskõlas meie varasemate tähelepanekutega ei takistanud MG132 täielikult DHA põhjustatud langusi E6 / E7 (võrrelge rada 2 ja rada 3). Vaatamata madalamatele E6 / E7 tasemetele rakkudes, mis olid kokku puutunud DHA ja MG132-ga, olid ubikvitineeritud E6 / E7 kogused nendes rakkudes võrreldavad ainult MG132-ga töödeldud rakkude kogustega. Seetõttu viitavad DHA ja MG132-ga koos töödeldud rakkudes suhteliselt ubikvitineeritud E6 / E7 sisaldused sellele, et DHA kutsub esile E6 / E7 ubikvitineerimise.

DHA-indutseeritud E6 / E7 lagunemine on seotud UPS-i täiustatud funktsioonidega

Ehkki nii DHA kui ka proteasoomi inhibiitor MG132 tõstsid mõlemad Ub-konjugaatide taset (joonis 2d), avaldasid nad proteasoomi aktiivsusele vastupidist mõju (joonis 3a) ning DHA võis osaliselt MG132 indutseeritud Ub-konjugaatide kuhjumise ja proteasoomi inhibeerimise tagasi pöörata. See viitab sellele, et MG132 ja DHA põhjustatud Ub-konjugaatide moodustumist võivad nende mõju UPS-ile erinevalt vahendada. Selle kontrollimiseks ja veendumaks, kas DHA-indutseeritud E6 / E7 lagunemine on seotud ka UPS-iga, transfekteeriti HeLa rakke ajutiselt UPS-i reporteriga GFP-CL1 või proteasoomse aktiivsuse reporteriga, GFP-ODC, 16 ja nende mõjuga. Nende reporterite, E6 / E7 ja Ub-konjugaatide ekspressioonil võrreldi MG132 ja DHA (joonis 3b). Kui MG132 suurendas nii GFP-ODC kui ka GFP-CL1 ekspressiooni, siis nende ekspressiooni vähendas DHA. Lisaks suruti vastuseks pikaajalisele DHA-ravile hästi dokumenteeritud proteasomaalne substraat p53, mille MG132 päästis (täiendav joonis 2). Need leiud näitavad, et erinevalt MG132, DHA tugevdab proteasoomi aktiivsust ja suurendab Ub-konjugaatide ekspressiooni ilma UPS-i blokeerimata ning et DHA põhjustatud E6 / E7 lagunemine on samaaegne suurenenud UPS-i funktsiooniga.

Image

DHA soodustab E6 / E7 viirusvalkude lagunemist, suurendades UPS-i aktiivsust. ( a ) HeLa rakke jäeti töötlemata või eeltöödeldi 1 tunni jooksul 5 μM MG132-ga ja seejärel töödeldi 6 tunni jooksul 50 μM DHA-ga. Valmistati kogu rakuekstraktid (10 μg ) ja inkubeeriti 1 tunni jooksul fluorogeense peptiidiga Suc-LLVY-aminometüülkumariiniga ja mõõdeti fluorestsentssignaal. Töötlemata kontroll seati väärtusele 1. ( b ) Näidatud reporteritega ajutiselt transfekteeritud HeLa rakke inkubeeriti 6 tunni jooksul 50 μM DHA või 5 μM MG132-ga ning reporterite, E6 / E7 ja ubikvitineeritud konjugaatide ekspressioon ( Ub-konjugaadid) uuriti Western blot meetodil. ( c ) Ub G76V -GFP reporteriga ajutiselt transfekteeritud HeLa rakke eeltöödeldi või mitte, 5 μM MG132-ga 1 tund ja seejärel töödeldi 50 μM DHA-ga 6 tundi. Vasakult, reporterite ja E6 / E7 ekspressioonitasemeid analüüsiti Western blot analüüsi abil; paremal, Ub G76V -GFP reporteri ekspressiooni fluorestsentsmikroskoobid pärast erinevat töötlemist (nagu vasakpoolses paneelis kirjeldatud). Skaalariba, 100 μm . ( d ja e ) DHA suurendab Ub G76V -GFP reporteri ja E6 / E7 valkude lagunemist. Ub G76V -GFP HeLa rakud jäeti töötlemata või eelinkubeeriti reporteri kuhjumise esilekutsumiseks 4 tundi 2, 5 μM MG132-ga. Seejärel töödeldi rakke 6 tunni jooksul 50 μM DHA-ga või mitte. Rakud koguti ja GFP fluorestsentsi uuriti voolutsütomeetriaga ( d ). Tulpdiagramm näitab nelja sõltumatu katse tulemusi. Fluorestsentskujutised ja histogrammid näitavad representatiivset katset (skaalariba, 100 μm ). Teise võimalusena tehti rakkudele immunoblot ( e ). Andmed on esitatud keskmisena ± SD väärtused ja vearibad tähistavad SD ( n 3). # P <0, 001

Täissuuruses pilt

Nende leidude kinnitamiseks ja D6- le reageerimisel täheldatud E6 / E7 lagunemise suurenemise ja UPS-i aktiivsuse vahelise seose uurimiseks töödeldi teist UPS-i reporterit Ub G76V -GFP ajutiselt ekspresseerivaid HeLa rakke 24 enne DHA-ga kokkupuudet MG132-ga või ilma selleta. (Joonis 3c). DHA vähendas Ub G76V -GFP ja E6 / E7 baastasemeid . Vahepeal olid Ub G76V -GFP reporteri ja E6 / E7 tasemed ainult MG132-ga kokkupuutunud rakkudes kõrgemad kui MG132 ja DHA-ga töödeldud rakkudes. Need leiud kinnitasid GFP-CL1 reporteriga saadud tulemust, väites, et DHA kutsub samaaegselt esile UPS-i aktiveerimise ja UPS-st sõltuva E6 / E7 lagunemise. Nimelt kuna HeLa rakke eelinkubeeriti MG132-ga, oli UPS-i funktsioon rakkudes enne DHA-ravi osaliselt pärsitud. Seetõttu võib tähelepanek, et MG132 ja DHA-ga koos töödeldud rakud näitasid Ub G76V -GFP reporteri ekspressiooni madalamat taset, võrreldes MG132-ga töödeldud rakkudes, osutada sellele, et DHA (teatud määral) alistab MG132 inhibeeriva toime UPS-ile. Seda kinnitati veel HeLa rakkudes, mis ekspresseerivad stabiilselt Ub G76V -GFP reporterit (Ub G76V -GFP HeLa). Ub G76V -GFP reporter ei kogune stabiilsetesse transfektantidesse UPS-i pärssimise puudumisel, kuna UPS lagundab seda väga tõhusalt. 24 Nagu on näidatud joonisel 3d, inhibeeriti Ub G76V -GFP reporteri MG132 indutseeritud akumuleerumist söötmele DHA lisamisega. Samuti pärssis DHA MG132-indutseeritud E6 / E7 tõusu (joonis 3e). Need andmed näitavad, et DHA-indutseeritud raku UPS-i aktiveerimine põhjustab vähemalt osaliselt E6 / E7 lagunemist.

ROS on seotud DHA-indutseeritud E6 / E7 vähenemisega

DHA kutsub esile ROS akumulatsiooni tuumorirakkudes, 22 ja on tõestatud, et see pärsib selektiivselt onkogeensete HPV-ga immortiseeritud keratinotsüütide kasvu lipiidide peroksüdatsiooni kaudu. 25 Seetõttu uurisime ROS-i võimalikku kaasatust DHA-indutseeritud E6 / E7 alareguleerimisse. Voolutsütomeetriline analüüs, kasutades ROS-i kogu ROS mõõtmiseks üldist ROS-tundlikku sondi CM-H2DCFDA, näitas DHA-ga kokkupuutuvates HeLa ja SiHa rakkudes diklorodihüdrofluorestseiini (DCF) fluorestsentsi ajast sõltuvat suurenemist (joonis 4a; täiendav joonis 3a). ROS-püüdur, N- atsetüültsüsteiin (NAC), nõrgendas märkimisväärselt DHA-indutseeritud DCF-i fluorestsentsi (joonis 4b; täiendav joonis 3b) ja takistas DHA ja eksogeense vesinikperoksiidi (EHA / E7) indutseeritud E6 / E7 vähenemist ja PARP-i taseme langust. H202) (joonised 4c ja d; lisajoonis 3c). Lisaks pärssis HeLa rakkude eelinkubeerimine teiste antioksüdantidega (EUK8 ja naatriumpüruvaat) ka DHA vahendatud mõju rakusurmale ja E6 / E7 ekspressioonile (täiendav joonis 3d). Need tähelepanekud viitavad sellele, et DHA indutseerib ROS-i tootmist, mis reguleerivad E6 / E7 ja apoptoosi.

Image

DHA-indutseeritud E6 / E7 ekspressiooni vähenemine sõltub ROS-i akumulatsioonist. ( a ) HeLa rakke töödeldi näidatud aja jooksul 50 μM DHA-ga ja rakusisesed ROS-i tasemed tuvastati voolutsütomeetria abil, kasutades CM-H2DCFDA sonde. ( b ) CM-H2DCFDA-ga koormatud HeLa rakke eeltöödeldi või mitte, 5 mM NAC-ga 1 tund, millele järgnes 50 μM DHA 2 tundi, ja ROS-i taset uuriti voolutsütomeetria abil. ( c ) HeLa rakke eeltöödeldi või mitte, 1 tund 5 mM NAC-ga, millele järgnes 50 μM DHA-ga 6 tundi. Täisrakulised lüsaadid blotiti näidatud antikehadega. ( d ) HeLa rakke inkubeeriti näidatud aja jooksul (vasakul) 300 μM H2O2-ga või eeltöödeldi või mitte, 1 tund 5 mM NAC-ga, millele järgnes inkubeerimine 300 μM H202-ga 6 tundi (paremal) ). Täisrakulised lüsaadid ekstraheeriti ja blotteeriti näidatud antikehadega

Täissuuruses pilt

DHA põhjustatud vähenenud E6 / E7 ekspressioonitasemed hõlmavad mitokondrite ROS ületootmist

Esialgsed katsed tuvastasid HeLa rakkudes märgatava DCF-i fluorestsentsi juba 20 minutit pärast DHA-ravi; see fluorestsents kolokaliseerus peamiselt elutähtsa mitokondrite värviga MitoTracker Red (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) (täiendavad joonised 4a ja b), mis viitab sellele, et mitokondrid on DHA indutseeritud ROS-i tõenäoline allikas. Mitokondriaalse ROS-i tuvastamine MitoSOX Redi abil näitas, et DHA põhjustas mitokondritest pärineva ROS-i produktsiooni kasvu, mida NAC pärssis (joonis 5a). Liigse mitokondriaalse ROS-i tootmisega kaasneb sageli mitokondriaalse membraani potentsiaali kadumine ja mitokondriaalse membraani mitteoksüdeerunud kardiolipiin, mis mõlemad on olulised mitokondrite funktsiooni säilitamiseks. 26 Kooskõlas sellega vähendas DHA mitokondriaalse membraani potentsiaali ja oksüdeerimata kardiolipiini taset ning NAC muutis need DHA mõjud märkimisväärselt (lisajoonis 4c). Täiendavate tõendite saamiseks mitokondrite osalemise kohta DHA-indutseeritud ROS-i tootmises võrdlesime mitokondrite funktsiooni HeLa-rakkudes, mida töödeldi DHA-ga ja / või NAC-iga, jälgides muutusi hapniku tarbimismäärades. Tulemus näitas, et NAC pärssis DHA-vahendatud OCR-i ajast sõltuvat langust (joonis 5b). MitoTracker Red 2-ga värvitud rakkude konfokiaalse mikroskoopia analüüs 2 tundi pärast ravi kinnitas, et NAC hoiab ära DHA põhjustatud hingavate mitokondrite kaotuse (joonis 5c). Need andmed näitavad selgelt, et mitokondriaalne ROS moodustab DOS-iga kokkupuutuvate HPV-ga nakatunud vähirakkude liigse kogunemise ROS-ist. Pärast selle leidmist otsisime järgmisena mitokondrite ROS-i mõju E6 / E7-le otsesemalt. HeLa rakke töödeldi NAC ja / või karbonüültsüaniid-m-klorofenüülhüdrasooniga (CCCP), mis on mitokondriaalse düsfunktsiooni indutseerija, mis on näidanud vallandavat ROSi ületootmist mitokondrites. 27, 28 CCCP suurendas mitokondriaalset ROS-i tootmist HeLa rakkudes (täiendav joonis 4d). Nimelt vähendas see ka E6 / E7 ja NAC võis selle efekti blokeerida (joonis 5d). Need tulemused viitavad sellele, et mitokondriaalne ROS mõjutab E6 / E7 ekspressiooni ja soodustab DHA põhjustatud E6 / E7 kaotust.

Image

Mitokondriaalse ROS-i kaasamine E6 / E7 allareguleerimisse. ( a ) HeLa rakke eeltöödeldi 1 tunni jooksul 5 mM NAC-ga, seejärel 2 tunni jooksul 50 μM DHA-ga või mitte, ja mitokondrite ROS-i taset uuriti voolutsütomeetria abil, kasutades MitoSOX Redi sonde (Molecular Probes). ( b ) 5 mM NAC, 50 μM DHA või NAC pluss DHA-ga töödeldud HeLa rakkude hapniku tarbimise määra (OCR) mõõdeti Seahorse Bioscience XF analüsaatori abil. Nool näitab DHA lisamise aega. c ) Pärast NAC, DHA või NAC ja DHA inkubeerimist elutähtsa mitokondriaalse värvainega (MitoTracker Red) värvitud HeLa rakkude representatiivsed konfokaalsed mikroskoopilised kujutised. Rakke eelinkubeeriti 1 tund 5 mM NAC-ga ja töödeldi seejärel veel 2 tundi 50 μM DHA-ga või ilma. Alumine paneel näitab ülemise paneeli karbitud ala suurema võimsuse vaateid (skaalariba, 10 μm ). ( d ) HeLa rakke eelinkubeeriti 1 tund 5 mM NAC-ga ja seejärel töödeldi veel 6 tundi 1 μM CCCP-ga või ilma. E6 / E7 ja PARP valgu taset analüüsiti Western blot analüüsiga. Kuvatakse keskmised ± SD väärtused ja vearibad näitavad SD ( n = 3). * P <0, 05

Täissuuruses pilt

DHA-indutseeritud ROS soodustab E6 / E7 lagunemist, suurendades UPS-i aktiivsust

ROS on seotud UPS-i komponentide 17, 18, 19 reguleerimisega, seega on võimalik, et neil võib olla põhjuslik roll DHA-indutseeritud UPS-i aktiveerimisel ja sellele järgneval E6 / E7 lagunemisel. Selle testimiseks hinnati kõigepealt eksogeense ROS-i mõju UPS-i funktsioonile ja UPS-i vahendatud E6 / E7 alareguleerimisele. HeLa ja SiHa rakkude kokkupuude H2O2-ga tõstis Ub-konjugaatide ekspressioonitaset (joonis 4d, parem paneel; täiendav joonis 3c, parem paneel). See Ub-konjugaatide akumuleerumine näis olevat tingitud proteasoomi inaktiveerimise asemel raku suurenenud ubikvitinatsiooni sündmusest, kuna H202-ga töödeldud rakud demonstreerisid oluliselt paremat proteasoomi aktiivsust (joonis 6a) isegi MG132-ga eelinkubeerimise tingimustes. Lisaks sellele, kui GFP-CL1 või GFP-ODC reporteritega ajutiselt transfekteeritud HeLa rakke inkubeeriti H202-ga (joonis 6b), vähenes nende reporterite ja E6 / E7 ekspressioonitase. Ub G76V -GFP reporteriga ajutiselt transfekteeritud HeLa rakkudes tehtud katsed (joonis 6c) näitasid lisaks, et mitte ainult H 2 O 2 ei vähendanud Ub G76V- GFP ja E6 / E7 baastaset, vaid kaotas MG132 indutseeritud suurenemise Ub G76V -GFP reporter ja E6 / E7. Need leiud näitavad, et eksogeenne ROS kiirendab UPS-st sõltuvat E6 / E7 lagunemist, suurendades UPS-i aktiivsust meie raku kontekstis, ja tõstavad võimaluse, et DHA-indutseeritud ROS-il võib olla sarnane roll. Tõepoolest, leidsime, et UL G76V -GFP reporterit ajutiselt ekspresseerivates HeLa rakkudes (joonis 6d) põhjustas NAC-vahendatud ROS inhibeerimine Ub G76V- GFP ja E6 / E7 DHA-indutseeritud vähenemise märgatava pöördumise. Lisaks pärssis farmakoloogiline mitokondriaalne ROS-i indutseerija CCCP MG132-indutseeritud E6 / E7 ekspressiooni suurenemist (joonis 6e, võrrelge rada 5 rajaga 4), samas kui NAC blokeeris selle inhibeeriva toime (võrrelge rada 6 rajaga 5), ​​toetades seisukohta, et mitokondritest pärit ROS aktiveerib ka UPS-i ja indutseerib UPS-st sõltuvat E6 / E7 lagunemist. Edasised katsed, milles kasutati Ub G76V- GFP sisaldavaid HeLa rakke (joonised 6f ja g), kinnitasid neid tulemusi. Ub G76V -GFP reporteri ja E6 / E7 MG132 indutseeritud akumulatsiooni pidurdasid märkimisväärselt DHA, H202 ja CCCP. Oluline on see, et need DHA, H202 ja CCCP mõjud olid ROS inhibiitori NAC juuresolekul osaliselt vastupidised. Need tulemused näitavad, et ROS toimib UPS-ist ülesvoolu ja soodustab DHA-indutseeritud E6 / E7 lagunemist, suurendades UPS-i funktsiooni.

Image

ROS vastutab UPS aktiivsuse suurenemise ja E6 / E7 järgneva lagunemise eest. ( a ) HeLa rakke jäeti töötlemata või eeltöödeldi 1 tunni jooksul 5 μM MG132-ga ja seejärel eksponeeriti 6 tunni jooksul 300 μM H2O2-ga. Mõõdeti 10 μg valke sisaldava rakuekstraktide suhteline proteasoomi aktiivsus. Töötlemata kontroll seati väärtusele 1. ( b ) Näidatud reporteritega ajutiselt transfekteeritud HeLa rakke inkubeeriti 6 tundi 300 μM H2O2 või 5 μM MG132-ga ning reporterite tasemed E6 / E7 ja Ub -konjugaate uuriti Western blot meetodil. ( c ) Ub G76V -GFP reporterit ajutiselt ekspresseerivaid HeLa rakke eeltöödeldi või mitte 1 tund 5 μM MG132-ga ja inkubeeriti seejärel 6 tunni jooksul 300 μM H2O2-ga. Seejärel uuriti GFP ja E6 / E7 ekspressioonitasemeid Western blot analüüsi abil. ( d ) Ub G76V -GFP reporterit ajutiselt ekspresseerivaid HeLa rakke eeltöödeldi või mitte, 1 tund 5 mM NAC-ga ja inkubeeriti seejärel 6 tundi 50 μM DHA-ga. Seejärel uuriti GFP ja E6 / E7 ekspressioonitasemeid Western blot analüüsi abil. ( e ) HeLa rakke eelinkubeeriti 1 tunni jooksul 5 μM MG132-ga või ilma ja seejärel eksponeeriti 6 tundi NAC (5 mM), CCCP (1 μM) või mõlema kombinatsiooniga. Kui näidatud, lisati NAC 1 tund enne CCCP-ga töötlemist ja E6 / E7 ekspressioonitasemeid analüüsiti Western blot analüüsiga. ( f ja g ) Ub G76V -GFP HeLa rakke jäeti töötlemata või eelinkubeeriti 4 tunni jooksul 2, 5 μM MG132-ga ja töödeldi seejärel NAC (5 mM), DHA (50 μM), H2O2 (300 μM). ), CCCP (1 μM) või NAC ja DHA / H202 / CCCP kombinatsioon 6 tundi. Kui näidatud, lisati NAC söötmele 1 tund enne töötlemist DHA, H202 või CCCP-ga. ( f ) Rakud koguti ja viidi läbi immunoblotanalüüs näidatud antikehadega. ( g ) GFP ekspressiooni pildistati fluorestsentsmikroskoobiga (ülalt) ja seejärel uuriti voolutsütomeetriaga (alt). Skaalariba, 200 μm . Andmed on esitatud keskmisena ± SD väärtused ja vearibad tähistavad SD ( n 3). # P <0, 001

Täissuuruses pilt

Arutelu

E6 / E7 säilitavad HPV-ga nakatunud vähirakkude pahaloomulist fenotüüpi ja segavad apoptootilises rajas osalevaid molekule. 29 Näitasime, et DHA indutseeris apoptoosi HeLa ja SiHa rakkudes, mis sisaldasid kahte kõige levinumat onkogeenset HPV tüüpi, ja E6 / E7 taset alareguleerisid. See leid koos E6 / E7 ekspresseerivate HPV-negatiivsete vähirakkude täheldatud resistentsusega DHA-indutseeritud apoptoosi suhtes on kooskõlas E6 / E7 pärssiva toimega apoptoosile. Lisaks on tuuma p53 / Rb peaaegu tuvastamatu HPV-ga nakatunud kasvajarakkudes nende pideva inaktiveerimise tõttu, mis on põhjustatud E6 / E7 olemasolust; 30 see p53 / Rb kaotus aitab kaasa E6 / E7 antiapoptootilistele omadustele. 9, 31 Kooskõlas nende varasemate uuringutega leidsime, et DHA-vahendatud E6 / E7 alareguleerimine ja apoptoosi esilekutsumine oli seotud p53 / Rb suurenenud tuumavärvimisega. P53 / Rb taastamist on iseloomustatud kui peamist mehhanismi, mis põhineb E6 / E7 repressioonide vahendatud apoptoosil. 8, 9, 32 on seega mõistlik eeldada, et DHA-indutseeritud apoptootilise rakusurma põhjustajaks on p53 / Rb taasaktiveerimine (mille käivitab E6 / E7 inhibeerimine). Kuid peale p53 / Rb on näidatud, et molekulid, sealhulgas Notch ja Sirtuin-1, osalevad ka E6 / E7 kaotusest põhjustatud apoptoosis. 33, 34 Tulevaste uuringute oluline väljakutse on seega nende võimaluste eristamine ja kindlaksmääramine, kas DHA põhjustatud apoptootiline protsess hõlmab uudset E6 / E7 sihtmärki.

DHA propageeris UPS-st sõltuvat E6 / E7 lagunemist koos UPS-i aktiivsuse suurenemisega ja UPS-i funktsiooni häirimine pärssis E6 / E7 DHA põhjustatud alareguleerimist, viidates sellele, et DHA pärssiv toime E6 / E7-le hõlmab UPS-i aktiveerimist. See annab ka võimaliku selgituse meie varasematele tulemustele, 23 mis näitavad, et DHA ülereguleerib ajutiselt p53 ekspressiooni SiHa rakkudes ja et rakkude pikaajaline inkubeerimine (24 tundi) DHA-ga vähendab p53 madalamale tasemele kui töötlemata rakkudes . Seda p53 ülesreguleerimise nähtust, millele järgnes pikaajaline langus, täheldati ka HeLa rakkudes (täiendav joonis 2a). Üldiselt reguleeritakse p53 ja hiire topeltminut 2 (MDM2) ubikvitiini ligaasi vastastikku autoregulatsiooni tagasisideahela abil. Aktiveeritud p53 indutseerib MDM2 transkriptsiooni, mis omakorda on suunatud p53-le proteolüütilise lagunemise jaoks; kuid MDM2-vahendatud p53 lagunemistee on HPV-ga nakatunud vähirakkudes välja lülitatud, kuna p53 laguneb E6 poolt pidevalt. 31 Kuna DHA-indutseeritud E6 vähenemine tuleneb UPS-i aktiveerimisest, võis täheldatud p53 ekspressioonimustri omistada p53 taasaktiveerimisele, mida vahendab E6 inhibeerimine, ja p53 järgnevale edasisele lagunemisele UPS-i suurenenud aktiivsuse tõttu. Selle toetuseks reguleeriti MDM2 ekspressiooni kohe pärast p53 maksimaalse taseme saavutamist (lisajoonis 2a) ja MG132-vahendatud UPS-i pärssimine tühistas DHA-indutseeritud p53 kadu 24 tunni pärast (täiendav joonis 2b). Need tulemused näitavad, et DHA-indutseeritud p53 on transkriptsiooniliselt aktiivne, kinnitades selle taasaktiveerumist; teisest küljest on need kooskõlas arvamusega, et DHA kiirendab ka UPS-st sõltuvat p53 lagunemist. See p53 suurenenud lagunemine pole täiesti ootamatu, sest näitasime, et DHA suurendab UPS-i funktsiooni. Lisaks p53-le soodustab DHA ka teiste endogeensete UPS-substraatide, näiteks β- kateniini, 35 östrogeeni retseptori, 36 ja zeste homoloogi tugevdaja, UPS-sõltuvat lagunemist erinevates vähirakuliinides. Kuigi jääb ebaselgeks, kas nende valkude lagunemine tuleneb UPS-i aktiveerimisest rakul, toetavad need tähelepanekud ideed, et DHA mõju UPS-i modulatsioonile ei pruugi piirduda HPV-ga nakatunud kasvajarakkudega.

Prompted by the observation that DHA-induced intracellular ROS primarily localized within mitochondria, we initially examined the contribution of mitochondria-produced superoxide to the total cellular ROS accumulation in DHA-treated HeLa cells. The results showed that DHA increased the mitochondrial ROS level, which was reversed by the antioxidant NAC pretreatment, suggesting that DHA induces cellular ROS by promoting mitochondrial ROS generation. However, in addition to mitochondrial ROS induction, other mechanisms responsible for DHA-induced total ROS accumulation also appear to exist. In support of this idea we found that, whereas NAC pretreatment almost completely blocked the increased level of MitoSOX fluorescence induced by DHA (Figure 5a, NAC+DHA), its inhibitory effect on the intensity of total cellular ROS indicator, DCF, was only partial (Figure 4b, NAC+DHA) when examined under the same conditions (2 h after 50 μ M DHA exposure). Previous studies have shown that DHA induces ROS accumulation in a number of malignant cell lines by elevating enzymatical and non-enzymatical lipid peroxidation. 22 It is therefore likely that DHA may elevate total cellular ROS through some as yet unidentified signaling cascades, which stimulate lipid peroxidation. How DHA exactly affects the mitochondrion to generate high levels of ROS in the organelle is currently not clear; however, our finding that OCR was attenuated immediately upon addition of DHA into the cultures suggests a possible role for DHA, via disruption of mitochondrial electron transport chain, in regulating mitochondrial ROS generation. Indeed, the mitochondrial respiratory chain has long been recognized as a target for unsaturated fatty acid-mediated production of ROS in vitro and in vivo . 38

An intriguing finding of this work is that ROS, including mitochondrial-produced and exogenous ROS, repressed E6/E7. We additionally discovered that DHA-induced E6/E7 degradation was attributed to the UPS activation mediated by ROS. Interestingly, despite significant enhancement of proteasome activity in DHA- and H 2 O 2 -treated HeLa cells, such a marked increase was not seen when purified proteasome and cell extracts prepared from HeLa cells were directly exposed to DHA or H 2 O 2 (Supplementary Figure 5). This suggests that the increased proteasome function observed in cell cultures largely results from an indirect regulatory effect of ROS on the proteasome, probably through induction of Ub-conjugates. Prior work shows that ROS can activate the enzymes involved in ubiquitination, 18, 39 leading to Ub-conjugates accumulation, which enhances the degradative capacity of the proteasome by stimulating its gate opening. 40 In these cases, Ub-conjugates formation appears to be an initial step of the ROS-mediated cellular UPS activation, and necessary for the activation of proteasome. In fact, although ROS-mediated UPS activation induced by DHA and H 2 O 2 was accompanied by the accumulation of Ub-conjugates (Figures 3b and 6b), the attenuated UPS function caused by ROS inhibition was concomitant with decreased levels of Ub-conjugates (Figures 4c and d). These observations indicate a link between Ub-conjugates formation and the UPS function in response to ROS, and it is thus possible that Ub-conjugates may have a role in the ROS-mediated proteasome activation. Nonetheless, although the induction of Ub-conjugates represents one potential mechanism by which ROS indirectly improve proteasome function, results from some recent studies imply that alternative mechanisms may exist. For example, increased proteasome activity caused by interferons is attributed to the ROS-stimulated de novo synthesis of inducible proteasome peptidase subunits, 41 which replace their corresponding conventional peptidase subunits and thereby result in the formation of more functional immunoproteasomes. Further, in a report examining the regulatory effect of Parkin on mitophagy, it was found that mitochondrial dysfunction can act as a signal for proteasome activation and triggers the UPS-dependent clearance of damaged mitochondria. 27 As increased cellular ROS (including those caused by exogenous application of H 2 O 2 ) are known to induce mitochondrial malfunction, 26 we cannot rule out the possibility that ROS may indirectly enhance proteasome function by triggering mitochondrial failure. Indeed, it had been demonstrated that proteasome activity is correlated with mitochondrial malfunction and oxidative stress in a mouse model of neurometabolic disease, arguing for a role of mitochondria dysfunction in ROS-mediated proteasome activation. 42 It deserves mention, however, that despite the enhancing effect of ROS on UPS activity observed in this and other studies, impaired UPS function has also been correlated with ROS. 43, 44 Although not fully clear, these inconsistent results may be partly attributed to the presence of heterogeneous proteasome populations and the differences in experimental conditions, such as the type, dose, and duration of ROS insults. 45

Collectively, the results of the present study identify a unique strategy for inducing the degradation of E6/E7 by activating ROS-mediated UPS function with DHA (Figure 7). Our finding that DHA simultaneously induced UPS activation and E6/E7 degradation highlights a novel biological function of DHA, and reveals one important mechanism by which DHA provokes the death of HPV-associated cancer cells.

Image

Proposed model showing how DHA reduces the expression of the E6/E7 viral oncoproteins in oncogenic HPV-infected cancer cells. DHA stimulates cellular ROS accumulation primarily via inducing mitochondrial ROS overproduction, which leads to mitochondria failure and the activation of cellular UPS. As a result, the UPS-dependent degradation of E6/E7 viral proteins is accelerated. Note that mitochondrial dysfunction might contribute to the UPS activation induced by DHA (dashed line)

Täissuuruses pilt

Materjalid ja meetodid

Plasmids, transfection and treatment of stably transfected cells

The expressing plasmids pSG5-HPV-18 E6/E7 (provided by Professor Shih-Ming Huang, Department of Dermatology, Tri-service General Hospital, Taipei, Taiwan) and FLAG-tagged ubiquitin pCS4-FLAG-Ub (provided by Professor Dae-Won Kim, Department of Biochemistry, Yonsei University, Seoul, Korea) were used as reported previously. 46, 47 The mammalian expression vectors encoding GFP-CL1 and GFP-ODC were kindly provided by Dr. Jong-Bok Yoon (Yonsei University). The Ub G76V -GFP construct was a gift of NP Dantuma (Addgene plasmid #11941, Cambridge, MA, USA). Constructs (4−6 μ g/10-cm dish) were transfected into cells using Lipofectamine LTX reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; #15338-100) as recommended by the manufacturer. Twelve hours after transfection, the cells were subjected to serum deprivation for 24 h and then subjected to different treatments. HeLa cells stably transfected with Ub G76V -GFP plasmids (Ub G76V -GFP HeLa) were selected using 0.8 mg/ml G418 as described previously. 15 For use, Ub G76V -GFP HeLa cells were pretreated with the proteasome inhibitor, MG132, to induce the accumulation of the Ub G76V -GFP reporter, and then the test compounds were added into the media. To achieve the optimal inhibitory effect of MG132 on the UPS, while avoiding any cytotoxic effects, the cells were pretreated with 2.5 μ M MG132 for 4 h followed by a 6-h incubation with the test compounds.

Immunoprecipitation and western blotting

For immunoprecipitations, HeLa cells transiently transfected with FLAG-tagged ubiquitin vectors were lysed in lysis buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, and 5 mM EDTA). Supernatants were added with a HPV-18 E6 antibody or HPV-18 E7 antibody and protein G beads, and incubated at 4 °C for 6 h with shaking. Beads were washed and then boiled in sample buffer for 5 min, and proteins were separated by 15% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis for ubiquitination analysis and detection of E6/E7 proteins. Western blotting of whole-cell lysates was performed as described in reference. 23

Measurement of oxygen consumption in real time

The OCR was measured using an XF24 Extracellular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, USA). HeLa cells were plated at 2 × 10 4 /well in complete medium and allowed to attach overnight. After washing with serum-free medium, the cells were switched to 590 μ l of unbuffered serum-free DMEM containing 25 mM glucose in the absence or presence of 5 mM NAC. Cells were incubated in a CO 2 -free atmosphere at 37 °C for 1 h to allow temperature and pH equilibration before loading onto the XF24 equipment. After three successive 3-min measurements at 5-min intervals, 66 μ l of 500 μ M DHA (final concentration=50 μ M) or solvent vehicle (control) was injected into the corresponding wells. The OCR was monitored by repeating the above measurement cycles 20 times.

Statistiline analüüs

The statistical significance of difference between control and treated groups was analyzed using one-way ANOVA. The difference was considered significant when P -value was <0.05.

Täiendav teave

Piltfailid

  1. 1

    Lisajoonis 1

  2. 2

    Lisajoonis 2

  3. 3

    Lisajoonis 3

  4. 4

    Lisajoonis 4

  5. 5

    Täiendav joonis 5

Wordi dokumendid

  1. 1

    Täiendav teave

Sõnastik

CCCP

carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone

CHX

tsükloheksiidi

CL1

a 16-amino-acid sequence (ACKNWFSSLSHFVIHL) degradation signal peptide

DHA

docosahexaenoic acid

DCF

dichlorodihydrofluorescein

H 2 O 2

hydrogen peroxide

HPV

human papillomavirus

MDM2

mouse double minute 2 homolog

NAC

N -acetyl-cysteine

OCR

hapniku tarbimise määr

ODC

ornithine decarboxylase

PARP

poly(ADP-ribose) polymerase

Rb

retinoblastoomi valk

ROS

reaktiivsed hapniku liigid

Ub-conjugates

ubiquitinated conjugates

UPS

ubiquitin–proteasome system

Lisateave on lisatud käesolevale dokumendile rakusurma ja -haiguste veebisaidil (//www.nature.com/cddis)