Otsene vähi ja stroomaalne koostoime suurendab fibroblastide vohamist ja suurendab skirroosse tüüpi maokartsinoomi rakkude invasiivseid omadusi | Briti vähiväljaanne

Otsene vähi ja stroomaalne koostoime suurendab fibroblastide vohamist ja suurendab skirroosse tüüpi maokartsinoomi rakkude invasiivseid omadusi | Briti vähiväljaanne

Anonim

Seda artiklit on värskendatud

Abstraktne

Taust:

Scirrhous-tüüpi maokartsinoomil (SGC) on ulatuslik submukoosne fibroos ja patsiendi eriti halb prognoos. Uurisime vähi ja strooma interaktsiooni olulisust SGC histogeneesis.

Meetodid:

Mao fibroblastid NF-25 ja soole fibroblastid NF-j2 kultiveeriti koos SGC-st tuletatud (HSC-39) või mitte-SGC-tuletatud (HSC-57 ja HSC-64) rakkudega. NF-25-st üles või alla reguleeritud geenide tuvastamiseks viidi läbi komplementaarse DNA (cDNA) mikrokiibi analüüs. Rakkude kasvu testis ja immunohistokeemias kasutati vaskulaarse raku adhesioonimolekuli-1 (VCAM-1) antikeha. Lisaks uuriti NF-25 fibroblastidega interaktsiooni mõju HSC-39 rakkudele, kasutades Western blot ja pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsiooni.

Tulemused:

HSC-39 rakud stimuleerisid kooskultiveerimisel NF-25 kasvu, kuid mitte NF-j2 kasvu. Tuvastati VCAM-1 indutseerimine NF-25 fibroblastides, mis oli spetsiifiline kooskultuurimisel HSC-39-ga, kuid mitte SGC-st tuletatud HSC-57 ja HSC-64 rakkudega. VCAM-1 suhtes neutraliseeriv antikeha pärssis NF-25 kasvu annusest sõltuvalt. Koeproovides oli VCAM-1 positiivne immunoreaktiivsus SGC-st tuletatud fibroblastides oluliselt kõrgem kui mitte-SGC-st tuletatud fibroblastides. Lisaks ei kutsunud interaktsioon NF-25 fibroblastidega esile mitte ainult epiteeli ja mesenhüümi üleminekulaadseid muutusi, vaid ka maatriksi metalloproteinaasiga seotud geenide ekspressiooni HSC-39 rakkudes.

Järeldus:

SGC rakkude ja mao fibroblastide vaheline interaktsioon loob kasvaja mikrokeskkonna ja tugevdab SGC agressiivsust.

Peamine

Scirrhous tüüpi mao kartsinoomi (SGC), mida nimetatakse ka difuusseks mao kartsinoomiks või linitis plasticaks, iseloomustab vähirakkude difuusne infiltratsioon ja kiire levik, millega kaasneb ulatuslik submukoosne fibroos ja sellest tulenev seina kiuline paksenemine (Otsuji et al, 2004) ). SGC-ga patsientide prognoos on äärmiselt halb, peamiselt lümfisõlmede metastaaside sagedase esinemise ja vähirakkude peritoneaalse leviku tõttu; Seetõttu on SGC nende omaduste aluseks olevate molekulaarsete mehhanismide mõistmine uute teraapiate väljatöötamiseks muutunud hädavajalikuks (Ikeguchi jt, 2004; Nakamura jt, 2006).

Vähi korral peetakse stromaalseid muutusi invasiivsel rindel desmoplastiliseks vastuseks, mis võib märkimisväärselt mõjutada vähirakkude vohamist ja invasiivsust (De Wever ja Mareel, 2003). Vähiga seotud fibroblastid (CAF), mis koosnevad fibroblastidest ja müofibroblastidest, loovad vähi-strooma interaktsiooni kahe eraldiseisva mehhanismi abil - efferentse raja ja aferentse raja kaudu (Hwang jt, 2008). Efektiivses rajas on leitud erinevaid autokriinseid ja parakriinseid vahendajaid, sealhulgas kasvufaktorid, tsütokiinid ja interleukiinid. Eriti soodustab kasvufaktori β muundamine mitte ainult CAF-de kemotaksist (Postlethwaite et al, 1987), vaid ka mitteinvasiivsete kahjustuste muundamist invasiivseteks (Cui jt, 1996). Lisaks on dokumenteeritud mitmeid faktoreid, mis hõlmavad keratinotsüütide kasvufaktorit (Nakazawa jt, 2003), hepatotsüütide kasvufaktorit (Tendo jt, 2005) ja interleukiin-1 β (Yashiro et al, 2007) kui olulisi vahendajaid, mis aktiveerivad parariini või autokriinset signaalimist SGC rakkude ja CAFide vahel, mis kõik soodustavad kasvaja kasvu ja progresseerumist. Aferentses rajas kutsub vähirakkude ja CAF-ide vaheline otsene interaktsioon omakorda esile rakusiseseid signaaliülekande teid; näiteks arvatakse, et raku adhesiooni molekulil N-kadheriinil on oluline roll paljude rakusiseste vastuste reguleerimisel, mis aktiveerivad vähirakkude motiilsust ja invasiivsust (Hazan et al., 2000). Seega koosneb vähirakkude sissetungi ja progresseerumise kiirendamise mikrokeskkond keeruliselt koostoimetest CAF-idega. Lisaks on soovitatud eluspetsiifiliste fibroblastide olulisust rinnavähirakkude vohamises ja invasioonis (Yashiro et al, 2005); kuid mao fibroblastide rollist CAF-idena SGC progresseerumise ajal on vähe teada.

Üldiselt arvatakse, et epiteeli – mesenhümaalne üleminek (EMT) ja rakuvälise maatriksi lagunemine (ECM) on varajased sündmused tuumori mitmeastmelise sissetungi ja metastaaside ajal. EMT on morfogeenne protsess, mille käigus rakud kaotavad oma epiteeliomadused nagu raku polaarsus ja raku-raku kontakt ning omandavad mesenhümaalsed omadused, näiteks suurenenud liikuvus (Berx jt, 2007). Ehkki EMT-d on algselt kirjeldatud selle funktsioonides embrüogeense arengu ajal (Duband jt, 1995; Shook ja Keller, 2003), on tõendite kogumine näidanud, et sellel on kriitiline roll tuumori sissetungimisel ja metastaaside tekkeks, eriti eraldumise ja vähirakkude migratsioon primaarsest kasvajast ja metastaatiliste saitide moodustumine kaugemates organites (Thompson et al, 2005). Vähirakkude EMT-d kutsuvad sageli esile erinevad transkriptsioonifaktorid, nagu tigu, Twist ja nälkjas (Lombaerts et al, 2006), mille tulemuseks on epiteelimarkerite nagu E-kadheriin allareguleerimine ja mesenhümaalsete markerite nagu vimentin ülesreguleerimine. SGC-s on kirjeldatud siili transkriptsioonifaktori indutseeritud mesenhümaalsete sarnaste geenide säilinud ekspressiooni (Ohta et al, 2009). Teisest küljest määrab maatriksmetalloproteinaaside (MMP) ja metalloproteinaaside koe inhibiitorite kohaliku tootmistaseme tasakaal ECM-i lagunemisvõime. MMP ekspressiooni kõrgenenud tasemed on dokumenteeritud erinevate pahaloomuliste kasvajate korral (Liotta et al, 1991) ja MMP2 üleekspressioon ning see on tihedalt seotud sissetungi ja metastaaside kõrge esinemissagedusega (Nomura et al, 1996), mida aktiveerib membraanitüüp - 1-MMP (MT1-MMP) (Sato et al., 1994). Seetõttu on SGC bioloogiliste, histopatoloogiliste ja kliiniliste omaduste mõistmiseks vaja mitmekesiseid eksperimentaalseid lähenemisviise.

Selles uuringus üritasime tuvastada uusi spetsiifilisi tegureid, mis võivad muutuda mao fibroblastides, kui neid inkubeeritakse koos SGC-ga saadud rakkudega. Mao fibroblastides diferentseeritult ekspresseeritud geene otsese kaaskultuuri juuresolekul või puudumisel SGC rakkudega uuriti komplementaarse DNA (cDNA) mikrokiibi analüüsi abil. Lisaks hinnati ka raku-raku kontakti mõju SGC-rakkude invasiivsetele omadustele, et mõista vähi ja strooma interaktsiooni bioloogilist tähtsust SGC histogeneesis.

materjalid ja meetodid

Rakuliinid ja rakkude kasvu test

Inimese SGC rakuliin HSC-39 (passaaž 20) ja mitte-SGC rakuliinid HSC-57 (passaaž 10) ja HSC-64 (passaaž 10) varustas dr Yanagihara (National Cancer Institute Research Center, Tokyo, Jaapan). HSC-39 rakud (kloonaalsed) saadi SGC-ga 54-aastase meespatsiendi peritoneaalsest astsiidist (märguande ringraku kartsinoom; Yanagihara et al., 1991). HSC-57 (klonaalsed) ja HSC-64 (kloonitud) rakud saadi vastavalt mao hästi ja halvasti diferentseeritud adenokartsinoomiga patsientide astsiidist (avaldamata andmed). NF-25 fibroblastid (heterogeensed, passaaž 4) loodi 77-aastaselt varase maovähiga patsiendilt, kellel oli distaalne gastrektoomia. Kasvajata seina seest pärinevaid mao fibroblaste kultiveeriti ja eraldati. Samuti eraldati NF-j2 fibroblastid (heterogeensed, passaaž 4) kõhunäärmevähiga meessoost patsiendi jejunumist. Patsiendil oli pankreatoduodenuktoomia ja fibroblastid saadi vähivabast jejuniaalseinast. Rakke hoiti rutiinselt RPMI-1640, millele oli lisatud 10% veise loote seerumit. NF-25 ja NF-j2 fibroblaste, mis külvati tihedusega 1, 0x105 rakku 6-süvikulistel plaatidel −1, inkubeeriti sama arvu HSC-39 rakkude otsese koosinkubeerimise juuresolekul või puudumisel. HSC-39 rakkudega kaudseks inkubeerimiseks kasutati 1 μm poorisuuruses Boydensi kambrit (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA). Rakkude arvu loendasime rakkude loendamise kambriga. HSC-39 rakkude eraldamiseks koosinkubeeritud NF-25 ja NF-j2 fibroblastidest kasutati Dynabeads Epithelial Enrich süsteemi (Dynal Biotech ASA, Oslo, Norra). NF-25 fibroblastide arv loendati vaskulaarrakkude adhesioonimolekuli-1 (VCAM-1) (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA) ja integriin- α4 (Santa Cruz) neutraliseerivate antikehade olemasolul või puudumisel. .

Immunofluorestsents

24 tundi pärast ühiskultuuri fikseeriti HSC-39 rakud ja NF-25 fibroblastid kambriklaasides 4% formaliiniga ja inkubeeriti blokeeriva lahusega, mis sisaldas 1% veise seerumi albumiini. Rakke inkubeeriti vimentiini (1: 1000 lahjendus; Dako, Glustrup, Taani), tsütokeratiini (lahjendus 1: 1000; Dako) ja VCAM-1 vastaste antikehadega. Pärast pesemist inkubeeriti objektiklaase sekundaarsete antikehadega, Cy2-konjugeeritud hiirevastaste ja Cy3-konjugeeritud küülikuvastaste IgG-antikehade seguga (lahjendus 1: 10 000).

cDNA mikrokiibi analüüs

Kogu RNA ekstraheeriti NF-25 fibroblastidest (üksikkultuur ja kooskultiveerimine HSC-39-ga), kasutades RNeasy komplekti (Qiagen, Hilden, Saksamaa). CDNA mikrokiibi koostas IntelliGene HS inimese ekspressioon CHIP (Takara Bio, Otsu, Jaapan), mis sisaldas 16 600 iseloomustatud inimese geeni sonde ja ekspresseeritud järjestuse silte. In vitro transkriptsioon, oligonukleotiidide massiivi hübridiseerimine ja skaneerimine viidi läbi vastavalt Takara Bio juhistele. Lühidalt, kogu RNA-st sünteesiti kaheahelaline cDNA ja see märgistati RNA fluorestsentsi märgistamise südamiku komplektiga (Takara Bio). Seejärel skaneeriti massiive GeneArray skanneriga (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), et saada pildi ja signaali intensiivsus. Pärast andmete normaliseerimist viidi läbi mikrotiivri (SAM) proovianalüüsi olulisuse analüüs ja vastavalt valmistamisjuhistele tuvastati oluliselt muudetud geenid (//chem.agilent.com).

Immunohistokeemia

Kobe Ülikooli Kliinikumis (Jaapan, Kobe) kirurgiliselt eemaldatud sporaadiliste SGC-de ja mitte-SGC-dega formaliiniga fikseeritud ja parafiini manustatud proove kasutati kokku 37. Ükski neist juhtudest ei saanud enne operatsiooni adjuvantset keemiaravi ega kiiritusravi. Kõigilt patsientidelt saadi teadlik nõusolek ja uuringu kiitis heaks Kobe ülikooli institutsionaalne järelevalvenõukogu. Histoloogiline uuring viidi läbi vastavalt Jaapani maovähi klassifikatsioonile (Jaapani maovähi ühing, 1999). Kasutati immunoglobuliini ensüümsillatehnika modifitseeritud versiooni koos LSAB komplektiga (Dako). Lühidalt, antigeensuse saamiseks autoklaaviti deparafiinitud ja rehüdreeritud 4 μm lõigud. Pärast endogeense peroksüdaasi ja mittespetsiifiliste seondumissaitide blokeerimist kanti antikehad VCAM-1 (lahjendus 1: 200), E-kadheriin (lahjendus 1: 200; Dako) ja tigu (lahjendus 1: 100; Abcam, Cambrige, Suurbritannia) vastu. sektsioonidesse. Seejärel inkubeeriti sektsioone biotinüleeritud kitse hiirevastase või küülikuvastase IgG-ga (lahjendus 1: 10 000) ja mädarõika peroksüdaasiga (HRP) konjugeeritud streptavidiin. Kromogeenne fikseerimine viidi lõigud 3, 3'-diaminobensidiini lahusesse. Sektsioonid kaeti Mayeri hematoksüliiniga. Iga molekuli immunoreaktiivsuse astmed liigitati vastavalt värvunud rakkude arvule ja värvumise intensiivsusele üksikutes rakkudes: (-), peaaegu puuduvad positiivsed rakud või 30% tuumorirakkudest, millel oleks nõrk immunoreaktiivsus, või tuumorirakud, millel on intensiivne immunoreaktiivsus.

Western blot

Rakud lüüsiti puhvris, mis sisaldas 50 mM Tris-HCl (pH 7, 4), 125 mM NaCl, 0, 1% Triton X-100 ja 5 mM etüleendiamiintetraäädikhapet, mis sisaldas 1% proteaasi inhibiitori kokteili (Sigma, St Louis, MO, USA). Valgud (20 μg ) eraldati naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesil, millele järgnes elektriülekanne Hybond C membraanile (Millipore, Bedford, MA, USA). Pärast blotimist antikehadega VCAM-1 (lahjendus 1: 1000), integriin- α 4 (lahjendus 1: 1000), FAK (lahjendus 1: 1000; Santa Cruz), paksilliini (lahjendus 1: 1000; BD transduktsioon, Lexington, KY), USA), E-kadheriin (lahjendus 1: 1000), vimentin (lahjendus 1: 1000), tigu (lahjendus 1: 500) ja β- aktiin (lahjendus 1: 10000; Sigma), HRP-konjugeeritud hiirevastane või -küüliku IgG-sid (lahjendus 1: 10000, GE Healthcare, Little Chalfont Buckinghamshire, Suurbritannia) kasutati sekundaarsete antikehadena. Signaale visualiseeriti tugevdatud kemoluminestsentsiga.

RT – PCR

Pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsioon (RT – PCR) viidi läbi OneStep RT – PCR analüüsikomplektiga (Qiagen). Selles uuringus kasutatud praimerikomplektid on näidatud tabelis 1. Iga 25 μl reaktsioonisegu, mis sisaldas 10 ng kogu RNA-d, amplifitseeriti 30 tsükli jooksul järgmise režiimiga: pöördtranskriptsioon temperatuuril 50 ° C 30 minutit; denatureerimine 30 sekundit temperatuuril 94 ° C; lõõmutamine 58 ° C juures 30 sekundit ja pikendamine temperatuuril 72 ° C 1 minut. Produktidele tehti elektroforees 2% agaroosgeelil.

Täissuuruses tabel

Tulemused

SGC-rakkudega koos inkubeerimise mõju fibroblastide proliferatsioonile

SGC-rakkude mõju uurimiseks mao fibroblastide proliferatiivsele aktiivsusele loendati NF-25 mao fibroblastide arv, mida kultiveeriti SGC-st tuletatud HSC-39 rakkude juuresolekul või puudumisel. HSC-39 rakud loodi algselt SGC-ga patsiendi astsiidist ja need rakud ei näita seega kleepuvate rakkude tüüpilist kuju, vaid moodustavad NF-25 fibroblastide puudumisel kolooniaid; sellegipoolest ilmnesid HSC-39 rakkudel otsene kinnitumine ja kokkupanemine NF-25 fibroblastidega kultuurianuma põhjas, ehkki neis ridades ei täheldatud morfoloogilisi muutusi (joonis 1A). Lisaks suurenes NF-25 fibroblastide arv dramaatiliselt, kui rakke kultiveeriti HSC-39 rakkudega ( P <0, 001; joonis 1B). Lahustuvate tegurite võimaliku mõju uurimiseks söötmes hoiti NF-25 fibroblaste ja HSC-39 rakke eraldi koos, kasutades 1 μm poorisuuruses Boydensi kambri inserte; siiski ei tuvastatud rakkude proliferatsiooni olulist suurenemist (joonis 1B).

Image

Rakkude ja rakkude kontakt SGC-st tuletatud HSC-39 rakkudega kiirendas NF-25 mao fibroblastide kasvu. ( A ) koos HSC-39 rakkudega kultiveeritud NF-25 fibroblastide immunofluorestsents. NF-25 fibroblastid ja HSC-39 rakud värviti vimentiini (roheline) ja tsütokeratiiniga (punane) (x 200). ( B ) NF-25 mao fibroblastide ja soolestiku NF-j2 fibroblastide kasvukõverad HSC-39 rakkudega koosinkubeerimise juuresolekul või puudumisel. Enne NF-25 ja NF-j2 fibroblastide arvu loendamist välistati ühiselt kultiveeritud HSC-39 rakud eraldamise teel magnetiliste helmeste meetodil. Lahustuvate tegurite mõju uurimiseks hoiti NF-25 fibroblaste ja HSC-39 rakke eraldi koos, kasutades 1 μm poorisuuruses Boydensi kambrit. * <0, 01.

Täissuuruses pilt

Yanagihara jt (2004) on varem teatanud, et HSC-44PE SGC rakkude ortotoopne implanteerimine põhjustas ksenotransplantaadi tekkimist maos, näidates ulatuslikku fibroosi ainult väheste kasvajarakkude infiltratsiooniga; sellist fibroblastide vohamist metastaatilistes kohtades, sealhulgas nahas, lümfisõlmedes ja kopsudes, siiski ei täheldatud, mis viitab sellele, et nähtus on ortotoopne. Niisiis hindasime järgnevalt soolefibroblastide NF-j2 proliferatiivset aktiivsust, et uurida, kas HSC-39 rakkudega kaaskultiveerimise mõju on koespetsiifiline või mitte. HSC-39 rakud ei näidanud raku-raku kontakti NF-j2 fibroblastidega, kui neid kultiveeriti ja hõljusid NF-j2 fibroblastide kohal. NF-j2 fibroblastide rakukasvu ei indutseeritud (joonis 1B).

VCAM-1 ekspressiooni ülesreguleerimist indutseerivad spetsiifiliselt mao fibroblastide SGC rakud

NF-25 fibroblastides spetsiifiliselt üles- ja allapoole reguleeritud molekulide tuvastamiseks viisime läbi cDNA mikromõõtmisanalüüsi, kasutades kogu RNA-sid NF-25 fibroblastidest, mida kasvatati HSC-39 rakkude juuresolekul või puudumisel (joonis 2A). HSC-39 rakkudega koos inkubeerimisega NF-25 fibroblastide geeniekspressiooniprofiili muutus võrreldes HSC-39 rakkudega kooskultiveerimata NF-25 fibroblastidega ei hõlmanud suurt hulka geene: pärast normaliseerimist ja Esialgsete andmete korrigeerimisel leiti, et statistiliselt olulisi erinevusi on 233 geenil (> 2, 5-kordselt ülesreguleeritud, 107 ja <0, 4-kordselt reguleeritud, 126 geenil) (joonis 2B). Mikrokiibi analüüsi täpsust kinnitas kuue juhuslikult valitud diferentsiaalselt ekspresseeritud geeni ekspressiooni reaalajas RT – PCR analüüs, kuna tulemused näitasid, et geeniekspressiooni voldi muutuse osas on mikrokiibi andmetega hea kooskõla (andmeid pole näidatud). . 13 mõjutatud adhesiooniga seotud geeni hulgast (ülesreguleeritud, kaheksa geeni ja allareguleeritud, viis geeni; tabel 2) otsustasime lõpuks keskenduda VCAM-1 geeni transkriptsioonile (GDB registreerimisnumber NM_001078.2), mis näitas 4.60- voldi ülesreguleerimine NF-25 fibroblastides, mida kultiveeriti koos HSC-39 rakkudega.

Image

NF-25 mao fibroblastides diferentseeritult ekspresseeritud geenide identifitseerimine raku-raku kontakti olemasolul või puudumisel HSC-39 rakkudega. ( A ) cDNA mikrokiibi strateegia illustratsioon. NF-25 fibroblaste (1 x 105 raku tassi- 1 ) hoiti 48 tundi HSC-39 rakkude juuresolekul või puudumisel (1 x 105 rakku tassis -1 ). HSC-39 rakud eraldati epiteelirakkude rikastamisega magnetiliste helmestega. ( B ) SAM-graafiku analüüsi tulemused. Cy5-positiivne (helesinine), geenid, mida on HSC-39 rakkudega koos kultiveeritud NF-25 fibroblastides ülesreguleeritud; Cy3 positiivne (roheline), NF-25 fibroblastides ülesreguleeritud geenid; positiivne (sinine), võrdselt ekspresseeritud ja negatiivne (punane) geenid, geenid, mida ei ekspresseeritud.

Täissuuruses pilt

Täissuuruses tabel

Järgmisena kinnitasime, kas VCAM-1 indutseerimine NF-25 fibroblastides on SGC-spetsiifiline sündmus või on seda näha mitte-SGC rakkudes. VCAM-1 induktsiooni nii mRNA kui ka valgu tasemel täheldati dramaatiliselt, kui NF-25 fibroblaste inkubeeriti HSC-39 rakkudega (joonis fig 3A ja B). NF-25 fibroblastides ekspresseeritakse VCAM-1 valku rakulisel membraanil selgelt eristuva spindli morfoloogiaga (joonis 3C). Siiski ei leitud VCAM-1 ekspressiooni taseme indutseerimist NF-25 fibroblastides, kui neid kultiveeriti koos HSC-57 ja HSC-64 rakkudega, mis mõlemad saadi mitte-SGC-ga patsientidelt.

Image

VCAM-1 ekspressiooni indutseerimine NF-25 mao fibroblastides on spetsiifiliselt indutseeritud otsese interaktsiooni kaudu HSC-39 rakkudega. NF-25 fibroblaste inkubeeriti 48 tunni jooksul HSC-39 (SGC-tuletatud), HSC-57 (mitte-SGC-tuletatud) ja HSC-64 (mitte-SGC-tuletatud) rakkudega. Vähirakud eraldati magnetiliste helmeste epiteeli rikastamisega. ( A ) RT – PCR analüüsi tulemused. Kontrollina kasutati β-aktiini ekspressiooni taset. ( B ) Western blot analüüsi tulemused. Kontrollina kasutati β - aktiini ekspressiooni taset. ( C ) NF-25 fibroblastide immunofluorestsents ja morfoloogilised muutused HSC-39 rakkudega kaaskultuuri juuresolekul või puudumisel (× 200). NF-25 fibroblastid visualiseeriti vimentiini (punane) ja VCAM-1 (roheline) vastaste antikehadega.

Täissuuruses pilt

Integriini- α- 4-VCAM-1 signaaliülekandetee olulisus mao fibroblastide vohamisel

VCAM-1 suhtes neutraliseerivate antikehade toimet uuriti, et hinnata, kas VCAM-1 ekspressiooni indutseerimine koos HSC-39 rakkudega kooskultiveerimisega võib soodustada NF-25 rakkude kasvuaktiivsust. VCAM-1 vastaste antikehade lisamine söötmele pärssis efektiivselt rakkude ja rakkude kontakti HSC-39-ga kasvu soodustavat toimet annusest sõltuval viisil (joonis 4A). Adhesioonimolekuli integriin- a4 on võimeline seonduma VCAM-1-ga ja aktiveerib seejärel rakusisese signaaliülekande, mis soodustab raku-raku adhesiooni eraldumist ja rakkude migratsiooni aktiivsuse suurenemist (Bogetto et al., 2000; Klemke et al., 2007). Samuti vähenes NF-25 fibroblastide arv, kui rakke kultiveeriti koos HSC-39 rakkudega söötmes, mis sisaldas anti-integriin-a4 antikeha, annusest sõltuval viisil (joonis 4B).

Image

VCAM-1 ja integriin-a4 vastaste antikehade neutraliseerimise mõju NF-25 fibroblastide kasvule HSC-39 rakkudega kaaskultiveerimise juuresolekul. NF-25 fibroblaste (1 x 105 rakku tassis −1 ) hoiti koos HSC-39 rakkudega (1 x 105 rakku tassis -1 ) ja iga antikeha erinevad kogused lisati söötmesse. NF-25 fibroblastide arv loeti 48 tundi pärast nende neutraliseerivate antikehade lisamist. ( A ) VCAM-1 vastaste antikehade (0–10 μg ml −1 ) mõju. ( B ) Integriini-α4 antikeha (0–10 μg ml −1 ) mõjud. Negatiivse kontrollina kasutati mittespetsiifilist hiire IgG-d (5 μg ml −1 ). Katsed viidi läbi kolm korda.

Täissuuruses pilt

Nende in vitro katsetest saadud tulemuste kohaselt uurisime VCAM-1 ekspressiooni juhuslikel SGC ja mitte-SGC juhtudel. Immunohistokeemia tulemused on kokku võetud tabelis 3 ja tüüpilised illustratsioonid on toodud joonisel 5. Üldiselt tuvastati VCAM-1 ekspressioon CAFides 14 (38%) 37 SGC ja mitte-SGC juhtumist. VCAM-1 ekspressioon tuvastati 11-st (61%) 18-st SGC juhtumist, mille puhul CAF-ide ulatuslik kasv oli ümbritsetud vähirakkudega, ja kolmel (15%) 17-st SGC-st mitteseotud juhtumist, kus vähirakkudel tekkis desmoplastiliste tuubulite moodustumine. CAFide muutus. VCAM-1 ekspressiooni sagedused CAF-ides olid SGC ja mitte-SGC juhtumites oluliselt erinevad ( P = 0, 004).

Täissuuruses tabel

Image

VCAM-1, tigude ja E-kadheriini ekspressioonide immunohistokeemia VCAM-1-positiivse SGC (märguande-rõngarakulise kartsinoomi) ja VCAM-1-negatiivse mitte-SGC seisundi korral (mõõdukalt diferentseerunud tubulaarne adenokartsinoom). Histoloogiline uuring viidi läbi hematoksüliini ja eosiini (H&E) värvimisega. Algne magenifikatsioon: × 200.

Täissuuruses pilt

Rakkude ja rakkude kontakt mao fibroblastidega soodustab EMT-taolisi muutusi ja indutseerib MMP produktsiooni SGC rakkudes

Analüüsiti HSC-39 rakkude muudetud omadusi koos inkubeerimisega NF-25 fibroblastidega. FAK ja paksilliini, VCAM-1-integriin-α4 signaaliradadega seotud molekulide (Liu ja Ginsberg, 2000; Liu et al, 2002) valgu tasemed olid NF-25 fibroblastides ülereguleeritud, kui neid kultiveeriti koos HSC- 39 rakku; integriin- α4 ekspressioonitasemes olulist muutust ei toimunud (joonis 6). Teisest küljest ei leitud HSC-39 rakkudes muutusi integriin- α- 4-VCAM-1 signaalimisrajas osalevate valkude tasemes. Huvitaval kombel tuvastati EMT-ga seotud transkriptsioonifaktori tigu induktsioon, millega kaasnesid E-kadheriini ekspressiooni vähenenud tasemed ja vimentiini ekspressiooni kõrgemad tasemed (joonis 6). Tõepoolest, VCAM-1-positiivsete SGC juhtude korral tuvastati tigu intensiivne immunoreaktiivsus (E-kadheriini madala ekspressiooniga) (joonis 5).

Image

Rakuraku kontakti mõju raku adhesioonimolekulide alareguleerimisele NF-25 fibroblastides ja EMT-laadsete muutuste esilekutsumine HSC-39 rakkudes. Western blot tulemused. Kakskümmend neli tundi pärast NF-25 ja HSC-39 rakkude inkubeerimist eraldati rakud magnetiliste helmeste meetodil. Kontrollina kasutati β- aktiini ekspressiooni taset.

Täissuuruses pilt

Sarnaselt uurisime täiendavalt MMP muudetud ekspressioone HSC-39 rakkudes, mis toimivad ECM-i lagunemisel ja võimaldavad vähirakkudel tungida kudedesse (Sato et al, 1994). Leiti, et MMP-2 , MT1-MMP ja MMP7 mRNA tase HSC-39 rakkudes on märkimisväärselt tõusnud (joonis 7).

Image

Rakkude ja rakkude kontakti mõju HMP-39 rakkude MMP-de ülesreguleerimisele. RT – PCR tulemused. Kakskümmend neli tundi pärast NF-25 fibroblastide ja HSC-39 rakkude inkubeerimist eraldati rakud magnetiliste helmeste meetodil. Kontrollina kasutati β-aktiini ekspressiooni taset.

Täissuuruses pilt

Arutelu

Selles uuringus hindasime NF-25 mao fibroblastide ja SGC-st saadud HSC-39 rakkude kooskultiveerimise tähtsust SGC patogeneesi selgitamiseks, tavaliselt kaasneb sellega mao seina erakorraline paksenemine, kliiniliselt kiire progresseerumine ja sellest tulenev tulemus. patsientide halb prognoos. Toetades neid SGC omadusi, suurendas koosinkubatsioon SGC-st pärinevate rakkudega tugevalt mao fibroblastide kasvu ja omakorda mõjutas invasiivset / metastaatilist potentsiaali SGC rakkudes endis. Lisaks leidsime, et raku ja raku vahelise VCAM-1 induktsiooni indutseerimine NF-25 rakkudes suurendas selle proliferatsiooni aktiivsust ning VCAM-1 ja integriin-a4 vastaste antikehade neutraliseerimine vähendas rakkude kasvu vastavalt annusest sõltuval viisil . See on esimene aruanne, mis näitab VCAM-1-integriin-a4 signaaliülekandetee aktiveerimise võimalikku rolli mao fibroblastide vohamise soodustamisel. Varasemad uuringud on näidanud, et leukotsüütides ekspresseeritud integriin-a4 toimib VCAM-1 retseptorina, mida ekspresseeritakse endoteelirakkudes ja ECM-i fibronektiinis (Chan ja Aruffo, 1993; Postigo et al., 1993); seetõttu arvatakse, et VCAM-1 omab olulist rolli vereringes leukotsüütide kinnihoidmise ja immobiliseerimise toetamisel karkassina. Sellegipoolest tuvastasime VCAM-1 ekspressiooni suurel osal SGC juhtudest, mis kinnitas VCAM-1 vahendamist SGC väljatöötamisel. Inimese T-lümfoblastilistes lümfoomides ei ekspresseerita VCAM-1 mitte ainult lümfoomirakkudes, vaid ka endoteelirakkude nii apikaalsel kui basolateraalsel pinnal, aktiveerides sellest tulenevalt lümfoomirakkude järjestikuse transmigratsiooni ja intravasatsiooni (Bogetto et al., 2000). Samuti soodustas integriin- α4 ja VCAM-1 vaheline kõrge afiinsusega interaktsioon melanoomirakkudes trans-endoteeli migratsiooni (Klemke et al., 2007). VCAM-1 arvukas ekspressioon CAF-ides võib aidata kaasa SGC-rakkude agressiivsusele ja see nähtus võib aidata kaasa SGC-rakkude kiirele levikule ja vaskulaarsele infiltratsioonile in vivo . VCAM-1 lahustuva vormi operatsioonieelsed seerumikontsentratsioonid maovähiga patsientide seerumites olid tervete kontrollrühmaga võrreldes märkimisväärselt kõrgemad; lisaks oli VCAM-1 kõrgenenud taseme olulisi seoseid haiguse staadiumiga, mao seina sissetungi, lümfisõlmede osaluse ja kaugete metastaaside esinemisega (Alexiou et al, 2002). Ehkki VCAM-1 tsirkuleerimise võimalik funktsioon kaugete metastaaside tekkeks on endiselt teadmata, viitavad leiud sellele, et VCAM-1 taseme hindamine seerumi või biopsia proovides võib olla uus marker patsiendi kartsinoomi metastaaside ja kordumise riski ennustamiseks pärast kirurgia. Veelgi enam, VCAM-1 ekspresseeritakse peamiselt CAFidest mao kartsinoomi kudedes, mitte vähirakkudes. VCAM-1 taseme tõus mao fibroblastide rakupinnal ja selle sekretsioon stroomasse võib avaldada suurt mõju SGC-rakkude proliferatsioonile ja migratsioonile.

Värskeimad uuringud on dokumenteerinud, et CAF-id on seotud epiteeli tahke tuumori bioloogia oluliste aspektidega, näiteks vähktõve progresseerumisega, tuumori kasvuga, angiogeneesiga ja metastaasidega stroomadest tuletatud faktor-1 (SDF-1), tuntud ka kui CXCL12 (Yang) püsiva ekspressiooniga. et al., 2008). Tõepoolest, luu morfogeneetilise valgu-2 poolt eraldatud SDF-1 sekretsioon suurendas mikrovaskulaarsete endoteelirakkude moodustumist torudes ja endoteeli eellasrakkude värbamist (Orimo et al., 2005) ja stimuleeris kasvaja kasvu otse, toimides CXCR4 kaudu, mida ekspresseerivad kartsinoomirakud. Seega arvatakse, et SDF-1 mängib keskset rolli vähi progresseerumise ja metastaaside niši loomisel. Sellegipoolest ei soovitatud käesolevas uuringus lahustuvat faktorit, mis soodustaks NF-25 fibroblasti kasvu, kui seda koos HSC-39 rakkudega koos kultiveerida, ja NF-25 fibroblastides koos kultiveeritud NF-25 fibroblastidega ei tuvastatud SDF-1 ekspressiooni suurenenud mRNA taset HSC-39 rakud cDNA mikrokiibi analüüsi abil (andmeid pole näidatud). Pigem leidsime, et NF-25 fibroblastide paljunemist kiirendas otsene ühiskultuur HSC-39 rakkudega, indutseerides märkimisväärselt VCAM-1 ekspressiooni. Lisaks tuvastati see VCAM-1 induktsioon ainult NF-25 mao fibroblastides, mitte NF-j2 soole fibroblastides, mis oli spetsiifiline toime, mis oli põhjustatud interaktsioonist SGC-st saadud rakkudega. Need leiud viitavad SGC ja mao fibroblastide otsese interaktsiooni olulisusele niši ehitamisel, mis on võimeline soodustama mao seina fibroosi ja suurendama vähirakkude pahaloomulist käitumist. Selles uuringus ei välistanud me põhjalikult võimalikku vahendamist lahustuvatele teguritele, mis sekreteeriti nii HSC-39 rakkudest kui ka NF-25 fibroblastidest otsese kaaskultuuri abil. Selliste rakuväliste stiimulite osaluse selgitamiseks SGC-ga patsientidel on vaja täiendavaid uuringuid kaugemate metastaaside progresseerumisel ja tuvastamisel.

Paljud aruanded on uurinud vähi ja strooma vastasmõju inimese pahaloomulistes kasvajates ning näidanud rakkude ja rakkude kontakti olulisust tuumori mikrokeskkonna loomisel, mis võib mõjutada vähirakkude motiilsust ja invasiivsust, EMT-d, angiogeneesi ja kaugeid metastaase (De Wever ja Mareel, 2003). Kindlasti määratletakse EMT kliinilistes vähi proovides kui funktsionaalse E-kadheriini kadu; minna üle teistele kadheriinidele (nt N-kadheriin); raku-raku adhesiooni halvenemine; apikoobaalne polaarsus ja kudede arhitektuur; pleiotroopne raku kuju; tuuma β-kateniini , tigu või nälkide ekspressioon; ja muidu mesenhümaalsete markerite nagu vimentin ootamatu ekspressioon (Thompson jt, 2005). Kuid me ei kasuta selles uuringus vaadeldud bioloogiliste nähtuste kohta mõistet „EMT”, kuna korratu diferentseerumine, raku polaarsuse kadumine ja liinispetsiifiliste või koespetsiifiliste tsütoloogiliste tunnuste kaotus on kartsinoomide eripärad, välja arvatud nn. kartsinoarkoom. Tarin (2005) soovitas mitte kasutada sõna „EMT” vähirakkudes, eriti kui hajutatud üherakulist infiltratsiooni väljendatakse mao difuusse (või märgirõngaste raku) kartsinoomi kaudu. Seetõttu väljendasime seda HSC-39 rakkude reaktsiooni kui 'EMT-laadse muutuse' SGC rakkudes. Meie eksperimendi kohaselt, milles kasutati NF-25 fibroblastide ja HSC-39 rakke, põhjustas otsene interaktsioon mao fibroblastidega tigu ekspressiooni ning sellest tuleneva E-kadheriini supressiooni ja vimentiini induktsiooni HSC-39 rakkudes. Eeldame hüpoteesi, et uuritud HSC-39 rakkudes sisalduvate vimentiini ja E-kadheriini ekspressiooni tasemeid on mingil põhjusel muudetud, mis järelikult taastati, kui rakke kasvatati koos NF-25 fibroblastidega. Kuid HSC-39 rakud ekspresseerivad algselt kõrge E-kadheriini taset (Oyama jt, 1994) ja jõudsime lõpuks järeldusele, et HSC-39 rakkudes indutseeriti EMT-taoline muutus kokkupuutel NF-25 fibroblastiga. Eelmises uuringus uuriti SGC diferentsiaalse geeniekspressiooniprofiili, kasutades cDNA mikrokiibi, ja leiti, et E-kadheriini ja integriin-P4 ekspressiooni alandamine SGC-st tuletatud rakuliinides oli seotud metastaaside suure potentsiaaliga kõhukelmesse ja lümfisõlmedesse (Hippo et al., 2001), toetades ka seda, et EMT-taoliste muutuste esilekutsumine toimub raku-raku kokkupuutel NF-25 fibroblastidega, võib soodustada vähi agressiivsust, mida tõenäoliselt vahendab tigu. Värske Ohta jt (2009) uuring näitas, et EMT-l võib olla keskne roll SGC progresseerumisel ja arendamisel; seetõttu on SGC-rakkudes selle EMT-laadse muutuse mehhanismi mõistmine vajalik uue SGC-vastase kemoterapeutilise lähenemisviisi väljatöötamiseks.

Muutuste ajalugu

Liitumised

GenBank / EMBL / DDBJ

  • NM_001078.2

HUVIDE KONFLIKT

Autorid ei kuuluta huvide konflikti.

Täiendav teave on lisatud ajakirja British Journal of Cancer veebisaidil (//www.nature.com/bjc)