Maatriksi metalloproteinaaside ja inhibiitorite erinev ekspressioon rottide kopsu mesenhümaalsetes ja epiteelirakkudes | laste uuringud

Maatriksi metalloproteinaaside ja inhibiitorite erinev ekspressioon rottide kopsu mesenhümaalsetes ja epiteelirakkudes | laste uuringud

Anonim

Abstraktne

Kopsu areng nõuab rakuvälise maatriksi ümberkujundamist. See hõlmab maatriksi metalloproteinaase (MMP) ja nende endogeenseid inhibiitoreid [metalloproteinaaside koe inhibiitorid (TIMP)]. Kuna neid on üldiselt uuritud ainult tervetes kopsudes, keskendusime konkreetselt mesenhüümi- ja epiteelirakkudele, mis on värskelt eraldatud erinevates arengufaasides. Fibroblastide puhul oli kõige silmatorkavam arengumuutus alveolaarsuse ajal 1. tüüpi membraani (MT1) -MMP transkriptsiooni tipp (sünnieelne tase neljakordne), mis vastab MT1-MMP teadaolevale olulisele rollile selles protsessis. TIMP-1 ja -2 mRNA-d suurenesid ajutiselt sünnitusjärgsel d (pn) 3-l. Alveolaarsete epiteelirakkude (AEC) korral oli MMP-2 ekspressioon maksimaalne loote d (f) 19 korral, kui II tüüpi alveolaarsed rakud (ATII) diferentseerusid ja pn5 ; seevastu MT1-MMP ekspressioon muutus vähe ja TIMP-1 ekspressioon vähenes raseduse edenemisega. ATI fenotüüpi in vitro ekspresseerivates rakkudes oli TIMP-1 ja -2 aktiivsus vastavalt üheksa- ja viiekordselt ATII tunnuseid ekspresseerivates rakkudes, samas kui ATII avaldas suuremat MMP-2 aktiivsust ja oli ainus rakutüüp, mis ekspresseeris MMP-9. See näitab ATII suuremat ümberkujundamise potentsiaali. Seetõttu on kopsu mesenhümaalsetel ja epiteelirakkudel üsna selged MMP / TIMP ekspressioonimustrid. Rakukompartmendi muutused tuleks konkreetselt dokumenteerida selliste kopsuhaiguste tekke korral nagu bronhopulmonaalne düsplaasia, mille puhul on teatatud MMP aktiivsuse muutustest.

Peamine

Rakuväline maatriks (ECM) on oluline kopsu morfogeneesis ja rakkude diferentseerumises, kasvamises ja liikuvuses (1). Kopsu arengu järjestikused pseudoglandulaarsed, kanalite, sahkulaarsed ja alveolaarsed etapid (2) hõlmavad kõik ECM-i ümberkujundamist (1). Tsingist sõltuvad endopeptidaasid ehk MMP viivad läbi ECM proteolüüsi (3). Nende tegevust reguleerivad mitmesugused mehhanismid, milles TIMP-d mängivad olulist rolli (3).

Arenevas kopsus ekspresseeritakse mitmesuguseid MMP-sid ja TIMP-sid (4, 5). Ehkki epiteeli- ja mesenhüümirakkudel näivad olevat erinevad MMP / TIMP ekspressioonitunnused (4, 6), on MMP ja TIMP ekspressioonimuutusi erinevatel arenguetappidel üldiselt uuritud ainult kogu kopsus (4, 5, 7, 8). Kui epiteeli- ja mesenhümaalseid rakke uuriti võrdlevalt, oli see väga piiratud aja jooksul (6). Suhtelise panuse küsimus on seda olulisem, et epiteeli ja mesenhüümi vastastikused koostoimed on kopsu kõigi arenguetappide jaoks üliolulised (9). Lisaks on siiani rohkem tähelepanu pööratud loote kopsude varajasele arengule kui hilisematele etappidele. Hilise arengu edasine dokumenteerimine võib aidata paremini mõista vastsündinute kroonilise kopsuhaigusega kaasnevate MMP aktiivsuse muutuste olulisust (10, 11). Käesolevas uuringus uurisime MMP-de / TIMP-de ekspressioonimuutusi fibroblastides ja AEC-des, mis olid isoleeritud roti kopsust, pseudoglandulaarse staadiumi lõpust alveolaarsesse staadiumisse. Uurisime ka rakke, mis ekspresseerivad in vitro kas ATI või ATII fenotüüpi.

Kuna MMP-de ja TIMP-de globaalset uuringut ei saanud kaaluda, keskendusime teadaolevalt erilise tähtsusega valkudele, sealhulgas MMP-2 ja MT1-MMP (või MMP-14), mis on seotud alveolaaride moodustumisega (12–14), TIMP- 1 (peamine MMP inhibiitor) ja TIMP-2, mis kontrollib MMP-2 aktiveerimist (15). Need on kopsus kõige enam ekspresseeritud maatriksit ümber kujundavate molekulide hulgas, mida tõendab areneva hiire eri organite profiilide uuring (5). Kuna me keskendusime hilisele arengule, ei lisatud TIMP-3, mis on hargnemise ajal morfogeneesi ajal oluline (16).

MATERJALID JA MEETODID

Kopsurakkude eraldamine.

Kasutati tiinustatud Sprague-Dawley rotte (Charles River, Saint Germain sur l'Arbresle, Prantsusmaa). Loomadega seotud protseduurid andis loa Prantsuse põllumajandusministeerium. AEC ja fibroblastid eraldati diferentsiaalse adhesiooni ja tsentrifuugimisega, nagu on kirjeldatud (17), f17 (pseudoglandulaarne staadium), f19 (kanalite staadium), f21 ja pn1 ja 3 (sakkulaarne staadium), pn5 ja 8 (alveolaarne staadium, progresseeruv eraldumine). ja pn16 (alveolaarne staadium, lõppenud eraldumine). Selle protseduuri abil eraldatud epiteelirakud ekspresseerivad iseloomulikke ATII markereid (17). Värskelt eraldatud rakud külmutati viivitamata ilma igasuguse kultiveerimisetapita ja säilitati temperatuuril -80 ° C.

AEC kultuur.

Et teha kindlaks, kas ATI või ATII tunnuseid ekspresseerivatel rakkudel on erinevad MMP / TIMP seadmed, külvati pn21-l isoleeritud AEC substraatidele, mis teatasid eelistavat kumbagi fenotüüpi. Engelbreth-Holm-Swarmi keldrimembraani maatriks [(EHS maatriks), mis on valmistatud laboratooriumis] ja kollageeni-fibronektiin-laminiin 5 kate (CFL), mis koosneb kollageenist I (8 μg / cm 2 ; BD Biosciences, Erembodegem, Belgia)., fibronektiin (2, 1 μg / cm2; Sigma Chemical Co., L'Isle d'Abeau-Chesnes, Prantsusmaa) ja laminiin 5 (0, 5 μg / cm 2 ; kingitus P. Rousselle'ilt, valgubioloogia ja keemia instituudist, CNRS, Lyon, Prantsusmaa) toetavad mõlemad ATII fenotüüpi. Plastik ja kollageen-fibronektiinkate (CF), mis koosneb ainult kollageenist I ja fibronektiinist (ühesugused kontsentratsioonid), soodustavad transdiferentseerumist ATI-ks (18, 19). Puhastatud AEC-d 10% veise loote seerumis (FBS) sisaldavas söötmes külvati (1, 5x106 rakku / ml) mitme auguga plaatide kasvuplaatidele, kas katmata või kaetud ühega kolmest maatriksisubstraadist. Pärast üleöö kleepumist substraadiga õhu-CO2 all (95% kuni 5%) lisati seerumivaba määratletud sööde (17) ja uuendati 24 tunni pärast. Pärast 30-tunnist inkubeerimist koguti konditsioneeritud sööde (CM) ja hoiti MMP / TIMP testide jaoks temperatuuril -80 ° C ja kultiveeritud rakkude fenotüüp määrati konkreetsete markerite immunomärgistamisega.

Rakkude immunomärgistamine.

Tsütokeratiini / vimentiini immunomärgistamine võimaldas määrata AEC-de ja fibroblastide vastastikuse saastatuse. T1a ja pindaktiivne valk B (SP-B) iseloomustasid vastavalt ATI ja ATII. Metanooliga fikseeritud rakke inkubeeriti 1 tund kas monoklonaalse roti-vastase pan-tsütokeratiini antikehaga (Sigma Chemical Co.), monoklonaalse roti-vastase vimentiini antikehaga (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), küüliku anti-roti SP-B-ga. antikeha (prof. JA Whitsetti kingitus, Cincinnati OH) või monoklonaalset anti-roti T1a antikeha (kingitus prof. MC Williamsilt, Boston, MA). Sekundaarsete antikehadena kasutati fluorestseiini isotiotsüanaadiga konjugeeritud hiirevastast immunoglobuliini antikeha (Jackson Immunoresearch Labs, Soham, Cambridgeshire, Suurbritannia) või Texase punase konjugeeritud küülikuvastast immunoglobuliini antikeha (GE Healthcare, Orsay, Prantsusmaa). Rakutuumad märgistati bisbensimiidiga (Sigma Chemical Co.). Fluorestsentsi vaadeldi Zeiss Axioskop-40 mikroskoobiga.

RNA ekstraheerimine.

Kogu RNA eraldati, kasutades Trizoli reagenti (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Prantsusmaa), sadestati, lahustati steriilses vees ja kvantifitseeriti neeldumisega lainepikkusel 260 nm (Biophotometer, Eppendorf). Terviklikkust kontrolliti denatureeriva geelelektroforeesiga.

cDNA sondid ja Northern blot analüüs.

Kogu roti kopsu RNA transkripteeriti, kasutades Superscript II pöördtranskriptaasi ja juhuslikke heksameeri praimereid (Invitrogen). Sondid amplifitseeriti polümeraasi ahelreaktsiooni abil, kasutades sihtmärgispetsiifilisi praimerijärjestusi (tabel 1), märgistatud (α 32 P) desoksütsütidiintrifosfaadiga (NEN, Perkin Elmer), kasutades Rediprime märgistussüsteemi (GE Healthcare), ja puhastati G-50 kolonnidel ( GE Healthcare). Northern blot analüüsiks elektroforeesiti 20 μg RNA 1, 2% agaroosi, 2, 2-M formaldehüüdi geelidel ja kanti seejärel nailonmembraanidele (Gene Screen, Perkin Elmer). Membraane uuriti järjestikku TIMP-1, TIMP-2, MT1-MMP, MMP-2 mRNA ja 18S rRNA suhtes puhverlahuses, mis sisaldas 50% formamiidi, 50 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 0, 8 M NaCl, 10% dekstraansulfaati., 0, 1% naatriumpürofosfaat, 5x Denhardti lahus, 0, 1% naatriumdodetsüülsulfaat (SDS) ja denatureeritud lõhe sperma DNA 75 μg / ml. Hübridisatsiooni viidi üleöö temperatuuril 42 ° C. Blotid eksponeeriti X-Omat AR Kodaki filmidele temperatuuril –80 ° C. Autoradiograafilisi signaale kvantifitseeriti densitomeetriliselt (NIH Image, Bethesda, MD) ja normaliseeriti 18S rRNA-ni.

Täissuuruses tabel

Zimograafia MMP-2 ja MMP-9 želatinase aktiivsuse määramiseks.

Võrdsetest rakkudest kogutud võrdsetes kogustes CM-d elektroforeesiti enne valamist mitteredutseerivates tingimustes 8% SDS-polüakrüülamiidi geelidel, mis olid immutatud 0, 5 mg / ml želatiiniga. Geele pesti 30 minutit SDS-i eemaldamiseks 2, 5% Triton X-100-ga, seejärel inkubeeriti öö läbi temperatuuril 37 ° C seedimispuhvris (50 mM Tris-HCl ja 10 mM CaCl2, pH 7, 4). Geele värviti Coomassie sinisega (R250), et saada värvimata piirkonnad, kus substraat lagunes proteaaside poolt. Aktiivsuse omistamine MMP-dele kinnitati pärssimisega etüleendiamiintetraäädikhappe (10 mM) juuresolekul. Densitomeetria saavutati tarkvara NIH Image abil.

Pöördsümograafia TIMP tegevuste määramiseks.

Võrdsetest arvudest rakkudest kogutud CM mahuosa elektroforeesiti 13% SDS-polüakrüülamiidi geelidel, mis sisaldasid nii želatiini (0, 5 mg / ml) kui ka želatanaasirikkaid lahuseid, mis olid toodetud rottide loote kopsufibroblastide poolt, mida stimuleeris forbolester-ester 12-tetradekanoüülforbool-13 atsetaat ( 20). Geele pesti ja inkubeeriti 10 tundi digereerimispuhvris temperatuuril 37 ° C ja värviti seejärel nagu sümograafia jaoks. TIMP-i tegevused ilmnesid heledal taustal tumedate ribadena želatiinaasi inhibeeriva toime tõttu. Ribad identifitseeriti nende molekulmassi ja inimese rekombinantse TIMP-2 standardiga võrdlemise teel (prof. G. Murphy kingitus, Cambridge, Suurbritannia). Densitomeetria saavutati tarkvara NIH Image abil.

Statistiline analüüs.

Andmed on esitatud keskmisena ± SE. Keskmisi väärtusi võrreldi korduvalt dispersioonanalüüsi (ANOVA) ja Fisheri väikseima kaitstud erinevusega (PLSD) või mitteparameetrilise Kruskal-Wallise analüüsi ja Mann-Whitney U testi abil, sõltuvalt rakendatavusest. statistilise olulisuse piiriks loeti p = 0, 05.

TULEMUSED

Eraldatud rakkude iseloomustus.

AEC-del ja fibroblastidel olid vastavalt nende rakutüübi (joonis 1 A ja C ) ning tugevalt ekspresseeritud tsütokeratini (joonis 1 B ) ja vimentiini (joonis 1 D ) iseloomulikud morfoloogilised tunnused. Vastastikune saastumine oli <5% VEC-positiivsetest rakkudest AEC-des ja <2% tsütokeratiin-positiivsetest rakkudest fibroblastides.

Image

Eraldatud ja kultiveeritud kopsurakkude iseloomustus. Hematoksüliin-eosiiniga värvimisel ilmnesid monokihi ( A ) polügoonikujulised AEC-d, samas kui fibroblastid olid spindlikujulised ( C ). AEC-d tugevalt märgistatud tsütokeratiini ( B ) ja fibroblastide (vimentin) ( D ) jaoks; tuumavastane pindamine bisbensimiidiga. Rakud, mida kultiveeriti CFL-maatriksil, olid immunoloogiliselt positiivsed nii ATII-markeri SP-B ( E ) kui ka ATI-markeri T1a ( F ) suhtes. Baarid = 20 μm.

Täissuuruses pilt

MT1-MMP arenguekspressioon.

Fibroblastides muutus MT1-MMP-mRNA tase enne sündi vähe (joonis 2 A ja B ). See suurenes pn3-l nelja- kuni viiekordseks, püsis kuni pn8-ni ja siis naasis pn16-l prenataalsele tasemele. AEC-de korral ei muutunud ekspressioonitase märkimisväärselt f17-st pn1-ni, kuid erinevalt fibroblastidest vähenes see pisut, kuid märkimisväärselt pn3-l. Mööduv tõus pn3 tasemeni 2, 5 korda ja f17 tasemeni 1, 3 korda ning f17 tasemeni 1, 3 korda (joonis 2 C ja D ). Alveolaarsuse ajal näitas võrdlus sama blotiga, et kopsufibroblastid ekspresseerisid umbes kaks korda rohkem MT1-MMP mRNA kui epiteelirakud (pole näidatud).

Image

MT1-MMP mRNA ekspressioon loote ja postnataalse kopsu fibroblastides ( A , B ) ja AEC-des ( C , D ). ( A ja C ) Esindavad Northern blot. ( B ja D ) mRNA suhtelise arvukuse densitomeetriline analüüs, mis on normaliseeritud laadimiseks 18S rRNA-ga. Viiest erinevast pesakonnast koosnevas erinevas pesakonnas tehtud viie sõltumatu määramise keskmine ± SE on keskmine ± SE. Mitme võrdlus ANOVA ja Fisheri PLSD-ga. Fibroblastide ( B ) oluline erinevus: * p <0, 05 vs f17; ** p <0, 01 vs f17; † p <0, 05 vs pn3 või pn8 ja AEC ( D ): * p <0, 05 vs pn3; † p <0, 05 vs f17.

Täissuuruses pilt

MMP-2 arenguekspressioon.

MMP-2 ekspressioon ei muutunud fibroblastides uuringuperioodil oluliselt (joonis fig 3 A ja B ). Seevastu AEC-des suurenes see 50% -lt f17-st f19-ni, kui see oli maksimaalne juhuslikult ATII diferentseerumise algusega; see langes siis f21-l ja vähenes veelgi pärast sündi. Pn5 (joonis 3 C ja D ) ilmnes kerge ja mööduv tõus.

Image

MMP-2 mRNA ekspressioon loote ja postnataalses kopsufibroblastides ( A , B ) ja AEC-des ( C , D ). ( A ja C ) Esindavad Northern blot. 18S rRNA abil normaliseerimiseks mRNA suhtelise arvukuse ( B ja D ) densitomeetriline analüüs. Viiest erinevast pesakonnast koosnevas erinevas pesakonnas tehtud viie sõltumatu määramise keskmine ± SE on keskmine ± SE. Mitme võrdlus ANOVA ja Fisheri PLSD-ga. AEC-de ( D ) olulised erinevused: * p <0, 05 vs pn1; ** p <0, 001 vs pn1; † p <0, 05 vs f19. Muutused fibroblastides ei saavutanud olulisuse taset.

Täissuuruses pilt

TIMP-1 ja TIMP-2 arenguväljendus.

Fibroblastides (joonis fig 4 A ja B ) ekspresseerusid TIMP-1 ja TIMP-2 mRNA-d f17-l üsna nõrgalt, võrreldes hilisemate etappidega; nad kasvasid vastavalt f17 ja f19 vahel kahe- ja kolmekordseks, püsides siis stabiilsena kuni pn1. Mõlema TIMP korral ilmnes pn3-l järsk ja tohutu tõus (neli kuni viis korda pn1-tase). Ekspressioonitasemed vähenesid seejärel järk-järgult, et saada pn8 sünnieelne tase. Mõlema TIMP ekspressioonimustrid olid hämmastavalt sarnased. AEC-des (joonis 2 C ja D ) vähenes TIMP-1 mRNA tase raseduse edenedes umbes 75%, samas kui TIMP-2 mRNA tase püsis konstantsena. Mõlemad TIMP mRNA-d suurenesid pn3 ja pn5 vahel, jõudes kaks korda f17 tasemele, seejärel püsisid konstantsena läbi pn16. Fibroblastide ja AEC-de võrdlus samadel blottidel näitas sarnast taset, välja arvatud pn3, kui fibroblastide sisaldus oli kõrgem (pole näidatud).

Image

TIMP-1 (□) ja TIMP-2 (▪) mRNA ekspressioon loote ja postnataalse kopsu fibroblastides ( A , B ) ja AEC-des ( C , D ). ( A ja C ) TIMP-1 ja TIMP-2 mRNA-de tüüpilised Northern-blotid vastavalt fibroblastides ja AEC-des. ( B ja D ) mRNA suhtelise arvukuse densitomeetriline analüüs, mis on normaliseeritud laadimiseks 18S rRNA-ga. Viiest erinevast pesakonnast koosnevas erinevas pesakonnas tehtud viie sõltumatu määramise keskmine ± SE on keskmine ± SE. Mitme võrdlus ANOVA ja Fisheri PLSD-ga. Oluline erinevus fibroblastides ( B ): * p <0, 05; ** p <0, 01; § p <0, 001 vs pn3 ja AEC ( D ) korral: * p <0, 05 vs f17; † p <0, 05 vs f21 ja pn1, ‡ p <0, 01 vs f21 ja pn1.

Täissuuruses pilt

MMP-de / TIMP-de diferentseeritud tootmine ATI või ATII fenotüüpi ekspresseerivate rakkude poolt.

EHS-i maatriksil kultiveeritud AEC ekspresseeris massiliselt SP-B ega suutnud T1a ekspresseerida, samal ajal kui plastil või CF-il kasvatatud AEC-id värvisid positiivselt T1a, kuid mitte SP-B (pole näidatud). Seetõttu peeti neid vastavalt ATII-ks ja ATI-ks. CFL-ga kultiveeritud rakud ekspresseerisid samaaegselt SP-B ja T1a (joonised fig 1 E ja F ), kuvades seega ATI-ATII vahendaja fenotüübi. Nagu on näidatud joonistel 5A ja B , tootsid rakud sarnaseid MMP-2 koguseid kõigil substraatidel, välja arvatud EHS maatriksis, kus aktiivsus oli 45% kõrgem. Ainult EHS-i maatriksil või CFL-il kasvatatud rakud vabastasid MMP-9, ehkki palju madalamas proportsioonis kui MMP-2. Rakud CFL-il, millel on sekretsioon, on vahendajaks CF- ja EHS-maatriksis olevate rakkude vahel. Nagu on kujutatud joonistel fig 5 C ja D , oli plasti või CF rakkude TIMP-1 aktiivsus umbes üheksa ja viiekordne vastavalt CFL ja EHS maatriksis olevate rakkude aktiivsusele ning TIMP-2 puhul täheldati kolm korda suuremat aktiivsust. Plastiku ja CF korral oli TIMP-1 aktiivsus umbes kaks korda suurem kui TIMP-2, samas kui EHS maatriksi või CFL korral olid mõlemad TIMP-d sarnased (joonis 5D). MMP / TIMP tasakaal näib seetõttu soodustavat rakkude suuremat proteolüütilist aktiivsust CFL- või EHS-maatriksil.

Image

Erinevatel substraatidel kasvatatud AEC-de poolt CM-s vabanenud želatinase (MMP-2 ja -9) ning TIMP-1 ja -2 aktiivsuste võrdlus. ( A ja B ) Želatanaasi aktiivsused, mida hinnatakse tsümograafia abil. ( A ) CM-de tüüpiline tsümogramm rakkudest plast-, CF-, CFL- või EHS-maatriksis ja EHS-maatriksist ilma rakkudeta. Želatinolüütiline toime ilmneb MMP-2 tugevate ribadena (

Image
) ja nõrgemad ribad pro-MMP-2 jaoks (
Image
), pro-MMP-9 (□) ja MMP-9 (▪). ( B ) densitomeetriline analüüs (suvalised ühikud, ühik); ainuüksi EHS-i maatriksist saadud aktiivsus lahutati kogu aktiivsusest, et määrata selle substraadil kasvatatud AEC-de põhjustatud osa. ( C ja D ) TIMP tegevused, mida hinnati pöördsümograafia abil. ( C ) CF-i, plasti, EHS-i ja CFL-i rakkude CM-i tüüpilised pöördtümmogrammid. MW, molekulmassi markerid; IC, sisekontroll (Dulbecco modifitseeritud Eagle sööde - 10% FBS); rhTIMP-2, inimese rekombinantne TIMP-2, mida kasutati positiivse kontrollina. Želatinolüütilisi toimeid pärssivad toimed ilmnesid positiivse värvumise tsoonidena koos Coomassie sinisega, millel oli kaks peamist pindala 28 (TIMP-1: □) ja 21 kD (TIMP-2: ▪). ( D ) Densitomeetriline analüüs. Andmed on kolme sõltumatu määramise (erinevad rakukultuuri katsed) keskmine ± SE. Korduv võrdlus Kruskal-Wallis analüüsi ja Mann-Whitney U testiga. Oluline erinevus B-s : * p <0, 001 vs pro-MMP-9 plastil; ** p <0, 001 vs MMP-9 plastil; † p <0, 001 vs pro-MMP-2 plastil; ja ‡ p <0, 01 vs MMP-2 plastil. D oluline erinevus: * p <0, 001 vs. TIMP-1 plastil; ** p <0, 01 vs TIMP-1 CF-l; † p <0, 01 vs TIMP-2 CF-il.

Täissuuruses pilt

ARUTELU

MMP / TIMP süsteem mängib võtmerolli epiteeli ja mesenhüümi interaktsioonides, mis on olulised kopsu arenguks. Me profileerisime MMP ja TIMP perekondade võtmeliikmete ekspressiooni kopsufibroblastides ja erinevates etappides isoleeritud AEC-des ning korreleerusime esialgselt variatsioone morfoloogiliste muutustega. Näitasime rakutüüpide vahel üsna erinevaid mustreid, mis näitab, et varem teatatud muutused terves kopsus polnud piisavalt informatiivsed, et mõista kõiki arengumõjusid.

Eraldatud rakkude kasutamine on selle uuringu võimalik piirang, kuna me ei saa välistada võimalust, et rakkude eraldamine võis mingil määral muuta transkriptsiooni taset. Uuring võimaldas siiski ilmneda arengumuutusi, mis tõenäoliselt pole tingitud rakkude töötlemisest. Samamoodi pole tõenäoliselt muutnud fibroblastide ja AEC-de vastastikune saastumine tulemusi, kuna ühe rakutüübi muutused teises ei kajastunud. Näiteks pn3 fibroblastide MT1-MMP või TIMP mRNA taseme märkimisväärne suurenemine ei toimunud muutuste ega AEC väärtuste langusega. Sellist võimalikku kallutatust välditakse tõepoolest in situ hübridiseerimise või immunohistokeemia abil, kuid need lähenemisviisid ei suuda vaevalt täpset kvantitatiivset määramist anda ega ole enam piirangutest vabastatud. Seega viisid nad mõnikord vastuoluliste tulemusteni, kus MMP-9 ei ekspresseerunud roti loote kopsus (12) ja TIMP-1 küüliku loote kopsus (7) või, vastupidi, MMP-9 ekspressioon loote rotis (21). ) või ahvi (11) kopsu ja TIMP-1 kopsi (11) või inimese ja hiire (8) kopsus. Teine piirang seisneb selles, et värskelt isoleeritud rakkudes ei ole võimalik MMP / TIMP aktiivsust kindlaks teha, kuna söötme kogumine vabastatud materjaliga nõuab mitmetunnist kultiveerimist, mis võib olla tinginud veelgi suuremaid muutusi kui raku eraldamine. Seetõttu, välja arvatud ATI / ATII võrdluse korral, pidime seetõttu piirduma oma uurimisega translatsioonieelsele tasemele ja tuletama ekspressioonimuutustest oletatavaid aktiivsuse muutusi. Viimaseks, kuigi me näitasime varem, et selle protseduuriga eraldatud AEC ekspresseerivad spetsiifilisi ATII markereid (17), ei saa me välistada, et siin raku osaks nimetatud AEC-d olid tegelikult Clara rakud, mis ekspresseerivad ka SP-B. See aga tõenäoliselt ei seganud meie esmast erinevust epiteelirakkude ja fibroblastide vahel.

Suur avastus seisnes MT1-MMP ekspressiooni oluliste muutuste lokaliseerimises fibroblastidesse alveolaarsuse ajal, mida ei ilmnenud varasematest globaalsetest profiiliuuringutest (5) ega ekspressiooniuuringutest, sealhulgas hiirte in situ hübridisatsioonist (13, 14). Lisaks oli varasemate tervete kopsude profiilide andmete põhjal ootamatu seose puudumine MMP-2, TIMP-de ja MT1-MMP vahel (5). Alveolaarsus hõlmab enne sündi toimuvat alveolaarmahu proliferatsiooni perioodi, sekundaarset septatsiooni, mis toimub rotil vahemikus 4 kuni 14 pn, ning lõpuks seina hõrenemise ja mikrovaskulaarse küpsemise perioodi, kus kahekordne kapillaaride võrk sulandub ühtne võrk (2). MT1-MMP maksimaalne ekspressioon fibroblastides pn3 ja pn8 vahel, millele järgneb langus pn16-l, viitab seosele septeerimisprotsessiga. Pealegi, kuigi palju vähem silmatorkav, saavutati maksimaalne tase ka AEC-des samal perioodil, pn5. Selle hüpoteesiga on kooskõlas ka hiirte in situ hübridisatsiooni varasemad leiud, mis näitavad tipptasemel ekspressiooni alveolaarsetes seintel d10 ümber (14). MT1-MMP kõrge ekspressioon sel perioodil on kooskõlas selle olulise rolliga alveolaarses arengus, mida hiljuti näitas MT1-MMP-puudulike hiirte eraldumise puudumine (13, 14). Ehkki ka muud rakutüübid, sealhulgas endoteelirakud, võiksid oma panuse anda, väidavad meie leiud fibroblastide suurt panust MT1-MMP tootmisel alveolaarsuse ajal. Mis puutub selle toimemehhanismi, kuigi MT1-MMP aktiveerib teadaolevalt pro-MMP-2 (22), siis näib, et MT1-MMP roll alveolarisatsioonis on sellest võimest suuresti sõltumatu (13, 14). Järjepidevalt on MMP-2-null-hiirtel ainult piiratud alveolaarsuse defektid (12, 13) ja kopsu arengu ajal ei leidnud me olulisi muutusi MMP-2 ekspressioonis fibroblastides. Võttes arvesse ühelt poolt MT1-MMP (23) rakkude liikuvust soodustavaid ja sissetungi soodustavaid tegevusi ning teiselt poolt müofibroblasti migratsiooni nõuet elastiinide sadestumiseks ja alveolaarsuse suurendamiseks (24), on MT1- MMP müofibroblastide migratsioonil kohtadesse, kus sekundaarse septa hüpotees on tõenäoline hüpotees. Kuna MT1-MMP soosib neovesseli moodustumist (25), võib see olla oluline ka mikrovaskulaarses arengus (13), mis on alveolaarsuse oluline komponent.

Vastupidiselt fibroblastidele kõikus MMP-2 ekspressioon AEC-des arenguga, millel on tõenäoliselt funktsionaalne tähtsus. Esimene ekspressiooni tipphetk f19-l korreleerus arvatavasti ATII all oleva alusmembraani (BM) katkemiste moodustumisega, mille kaudu jalgade protsessid väljaulatuvad ja kontakti lipofibroblastidega loovad (26, 27). ATII küpsemine korreleerub epiteeli ja mesenhüümi interaktsioonide oluliseks osutunud BM-i katkemiste sagedasema sagedusega (26, 27). Huvitaval kombel näitas meie uurimine ka seda, et ATII-l on suurem maatriksi proteolüütiline potentsiaal kui ATI-l, mis on tõenäoliselt seotud membraani katkemiste eelistatud seotusega esimestega. Kooskõlas meie järeldustega avaldasid plastil kasvatatud AEC-d pärast 2-päevast kultiveerimist suuremat kolgenolüütilist aktiivsust kui pärast 7-päevast (28), mis tõenäoliselt peegeldab ATII muundamist ATI fenotüübiks sellel põhimikul. Veelgi enam, vähendatud MMP-2 ekspressioon, mida täheldati AEC-des vahemikus f19 ja f21 (joonis 4), võib kajastada ATI suurenenud osakaalu mõlemas etapis (2). Pärast langust sündimise ajal täheldati pn5-l MMP-2 ekspressiooni teist piiki. Selle tähtsus on ebaselge. Tundub, et see ei ole seotud BM-i katkemistega, mis pärast sündi regulaarselt vähenevad (27), ja vastupidiselt MT1-MMP ekspressiooni haripunktile fibroblastides, ei säilinud see kogu alveolaarse eraldumise ajal. Sellegipoolest teatati, et bronhopulmonaalse düsplaasia poole arenevad imikud vähendasid MMP-2 ja suurendasid MMP-9 aktiivsust hingetoru heitvees (10, 11). Need muutused tähistavad tõenäoliselt epiteelirakkude muutunud vabanemist. Kuna alveolaarsus on haiguses häiritud, viitavad nad epiteeli MMP-2 kõrgendatud ekspressiooni funktsionaalsele tähtsusele alveolaarsuse alguse ajal, ehkki selle täpne roll pole teada.

Leiti, et TIMP-1 ekspressioon oli nii fibroblastides kui ka AEC-des raseduse lõpus minimaalne ja vähenes AEC-de küpsemise korral. Vastavate kanalite ja sahkulaarsete etappide ajal tekivad ja arenevad õhu-vere tõkked, maatriksimaterjal väheneb ja jalgade protsesside arv suureneb. Eeldades aktiivsuse peegeldunud muutusi, võib madal TIMP-1 tase soodustada proteolüütilist aktiivsust, mis on vajalik ECM-i lagundamiseks nende protsesside ajal. Ehkki silmatorkav, ei pruugi TIMP-1 ja -2 ekspressioonipiik pn3 fibroblastides seevastu olla seotud konkreetse arengusündmusega, kuna see ilmneb ajal, mil kops pärast sünnituseelse pindaktiivse aine kogunemist ja enne algust muutub vähe alveolaarsuse suurenemine. Minoo jt. (29) on varem teatanud samasugusest TIMP-1 mRNA suurenemisest vastsündinud paavianide kogu kopsus enneaegse või tähtajalise sünnituse korral. Selle olemasolu enneaegsetel vastsündinutel viis selle suurenemiseni hapniku hingamisele ülemineku tagajärjel (29). Meie leiud esindavad tõenäoliselt sama nähtust. Selle mööduva tõusu olulisus on ebaselge, kuid kas see kajastus suuremas TIMP aktiivsuses, näib, et see on tõenäoliselt seotud sünnitusjärgse ECM-i ümberkujundamisega. Postnataalselt suurenesid nii TIMP-1 kui ka -2 koopiad AEC-des järk-järgult ja püsisid maksimaalses vahemikus pn5 ja pn16. Fibroblastides seevastu vähenesid TIMP-1 ja -2 ekspressioon pn5-st pn8-ni ja saavutasid pn16-l eriti madala taseme. Kõrge AEC väärtus võib vastata BM progresseerumisele ja stabiliseerumisele vähenenud katkenduste sagedusega (27). Mõlema sektsiooni TIMP-ide suhteliselt kõrge ekspressioonitase mõnes sektsioonis võib hõlbustada ka sekundaarse harjaste teket, piirates lahustuva elastiini (tropoelastiini) lagunemist enne ristsidemetega stabiliseerumist. Viimaseks, kuna TIMP-d soodustavad rakkude kasvu sõltumata nende MMP-d pärssivast toimest (30, 31), võivad sünnitusjärgsete nädalate kõrged TIMP-tasemed aidata kaasa raku intensiivsele vohamisele, mida sel ajal täheldatakse kõigi rakutüüpide puhul (2). TIMP vähenenud ekspressioon fibroblastides pärast septeerimise lõppemist võib olla korrelatsioonis interstitsiaalse sektsiooni hõrenemisega, mis toimub selles viimases arengufaasis (2).

Tervikuna annab see uuring uue ülevaate MMP / TIMP ekspressioonist arenevas kopsus, tuues välja erinevate rakkude eristamise tähtsuse. Selliste haiguste ennetamise perspektiivis, mis hõlmavad muutusi MMP tegevuses, eriti bronhopulmonaarset düsplaasiat, tuleks dokumenteerida muutused erinevates rakukompartmentides.

Sõnastik

AEC-d

alveolaarsed epiteelirakud

ATI (II)

I tüüpi alveolaarsed rakud (II tüüp)

CF

kollageeni-fibronektiini kate

CFL

kollageen-fibronektiin-laminiin 5 kate

CM

konditsioneeritud sööde

EHS maatriks

Engelbreth-Holm-Swarm keldrimembraani maatriks

f

lootepäev

MMP

maatriksmetalloproteinaas

pn

sünnitusjärgne päev

SP-B

pindaktiivne valk B

TIMP

metalloproteinaaside koe inhibiitor