Ep1 prostanoidi retseptori kahjulik roll vere-aju barjääri kahjustuses pärast eksperimentaalset isheemilist insuldi | teaduslikud aruanded

Ep1 prostanoidi retseptori kahjulik roll vere-aju barjääri kahjustuses pärast eksperimentaalset isheemilist insuldi | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Haiguse eksperimentaalsed mudelid
  • Stroke

Abstraktne

Tsüklooksügenaas-2 (COX-2) aktiveeritakse vastusena isheemiale ja aitab märkimisväärselt kaasa neuroinflammatoorsele protsessile. COX-2-st tuletatud prostaglandiini E 2 (PGE 2 ) akumulatsioon on paralleelne insuldi vahendatud vere-aju barjääri (BBB) ​​lagunemise olulise suurenemisega. BBB häire on isheemilise insuldi tõsine tagajärg ja seda vahendavad peamiselt maatriksmetalloproteinaasid (MMP-d). Selle uuringu eesmärk oli uurida PGE2 EP1 retseptori rolli insuldi neurovaskulaarses kahjustuses. Hüpoteesime, et EP1 farmakoloogiline blokaad või geneetiline kustutamine kaitseb MMP-3 ja MMP-9 taset ja aktiivsust vähendades BBB kahjustuste ja hemorraagilise muundamise eest. Leidsime, et pärast isheemilist ravi EP1 antagonistiga SC-51089 või EP1 geneetilise deletsiooniga vähendatakse ajutise fokaalse ajuisheemia eksperimentaalses mudelis märkimisväärselt BBB häireid ja vähendatakse hemorraagilisi transformatsioone. Neid EP1 inaktiveerimise neurovaskulaarseid kaitsvaid toimeid seostatakse MMP-9 / -3 olulise vähenemisega, perifeersete neutrofiilide infiltratsiooni vähenemisega ja BBB-d moodustavate tihedate ristmike proteiinide (ZO-1 ja okludiini) säilimisega. Meie uuringus leiti, et EP1 signaaliülekandetee on oluline seos neuroinflammatsiooni ja MMP-vahendatud BBB lagunemise vahel isheemilise insuldi korral. EP1-retseptori sihtimine võiks olla uudne lähenemisviis insuldist põhjustatud neurovaskulaarsete kahjustuste laastavate tagajärgede leevendamiseks.

Sissejuhatus

Isheemilist insulti iseloomustab aju varustava arteri oklusioon, mille tagajärjel infarkti tuumas sureb mõne aja jooksul neuron. Infarkti südamikku ümbritseb penumbra - kudede piirkond, mis on vastuvõtlik infarktile, kuid on potentsiaalselt päästetav. Ajukahjustus laieneb infarkti tuumast penumbrasse ja hõlmab arvukalt mehhanisme, sealhulgas iooniline tasakaalustamatus, oksüdatiivne stress, neuroinflammatsioon, immuunrakkude infiltratsioon ja hematoentsefaalbarjääri (BBB) 1, 2 katkemine. BBB koosneb endoteelirakkudest, tihedalt ühendatavatest valkudest (TJP), rakuvälistest maatriksvalkudest, astrotsüütidest, peritsüütidest ja perivaskulaarsest mikrogliast, mis koos moodustavad väga selektiivse barjääri vereringe ja aju vahel. 3.4 .

BBB häire on isheemilise insuldi tõsine tagajärg ja seda vahendavad peamiselt maatriksmetalloproteinaasid (MMP-d) - ensüümide perekond, mis lagundavad TJP-sid ja rakuväline maatriks 5, 6, 7, 8 . Suur hulk prekliinilisi ja kliinilisi tõendeid näitab, et MMP-3 ja MMP-9 on neurovaskulaarsete kahjustuste, vasogeense ödeemi ja isheemilise insuldi hemorraagilise muundamise võtmetegurid 7, 9, 10, 11, 12 . MMP-3 ja MMP-9 farmakoloogiline pärssimine või geneetiline kustutamine on kasulik aju isheemilise kahjustuse loommudelitel 8, 11, 12, 13, 14 . Mitmed uuringud näitavad, et BBB kahjustus aitab märkimisväärselt kaasa närvide progresseeruvale surmale penumbral piirkonnas pärast insuldi 8, 15 . Seetõttu on neurovaskulaarsete kahjustuste eest vastutavate mehhanismide mõistmine hädavajalik efektiivse ravi väljatöötamiseks inimese isheemilise insuldi korral.

Neuroinflammatoorsed protsessid aitavad märkimisväärselt kaasa isheemilise insuldi patofüsioloogiale. Tsüklooksügenaas-2 (COX-2) aktiveeritakse vastusena aju isheemilisele kahjustusele ja katalüüsib lipiidide vahendajate tootmist, millest paljud on põletikuvastased ja kahjustavad isheemilist kudet 16, 17, 18, 19 . COX-2 pärssimine vähendab BBB läbilaskvust ja MMP aktiivsust isheemilise insuldi ja neuroinflammatsiooni loommudelitel 20, 21 . Prostaglandiin E 2 (PGE 2 ) on suurenenud COX-2 aktiivsuse peamine produkt põletikuliste seisundite ja ajuisheemia ajal 18, 20 . COX-2-st tuletatud PGE2 akumulatsioon aju isheemias on paralleelne BBB lagunemise ja neutrofiilide infiltratsiooni olulise suurenemisega 20 . In vivo on tõendeid selle kohta, et PGE2 intratserebraalne süstimine põhjustab BBB läbilaskvuse olulist suurenemist 22 .

PGE 2 avaldab oma toimet nelja E prostanoid (EP) retseptori kaudu, mida nimetatakse EP1-ks läbi EP4 23 . EP1-retseptori aktiveerimine on oluline mehhanism, mis on seotud COX-2-st tuletatud PGE2 kahjulike mõjudega eksperimentaalses isheemilises insuldis 24, 25, 26, 27 . Viimase kümnendi jooksul on arvukad uuringud näidanud, et EP1 retseptori farmakoloogiline pärssimine või geneetiline inaktiveerimine tagab neuroprotektsiooni, seda nii isheemilise kahjustuse in vitro kui ka in vivo mudelis, tasakaalustades eksitotoksilisust 24, 26, 27 ja apoptootilist signaali 28, 29, 30 . Kuid praktiliselt ei teata EP1 rolli neuroinflammatoorsete sündmuste korral, mis põhjustavad insuldi BBB kahjustusi. Hüpoteesime, et EP1 farmakoloogiline pärssimine või geneetiline kustutamine kaitseb MMP-9 / -3 taset ja aktiivsust vähendades BBB kahjustuste ja hemorraagilise muundamise eest. Kasutades keskmise ajuarteri oklusiooni (MCAO) isheemilise insuldi mudelit, testisime EP1 farmakoloogilise blokaadi või EP1 geneetilise deletsiooni mõju isheemiajärgsele neurovaskulaarsele kahjustusele. Leidsime, et postisheemilise raviga EP1 retseptori antagonistiga SC-51089 või EP1 geneetiline deletsioon põhjustab BBB lagunemise olulist vähenemist ja hemorraagilise transformatsiooni vähenemist pärast ajutist fokaalset ajuisheemiat. Neid EP1 inaktiveerimise BBB kaitsvaid toimeid seostatakse MMP-9 / -3 olulise vähenemisega, perifeersete neutrofiilide infiltratsiooni vähenemisega ja neurovaskulaarset ühikut moodustavate tihedate ristmike valkude säilimisega. Meie uuringus leiti, et EP1 signaaliülekandetee on oluline seos neuroinflammatsiooni ja MMP-vahendatud BBB lagunemise vahel isheemilise insuldi korral. EP1-retseptori sihtimine võiks olla uudne lähenemisviis insuldist põhjustatud neurovaskulaarsete kahjustuste laastavate tagajärgede leevendamiseks.

Tulemused

EP1 on ülesreguleeritud pärast isheemilist insulti, mida ekspresseeritakse neuronites ja endoteelirakkudes

Pole teada, kas EP1 retseptori vastus isheemiale on diferentsiaalselt reguleeritud. EP1 ekspressiooni suurenemine pärast isheemiat võib tugevdada retseptori kahjulikku mõju, mis on seotud insuldi neuroinflammatoorse vastusega. Konstrueeriti isheemilise kahjustuse ajaline kulg, mis koosnes fiktiivselt opereeritud ja isheemilistest rottidest, kes tapeti 4, 14, 24 ja 48 tundi pärast MCAO-d. EP1 mRNA ekspressioon suurenes ipsilateraalses peaajukoores 4 tunni (P <0, 01) ja 48 tunni (P <0, 001) järel isheemia järgselt, võrreldes ekspressioonitasemetega võltsrühma ipsilateraalses ajukoores (joonis 1A). Järgmisena otsisime hinnangut, kas EP1 mRNA ekspressiooni suurenemisele järgneb suurenenud EP1 valgu tase. Immunoblotanalüüsid näitasid EP1 valgu taseme märkimisväärset tõusu 14 tunni jooksul pärast isheemiat ipsilateraalses ajukoores, võrreldes valerühmaga (P <0, 05, joonis 1B, C).

Image

EP1 mRNA ekspressioon isheemises ajukoores ja EP1 valgu tase isheemilises ja kontralateraalses poolkeras mõõdeti näiliselt opereeritavalt ning 4, 14, 24 ja 48 tundi pärast oklusiooni algust. ( A ) EP1 mRNA suureneb 4 tunni jooksul (P <0, 01, ühesuunaline ANOVA) ja 48 tunni pärast pärast oklusiooni (P <0, 001, ühesuunaline ANOVA) võrreldes platseeboga. ( B ) EP1 valgu tase on isheemilises ajukoores kõrgem 14 tundi pärast oklusiooni võrreldes platseeboga (P <0, 05, kahepoolne paarimata t-test). ( C ) EP1 ekspressiooni representatiivne immunoblot ajukoores aja jooksul vastuseks isheemiale. Sham, N = 5; 4 h, N = 5; 14 h, N = 6; 24 tundi, N = 8; 48 h, N = 7. CXi = ajukoore löögi suhtes kahepoolne külg; CXc = ajukoorega vastupidine ajukoores.

Täissuuruses pilt

Varasemad aruanded EP1 rolli kohta isheemias on keskendunud peamiselt neuronaalsele EP1 signaliseerimisele. Täiendavad rakutüübid võivad pärast isheemilise insuldi tekitada EP1 signaaliülekannet. EP1 ekspresseerivate rakutüüpide määramiseks viisime läbi neuronite, endoteelirakkude, astrotsüütide ja mikroglia spetsiifiliste rakumarkeritega kahekordse immunofluorestsentsi värvimise. Teeslatusega opereeritud rottidel leiti EP1 neuronites ja endoteelirakkudes (joonis 2A, B). EP1 värvumist ei täheldatud mikroglia ega astrotsüütide korral (joonis 2C, D). Sarnane EP1 rakuline lokalisatsioon leiti roti isheemilises ajus 24. ja 48. tunnil pärast mööduvat fokaalset isheemilist insuldi (andmeid pole näidatud).

Image

Vaba ujuvusega topeltimmunohistokeemia viidi läbi EP1-vastaste antikehade ja neuronite (NeuN), endoteelirakkude (RECA-1), astrotsüütide (GFAP) ja mikroglia (CD11b) rakumarkerite näilikuga opereeritud rottidel. Kõik pildid tehti ajukoorest. ( A ) NeuN (punane) ja EP1 (roheline) topeltmärgistamine näitab nii tuuma (kollane nool) kui ka tuumavälist värvumist (valge nool), mis viitab sellele, et EP1 valk võib ekspresseerida membraanidel ja tuumaümbrises neuronites. ( B ) RECA-1 (punane) ja EP1 (roheline) topeltmärgistamine näitab, et EP1 ekspresseeritakse endoteelirakkudes. ( C ) CD11b (punane) ja EP1 (roheline) topeltmärgistamine näitab nähtavat värvumist neuronitel, kuid mitte mikroglial. ( D ) GFAP (punane) ja EP1 (roheline) topeltmärgistamine näitab EP1 nähtavat värvumist neuronitel, kuid mitte astrotsüütilisi protsesse.

Täissuuruses pilt

Hiline ravi EP-1 antagonistiga SC-51089 vähendab kortikaalse infarkti mahtu

On tõendeid, et SC-51089 vähendab hiire insuldimudelites infarkti suurust, kui seda antakse pärast MCAO 24, 31 algust. SC-51089 võimet vähendada infarkti mahtu roti intraluminaalse insuldi mudelis ei ole siiski varem uuritud. Seetõttu määrati infarkti maht ajukoores ja juttkehas pärast 48-tunnist reperfusiooni rottidel, kellele manustati SC-51089, või vehiikulit, alustades 4, 5 tundi pärast insuldi algust, mis on kliiniliselt oluline viivitatud ravigraafik. Mõlema rühma esindavad koronaalsed lõigud on näidatud joonisel 3A. SC-51089 manustamine vähendas kogu infarkti mahtu 37% (joonis 3B, P <0, 01). Infarkti mahu vähenemine toimus ajukoores; Ravi SC-51089 vähendas kortikaalse infarkti mahtu 52% (joonis 3C, P <0, 01) ja muutusi striaatiaalse infarkti mahus ei täheldatud (joonis 3C, P = 0, 43). Uurisime ka infarkti mahtu 2-millimeetrise viilu kohta, viil 1 oli kõige rostraalsem. Kortikaalse infarkti suuruse vähenemist täheldati SC-51089-ga töödeldud rühmas viilude 3–6 korral (vastavalt P <0, 01, P <0, 05, P <0, 001, P <0, 05, joonis 3D). SCIA 51089-ga ravitud rühmas vähenes 5. lõigul infarkti striaatiline maht ( P <0, 05, joonis 3E). Need andmed näitavad, et EP1 blokeerimine SC-51089-ga pärast isheemilist insuldi kaitseb äärepoolsemat ajukoort, mitte striatumit.

Image

Rottidele tehti 90 minutit ajuarteri keskmist oklusiooni ja nad 48 tunni pärast reperfusiooni lõpetati. Infarkti maht määrati 2, 3, 5-trifenüül-2H-tetrasooliumkloriidi värvimisega nii ajukoores kui ka striaatumis. ( A ) Kandja- ja SC-51089-ga töödeldud rottide koronaalsed lõigud, mis vastavad lõikudele 1, 2, 3, 5 ja 6. Lõigu 4 maht määratakse kindlaks kolmanda lõigu pööramisega. Esitatakse rotid, kelle kortikaalse infarkti maht on rühma keskmisele kõige lähemal. ( B ) SC-51089 manustamine vähendab kogu infarkti mahtu rottidel (148, 3 ± 13, 2 mm 3 ) võrreldes vehiikliga (244, 5 ± 25, 4 mm 3, P <0, 01, kahepoolsed paarimata t-testid). ( C ) Ajukoore ja striaatiaalse koe analüüs näitab eraldi peaaegu identseid striataalseid infarktikoguseid SC-51089-ga töödeldud (73, 9 ± 12, 3 mm 3 ) ja vehiikuliga töödeldud (85, 9 ± 7, 9) rottide (P = 0, 43, kahepoolsed paaritamata t-) vahel. test). Kortikaalse infarkti maht vähenes dramaatiliselt SC-51089-ga töödeldud (83, 07 ± 7, 721 mm 3 ) võrreldes vehiikliga (154, 0 ± 18, 06 mm 3 ). ( D ) Kortikaalse infarkti mahu analüüs 2-millimeetrise viilu kohta näitab, et kortikaalse infarkti mahu vähenemine on näha kogu ajukoores (P> 0, 05, P> 0, 05, P <0, 01, P <0, 05, P <0, 001, P <0, 05, kaks) -tee ANOVA koos Bonferroni järeltestidega). ( E ) Struumaalse infarkti mahu analüüs 2 mm lõigu kohta näitab, et infarkti mahud on rühmade vahel peaaegu identsed (P> 0, 05, P> 0, 05, P> 0, 05, P> 0, 05, P 0, 05, kahesuunaline ANOVA koos Bonferroni-järgse testid). Sõiduk N = 10, SC-51089 N = 11.

Täissuuruses pilt

Selles MCAO mudelis kahjustatakse striatumit eksitotoksilisuse ja oksüdatiivse stressi mõjul ning striataalset infarkti südamikku ümbritsev ajukoore surub sekundaarsete mehhanismide, sealhulgas BBB häirete ja neuroinflammatsiooni tõttu aja jooksul rakusurma. Kuna juttkehas infarkti mahu muutust ei täheldatud ja oleme huvitatud ajukoore kaitsmisest sekundaarsete kahjustuste eest, viisime ülejäänud katsed läbi kortikaalse koeproovi abil.

SC-51089 post-isheemiline manustamine vähendab insuldist põhjustatud BBB häireid rottidel

BBB häirimine põhjustab vere komponentide kontrollimatut sissevoolu ajusse, põhjustades vedeliku ödeemi ja neurotoksiliste ainete kuhjumist, mis soodustavad vigastuse progresseerumist pärast isheemilist insuldi. BBB läbilaskvuse taseme kvantifitseerimiseks 48 tunni möödudes insuldist mõõdeti immunoglobuliini G (IgG) taset SC-51089- ja kanduriga töödeldud rottide ipsilateraalses ja kontralateraalses korteksis. Nii SC-51089 kui ka vehiikligrupis olid IgG kontsentratsioonid ajukoores insuldi suhtes kahepoolselt (CXi) kõrgenenud, võrreldes kontralateraalse poolkeraga (CXc) (täiendav joonis 1A, P <0, 0001) ja IgG tase oli isheemilises seisundis oluliselt vähenenud SC-51089-ga töödeldud rottide poolkera võrreldes kandjaga (täiendav joonis 1A, P <0, 001). Lahustuvate plasmavalkude kasutamine BBB läbilaskvuse markerina eeldab, et valkude tase on loomade vahel püsiv; selle kinnitamiseks kvantifitseeriti IgG tase plasmas. Ravitud rottide plasmas ei täheldatud vehiikuliga IgG taseme muutusi (täiendav joonis 1B, P = 0, 31). Ajukoore IgG tase jagati vastava looma plasma IgG kontsentratsiooniga, et saada BBB läbilaskvuse korrigeeritud mõõt; Raviga SC-51089 säilitati pärast korrektsiooni madalamat IgG taset isheemises ajukoores (joonis 4A, P <0, 05). Lõpuks, et teha kindlaks, kas IgG vähendamine ajukoores oli proportsionaalselt vähendatud insuldimahu funktsioon või kas IgG vähenemine tasemed olid SC-51089-ga ravimise tagajärg, jagasime kortikaalse IgG taset plasma IgG kontsentratsiooni ja vastava infarkti mahu järgi. Normaliseeritud IgG tase vähenes SC-51089-ga ravitud rottidel võrreldes vehiikligrupiga, mis näitab, et aju IgG taseme langus on ravi tulemus (joonis 4B, P <0, 05).

Image

Immunoglobuliini G ja hemoglobiini tase on terves ajus äärmiselt madal, seetõttu kasutati neid vastavalt vere-aju barjääri läbilaskvuse ja hemorraagilise muundamise näitajatena. ( A ) IgG kontsentratsioonid ajukoores jagati plasmakontsentratsioonidega, et saada vere-aju barjääri läbilaskvuse korrigeeritud mõõt. Parandatud IgG tase on SC-51089-ga ravitud rottide isheemises ajukoores vähenenud võrreldes vehiikliga (P <0, 05). ( B ) Kortikaalse IgG kontsentratsioon jagati plasmakontsentratsiooniga ja molekulaarseteks analüüsideks kasutatud lõigu infarkti ruumala annab ligikaudse IgG mõõtme infarktiga kuupmahu kohta. Infusiooniga koe IgG / ühik ühikus on SC-51089-ga ravitud loomadel vehiikuliga võrreldes väiksem (P <0, 01, paarimata kahepoolne t-test). ( C ) Keskmine hemoglobiinisisaldus oli SC-51089-ga ravitud rottidel (1, 90 ± 0, 39 ng / μg) märkimisväärselt langenud, võrreldes kandjaga ravitud rühmaga (3, 20 ± 0, 36 ng / μg) (P = 0, 0243, kahepoolsed paaritamata t- test). Kandja N = 10, SC-51089 N = 11. CXi = ajukoore löögi suhtes kahepoolne külg; CXc = ajukoorega vastupidine ajukoores.

Täissuuruses pilt

Hemorraagiline transformatsioon toimub isheemilise insuldi tagajärjel kahjustatud BBB terviklikkuse tõttu, võimaldades vere reguleerimata aju sissevoolu 32 . Hemoglobiini (Hb) tasemed kvantifitseeriti, kasutades ELISA-d SC-51089 ja vehiikuliga töödeldud rottide ajukoores, et mõõta hemorraagilise transformatsiooni astet. Ipsilateraalne Hb sisaldus suurenes dramaatiliselt mõlemas ravirühmas vastuseks 90 min MCAO ja 48 h reperfusioonile (joonis 4C, P <0, 01). SC-51089 manustamine vähendas märkimisväärselt hemoglobiini taset isheemises ajukoores võrreldes kandjaga ravitud rühmaga (joonis 4C, P <0, 05). Kokkuvõttes viitavad need andmed sellele, et EP1 farmakoloogiline blokaad vähendab isheemilise insuldi järgset BBB läbilaskvuse ja hemorraagilise transformatsiooni astet.

SC-51089 vähendab MMP-9 ja MMP-3 valkude taset ja aktiivsust rottidel

MMP-9 ja MMP-3 on kaks MMP-d, mis on seotud isheemilise insuldi ägedate vigastustega. MMP-3 lõhustab pro-MMP-9 inhibeerivat domeeni ja mõlemad aktiivsed proteaasid lagundavad BBB-d ja rakuvälist maatriksit. MMP-9 / -3 valgu taset isheemilises ajus mõõdeti immunoblotanalüüsiga (joonis 5A, B). Nagu arvata võis, olid MMP-9 ja MMP-3 tasemed isheemilises ajukoores kõrgendatud võrreldes vehiikuliga ravitud rottide kontralateraalse poolkeraga (joonis 5C, D, P <0, 001) ja mõlemas SC-51089 kontralateraalses ajukoores peaaegu tuvastamatud. ja sõidukirühmad. SC-51089 manustamine vähendas nii MMP-9 (joonis 5C, P <0, 01) kui ka MMP-3 (joonis 5D, P <0, 001) taset ipsilateraalses ajukoores võrreldes vehiikligrupiga. Endogeenselt aktiivsete MMP tasemete mõõtmiseks kasutati fluoromeetrilise immuunkatsetuse testi, et kvantifitseerida MMP-9 ja MMP-3 aktiivsust vehiikuliga ja SC-51089 töödeldud rottide ajukoores. SC-51089 manustamine vähendas oluliselt vehiikliga võrreldes nii MMP-9 (joonis 5E, P <0, 0001) kui ka MMP-3 (joonis 5F, P <0, 05) aktiivsust isheemises ajukoores.

Image

Maatriksi metalloproteinaas-9 ja -3 valkude tase ja ensümaatiline aktiivsus määrati SC-51089- ja kanduriga töödeldud rottide kooretes. ( A ) MMP-9 tüüpiline immunoblot ajukoores. ( B ) Tüüpiline immunoblot MMP-3 jaoks vehiikuliga ja SC-51089-ga töödeldud rühmade ajukoores. ( C ) Densitomeetriline analüüs näitab MMP-9 taseme tõusu mõlema rühma isheemilises poolkeras (P <0, 001, P <0, 01, paarimata kahepoolne t-test), võrreldes kontralateraalse poolkeraga. MMP-9 tasemed olid SC-51089-ga töödeldud rottide isheemilises ajukoores vähenenud võrreldes vehiikligrupiga (P <0, 01, paarimata kahepoolne t-test). ( D ) Densitomeetriline analüüs näitab MMP-3 taseme tõusu vehiiklitega ravitud rottide isheemilises ajukoores (P <0, 001), kuid mitte SC-51089-ga ravitud rottidel (P = 0, 20). Vähendatud MMP-3 taset mõõdeti SC-51089-ga töödeldud rottide isheemises ajukoores võrreldes kandurigrupiga (P <0, 001, paarimata kahepoolne t-test). ( E ) FRET peptiidi aktiivsuse test näitab suurenenud MMP-9 aktiivsust isheemises ajukoores, võrreldes kontralateraalse poolkeraga, nii SC-51089- kui ka kandjaga töödeldud rühmades (P <0, 001, P <0, 05). Vähendatud MMP-9 aktiivsust mõõdeti SC-51089-ga ravitud rottide isheemises ajukoores võrreldes kandurigrupiga (P <0, 0001, paarimata kahepoolne t-test). ( F ) FRET peptiidi aktiivsuse test näitab suurenenud MMP-3 aktiivsust isheemises ajukoores, võrreldes mõlema rühma kontralateraalse poolkeraga (P <0, 05). Vähendatud MMP-3 aktiivsust mõõdeti SC-51089-ga töödeldud rottide isheemises ajukoores võrreldes kandurigrupiga (P <0, 05, paarimata kahepoolne t-test). Sõiduk N = 10, SC-51089 N = 11. CXi = ajukoore löögi suhtes kahepoolne külg, CXc = ajukoorega vastassuunaline ajukoores, RFU = suhteline fluorestsentsühik.

Täissuuruses pilt

SC-51089 vähendab neutrofiilide infiltratsiooni rottidel

Neutrofiilid on perifeersed immuunrakud, mis värvatakse vigastuse kohale ja sekreteerivad MMP-sid, kui nad migreeruvad endoteelirakkude vahel, et imbuda koesse. Isheemilise insuldi 33 korral on MMP-9 peamiseks allikaks neutrofiilid. Müeloperoksidaasi (MPO) taset kasutati neutrofiilide infiltratsiooni aju parenhüümi indikaatorina (joonis 6A). MPO tase on kahepoolses ajukoores dramaatiliselt suurenenud, võrreldes vehiikuliga töödeldud rottide kontralateraalse ajukoorega (joonis 6B, P <0, 001) ja ravi SC-51089 vähendas isheemilise koore MPO taset võrreldes vehiikliga (joonis 6B, P <0, 05). Vähenenud neutrofiilide infiltratsioon võib olla tingitud neutrofiilide vähenenud võimeest migratsiooni algatada. Rakkudevaheline adhesioonimolekul (ICAM-1) on üks endoteelirakkude poolt ekspresseeritavatest adhesioonimolekulidest, mis võimaldab neutrofiilidel kinnituda endoteelirakkude seina luminaalpinnale ja algatada migratsiooni. ICAM-1 taset mõõdeti immunoblotanalüüsiga (joonis 6C). Võrreldes kontralateraalse poolkeraga täheldati nii SC-51089- kui ka kandjaga töödeldud rühmade isheemiliste poolkerade puhul dramaatiliselt suurenenud ICAM-1 taset (joonis 6D, P <0, 0001). SC-51089-ga töödeldud rottidel olid vehiikuliga võrreldes madalamad ICAM-1 tasemed, kuigi erinevus rühmade vahel ei olnud statistiliselt oluline (joonis 6D, P = 0, 16). Need andmed kokku viitavad sellele, et ravi SC-51089 võib vähendada neutrofiilide infiltratsiooni isheemilisse ajukooresse, millega paralleelselt vähenevad MMP-9 / -3 tasemed ja BBB häired.

Image

Müeloperoksüdaasi taset mõõdeti kui isheemilise koore neutrofiilide infiltratsiooni indikaatorit. Mõõdeti ka ICAM-1 taset, kuna neutrofiilid kasutavad endoteeli kleepumiseks ICAM-1. ( A ) MPO tüüpiline immunoblot mõlema rühma ajukoores. ( B ) MPO tase on isheemilises poolkeras suurenenud võrreldes kahepoolse poolkeraga mõlemas rühmas (P <0, 001). SC-51089-ga töödeldud rottidel ilmnes isheemilises ajukoores märkimisväärselt väiksem MPO-valgu tase võrreldes vehiikliga töödeldud rühmaga (P <0, 05, paarimata kahepoolne t-test). ( C ) ICAM-1 tüüpiline immunoblot mõlema rühma ajukoores. ( D ) ICAM-1 tase on isheemilises poolkeras märkimisväärselt suurenenud, võrreldes mõlema rühma kontralateraalse poolkeraga (P <0, 001). ICAM-1 tase vähenes SC-51089-ga töödeldud rottide isheemilise koore vähenemise suhtes vehiikuliga (P = 0, 16). Kandja N = 10, SC-51089 N = 11 CXi = ajukoore löögi kahepoolne külg, CXc = ajukoorega vastupidine ajukoores.

Täissuuruses pilt

SC-51089 kaitseb TJP-sid insuldist põhjustatud lagunemise eest

Mõõtsime oklubiini ja ZO-1 - kahe proteiini, mis on BBB komponendid ja MMP-de substraadid - valgu taset. Occludin on transmembraanne valk, mis seob külgnevad endoteelirakud ja aitab kaasa raku 4 raku tõkestamisele. ZO-1 mängib rolli tihedate ristmike korralduses ja reguleerimises, interakteerudes N-terminaalses otsas oleva okludiiniga ja C-terminaalses otsas oleva aktiini tsütoskeletiga; need TJP-d lagunevad fokaalse isheemia korral 9, 12, 35 . Okkludiini ja ZO-1 taset mõõdeti selleks, et selgitada välja, kas SC-51089 vähendab nende TJP-de lagunemist vastuseks isheemiale. Tuvastasime immunoblotanalüüsi teel kaks oklüdiini monomeeri (50 ja 65 kDa) ja ühe dimeerse vormi (125 kDa) (joonis 7A). 50 kDa okludiini riba on kas struktuurimonomeer või lagunemissaadus 36 ; 50 kDa okludiini riba ribades rühmade vahel erinevusi ei olnud (joonis 7D, P = 0, 43). 65 kDa okludiini riba on tõenäoliselt fosforüülitud vorm, mis tekib vastusena vigastusele, kuna see on kontralateraalses ajukoores tuvastamatu ja isheemilises ajukoores ülesreguleeritav ning leidub suurema molekulmassiga; see riba oli SC-51089-ga töödeldud loomadel vehiikliga võrreldes vähenenud (joonis 7B, P <0, 05). Oksludiini isovorm 125 kDa on tõenäoliselt struktuurne dimeer, mida hoitakse koos redutseerumatute disulfiidsildadega 36 ; see riba oli lagunemise eest kaitstud SC-51089-ga töödeldud rottidel, võrreldes kandjaga (joonis 7C, P <0, 01). Mõlemas ravirühmas vähenesid ZO-1 tase ipsilateraalses ajukoores märkimisväärselt, võrreldes kontralateraalse ajukoorega (joonis 7E). Võrreldes kandekeskkonnaga oli ZO-1 kaitstud lagunemise eest SC-51089-ga töödeldud rottidel (joonis 7F, P <0, 05). Kokkuvõttes viitavad need andmed sellele, et töötlemine SC-51089 vähendab BBB häirimist, säilitades okludiini ja ZO-1 taset ning vähendades tõenäoliselt okludiini fosforüülimist.

Image

( A ) Isheemilistes proovides täheldati okludiini riba umbes 65 kDa juures, kuid mitte kahjustamata kontralateraalsetes proovides (arvatavasti toodetud vastusena vigastusele). ( B ) 65 kDa isovormi densitomeetriline analüüs näitab mõlema rühma isheemilise poolkera suurenenud taset võrreldes kontralateraalse poolkeraga (P <0, 001, P <0, 05, paarimata kahepoolsed t-testid). Selle valgu vähendatud taset mõõdeti SC-51089-ga ravitud rottide isheemises ajukoores võrreldes kandurigrupiga (P <0, 05, paarimata kahepoolne t-test). ( C ) Vigastamata kontralateraalses korteksis täheldati suurtes kogustes oklludiini riba umbes 125 kDa juures ja see vähenes isheemilistes proovides. 125 kDa isovormi densitomeetrilised analüüsitasemed näitavad mõlema rühma isheemilise poolkera vähenenud taset võrreldes kontralateraalsusega (P <0, 001, P <0, 05, paarimata kahepoolsed t-testid) ja säilinud tasemed SC-51089 isheemilises ajukoores. töödeldud rotte võrreldes vehiikligrupiga (P <0, 01, paarimata kahepoolne t-test). ( D ) 50 kDa oklüdiini riba densitomeetriline analüüs ei näidanud rühmade vahel erinevusi. ( E ) 220–225 kDa juures tuvastati kaks ZO-1 riba, mis lagunesid isheemilistes proovides. ( F ) ZO-1 laguneb isheemilises poolkeras võrreldes vehiikuliga töödeldud rottide kontralateraalse poolkeraga (P <0, 01, paarimata kahepoolne t-test). SC-51089-ga säilitati isheemilises ajukoores ZO-1 tase võrreldes kandjaga (P <0, 05, paaritamata kahepoolne t-test) ning erinevused isheemilise ja kontralateraalse poolkera ekspressiooni vahel ei erine oluliselt SC-51089-ga ravitud rottidel ( P = 0, 29, paarimata kahepoolne t-test). Paneelil E ilmub aktiin valgu elektroforeesi ajal mitteredutseerivate tingimuste tõttu kahekordse ribana. Kandja N = 10, SC-51089 N = 11. CXi = ajukoore löögi suhtes kahepoolne külg, CXc = ajukoorega vastupidine ajukoores.

Täissuuruses pilt

EP1 löögi mõju infarkti suurusele, hematoentsefaalbarjääri läbilaskvusele ja hemorraagilisele transformatsioonile

Oleme näidanud, et EP1 farmakoloogiline blokaad koos SC-51089-ga vähendab roti insuldimudelis infarkti mahtu ja vere-aju barjääri katkemist. Et kinnitada, et meie tulemused ei olnud tingitud SC-51089 manustamise sihtmärgivälistest mõjudest, kasutati EP1 - / - hiirtel EP1 kahjuliku rolli edasiseks kontrollimiseks insuldist põhjustatud BBB kahjustuses. EP1 - / - hiirtele tehti 60 minutit MCAO-d ja nad surmati 24 tundi pärast reperfusiooni, sarnaselt nagu enne 26 . See tulemusnäitaja valiti, kuna eelnevad uuringud on näidanud suurenenud MMP tootmist ja dramaatilist BBB lagunemist hiire ajus 24-tunnise reperfusiooni järel pärast mööduvat MCAO 12, 33 . Keskmine infarkti maht vähenes EP1 - / - hiirtel võrreldes WT rühmaga 17%, ehkki erinevused rühmade vahel polnud statistiliselt olulised (joonis 8, P = 0, 26).

Image

Hiirtele tehti 60 minuti pikkune MCAO oklusioon ja 24 tunni pärast oklusioon surmati. Infarkti maht määrati 2, 3, 5-trifenüül-2H-tetrasooliumkloriidi värvimisega. Infarkti maht on EP1 - / - hiirtel (23, 88 ± 4, 008 mm 3 ) võrreldes metsiktüübiga (28, 91 ± 1, 428 mm 3 ) vähenenud, ehkki erinevused pole statistiliselt olulised (P = 0, 26, paarimata kahepoolne t-test). WT, N = 8; EP1 - / -, N = 8. WT = metsikut tüüpi, EP1 - / - = EP1 väljalülitamine.

Täissuuruses pilt

IgG taset mõõdeti EP1 - / - ja WT hiirte ajukoores kui BBB läbilaskvuse näitajaid. Ajukoore IgG tase jagati iga looma vastava plasma IgG kontsentratsiooniga; IgG tase ipsilateraalses poolkeras oli isheemilises EP1 - / - hiires vähenenud võrreldes isheemilise WT-ga (joonis 9A, P <0, 01). IgG kontsentratsiooni langus EP1 - / - hiirtes püsis pärast normaliseerumist infarkti mahu järgi (joonis 9B, P <0, 01). Vaatasime ebatavaliselt kõrget IgG taset EP1 - / - näiliselt opereeritud rühma mõlemal poolkeral ja EP1 - / - MCAO rühma kontralateraalsel poolkeral (täiendav joonis 2A). IgG tasemete analüüs šampoonide ja MCAO rühmade plasmas näitas genotüübi olulist interaktsiooni (moodustades ~ 37% koguvariatsioonist, täiendav joonis 2B, P <0, 001), kuid mitte insuldi (moodustades ~ 3% kogu dispersioonist), P = 0, 90), arvestades mõlemas EP1 - / - rühmas täheldatud IgG plasmakontsentratsiooni suurenemist. Täiendavas kontrollkatses mõõtsime IgG taset plasmas ja ajukoores nii naiivsete EP1 - / - kui ka WT hiirtel. Leidsime EP1 - / - võrreldes väga olulise tõusu nii plasma kui ka kortikaalse IgG tasemes võrreldes WT hiirtega. Plasma IgG tase naiivsetel WT loomadel oli 197, 3 ± 15, 1 μg / ml ja väärtused EP1 - / - hiirtel olid 1988, 4 ± 423, 3 μg / ml ( P = 0, 0029, kahepoolne paarimata t-test, n = 5 genotüübi kohta; keskmine ±) SEM). Ajukoore IgG taseme statistiliselt oluline tõus leiti ka naiivse EP1 - / - korral võrreldes WT-ga. Ipsilateraalsed IgG tasemed WT hiirte ajukoores olid 4, 38 ± 0, 14 pg / μg valku versus 13, 15 ± 1, 14 pg / μg valku EP1 - / - hiirtel ( P <0, 0001, kahepoolne paarimata t-test, n = 5 genotüübi kohta) ; keskmine ± SEM). Kuna EP1 väljalülitamine suurendas algtasemel IgG taset plasmas, kasutasime ajus albumiini taset täiendava markerina BBB läbilaskvusest pärast insulti. EP1 - / - hiirtel on võrreldes WT-ga dramaatiliselt vähenenud albumiini tase isheemises ajukoores (täiendav joonis 2C, P <0, 001) - efekt püsib ka pärast infarkti mahu normaliseerumist (täiendav joonis 2D, P <0, 01). Võrreldes WT hiirtega ei leitud EP1 - / - plasmas albumiini taseme muutusi (täiendav joonis 2E).

Image

Ajukoore IgG taset mõõdeti näiliselt opereeritud ja isheemilistel loomadel WT ja EP1 - / - rühmades ning normaliseeriti plasma IgG taseme ja infarkti mahu järgi. ( A ) Kortikaalse IgG tase jagati IgG kontsentratsioonidega plasmas, et saada BBB läbilaskvuse korrigeeritud mõõt. IgG läbilaskvus on madal mõlemas näiliselt opereeritud rühmas. IgG läbilaskvus on WT MCAO-rühma isheemilises poolkeras oluliselt suurenenud, võrreldes kontralateraalse poolkeraga (P <0, 01, paarimata kahe sabaga t-test). Ig1 permeaablus on EP1 - / - MCAO hiirte isheemilises poolkeras oluliselt vähenenud võrreldes WT-ga (P <0, 01, paarimata kahepoolne t-test). EP1 - / - MCAO hiirtel isheemiliste ja kontralateraalsete poolkerade vahel olulisi erinevusi ei ole (P = 0, 10, paarimata kahepoolne t-test). ( B ) Plasma ja infarkti suurusega normaliseeritud kortikaalse IgG tase näitab EP1 - / - hiirte dramaatilist vähenemist võrreldes WT kontrollidega (P <0, 01, paarimata kahepoolne t-test). ( C ) Hemoglobiini taset mõõdeti hemorraagilise transformatsiooni astmena. Hemoglobiini tase on madal mõlemas näiliselt opereeritud rühmas ja isheemilises poolkeras on WT MCAO hiirte kontralateraalse poolkeraga võrreldes märkimisväärselt kõrge (P <0, 05, paarimata kahesaba t-test). EP1 - / - MCAO hiirte isheemilises poolkeras vähenesid hemoglobiinisisaldused võrreldes metsiktüübiga (P <0, 01, paarimata kahepoolne t-test). EP1 - / - MCAO hiirte isheemiliste ja kontralateraalsete poolkerade vahel olulisi erinevusi ei mõõdetud (P = 0, 90, paarimata kahepoolne t-test). WT Sham, N = 3; EP1 - / - Sham, N = 3; WT MCAO, N = 8, EP1 - / - MCAO, N = 8. WT = metsikut tüüpi; EP1 - / - = EP1 väljalõige, MCAO = peaajuarteri keskmise oklusioon.

Täissuuruses pilt

Et teha kindlaks, kas EP1 geeni deletsioon vähendab hemorraagilist transformatsiooni, kvantifitseeriti hemoglobiini tase WT ja EP1 - / - hiirte kooretes nii näivas kui ka isheemilises rühmas. Hemoglobiini tase langes EP1 - / - hiirte isheemises ajukoores võrreldes WT-ga (joonis 9C, P <0, 01), mis näitab vähenenud hemorraagilist transformatsiooni.

MMP-9 ja MMP-3 aktiivsus on EP1 - / - hiirtel vähenenud

MMP-9 tasemed hiire korteksides määrati immunoblotanalüüsiga (joonis 10A). MMP-9 tasemed olid mõlema rühma isheemilises poolkeras kõrgenenud võrreldes kontralateraalse poolkeraga ja EP1 - / - hiirte ipsilateraalses ajukoores langesid dramaatiliselt võrreldes WT-ga (joonis 10B, P <0, 05). Prooviti MMP-3 immunoblotanalüüsi, kuid elujõulist signaali ei õnnestunud saada. Endogeenset MMP-9 / -3 aktiivsust kvantifitseeriti fluoromeetrilise immuunkatsetuse testiga EP1 - / - ja WT hiirte kooretes. Nii MMP-9 ( P <0, 01) kui ka MMP-3 ( P <0, 05) aktiivsuse vähenemist täheldati EP1 - / - hiirte ipsilateraalsetes korteksites võrreldes WT-ga (joonis 10C, D).

Image

MMP-9 / -3 valgu taset mõõdeti immunoblotanalüüsiga ja ensümaatiline aktiivsus kvantifitseeriti, et teha kindlaks, kas EP1 - / - hiirte vähenemine on kooskõlas roti andmetega. ( A ) MMP-9 representatiivne immunoblot hiire ajukoores. ( B ) Densitomeetriline analüüs näitab, et MMP-9 on mõlema rühma isheemilises poolkeras kõrgendatud, võrreldes kontralateraalse poolkeraga (P <0, 05, P <0, 01 paarimata kahepoolses t-testis). EP1 - / - hiired on dramaatiliselt vähendanud MMP-9 valgu taset isheemises ajukoores võrreldes metsiktüübiga (P <0, 05, paarimata kahepoolne t-test). ( C ) MMP-9 aktiivsuse mõõtmiseks hiire ajukoores kasutati FRET-peptiidi immuuntesti. MMP-9 aktiivsus suurenes WT-rühma isheemilises ajukoores võrreldes kontralateraalse poolkeraga (P <0, 05, paarimata kahepoolne t-test), kuid mitte EP1 - / - rühmas (P = 0, 26, paarimata-kaks) sabaga t-test). MMP-9 aktiivsus vähenes EP1 - / - hiirte isheemises ajukoores metsiktüübiga võrreldes (P <0, 01, paarimata kahepoolne t-test). ( D ) MMP-3 ensümaatilist aktiivsust mõõdeti FRET-peptiidi immuunkatsetuse testi abil. MMP-3 aktiivsus suurenes isheemises ajukoores, võrreldes mõlema rühma kontralateraalse poolkeraga (P <0, 01, P <0, 05, paarimata kahepoolsed t-testid). MMP-3 aktiivsus vähenes EP1 - / - hiirte isheemises ajukoores metsiktüübiga võrreldes (P <0, 05, paarimata kahepoolne t-test). WT, N = 8; EP1 - / -, N = 8. CXi = ajukoore ajupoolne külg ajurabandusele, CXc = ajukoore ajurabanduse vastaskülg.

Täissuuruses pilt

Rottide mudeli leidude kinnitamiseks üritasime immunoblotanalüüsi ja ELISA abil mõõta hiire aju MPO taset, kuid kummagi meetodi abil ei õnnestunud meil saada elujõulist signaali. ICAM-1 taset mõõdeti immunoblotanalüüsiga (joonis fig 11A, B); ICAM-1 tase ipsilateraalses poolkeras oli mõlemas rühmas kõrgem, kuid EP1 - / - rühmas võrreldes WT-ga oluliselt madalam (P <0, 01, joonis 11B).

Image

Mõõdeti ICAM-1 taset, et teha kindlaks, kas EP1 deletsioon moduleerib vastusena isheemiale ICAM-1 tootmist. ( A ) ICAM-1 tüüpiline Western-blot hiire ajukoores. ( B ) ICAM-1 tasemete densitomeetriline analüüs näitas mõlemas rühmas isheemilise poolkera kasvu võrreldes kontralateraalse poolkeraga (P <0, 01, paarimata kahepoolsed t-testid). Isheemilistes EP1 - / - hiirtes on ICAM-1 tase märkimisväärselt langenud võrreldes WT-ga (P <0, 01, paarimata kahepoolne t-test). WT, N = 6; EP1 - / -, N = 8. CXi = ajukoore ajupoolne külg ajurabandusele, CXc = ajukoore ajurabanduse vastaskülg.

Täissuuruses pilt

Arutelu

Selles uuringus näitasime EP1 inaktiveerimise neurovaskulaarset kaitsvat toimet isheemilise insuldi korral. Post-isheemiline ravi SC-51089, EP1 antagonisti või EP1 geneetilise deletsiooniga, põhjustas MMP-9 ja MMP-3 valgu taseme ja aktiivsuse olulist langust isheemilises ajus ning vähendas seeläbi MMP-vahendatud neurovaskulaarset kahjustust eksperimentaalne mööduva isheemilise insuldi mudel nii rottidel kui hiirtel. Sellel EP1 pärssimise BBB kaitsva mõju säilimisel kahel erineval liigil on oluline translatsiooniline tähtsus ja see suurendab tõenäosust, et see lähenemisviis võib toimida ka inimese insuldi korral.

On tõestatud, et selles uuringus kasutatud EP1 antagonist SC-51089 vähendab infarkti suurust ja käitumispuudujääke nii ajutise isheemilise insuldi 24, 31 kui ka püsiva 31 mudeli korral; efektiivne nii isastel kui emastel hiirtel ja lai terapeutilise manustamise aken 31 . Meie tulemused on kooskõlas varasemate aruannetega; SC-51089 post-isheemiline süstimine vähendab rottidel infarkti koguhulka 48 tundi pärast MCAO-d. Kortikaalse ja striataalse infarkti ruumalad mõõtsime eraldi, mis näitas, et infarkti mahu vähenemine toimus ainult ajukoores, kusjuures striataalse infarkti maht oli vehiikuliga ja SC-51089-ga töödeldud rühmas peaaegu identne. Need tulemused viitavad sellele, et EP1 farmakoloogiline pärssimine vähendab tõenäoliselt vigastuse progresseerumist infarkti tuumast, peamiselt lokaliseerituna rinnakelmesse, kortikaalsesse penumbraalsesse piirkonda. Vere-aju barjääri katkemine progresseerub mitme päeva jooksul ja on oluline panus penumbras toimuvasse raku progresseeruvasse surma. Neurovaskulaarse üksuse terviklikkuse säilitamine aitab tõenäoliselt kaasa kortikaalse infarkti mahu vähenemisele, mida täheldatakse EP1 antagonistiga ravitud loomadel.

EP1 - / - hiirtel täheldati 24 tunni jooksul pärast MCAO-d väikest, kuid statistiliselt ebaolulist koguinfarkti mahu vähenemist. Varasemad teated on siiski näidanud, et hilisemates ajahetkedes hukkus EP1 - / - hiirtes infarkti mahu oluline vähenemine: −35% 72 h 24 ja 42% 96 h 26, võrreldes metsiktüübiga, näidates, et nakkuse neuroprotektiivne toime EP1 kustutamist nähakse ajahetkedel hiljem kui 24 tunni pärast.

We are the first to show that EP1 mRNA and protein levels are increased in the brain at 4 h and 48 h following ischemic stroke in rats. Pro-inflammatory signals such as TNFα have been shown to increase EP1 mRNA in human amnionic WISH cells 37 . Thus, it is possible that the EP1 regulation 4 h post-MCAO may be mediated by TNFα, although confirmation of this mechanism in the brain is outside the scope of this study. EP1 mRNA increases at 48 h could be due to compensatory production by surviving resident brain cells. EP1 protein expression is increased 14 h after ischemia in the cortex, and then falls back to baseline levels. Increased expression of EP1 may result in increased susceptibility to PGE 2 -mediated neurotoxicity in the brain during the acute phase of ischemic injury.

IgG concentrations in the brain were measured to quantify BBB permeability in SC-51089-treated rats and EP1 −/− mice because IgG levels are extremely low in the uninjured contralateral cortex and greatly increased in the ischemic brain when the BBB is compromised. IgG levels in the ischemic cortices of SC-51089-treated rats were significantly lower compared to the vehicle, suggesting that the BBB could be more intact in the treated group. Since IgG is a soluble plasma protein, we divided the concentration of IgG measured in the cortex by the concentration of IgG in the plasma to account for variability between animals, and then by the stroke volume in the corresponding hemisphere to produce an approximate measurement of the amount of IgG per-unit of tissue volume. In SC-51089-treated rats, IgG levels were reduced in the ischemic hemisphere after normalization, which supports that the reductions in IgG levels in the rat brain are due to reduced neurovascular injury, and not merely due to a smaller infarct size in animals treated with the EP1 antagonist.

In EP1 −/− mice, the results are complicated by the fact that EP1 knockout increases circulating IgG levels several-fold. To our knowledge, this is the first report of an EP1-mediated mechanism modulating IgG production, demonstrating a previously unknown interaction between inflammation and immune system regulation. Cortical IgG levels were divided by the animal's corresponding plasma IgG concentration, revealing significantly reduced IgG levels in the ischemic hemisphere of EP1 −/− mice. Another soluble plasma protein, albumin, was chosen as a second measure of BBB permeability due to the EP1 knockout/IgG interaction. Albumin levels were markedly reduced in the ischemic hemisphere of EP1 −/− mice, an effect that persists after normalizing by infarct volume. Hemorrhagic transformation is a serious consequence of ischemia that increases mortality in stroke patients, and occurs where BBB disruption is great enough to allow erythrocytes to pass into the parenchyma 32 . Hemoglobin levels were measured as an indicator of hemorrhagic transformation. Pharmacological blockade or genetic deletion of EP1 resulted in reduced hemoglobin levels in the ischemic brain. Collectively, these data indicate that inhibition of EP1 signaling reduces the degree of BBB disruption and hemorrhagic transformation following experimental cerebral ischemia.

MMP-9 and MMP-3 have been implicated in neurovascular injury and apoptotic cell death in ischemic stroke, in both humans and rodent models. In human ischemic stroke, perivascular neutrophils express MMP-9 and are associated with disrupted micro-vessels, hemorrhagic transformation, and basal lamina degradation 38 . In the peri-infarct region, microglia, macrophages, endothelial cells, and neurons express MMP-9 10, 15, 39 . In the clinical setting, MMP-9 levels in plasma have been correlated with fluid-attenuated inversion recovery hyperintensities 40, hemorrhagic transformation 41, blood-cerebrospinal fluid barrier disruption 42, and poorer behavioral outcomes 43 . Extensive evidence in rodent models suggests that acute inhibition of MMP-9 and MMP-3 confers protection to the ischemic brain. In mice, MMP-9 knockout reduces fluid edema, infarct size, ZO-1 degradation, and BBB permeability 11, 12 . Pharmacological inhibition of MMP-9 reduces infarct size, neurological deficits, DNA fragmentation, hemorrhagic transformation, and apoptotic cell death after ischemic stroke 44, 45, 46 . MMP-3 knockout limits BBB breakdown, reduces pro- and active MMP-9 expression in the brain, and reduces TJP degradation in models of neuroinflammation and cerebral ischemia 13, 47 .

Findings from this study demonstrate that an EP1-mediated mechanism modulates MMP-9 and MMP-3 in the ischemic brain. Elucidating the mechanism by which EP1 inhibition reduces MMP levels in the ischemic brain is complicated since both resident brain cells and peripheral immune cells produce MMPs in response to ischemia 48 . It is possible that EP1 blockade reduces neuronal MMP-9 transcription. EP1 is expressed on neurons, and EP1 stimulation with PGE 2 has been shown to phosphorylate NF-κB 49 . The MMP-9 promoter has an NF-κB binding domain 50, 51, 52, thus inhibition of EP1 signaling may reduce transcription of MMP-9 in the brain. Although resident brain cells produce MMPs, infiltrating neutrophils have been demonstrated to be the major source of MMP-9 in cerebral ischemia and the extent of neutrophil infiltration correlates with stroke volume in humans 33, 53 . Neutrophils are recruited to the brain following ischemia, where they adhere to the endothelial cell wall and migrate into the tissue. Neutrophils secrete MMPs and degrade TJPs as they pass through the neurovascular unit, increasing the permeability of the BBB 33, 54, 55 . If blockade of EP1 signaling inhibits the ability of neutrophils to adhere to the endothelial cell wall, this could explain decreased infarct volumes, decreased blood component extravasation, reduced MMP levels, preserved occludin, and ZO-1 levels in EP1 antagonist-treated rats and EP1 −/− mice. In the present study, MPO was used as an indicator of peripheral neutrophil infiltration. Significantly less MPO was measured in SC-51089-treated rats compared to the vehicle, suggesting reduced neutrophil infiltration in animals receiving the EP1 blocker. Previous research has shown that EP1 upregulates ICAM-1 levels in oral cancer cells 56 . ICAM-1 levels were measured to determine if EP1 modulates ICAM-1 in cerebral ischemia. ICAM-1 levels trended towards a decrease in the SC-51089-treated group, but EP1 gene deletion significantly reduced ICAM-1 expression in the ischemic cortex compared with WT mice. This may reflect a more profound effect of EP1 knockout compared to a pharmacological antagonist and/or differences between species in the mechanism(s) responsible for the increases in ICAM-1 levels in response to stroke. Nonetheless, decreased ICAM-1 in EP1 −/− mice suggests reduced neutrophil infiltration.

In addition to MMP-mediated BBB disruption our results show that SC-51089 treatment may reduce MMP-independent BBB permeability. A higher molecular weight occludin isoform was observed in ischemic samples but not in the unaffected contralateral hemispheres. This isoform is likely a phosphorylated and/or ubiquitinated occludin isoform. Cerebral ischemia phosphorylates occludin 57, which attenuates interactions with ZO-1 58 . Treatment with SC-51089 significantly reduced the levels of this occludin isoform. A previous report utilizing an embolic rat model of ischemic stroke demonstrated that SC-51089 reduces tyrosine phosphorylation of occludin 59 . Others have demonstrated that ischemia-reperfusion injury can phosphorylate and ubiquitinate occludin 60 . Our data suggest that EP1 inhibition may also reduce BBB permeability by reducing post-translational modifications of occludin, consequently preserving the structural organization of the tight junctions and BBB functionality.

In conclusion, we have demonstrated that EP1 antagonism or EP1 gene deletion limits BBB breakdown, attenuates hemorrhagic transformation, and significantly reduces MMP-9 and MMP-3 protein levels and activity following experimental ischemic stroke in rodents, which is likely due to reduced immune cell infiltration into the brain. These results suggest that inhibiting EP1 signaling may be a viable therapeutic strategy to reduce neurovascular injury in ischemic stroke. Despite the prominent role of MMP-9 and MMP-3 in BBB disruption in cerebral ischemia, therapeutic targeting of these proteases in humans is challenging because current pharmacological inhibitors produce a complete and unspecific inhibition of all members of the MMP family which results in unfavorable side effects and limits their clinical use 61 . Upstream inhibition of MMP production or activation may be an effective alternative to direct MMP inhibitors. Findings from our current study indicate that EP1 blockade could represent a novel alternative strategy to protect the BBB from MMP-9 and MMP-3-associated breakdown following ischemic stroke.

Materjalid ja meetodid

Loomad

All procedures involving animals were performed in accordance with the approved guidelines of the National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA) for the care and use of laboratory animals, the ARRIVE guidelines (//www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines), and were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee at the University of Florida (protocol approval number: 201106503). All efforts were made to minimize pain and distress to the animals. For the rat experiments, we purchased adult male Wistar rats (10-12 weeks of age; 280–320 g) from Harlan Laboratories (Indianapolis, IN, USA). All animals were acclimated to our animal facility for at least 7 days before any surgical procedure. Rats were housed in groups of two in a room with a controlled environment and a 12-h light/dark cycle. Animals had free access to food and water. For the experiments involving mice, we utilized adult male wild-type (WT) and EP1 −/− mice on the C57BL/6 background. Mice were bred and maintained in our animal facilities and were used when they were 8-12 weeks old (20–25 g). Mice had access to food pellet and water ad libitum , and were housed under reverse light cycle conditions.

Surgical procedures to induce middle cerebral artery occlusion (MCAO)

Transient focal cerebral ischemia was induced by intraluminal insertion of a silicone-coated filament as described in detail in our previous reports 20, 26, 27, 35 . Briefly, animals were anesthetized by isoflurane inhalation in medical-grade oxygen. Once surgical levels of anesthesia were attained, animals were placed on a water-circulating heat pad (Gaymar, TP-700, Torrington, CT, USA). The surgical area was shaved and swabbed with betadine followed by 70% ethanol. Surgery was performed using a stereomicroscope (Motic, SMZ-168, Richmond, BC, Canada). The anterior neck was opened with a midline vertical incision. Dissection medial to the right sternocleidomastoid muscle exposed the common carotid artery (CCA), external carotid artery (ECA), and internal carotid artery (ICA). The arteries were carefully separated from the vagus nerve and connective tissue. A nylon filament (4-0 for rats; 7-0 for mice), coated with silicone rubber, was advanced gently in the ICA to occlude the ostium of the middle cerebral artery (MCA) until a mild resistance was felt, approximately 18–20 mm from the carotid bifurcation in rats, and 9–11 mm in mice. In rats, MCAO was confirmed by a neurological exam performed after one hour of filament insertion. Only rats showing consistent contralateral circling and paw deficits were included in this study. In mice, successful MCAO was confirmed by a significant drop of more than 80% in cerebral blood flow from baseline as monitored by laser Doppler flowmetry (moorVMS-LDF Dual Channel Laser Doppler Blood Flow Monitor, Moor Instruments Inc., Wilmington, DE, USA). The occluding filament was kept in place for 90 min (rats) or 60 min (mice). At the end of the ischemic period, the animals were re-anesthetized and the filament was gently retracted to allow reperfusion of the ischemic region. The incision was closed with nylon sutures, povidone-iodine was applied, and animals were allowed to recover from anesthesia. Animals were injected subcutaneously with 0.05 mg/kg of buprenorphine hydrochloride (Buprenex) to minimize pain and allowed to fully recover in a warm cage (Thermocare ICS Warmer W-1 model 75W, Paso Robles, CA, USA).

Narkootikumide ravi

For the intravenous administration of vehicle or SC-51089, an EP1 receptor antagonist, a Micro-Renathane catheter was placed in the right distal segment of the femoral vein of ischemic rats at the time of MCAO surgery. SC-51089 (Cat. No. 10011561, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) was freshly dissolved in 30% Kolliphor ® HS 15 (Cat. No. 42966, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) in physiological saline and given after 3 h of reperfusion (4.5 h after the onset of MCAO) at a dose of 3 mg/kg. Rats in the vehicle group were on the same treatment schedule and received the same volume of 30% Kolliphor ® HS15. Additional injections of SC-51089 or vehicle were administered after 18 and 28 h of reperfusion via the femoral vein catheter. Rats were randomly assigned to vehicle or treatment conditions.

Infarct Volume Measurement

At the time of euthanasia, rodents were anesthetized with an overdose of sodium pentobarbital (150 mg/kg; ip) and perfused transcardially with ice-cold saline. The brains were removed, placed in a slicing matrix (Zivic Instruments, Pittsburgh, PA, USA) and cut into sections (six 2-mm sections in rat, seven 1-mm sections in the smaller mouse brain). The fourth section (starting rostrally) was frozen on dry ice for molecular analyses, while the rest of the sections were incubated in a 2% TTC solution at 25 °C for 30 minutes to stain for metabolically active tissue. TTC-stained sections were fixed in a 4% PFA solution in PBS, then placed rostral-side down on a HP Scanjet 8300 (Palo Alto, CA, USA), scanned at 600 dpi, and saved as a JPEG. Since the fourth section was removed for molecular analyses, the infarct size of the fourth slice was determined by scanning the caudal side of the third section.

Due to the swelling associated with edema in the ipsilateral hemisphere, measuring the area of infarcted tissue directly would overestimate the infarcted area. In this study, corrected infarct volume was calculated by measuring the area of TTC-stained cortical or striatal tissue on the contralateral side of the brain and subtracting the area of TTC-stained tissue on the ipsilateral side of the brain as described previously 62 . Adobe Photoshop CS5 was used to select and calculate areas in mm 2 per brain slice. Infarct volume per slice was determined by multiplying the area of infarcted tissue by the thickness of the slice. Total infarct volume was calculated by summing individual slice infarct volumes.

Brain tissue homogenization

Brain tissue homogenates were prepared from the fourth rostral section. Ipsilateral and contralateral hemispheres were separated, then cortical and striatal tissue was dissected out. The tissue samples were weighed and homogenized in a RIPA buffer containing 1% SDS, 1% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, and 1% IGEPAL® CA-630 (Sigma-Aldrich) at 10 μL/mg of brain tissue. HALT Protease Inhibitor Cocktail, HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail and 0.5 M EDTA (Cat. No. 78430; Cat. No. 78428; and Cat. No. 1860851, respectively; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) were added at 10 μL/mL of homogenization buffer immediately before use. Brain tissue was homogenized with a Tissue-Tearor homogenizer (BioSpec Inc., Bartlesville, OK, USA) then sonicated twice using a Vibra-Cell™ sonicator (Sonics & Materials Inc., Newtown, CT, USA) with 15 minutes of equilibration on ice between sonications. Resulting tissue homogenates were centrifuged at 14, 000× g for 20 min at 4 °C in an Eppendorf Microcentrifuge Model 5430R (Hamburg, Germany), and the supernatants were aliquoted and stored at −80 °C until use.

Western blotting

Forty or fifty μg of protein (for mouse and rat, respectively) were reduced in 5% β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) at 100 °C for 10 min and loaded into 4–20% Mini-PROTEAN TGX gels (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Proteins were separated at 200V for 45 min in a 0.1% SDS Tris-glycine running buffer and the gels were subsequently incubated for 10 min in a Tris-glycine buffer containing 10% methanol. Proteins were transferred to Immobilon-FL PVDF membranes (Millipore, Billerica, MA, USA) using a Trans-Blot Turbo (Bio-Rad) semi-dry transfer system. The membranes were blocked in 5% non-fat milk in TBS for 1 h at 25 °C. Primary antibodies against proteins of interest: rabbit polyclonal anti-EP1 Cat. No. 101740, 1:2, 000, Cayman Chemical; rabbit monoclonal anti-MMP-9 (rat) Cat. No. ab76003, 1:5, 000, Abcam (Cambridge, MA, USA); rabbit polyclonal anti-MMP-9 (mouse) Cat. No. SC-6841-R, 1:500, Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA); rabbit polyclonal anti-MMP-3 (rat and mouse) Cat. No. ab53015, 1:1, 000, Abcam; rabbit monoclonal anti-occludin Cat. No. ab167161, 1:1, 000, Abcam; rabbit polyclonal anti-ZO-1 Cat. No. 61-7300, 1:1, 000, Life Technologies (Carlsbad, CA, USA); rabbit polyclonal anti-MPO Cat. No. SC-16128-R, 1:700, Santa Cruz Biotechnology; goat polyclonal anti-ICAM-1 (rat and mouse) Cat. No. AF583, 1:800, R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) were added to 5% milk in TBST and incubated overnight at 4 °C. The membranes were washed four times in TBST and probed with IRDye 800CW goat anti-rabbit or donkey anti-goat secondary antibodies (1:30, 000; Li-Cor, Lincoln, NE, USA) in 5% milk in TBST w/0.01% SDS for 1 h at 25 °C. The membranes were scanned on an Odyssey infrared scanner (Li-Cor) and band intensity was measured using Image Studio V2.0. The membranes were probed with anti-β-actin antibody (A1978, 1:10, 000, Sigma-Aldrich) for 1 h at 25 °C followed by incubation with IRDye 680LT donkey anti-mouse (1:40, 000; Li-Cor) for 1 h at 25 °C. The membranes were scanned and the signal of the protein of interest was divided by the actin signal to correct for potential loading and transfer variations between lanes/gels.

ELISAs

Various proteins normally found in the blood, but not found in the healthy brain, were used as indicators of BBB permeability. Immunoglobulin G (IgG), hemoglobin (Hb), and albumin concentrations were measured. ELISA kits were purchased from Immunology Consultants Laboratory, Inc. (Portland, OR, USA) and used according to the provided instructions (rat IgG, Cat. No. E-25G; rat Hb, Cat. No. E-25HM; mouse IgG, Cat. No. E-90G; mouse Hb, Cat. No. E-90HM; mouse albumin, Cat. No. E-90AL). Absorbance was measured at 450 nm using a Synergy HT Multi-mode plate reader (BioTek, Winooski, VT) running Gen5™ data analysis software. IgG concentrations were measured using 50 μg of total protein, Hb concentrations using 10 μg of total protein, and albumin concentrations using 3 μg of total protein. Plasma was diluted 1:20, 000 for IgG quantification and 1:500, 000 for albumin quantification. Corrected values were obtained by dividing measured protein concentrations by the infarct volume of the fourth brain section.

Fluorometric immunocapture assay of MMP enzymatic activity

Enzymatic activity of MMP-9 and MMP-3 was measured using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide immunoassay as previously described by our group 63, 64 . High-binding 96-well plates (Greiner Bio-One, Monroe, NC, USA) were coated with 200 μg/mL of protein A/G (Cat. No. 1003-01, ScienCell, Carlsbad, CA, USA) in a carbonate/bicarbonate buffer at a pH of 9.4 for 2 h at 25 °C. The wells were aspirated and washed three times with 200 μL of TCNB (50 mM Tris, 10 mM CaCl 2, 150 mM NaCl, 0.05% Brij® L23). Polyclonal rabbit anti-MMP-9 or anti-MMP-3 antibodies (Cat. No. SC-6841-R; Cat. No. SC-6839-R, Santa Cruz Biotechnology) were added to the wells at 0.5 μg/well and bound for 2 h. The wells were aspirated and washed three times before adding samples (50 μg of total protein) in duplicate into the wells containing the protein A/G-antibody complex and allowed to bind overnight at 4 °C. The wells were aspirated, washed, and 5-FAM/QXL™ 520 FRET peptides (Substrate III Cat. No. AS-60570-01 or Substrate XIII Cat. No. AS-60580-01, Anaspec (Fremont, CA, USA), for MMP-9 or MMP-3, respectively) were added to the wells. The plates were incubated at 37 °C and read at excitation/emission wavelengths of 485/528 nm after 24 and 48 h of incubation in a Synergy HT Multi-mode microplate fluorescence reader running Gen5™ data analysis software (BioTek). Baseline fluorescence was determined from the average of two substrate control wells, which was subtracted from the average of each pair of sample wells to give a final relative fluorescent unit (RFU) value.

qRT-PCR

EP1 mRNA expression in response to ischemia was measured using qRT-PCR in sham-operated, 4 h, 14 h, 24 h, and 48 h post-MCAO rats. Following perfusion with ice-cold saline, the brains were placed in a slicing matrix (Zivic Instruments) and sectioned into six 2-mm sections. The third section was separated into ipsilateral and contralateral hemispheres, and cortical tissue was separated from striatal tissue. Tissue samples were placed in RNAlater RNA Stabilization Reagent (Cat. No. 76106, Qiagen, Germany) at 10 μL/mg of tissue, kept at 4 °C for 24 h and then placed at −20 °C until further processing. Using the Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit (Cat No. 732-6830, Bio-Rad) the RNA was extracted from the tissue according to the provided instructions. Total cDNA was generated in a T100 thermal cycler (Bio-Rad) using iScript Supermix (Cat. No. 170-8841, Bio-Rad). Quantitative real-time PCR was performed using the following primers: EP1 forward, 5′-CCT GCT GGT ATT GGT GGT GTT-3′, EP1 reverse, 5′-CAG GAT CTG GTT CCA CGA CG-3′; Ywhaz forward, 5′-TGT TCT AGC CTG TTT CCC CG-3′, Ywhaz reverse, 5′-ACG ATG ACG TCA AAC GCT TC-3′. Ywhaz was used for normalization since gene expression does not significantly change in response to ischemia 65, which was confirmed in our preliminary pilot study. The samples were loaded in quadruplicates with 5 μL of SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad), 1 μL of forward and reverse primers (IDT, Coralville, IA, USA), 1 μL of nuclease-free water, and 20 ng of cDNA per well. The plate was spun down and the PCR reaction proceeded under the following conditions: 95 °C 30 s, (95 °C 5 s, 60 °C 30 s) for 40 cycles, followed by a melt curve calculation (start - 65 °C 5 s, +0.5 °C/cycle for 60 cycles) in a CFX96 C1000 Touch thermal cycler running CFX Manager 3.1 (Bio-Rad). Cq values for each replicate well were averaged to give a final Cq value for each animal. Relative normalized expression was determined by a ΔΔCq calculation where Cq values were normalized to Ywhaz expression to give ΔCq values, which were normalized to the expression in the ipsilateral cortex of the sham group to produce the final ΔΔCq value.

Immunohistokeemia

Rodents were perfused with PBS followed by 4% PFA. The brains were removed and placed in a 4% PFA solution and kept at 4 °C overnight and then transferred to 30% sucrose in PBS for 48 h. The brains were frozen in Tissue-Tek ® optimum cutting temperature (OCT) embedding medium, sectioned at 40 μm in a cryostat, placed in a cryoprotectant solution (30% ethylene glycol, 30% glycerol, 10% PBS, 30% water; adjusted to pH 7.4), and kept at –20 °C until use. Free-floating sections were washed four times with TBS w/ 0.1% Triton X-100, and blocked with 5% normal goat serum and 1% bovine serum albumin for 1 h at 25 °C. Antibody incubations were performed in 12-well plates containing 2 mL of TBS w/ 0.1% Triton X-100 containing 0.5% BSA. Sections were incubated for two nights at 4 °C on an orbital shaker at 50 rpm with primary antibodies against proteins of interest: rabbit polyclonal anti-EP1 Cat. No. ab93479, 1:250, Abcam; mouse monoclonal anti-NeuN Cat. No. MCA-1B7, 1:1, 000, EnCor Biotechnology (Gainesville, FL, USA); mouse monoclonal anti-RECA-1 Cat. No. MCA970GA, 1:1, 000, AbD Serotec (Raleigh, NC, USA); mouse monoclonal anti-GFAP Cat. No. MCA-5C10, 1:1, 000, EnCor Biotechnology; mouse monoclonal anti-CD11b Cat. No. MCA275GA, 1:1, 000, AbD Serotec. Sections were washed three times and secondary antibodies (anti-rabbit Alexa Fluor 488 Cat. No. 111-545-144, 1:1, 000, Jackson IR (West Grove, PA, USA); anti-mouse Cy3 Cat. No. 115-165-166, 1:1000, Jackson IR) were added to 0.5% BSA in TBS and incubated for 2 h at 25 °C. Sections were washed three times and incubated in 100 nM DAPI for 10 s, dipped in water, mounted with Fluoromount (Cat. No. F4680, Sigma-Aldrich), and stored at 4 °C until imaging. Images were obtained on an Olympus disc scanning unit (DSU) motorized IX81 spinning disc confocal microscope at 60× magnification using a water immersion lens and DAPI, FITC, and TRITC filters for the blue, green, and red channel acquisition, respectively.

Statistilised analüüsid

Andmed on esitatud keskmisena ± SEM. GraphPad Prism 5 was used to conduct statistical tests. A two-tailed unpaired Student's t-test, one-way ANOVA followed by a Tukey post-test, or two-way ANOVA followed by a Bonferroni post-test was used. Statistiliselt oluliseks loeti P- väärtust alla 0, 05.

Lisainformatsioon

How to cite this article : Frankowski, JC et al . Detrimental role of the EP1 prostanoid receptor in blood-brain barrier damage following experimental ischemic stroke. Sci. Esindaja 5, 17956; doi: 10.1038/srep17956 (2015).

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.