Tsütokineesi blokeerimise mikrotuuma tsütomee test | loodusprotokollid

Tsütokineesi blokeerimise mikrotuuma tsütomee test | loodusprotokollid

Anonim

Seda artiklit on värskendatud

Abstraktne

Tsütokineesi blokeeriva mikrotuuma tsütomeetri test on terviklik süsteem DNA kahjustuste, tsütostaasi ja tsütotoksilisuse mõõtmiseks. DNA kahjustuse sündmusi hinnatakse konkreetselt jagatud kahetuumalistes (BN) rakkudes ja need hõlmavad (a) mikrotuumasid (MNi), kromosoomi purunemise ja / või kogu kromosoomi kaotuse biomarkerit, b) nukleoplasmaatilisi sildu (NPB), DNA biomarkerit ekslik parandamine ja / või telomeeride lõppfusioonid ja (c) tuumapungad (NBUD), biomarker amplifitseeritud DNA ja / või DNA paranduskomplekside elimineerimiseks. Tsütostaatilist toimet mõõdetakse ühe-, kahe- ja mitmetuumaliste rakkude osakaalu ja tsütotoksilisuse kaudu nekrootiliste ja / või apoptootiliste rakkude suhte kaudu. Lisateavet MNi, NPB ja NBUD moodustumise mehhanismide kohta saadakse tsentromeeri ja / või telomeersondi abil. Testi rakendatakse edukalt genotoksiinide in vivo kokkupuute biomonitoorimisel, in vitro genotoksilisuse testimisel ja erinevates uurimisvaldkondades, näiteks nutrigenomics ja farmakogenomics, samuti normaalseks koe- ja tuumori kiirgustundlikkuseks ning vähiriski ennustamiseks. Protseduuri lõpuleviimine võib võtta kuni 5 päeva.

Sissejuhatus

MNi pärinevad kromosoomifragmentidest või tervetest kromosoomidest, mis tuumajagunemise ajal anafaasis maha jäävad (joonis 1) 1, 2, 3, 4, 5, 6 . Tsütokineesi blokeerimise mikrotuuma (CBMN) test on eelistatav meetod MNi mõõtmiseks kultiveeritud inimese ja / või imetaja rakkudes, kuna skoorimine on piiratud ainult kord jaotatud BN rakkudega, mis on rakud, mis suudavad ekspresseerida MNi 3, 4, 5, 6 CBMN testis tuvastatakse kord jagunenud rakud nende BN-i väljanägemise järgi pärast tsütokineesi blokeerimist tsütochalasin-B-ga (Cyt-B), mis on mikrofilamentide rõngaste komplekti inhibiitor, mis on vajalik tsütokiinide lõpuleviimiseks 3, 4, 5, 6, 7 . MNi punktide piiramine BN-rakkudes hoiab ära segaduse tekitamise, mis on põhjustatud suboptimaalsest või muudetud rakkude jagunemise kineetikast, mis on mikrotuuma (MN) testimisprotokollide peamine muutuja, mis ei tee vahet mittejagunevate rakkude vahel, mis ei suuda MNi ekspresseerida, jagunevate rakkude vahel, mis suudavad 6, 8, 9 . CBMN-test on oma töökindluse ja hea reprodutseeritavuse tõttu muutunud üheks standardseks tsütogeneetiliseks testiks geneetilises toksikoloogilises testimises inimese ja imetaja rakkudes.

Image

MN pärineb kas mahajäänud tervetest kromosoomidest või tsentrilistest kromosoomifragmentidest. NPB-d pärinevad ditsentrilistest kromosoomidest, mis võivad olla põhjustatud kaheahelaliste DNA purunemiste või telomeerse otsa sulandumiste väärast parandamisest. Neid sündmusi saab täheldada ainult tuumajagunemist lõpule viivates rakkudes, mida tuntakse ära nende BN-i välimuse järgi pärast tsütogeneesi blokeerimist Cyt-B-ga.

Täissuuruses pilt

Viimase 17 aasta jooksul on CBMN-test arenenud kõikehõlmavaks meetodiks kromosoomi purunemise, DNA väärarengu, kromosoomi kadu, mitte-disjunktsiooni, nekroosi, apoptoosi ja tsütostaasi mõõtmiseks (joonised 1, 2, 3, 4, 5 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 . Seda meetodit kasutatakse nüüd ka ditsentriliste kromosoomide biomarkeri NPBde mõõtmiseks mis on saadud telomeeri otsfusioonidest või DNA väärast parandamisest ja NBUD-de mõõtmiseks biomarker geeni amplifikatsiooni 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 . Nende arengute olulisust ja CBMN-analüüsi mõistet kui kromosomaalse ebastabiilsuse tsütoomianalüüsi on selgitatud järgmistes osades. „Tsütoomi“ kontseptsioon tähendab, et süsteemi kõik rakud Uuritud tsütoloogiliselt hinnatakse selle elujõulisuse staatuse (nekroos, apoptoos), mitootilise staatuse (ühetuumaline, BN, mitmetuumaline) ja selle kromosomaalsete kahjustuste või ebastabiilsuse staatuse (MNi, NPB-de, NBUD-de olemasolu ja tsentromeeri sondimärgi arvu järgi) kui selliseid molekulaarseid vahendeid kasutatakse koos testiga) (joonised fig. 1, 2, 3, 4, 5). Nendel põhjustel on nüüd asjakohane nimetada seda tehnikat tsütokineesi blokeeriva MN tsütoomi (CBMN Cyt) testiks.

Image

Neid biomarkereid kasutades CBMN testis, on võimalik mõõta kromosoomi purunemise sagedust (MN), kromosoomi kadu (MN), kromosoomi ümberpaigutamist, näiteks ditsentrilisi kromosoome (NPB), geeni amplifikatsiooni (NBUD), nekroosi ja apoptoosi. Lisaks saab tsütostaatilist toimet hõlpsalt hinnata ühe-, kahe- ja mitmetuumaliste rakkude suhte põhjal.

Täissuuruses pilt

Image

a ) ühetuumaline rakk; ( b ) BN rakk; ( c ) mitmetuumaline rakk; ( d ) varane nekrootiline rakk; ( e ) hiline apoptootiline rakk; ( f ) BN-rakk, mis sisaldab ühte või enamat MNi; ( g ) BN, mis sisaldab NPB (ja MN); h ) NBN-sid sisaldav BN-rakk. Ühetuumaliste, BN, mitmetuumaliste, nekrootiliste ja apoptootiliste rakkude suhteid kasutatakse mitootilise jagunemiskiiruse ehk NDI (tsütostaasi näitaja) ja rakusurma (tsütotoksilisus) määramiseks. BN-rakkude sagedus MNi, NPB või NBUD-dega näitab genoomi kahjustuse ja / või kromosomaalse ebastabiilsuse määra. Erinevat tüüpi rakutüüpide ja biomarkerite fotovalikute laiema valiku jaoks CBMN Cyt testis leiate Fenech et al . 75 .

Täissuuruses pilt

Image

Molekulaarsete meetodite kasutamine a) MN tuvastamiseks, mis on pärit mahajäänud tsentrilisest kromosoomi fragmendist, b) MN, mis on pärit mahajäänud kromosoomist ja c) spetsiifilise kromosoomi mitte-disjunktsioon, mis põhjustab aneuploidsed tütartuumad. BN-rakkude tuumades ja MNi-s olevad kollased laigud iga paneeli vasakul küljel näitavad tsentromeerset või kinetokoore värvimismustrit pantsentromeersete sondide või kinetokoorsete antikehade kasutamisel. BN-rakkude tuumades ja MNi-s asuvad helesinised laigud iga paneeli paremal näitavad tsentromeerse värvumise mustrit, kui kasutatakse MN moodustumisel osalevate kromosoomide spetsiifilisi tsentromeerseid sonde või mitte-disjunktsiooni sündmusi. Näidatud näide on hüpoteetiline rakk, millel on ainult kaks paari kromosoome. Pancentromeerseid sondid tuleks kasutada ainult kromosoomi purunemisest (tsentromeernegatiivne) pärit MNi ja kromosoomi kadu (tsentromeerpositiivne) eristamiseks. Kromosoomspetsiifilisi tsentromeersondi tuleks kasutada ainult unikaalsete kromosoomidega seotud valedegregatsiooni mõõtmiseks (mitte-disjunktsiooni või kromosoomi kadumise tõttu). Oluline on märkida, et pantsentromeerseid sonde ei saa disjunktiivsuse määramiseks kasutada tuumade kõigi tsentromeeride usaldusväärse loendamise keerukuse tõttu.

Täissuuruses pilt

Image

Pancentromeerseid ja telomeerseid sondide abil saab eristada (I) MNi, mis pärineb kogu kromosoomi kadumisest ( a ), ja MNi vahel, mis pärinevad tsentrilistest kromosoomifragmentidest ( b ) ja (II) NPB-st ditsentrilistest kromosoomidest, mis tulenevad DNA ahela purunemiste väärast parandamisest ( b ) ja telomeeri otsa sulandumistest põhjustatud ditsentrilised kromosoomid ( c ). Kollased punktid tähistavad sonde, mis hübridiseeruvad kromosoomide tsentromeerse piirkonnaga. Helesinised punktid tähistavad sonde, mis hübridiseeruvad kromosoomide telomeersete järjestustega.

Täissuuruses pilt

Oleme teinud ettepaneku, et BN-rakkude tuumade vahel olevad NPB-d tuleks CBMN-testis skoorida, kuna need annavad kromosoomi ümberpaigutamise mõõtme, mis muidu pole selles testis saavutatav, kui ainult MNi-d on 3, 22, 23, 35, 36, 37, 38, 39 . NPB-d tekivad siis, kui ditsentriliste kromosoomide tsentromeerid tõmmatakse anafaasis raku vastaspoolustele. Harva on võimalik enne tuumamembraani moodustumist jälgida ditsentrilisi anafaasilisi sildu, sest rakud kulgevad kiiresti läbi anafaasi ja telofaasi, viies lõpule tsütokiinide, mille tulemuseks on NPB purunemine, kui tütarrakud eralduvad 26 . CBMN-testis lastakse NPB-dega BN-rakkudel siiski akumuleeruda, kuna tsütokinees on pärsitud ja tuumamembraan moodustatakse lõpuks kromosoomide ümber, võimaldades anafaasisilla jälgida NPB-na.

Mitmesugused mehhanismid võivad viia NPB moodustumiseni pärast DNA ekslikku ahelate katkemist DNA 39-s . Tavaliselt moodustatakse ditsentriline kromosoom ja tsentriline kromosoomi fragment, mille tulemuseks on vastavalt NPB ja MN (joonised 1, 2, 3 ja 5). DNA ahela purunemiste ebaõige parandamine võib viia ka ditsentriliste rõngaskromosoomide ja liitunud tsükli kromosoomide moodustumiseni, mis võib samuti põhjustada NPB-de 39 moodustumist. Ditsentrilise kromosoomi ja NPB moodustumise alternatiivne mehhanism on telomeeri otsa sulandumine, mis on põhjustatud telomeeri lühenemisest, telomeeri katvate valkude kadumisest või telomeeri ühtekuuluvusdefektidest 40, kuid sel juhul ei kaasne NPB tingimata tsentrilise kromosoomi fragmendi või MN-iga. Anafaasiliste sildade ja NPB-de moodustumist on täheldatud näriliste ja inimese soolevähi mudelites in vivo ning näidatud, et need korreleeruvad telomeeri pikkusega, mis näitab, et NPB moodustumist võib kasutada ka kriitiliselt lühikeste telomeeride 25 asendusmõõtmena 25 . Reaalajas läbiviidud in vitro uuringud näitasid, et anafaasisillad võivad hilise anafaasi ajal puruneda rohkem kui ühes piirkonnas, mis põhjustab acentriliste kromosoomifragmentide moodustumist ja lõpuks MNi 26, 27 . Seetõttu võib mõni MNi pärineda ka purustatud anafaasilistest sildadest, ehkki pole selge, kas see juhtub tsütokiinidega blokeeritud rakkudes. NPB-de skoorimise olulisust ei tohiks alahinnata, kuna see annab otseseid tõendeid genoomi kahjustustest, mis on põhjustatud valesti parandatud DNA purunemistest või telomeeride otsfusioonidest, mida muidu pole võimalik järeldada ainult MNi skoorimisega, mis võib pärineda kas acentrilistest kromosoomifragmentidest või kromosoomi kadumisest. .

Viimase kümnendi jooksul on välja kujunenud veel üks ainulaadne MNi moodustumise mehhanism, mida tuntakse tuumaenergia tekkena. Seda protsessi on täheldatud kultuurides, mida kasvatatakse tugevates selektiivsetes tingimustes, mis kutsuvad esile geeni amplifikatsiooni, samuti mõõduka foolhappevaeguse korral 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 . Shimizu jt . 31, 32 näitas imetajarakkudega tehtud in vitro katsete abil, et amplifitseeritud DNA lokaliseeritakse selektiivselt tuuma perifeeria spetsiifilistesse kohtadesse ja elimineeritakse tuuma pumpamise kaudu, moodustades MNi mitoosi S-faasis. Amplifitseeritud DNA võib elimineeruda homoloogsete piirkondade rekombinatsiooni kaudu amplifitseeritud järjestustes, moodustades acentrilise ja atelomeerse DNA miniringid (kaks minutit), mis paiknevad tuuma erinevates piirkondades, või amplifitseeritud järjestuste ekstsisiooni teel pärast segregatsiooni erinevates piirkonna piirkondades. tuum. Tuumade tekkeprotsess toimub S-faasis ja NBUD-sid iseloomustab sama morfoloogia kui MN-i, erandiks on see, et sõltuvalt lootustöötluse etapist on need tuumaga seotud kitsa või laia nukleoplasmaatilise materjali varrega ( Joonised 2 ja 3h). Tuumade tekkeprotsessi kestus ja saadud MN ekstrudeerimine rakust on suuresti teadmata. MNi võib moodustuda ka punkerdamisprotsessis pärast kokkupuudet y-kiirgusega 33 . Selles protsessis on Rad 51 rekombinatsioonivalgu kompleksid detekteeritavad kogu tuumas 3 tundi pärast kiiritamist ja seejärel kontsentreeritakse erinevatesse fookustesse, enne kui nad tuumast NBUD-dena välja pressitakse.

Inimese pikaajaliste primaarsete lümfotsüütide kultuuride foolhappevaeguse uuringute seerias kvantifitseerisime hoolikalt MNi, NPBde ja NBUDde omavahelisi seoseid, et kinnitada nende biomarkerite kasutamist ja teha põhjalikumalt kindlaks foolhappevaeguse mõju, füsioloogilises vahemikus, genoomse stabiilsuse erinevates aspektides 35, 36, 37, 38 . Foolhappe kontsentratsioon korreleerus märkimisväärselt ( P <0, 0001) ja negatiivselt ( r = –0, 63 kuni –0, 74) kõigi nende kromosoomikahjustuse markeritega, mis viidi miinimumini foolhappe 60–120 nM juures. MN, NPB ja NBUD sageduse tugev ristkorrelatsioon ( r = 0, 65–0, 77; P <0, 001) soovitab ühist mehhanismi, mille käivitavad foolhappe puudusest põhjustatud DNA purunemised, millest kõige usutavam on purunemisel-liitumisel tekkiv sild tekitatav kromosomaalne ebastabiilsus. tsüklid 41 .

MNi ekspressiooni võib kasutada ka DNA hüpometüleerimise asendusmarkerina. Näiteks indutseerib DNA metülatsiooni inhibiitor 5-asatsütidiin kromosoomide 1, 9 ja 16 heterokromatiini piirkondade alakondenseerumist ja nende kromosoomide MNi-spetsiifilist kaotust inimese lümfotsüütides in vitro 42, 43 . Immuunpuudulikkust, tsentromeerse piirkonna ebastabiilsust, näo anomaaliate sündroomi, mis on põhjustatud mutatsioonist DNA metüültransferaasi geenis DNMT3B, iseloomustab 1., 9. ja 16. kromosoomi heterokromatiini despiraliseerumine ja selle kromatiini kadumine NBUD-deks ja MNi 44- ks. Need sündmused on tõenäoliselt olulised vananemisprotsessis, kuna Suzuki jt . 45 näitasid, et inimese normaalsete fibroblastide vananemine in vitro põhjustab satelliidi 2 ja 3 satelliidi DNA (mida on ohtralt kromosoomide 1, 9 ja 16 jukstatsentromeerses DNA-s) demetüleerimise ja neid järjestusi sisaldava MNi sagenemise sageduse. . On lõplikult tõestatud, et in vivo vananemine põhjustab MN sageduse suurenemist lümfotsüütides ja et X 45 kromosoomi kadumine naistel ja meestel ning Y kromosoomi kaotamine meestel on peamised mehhanismid, mis seletavad seda suurenemist 6, 45, 46 .

Kuigi on ilmne, et MN ekspressioon võib satelliit-DNA hüpometüleerimise tagajärjel suureneda, on ka võimalik, et suurenenud genoomikahjustusi võib põhjustada CpG saarte hüpermetüülimine rakutsüklis osalevate majapidamisgeenide promootorpiirkondade sees või naabruses kontrollpunktid ja DNA parandamine. Näiteks võiks mitootiliste spindli kontrollpunkti geenide, näiteks APC, BUBR1 ja hCDC4, CpG saare hüpermetüülimine vähendada nende ekspressiooni ja suurendada seetõttu kromosoomi vale segregatsiooni võimalust, mis viib MN moodustumiseni 47, 48 . DNA parandamisel osalevate ATM-, FANC- ja BRCA1- või BRCA2-geenide vaigistamine või funktsioonide kadumine võib põhjustada ka kõrgemaid MN sagedusi inimese rakkudes 49, 50, 51 .

CBMN Cyt testi täielikuks ärakasutamiseks ja genotoksilise mehhanismi sügavamaks mõistmiseks on oluline eristada tervetest kromosoomidest pärinevaid MNi ja acentrilistest fragmentidest pärit MNi ning teha kindlaks, kas kromosoomide vääragregatsioon toimub tuumade vahel BN-lahter, mis võib sisaldada või mitte sisaldada MNi-d. See saavutatakse kõige paremini meetoditega, mis võimaldavad tuvastada kromosoomide tsenomeerseid piirkondi. MN suuruse kasutamist diskrimineerijana ei soovitata kasutada inimrakkude või muude rakutüüpide puhul, mille kromosoomid on heterogeensed, kuna väike MN võib sisaldada kas suure kromosoomi fragmenti või tervet väikest kromosoomi. Kromosoomide tsentromeerseid piirkondi saab tuvastada kaudselt, kasutades tsentromeerides 52, 53 koondatud kinetokori valkude antikehi, kuid see lähenemisviis ei erista unikaalseid kromosoome ega pruugi tuvastada kromosoomi kadu, mis tuleneb puudulike tsentromeeride kinetokooride puudumisest 54 . Eelistatud meetod on in situ hübridisatsiooni (ISH) kasutamine tsentromeersete piirkondade tuvastamiseks, kasutades DNA või peptiidi nukleiinhappe pantsentromeerseid sondid, mis võimaldab terveid kromosoome sisaldavaid MNi-sid usaldusväärselt tuvastada. Lisaks sellele saab BN-rakkudes mitte-disjunktsionaalsete sündmuste (st unikaalsete homoloogsete kromosoomipaaride ebaühtlane jaotumine tütartuumades) tuvastamiseks kasutada unikaalse kromosoomi jaoks spetsiifilisi tsentromeerseid sondid 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 55 . Tulemuste tüüpe, mida erinevate tehnikatega võib oodata, on skemaatiliselt illustreeritud joonisel 4. Samuti on MN ja NPB moodustumise mehhanismi määramiseks võimalik kasutada pantelomeersete ja pantsentromeersete sondide kombinatsiooni, nagu on selgitatud joonisel 5. Näiteks telomeerses termotuumasünteesist pärineval NPB-l peaks olema silla sees telomeersignaal, kuid DNA valest parandamise sündmusest pärineval NPB-l on vähem tõenäoline, et silla sees oleks telomeersignaal, kuna eeldatakse, et kaheahelalised katkestused esinevad sagedamini mitte-telomeersetes järjestustes, kuna neid on palju rikkalikumalt.

Enamikul keemilistest ainetest ja erinevat tüüpi kiirgusest on molekulaarsel, rakulisel ja kromosoomitasandil mitu mõju, mis võivad ilmneda samaaegselt ja erineva ulatusega, sõltuvalt annusest. Genotoksiliste sündmuste tõlgendamine tuumajagunemiskiirusele ja nekroosile või apoptoosile avalduva mõju puudumise kohta võib olla segane, kuna genoomi kahjustuse täheldatud suurenemine võib olla tingitud kaudsetest teguritest, nagu apoptoosi pärssimine või puudulikest / lubavatest rakutsükli kontrollpunktidest, mis viib lühemate rakutsükli ajad ja suuremad kromosoomi valedegregatsiooni määrad. Lisaks annab tuumajaotuse indeksi (NDI) ja nekroosi ja apoptoosi läbinud rakkude osakaalu määramine olulist teavet uuritava aine tsütostaatiliste ja tsütotoksiliste omaduste kohta, mis on oluline toksilisuse hindamisel. Inimese lümfotsüütides annab NDI ka mitogeeni vastuse mõõtme, mis on kasulik immuunvastuse biomarker toitumisuuringutes ja võib olla seotud ka genotoksilise kokkupuutega 3, 23, 36, 37, 38, 56 . Tsütomeetod CBMN Cyt analüüsis on oluline, kuna see võimaldab genotoksilisi (MNi, NPB ja NBUD-sid BN-rakkudes), tsütotoksilisi (nekrootiliste ja apoptootiliste rakkude osakaal) ja tsütostaatilisi (ühe-, kahe- ja mitmetuumaliste rakkude osakaal ja suhe, NDI) sündmused, mis kajastatakse ühe testi jooksul.

Kokkuvõtteks võib öelda, et CBMN-meetod on arenenud DNA kahjustuste ja eksliku, kromosomaalse ebastabiilsuse, mitootiliste kõrvalekallete, rakusurma ja tsütostaasi tõhusaks tsütoomianalüüsiks, võimaldades otsest ja / või kaudset mõõtmist raku- ja tuumafunktsiooni häirete erinevate aspektide, näiteks

  • parandamata kromosoomi purunemised, DNA valeparandus, tsentrilised kromosoomifragmendid ja asümmeetriline kromosoomi ümberkorraldus (MN või NPB, millega kaasneb tsentrilistest kromosoomifragmentidest pärit MN),

  • telomeersed sulandumised (NPB koos telomeersignaalidega silla keskel ja võimaluse korral ilma MN-iga)

  • kromosoomide vale segregatsioon spindli või kinetokoore defektide või rakutsükli kontrollpunkti valest talitlusest (MN, mis sisaldab terveid kromosoome või kromosoomispetsiifiliste tsentromeeride signaalide asümmeetriline jaotus BN rakkude tuumades),

  • amplifitseeritud DNA ja / või DNA paranduskomplekside (NBUD) tuuma likvideerimine,

  • kromosomaalse ebastabiilsuse fenotüüp ja purunemis-sulandumissillatsüklid (MNi, NPB ja NBUD samaaegne ekspressioon)

  • DNA hüpometüleerimine (terved 1., 9. ja 16. kromosoomi sisaldava MN sageduse spetsiifiline tõus),

  • muutunud mitootiline aktiivsus ja / või tsütostaas (NDI) ja

  • rakusurm nekroosi või apoptoosi tagajärjel (nekrootiliste ja apoptootiliste rakkude suhe)

Genotoksilisuse katseprotseduuride rahvusvahelise seminari mikrotuuma testi töörühm jõudis järeldusele, et testi vastuvõtmiseks on kohustuslik näidata nii kontroll- kui ka töödeldud rakkudes rakkude proliferatsiooni, kuna MN ekspressioon on ohustatud, kui tsütostaatiliste või halbade rakkude abil jagunevate rakkude osakaal väheneb koekultuuri tingimused 9, 57, 58 . On ilmne, et parim viis muudetud rakkude jagunemise kineetika võimalike segavate mõjude kõrvaldamiseks on kasutada CBMN Cyt testi sõltumata rakutüübist, mida kasutatakse MNi määramisel BN rakkudesse, mis lisaks võimaldab mõõta nii NPB-sid kui ka NBUD-sid, tsütotoksilisus ja tsütostaatiline toime. Cyt-B mittekasutamise valik on õigustatud ainult nendes harvadel olukordades, kus tsütokiinide defekte uuritakse spetsiaalselt.

CBMN-test on juba osutunud tõhusaks vahendiks raku- ja tuumafunktsiooni häirete uurimisel, mis on põhjustatud in vitro või in vivo vananemisest, mikrotoitainete puudusest või liigsusest, genotoksiiniga kokkupuutest ja genoomi säilitamise geneetilistest defektidest. Värskeimad uuringud näitavad, et see meetod osutub tõenäoliselt viljakaks ka toitumise ja toksikogenoomika ning nende kombinatsioonide tekkivates valdkondades, kuna muutub üha selgemaks, et toitainete seisund mõjutab ka tundlikkust eksogeensete genotoksiinide suhtes 59 . CBMN Cyt testi lõppeesmärgiks on selle võime ennustada haiguse tulemusi ennetavalt. Projekt Inimese mikrotuuma (HUMN) (//www.humn.org), rahvusvaheline koostööprojekt, mille eesmärk on kindlaks teha MN sagedust mõjutavad muutujad inimestel ja selle biomarkeri patoloogiline olulisus 60, lõpetas hiljuti kohordi uuringu, mis hõlmas kokku 6718 katsealust kümnest riigist, skriinitud MN sageduse kohta aastatel 1980–2002; vähktõve esinemissageduse olulist suurenemist täheldati keskmise (RR = 1, 84; 95% CI: 1, 28–2, 66) ja kõrge MN-sagedusega (RR = 1, 53; 95% CI: 1, 04–2, 25) rühmade subjektides, võrreldes patsientidega, kellel oli madal MN sagedus 61 . Suitsetajate kopsuvähi juhtumikontrolli uuringu tulemused näitasid, et nii spontaanne kui ka nikotiinist saadud nitrosamiin-4- (metüülnitrosamino) -1- (3-püridüül) -1-butanoon (NNK) põhjustatud MNi on seotud suurenenud kopsuvähiga risk (vastavalt OR 2, 06 ja 2, 32) ning seos NPB (vastavalt OR 29, 05 ja 45, 52) ning NBUD-dega (vastavalt 6, 53 ja 10, 10) oli veelgi suurem 62 . Need esialgsed tulemused näitavad CBMN Cyt testi potentsiaalset ennustatavat väärtust vähiriski suhtes ja kinnitavad selle kasutamist testina potentsiaalselt kantserogeensete toitumis-, keskkonna- ja geneetiliste tegurite tuvastamiseks.

CBMN Cyt testi kasutamine perifeerse vere lümfotsüütides annab võimaluse ühtlustatud lähenemiseks genotoksilisuse ja tsütotoksilisuse uurimiseks nii in vitro kui ka ex vivo , mis on oluline in vivo mõju modelleerimiseks ja prognoosimiseks inimestel. See annab võimaluse sama süsteemi abil kontrollida, mil määral in vitro test ennustab in vivo genotoksilisi sündmusi. CBMN Cyt testi vastuvõtmine farmaatsiatööstuses 57, 58, 63, selle rakendamine inimese genotoksiliste kokkupuudete bioloogiliseks seireks 24, 60, 61 ning selle üha suurenev rakendamine ennetava meditsiini ja toitumise alal 62, 64, 65 ning suurenenud investeeringud CBMN Cyt testi automatiseerimine (vt //www.imstar.fr/applications/genotoxicity/micronucleiassay/; //www.metasystems.de/products/metafer/metafer_msearch.htm; //www.biocompare.com/techart.asp ? id = 1247) näitavad selle testi kasvavat tähtsust 66, 67, 68, 69, 70, 71 .

Eraldatud lümfotsüütide kultuurides rakendatavat CBMN Cyt testi standardmeetodit ja selle erinevaid modifikatsioone, mida kasutatakse koos teiste kultiveerimissüsteemide ja rakutüüpidega, kirjeldatakse üksikasjalikult järgmistes osades. Ajastuse teabe leiate tabelist 1.

Täissuuruses tabel

Materjalid

Reaktiivid

  • Ficoll – Paque, steriilne (Amersham Pharmacia Biotech; # 17-0840-03, 500 ml, # 17-0840-02, 100 ml)

    Ettevaatust

    See toode on väga püsiv, kui pudel jääb avamata; pikaajalisel kokkupuutel õhuga võib see aga halveneda. Parimate tulemuste saamiseks dateerige pudelid alati, kasutage 100 ml pudeleid ja eemaldage need nõela ja süstla abil aeglaselt, ilma et tihendit purustataks. Hoida temperatuuril 4 ° C. Kasutada toatemperatuuril (20–22 ° C).

  • Hanki tasakaalustatud soolalahus (HBSS), steriilne, kaltsiumi ja magneesiumiga, ilma fenoolpunaseta (Trace, # 11-101-0500V). Hoida temperatuuril 4 ° C

    Kriitiline

    • Kasutada toatemperatuuril (20–22 ° C).

  • RPMI 1640 sööde, ilma L-glutamiinita, steriilne vedelik (Trace, # 11-066-0500V, 500 ml või # 11-066-100V, 100 ml). Hoida temperatuuril 4 ° C. Kasutada kultuuride ettevalmistamisel temperatuuril 37 ° C.

  • Veise loote seerum (FBS), kuumusega inaktiveeritud, steriilne (Trace, # 15-010-0100V, 100 ml). Hoida külmutatud temperatuuril –20 ° C. Enne söötmele lisamist sulatage see temperatuuril 37 ° C veevannis. Pärast sulatatud FBS püsib temperatuuril 4 ° C stabiilsena 3–4 nädalat

    Ettevaatust

    Vältige sulatatud FBS korduvat uuesti külmutamist.

  • L-glutamiini lahus, 200 mM steriilne lahus, testitud rakukultuur (Sigma, # G7513, 20 ml). Hoida külmutatud temperatuuril –20 ° C 1, 1 ml alikvootidena. Enne söötmele lisamist sulatage see toatemperatuuril

  • Naatriumpüruvaadi lahus, 100 mM naatriumpüruvaat, steriilne lahus (Trace, # 21-154-0100V, 100 ml). Hoida külmutatud temperatuuril –20 ° C 1, 1 ml alikvootidena. Enne söötmele lisamist sulatage see toatemperatuuril

  • Cyt-B (Sigma, # C6762)

    Ettevaatust

    See materjal on mürgine ja võimalik teratogeenne. Seda tuleb alati osta suletud viaalides. Selle reaktiivi ettevalmistamine peab toimuma tsütokaitsekorpuses ja kasutama tuleb järgmisi isikukaitsevahendeid: Tyveki kleit, tolmumass P2, kahekordsed nitriilkindad ja kaitseprillid.

  • DMSO (Sigma, hübriid, steriilselt filtritud, nr D2650)

  • Fütohemagglutiniin (PHA; Abbott Murex, # HA15 8E27)

  • Isoton II (Coulter Electronics, # 8546719)

  • Zapoglobin (Coulter Electronics, nr 9366013)

  • DePex (või DPX) kinnitusvahend (Ajax, 3197)

  • 1% (mass / maht) hüpokloriti lahus tsütsentrifuugikuppide desinfitseerimiseks. Vahetage iganädalaselt

  • Diff-Quik värvimiskomplekt (Lab-Aids LP64851, tarninud Surgical and Medical). Koosneb fikseerimisvahendist, lahusest 1 (oranž) ja lahusest 2 (sinisest). Plekke saab uuesti kasutada ja need võivad sõltuvalt kasutamisest kesta mitu kuud. Diff-Quik on modifitseeritud Wright-Giemsa plekk

  • Metanool (Ajax Univar, # 318) rakkude fikseerimiseks. Seda fiksaatorit saab kasutada Diff-Quiku fikseerimisvahendi asemel, kui see otsa saab

  • 0, 85% (mass / maht) isotooniline soolalahus, steriilne, PHA lahuse valmistamiseks: lisage 4, 25 g naatriumkloriidi 500 ml Milli-Q veele, autoklaavige 30 minutit 121 ° C juures ja hoidke seejärel temperatuuril 4 ° C.

Varustus

  • Steriilsed vaktsiinitoru veretorud, kus antikoagulandina kasutatakse liitiumhepariini (nt Greineri vaakumtorud 9 ml, # 455084 geeli pole)

  • 70 ml gamma polüstüreenist steriilsed mahutid (nt Sarstedt 75.9922.333)

  • 10 ml steriilsed gradueeritud pipetid (Falcon # 7551)

  • Eelistatud toru Ficolli eraldamiseks - sõltuvalt vere mahust: 50 ml steriilset koonilist polüstüreeni (Falcon # 2073), 15 ml steriilset, koonilist polüpropüleeni (Falcon # 2096), 10 ml polüstüreeni, kollase korgiga, steriilne, V-põhjaga (Ühekordselt kasutatavad tooted nr 21829)

  • Steriilsed korpusega Pasteuri pipetid 9 ″ (22–23 cm) (Chase # 93P)

  • 200–1000 μl Finnpipetti + steriilsed 1 ml otsikud (Labsystems, Edward Instruments Co. # 1040-800 sinine)

  • 40–200 μl Finnpipetti + steriilsed 200 μl otsikud (Labsystems, Edward Instrument Co. # 1030-800 kollane)

  • Bioloogilise ohutuse kabinet (nt Gelman Sciences II klassi BH seeria)

  • Pingitud tsentrifuug, suletud ämbritega biosafe, mis on võimeline ketrama 1000 g juures (nt MSE Mistral 2000R)

  • Elementide loendur (nt Coulter Electronics mudel ZB1). Selle asemel võib kasutada hemotsütomeetrit, kui elektrooniline rakuloendur pole saadaval

  • Loendusviaalid 15 ml (Johns lahjendusviaalid nr DSV002)

  • Rakkude kasvatamiseks eelistatav tuub sõltub lõplikust kultuurimahust. 750 μl isoleeritud lümfotsüütide kultuuri jaoks kasutage 6 ml vahtpolüstüreeni, gamma-steriliseeritud ümarapõhjast katseklaasi (Falcon # 2058).

  • Ühekordseks kasutamiseks mõeldud 0, 22 μm filtrisõlmed, süstlapõhised (Millipore-GS, # SLGS0250S)

  • 0, 2 μm hüdrofoobne filter (Millipore, Dualex # SSLOVS25XS)

  • Tsütsentrifuug (nt Shandon Cytocentrifuge firmalt Thermo Electron Corporation, //www.thermo.com)

  • Mikroskoobi objektiklaasid, jäätunud otsaga, 76 × 26 mm (3 × 1 ″), paksusega 1 mm (HD Scientific MZO2 110) - alkoholiga pühitud ja enne kasutamist lastud kuivada

  • Filtrikaardid - Shandon 3 × 1 ″, paksud, valged, karbid suurusega 200 (tootjalt Thermo Electron Corporation)

  • Tsütsentrifuugikupid - tarnitud koos Thermo Electron Corporation instrumendiga. Enne monteerimist peab olema puhas ja täiesti kuiv

  • Metallist liugklambrid - 12, mis on varustatud instrumendiga Thermo Electron Corporation

  • Liugklapi avaja - tarnitakse Thermo Electron Corporationi instrumendiga

  • Värvimisalused ja -mahutid

  • Kaaned, ei. 1, 22 × 50 mm (HD Scientific MZ LD2250)

  • Koed või Whatman ei. 1 filterpaber, nr. 371001240, läbimõõt 24 cm (firmalt Lab Supply)

  • Suurepärase optikaga mikroskoop värvitud slaidide erevälja ja fluorestsentsi uurimiseks × 1000 suurendusega (nt Leica DMLB, Nikon Eclipse 600)

  • Lükandkarbid (Kartell, nr 278)

Reaktiivi seadistamine

  • Kultiveerimissööde Valmistatakse, lisades 90 ml RPMI 1640 söödet 10 ml 100% FBS, 1 ml 200 mM L-glutamiini ja 1 ml 100 mM naatriumpüruvaadi lahusega.

    Valmistage sööde steriilsetesse koekultuuriklassi klaas- või plastpudelitesse. Sõltuvalt vajalike kultuuride arvust võib valmistada väiksema koguse söötme. Kultiveerimissöödet võib enne kasutamist hoida temperatuuril 4 ° C 1 nädal. Valmistatud söödet ei pea tavaliselt steriilselt filtreerima, kui järgitakse ranget aseptilist tehnikat; kuid selleks, et olla täiesti kindel, võib söötme steriilselt filtreerida, kasutades 0, 22 μm filtrit.

  • Cyt-B 5 mg tahket ainet lahustatakse 8, 33 ml DMSO-s, et saada Cyt-B lahuse kontsentratsioon 600 μg ml −1 järgmiselt:

    1. Eemaldage Cyt-B viaal temperatuuril -20 ° C ja laske soojeneda toatemperatuurini. Ärge eemaldage tihendit.

    2. Steriliseerige kummitihendi ülemine osa etanooliga ja laske etanoolil aurustuda.

    3. Pipeteerida 8, 33 ml DMSO-d 50 ml steriilsesse Falconi tuubi.

    4. Vabastage viaali tihend 25 G nõela ja 0, 2 μm hüdrofoobse filtriga.

    5. Süstige 5 ml steriilse süstla ja teise nõela abil läbi tihendi 4 ml 8, 3 ml DMSO-d.

    6. Segage sisu õrnalt. Cyt-B peaks DMSO-s kergesti lahustuma. Jätke süstal ja nõel paika.

    7. Eemaldage 4 ml viaalist süstlasse ja väljutage märgistatud steriilsesse TV10 tuubi.

    8. Aspireerige ülejäänud 4, 3 ml DMSO-d süstlasse ja süstige viaali nagu enne.

    9. Eemaldage see viimane maht viaalist ja väljutage TV10 tuubi.

    10. Segage ja jagage 100 μl alikvoodid steriilsetesse, 5 ml polüstüreenist kollastes korkides katseklaasidesse, mis on märgistatud kuupäevaga Cyt B.

    11. Hoida temperatuuril –20 ° C kuni 12 kuud. Sigma garanteerib pulbriviaalidele 2 aasta jooksul, kui neid hoitakse temperatuuril –20 ° C.

  • PHA Selle reaktiivi valmistamist on toote infolehes toodud juhistest pisut muudetud, et see sobiks selle protokolliga. 45 mg tahket ainet lahustatakse 20 ml steriilses isotoonilises soolalahuses, et saada 2, 25 mg ml −1 lahus järgmiselt:

    1. Eemaldage viaal külmkapist ja laske soojeneda toatemperatuurini. Ärge eemaldage tihendit.

    2. Steriliseerige kummitihendi ülemine osa etanooliga ja laske etanoolil aurustuda.

    3. 20 ml steriilset isotoonilist soolalahust pipeteeritakse 50 ml steriilsesse Falconi tuubi.

    4. Vaakumi purustamiseks õhutage tihendit 25G nõela ja 0, 22 μm hüdrofoobse filtriga.

    5. 10 ml steriilse süstla ja teise nõela abil süstige viaali 5 ml 20 ml isotoonilist soolalahust ja lahustage tahke aine.

    6. Eemaldage 5 ml lahus viaalist süstlasse ja väljutage teise märgistatud steriilsesse 50 ml Falconi tuubi.

    7. Lisage viaali süstla abil veel 5 ml isotoonilist soolalahust ja segage ettevaatlikult.

    8. Eemaldage see maht viaalist ja väljutage märgistatud Falconi tuubi.

    9. Lisage märgistatud Falconi torusse ülejäänud 10 ml isotoonilist soolalahust.

    10. Jaotage 500 μl alikvoodid steriilsetesse, märgistatud 1, 2 ml viaalidesse (krüoviaalne tüüp).

    11. Hoida temperatuuril 4 ° C kuni 6 kuud.

    Märkus: 500 μl alikvoodid on ainult ühekordseks kasutamiseks. Visake viaalist järelejäänud lahus ära. Visake viaal bakteriaalse saastumise tunnustega ära. Võib esineda kerget hägusust, kuid see ei mõjuta PHA aktiivsust.

Protseduur

Leukotsüütide eraldamine ja loendamine

Ajastus: umbes 3 tundi

  1. Värske veri kogutakse veenipunktsiooni teel vaakuminainerite veretorudesse liitiumhepariini antikoagulandiga. Hoidke veretorusid toatemperatuuril (st 20–22 ° C). Võetud maht sõltub vajalike rakkude arvust. (Tavaliselt võib eeldada, et 1 ml vere kohta koguneb kuni 1 × 106 leukotsüüti.)

    Ettevaatust

    Kõik protseduurid kuni slaidi ettevalmistamiseni tuleb läbi viia aseptiliselt II klassi bioloogilise ohutuse kabinetis.

  2. Lahjendage täisveri 1: 1 suhtega HBSS-iga (20–22 ° C) ja segage segu ettevaatlikult ümber.

  3. Kandke lahjendatud veri Ficoll-Paque'ile õrnalt üle suhtega 1: 3 (nt 2 ml Ficoll-Paque: 6 ml lahjendatud verd), olles väga ettevaatlik, et mitte liidest häirida.

  4. Katsetage ja tasakaalustage tsentrifuugi ämbrid enne tuubide tsentrifuugimist 30 minutit temperatuuril 18–20 ° C 400 g juures.

  5. Eemaldage Ficoll-Paque'i liidesest lahjendatud leukotsüütide kiht ja lahjendatud plasma steriilse korgiga Pasteuri pipeti abil uude katseklaasi, jälgides, et Ficoll-Paque ei eemalduks liiga palju.

  6. Lahjendage leukotsüütide suspensioon (mis sisaldab lümfotsüütide ja monotsüütide segu) toatemperatuuril (20–22 ° C) 3-kordse HBSS-i mahuga, segage ettevaatlikult ja tsentrifuugige seejärel 10 minutit 180 g juures.

  7. Supernatant visatakse ära ja resuspendeeritakse rakupellet (kergelt beež) Pasteuri pipeti abil 2-kordses HBSS-i eemaldatud ruumalas ja tsentrifuugitakse seejärel 100 g juures 10 minutit temperatuuril 18–20 ° C.

  8. Supernatant eemaldatakse ja resuspendeeritakse rakud Pasteuri pipeti abil õrnalt toatemperatuuril 1 ml söötmes.

  9. Lahtrid loendatakse, kasutades loendurit.

  10. Seadke inimese lümfotsüütide loendamiseks seadme seaded (nt Coulteri loenduri mudel ZB1; lävi: 8, sumbumine: 1, ava: 1/4, manomeeter: 0, 5 ml).

  11. Punaste vereliblede jääkide lahjendamiseks lahjendage 15 μl rakususpensioon 15 ml isotoniks + viis tilka zapoglobiini.

  12. Keskmise määramiseks tehakse loendus kolmes eksemplaris. Kui rakkude arv on> 15 000, loendatakse selle asemel 7, 5 μl rakke, siis korrutatakse kahega. Korrutage väärtus 2000-ga (lahjendustegur 1000 ja loendusmaht 0, 5 ml), et saada rakkude arv milliliitri kohta.

  13. Rakkude seadistamiseks 750 μl söötmes 1 × 10 6 ml kohta, jagage 750 (μl) rakkude arvuga milliliitris ja korrutage 1-ga. See annab rakkude mahu, mida kasutatakse μl-s. Selle maht täiendatakse söötmega kuni 750 μl.

    Näide: keskmine rakkude arv = 12 586

    12 586 × 2000 = 25, 2 × 106 rakku ml kohta

    750 μl / 25, 2 (× 10 6 ) × 1 (× 10 6 ) = 29, 8 μl

    29, 8 μl rakususpensioon + 720, 2 μl söödet = rakususpensioon kontsentratsiooniga 1 × 106 6 ml kohta 750 μl.

    Paus punkt

    • Rakke võib sel ajal toatemperatuuril pimedas 1–2 tunniks söötmesse jätta, tuubid sulgedes.

Lümfotsüütide kasvatamine, Cyt-B lisamine ja rakkude kogumine

Ajastus: 72 tundi

  1. Ülaltoodud arvutuse (etapp 13) abil resuspendeerige rakud uuesti söötmesse kontsentratsiooniga 1x106 ml kohta. Lisage söötme arvutatud maht märgistatud 6 ml ümarapõhjalistesse katsutitesse, seejärel lisage rakud söötmesse, et saada lõppmaht 750 μl. Seadistage uuritava subjekti ja / või ravi jaoks topeltkultuurid (joonis 6).

  2. Stimuleerige lümfotsüütide mitootilist jagunemist, lisades PHA. Lisage 10 μl PHA lahust 750 μl kultuurile, et saada lõppkontsentratsioon 30 μg ml −1 . Pärast kasutamist visake järelejäänud PHA ära.

  3. Inkubeerige rakke temperatuuril 37 ° C täpselt 44 tunni jooksul niisutatud keskkonnas, mis sisaldab 5% CO 2, lahti kaanedega.

    Kriitiline samm

    • Cyt-B tuleb lisada täpselt 44 tundi pärast PHA stimuleerimist.

    Image

    Täissuuruses pilt

    Cyt-B lisamine kultuurile

    1. Sulatage viaal, mis sisaldab 100 μl Cyt-B lahust DMSO-s kontsentratsiooniga 600 μg ml −1 .

      Ettevaatust

      Tehke kõik Cyt-B lahustega manipuleerimised õhupuhastiga, mille alusklaas on kuni rinna tasemeni, ja kasutage järgmisi isikukaitsevahendeid: Tyveki kleit, kahekordsed nitriilkindad ja kaitseprillid. Need ettevaatusabinõud on vajalikud kaitseks bioloogiliselt ohtlike ja tsütotoksiliste aerosoolide eest.

    2. Lisage viaali aseptiliselt 900 μl toatemperatuuril tasakaalustatud söödet, et saada 1000 μl lahust 60 μg ml −1 Cyt-B.

    3. Eemaldage 750 μl kultuuri ülaosast 56 μl söödet ja asendage 56 μl 60 μg ml −1 Cyt-B lahusega, et saada Cyt-B lõplik kontsentratsioon 4, 5 μg ml −1 .

    4. Pange kultuurid tagasi inkubaatorisse ja inkubeerige kultuure veel 28 tundi. Ülejäänud Cyt-B lahus visake ära.

    5. Pärast Cyt-B lisamist 24–28 tundi kogutakse rakud slaidide ettevalmistamiseks ja skoorimiseks vastavalt allpool toodud protseduurile. Valitud koristusaeg peaks maksimeerima BN-rakkude osakaalu ja minimeerima ühetuumaliste ja mitmetuumaliste (kolme või enama tuumaga) rakkude sagedust.

    Rakkude kogumine tsütsentrifuugimisega

    Ajastus: umbes 30 minutit

    1. Järgige slaidide, filtrikaartide ja tsütotsentrifuugikuppide kokkupanekul tsütostsentrifuugi rootori tootja juhiseid. Tsütotsentrifuugimine viiakse läbi temperatuuril 18–20 ° C.

    2. Valmistage rakkude kontsentratsioon, mis on piisav rakkude ühekihilise valmistamiseks igas kohas. Rakkude optimaalse kontsentratsiooni saavutamiseks objektiklaasil pärast tsütotsentrifuugimist võib osutuda vajalikuks kultuuri õrnalt tsentrifuugimine ja osa supernatandi eemaldamine. Lümfotsüütide kasvatamise korral ümarapõhjalistes tuubides on vaja eemaldada ainult supernatant (umbes 300 μl 1 ml kultuurist), kuna rakud kipuvad inkubaatorisse settima.

      Ettevaatust

      Rakukultuuriproovi laadimine ja tsütotsentrifuugimine (sammud 23–28) tuleb läbi viia õhupuhastiga või eelistatavalt heakskiidetud tsütokaitsmekapis. Kandke sobivat kaitsekaitset, sealhulgas kindaid.

    3. Rakud resuspendeeritakse, kasutades Pasteuri või Gilsoni pipeti abil rakkude lagunemist. Kõige parem on kõigepealt koristada kõik koristatavad kultuurid ja seejärel uuesti vahetult enne proovikupusse laadimist uuesti koristada.

    4. Kiiresti töötades lisage iga proovi tassi süvendisse 100–200 μl rakususpensiooni. Tsütokiinidega blokeeritud lümfotsüütide kultuuride maht on tavaliselt 120 μl. Vajalik maht võib vajada väikest kohandamist, sõltuvalt rakkude kontsentratsioonist kultuuris ja optimaalsele rakkude tihedusele slaidide määramiseks, mis määratakse katse-eksituse meetodil.

    5. Pange rootori kaas tagasi ja lukustamiseks vajutage keskel asuvat nuppu. Asetage rootor tsütotsentrifuugi ja klõpsake peamist kaant kinni. Seadke tootja soovitatud kellaaja ja kiiruse parameetrid.

    6. Vajuta start. Masin käivitab programmi, peatub ja aeglustub automaatselt.

    7. Rootori tagasivoolukanalile tagasipöördumisel järgige iga liugklapi avamiseks tootja protseduure.

    Rakkude kuivatamine, kinnitamine ja värvimine ning slaidide ettevalmistamine

    Ajastus: umbes 30 minutit

    1. Demonteerige kõik klappide hoidjad ja jälgige, et laigud ei määrduks. Visake filtrikaardid bioloogiliste ohtude prügikasti. Pange proovikupud 1% hüpokloriti lahusesse, et leotada vähemalt 10 minutit, seejärel loputage kuus korda ettevaatlikult puhta veega ja kuivatage. Ärge kasutage tasside kuivatamiseks otsest kuumust.

      Ettevaatust

      Proovide värvimisel tuleb kanda sobivat kaitset, sealhulgas nitriilkindaid.

    2. Pange objektiklaasid horisontaalselt alusplaadile ja laske rakkudel õhu käes kuivada täpselt 10 minutit toatemperatuuril.

      Kriitiline samm

      • Ärge kuivatage objektiklaase õhu käes kui kauem kui 10 minutit, vastasel juhul muutuvad raku ja tuuma morfoloogia, mis muudab klappide skoorimise keerukaks.

    3. Pange objektiklaasid vertikaalselt kuiva peitsimisalusesse ja asetage 10–15 minutiks metanooli või Diff-Quiku fikseerimisvahendisse. Metanooli saab uuesti kasutada.

    4. Viige rack viivitamatult Diff-Quik lahusesse 1 (oranž) ja värvitage 6 sekundit, liigutades resti edasi-tagasi. Vajadusel suurendage värvimisaega.

    5. Viige rack viivitamatult Diff-Quik'i lahusesse 2 (sinine) ja värvige veel 6 sekundit, liigutades nagi edasi-tagasi. Jällegi võib värvimisaega vajadusel pikendada.

      Kriitiline samm

      • Värvimisaeg määratakse katse-eksituse meetodil sõltuvalt sellest, kui värsked plekid on. Eesmärk on saavutada tuuma- ja tsütoplasmaatilise värvimise vahel optimaalne kontrast, nii et CBMN Cyt testi erinevad biomarkerid oleksid hõlpsalt ja ühemõtteliselt skooritud.

    6. Hoides objektiklaase riiulis, peske neid väga lühidalt ja õrnalt kraaniveega ning loputage puhta veega, veendudes, et kiledele jäävad veepiisad ei libiseks.

    7. Pange slaidid koheselt paberiga kaetud salvrätikutele (või veel parem, Whatman nr 1 filterpaber), et kogu jääkniiskus eemaldada. Ärge suruge rakualadele survet ega hõõruge neid.

    8. Pange objektiklaasid alusklaasile ja laske kuivada umbes 10–15 minutit.

    9. Uurige rakke värvumisefektiivsuse ja rakkude tiheduse hindamiseks × 100 ja × 400 suurendusel, pidades meeles, et CBMN Cyt testi jaoks on vajalik vähemalt 1000 BN rakku. Resistentsuse saab selles etapis läbi viia, kui värvimine on liiga kerge, korrates samme 30–37. Kui rakkude tihedus on liiga raske või kerge, kontsentreerige või lahjendage rakud vastavalt vajadusele ja korrake ketrus- ja värvimistoiminguid.

    10. Kui objektiklaasid on rahuldavad, suletakse kultuure sisaldavad tuubid või kolvid ja visatakse bioohtlike jäätmete prügikasti.

    11. Enne kaaneklappide panemist laske objektiklaasidel täielikult kuivada vähemalt 30 minutit.

      Paus punkt

      • Objektiklaase võib kuivatada jätta toatemperatuuril üleöö.

    Katte libisemine ja ladustamine

    1. Asetage katteks libistatavad slaidid lapile või paberile ja pange igaühe kõrvale üks katteklapp.

      Ettevaatust

      Orgaanilise lahusti sissehingamise vältimiseks DePex-is viige läbi katte libisemine ja hoidke klaasid seal täiesti kuivaks.

    2. Pange kaks suurt tilka DePexi (kasutage plastist tilgutit) igale kattekilele ligikaudsele alale, kus laigud vastavad.

      Ettevaatust

      DePex-keskkonna kandmisel kandke nitriilkindaid.

    3. Pöörake slaid ümber katte libisemisliistu ja laske DePexil kapillaaride toimel levida. Liigse DePexi ja õhumullide väljutamiseks libistage katteklappi ettevaatlikult edasi-tagasi. Veenduge, et täppide kohal ei oleks õhumulle.

    4. Pühkige liigne DePex klaasi servadest ja veenduge, et sööde või klaas ei kata ühtegi jäätunud etiketi piirkonda, kuna kodeeriv silt ei kleepu neile.

    5. Pange objektiklaasid alusele ja jätke üleöö aurukannisse kuivama.

    6. Hoidke objektiklaase klapikarpides toatemperatuuril ja kleepige kleepuva sildiga jäätunud ala kohale enne punktide määramist.

    7. Skoorige biomarkerid CBMN Cyt analüüsis, kasutades 1. lahtris kirjeldatud kriteeriume. Üksikasjalikuma teabe saamiseks iga slaidi kohta vaadake 2. selgitust. Lahtris 3 selgitatakse, kuidas NDI arvutatakse, samuti mõõtmise eesmärki. Tüüpilise tulemustabeli põhielemendid on loetletud tabelis 2 ja tulemuslehe näide on toodud tabelis 3. CBMN Cyt analüüsis saadud erinevate rakutüüpide tervikliku fotogalerii kohta vt Fenech jt . 72 . Joonistel 7, 8, 9, 10 on skemaatiliselt selgitatud MNi, NPB ja NBUD-de olemasolu määramiseks sobivate BN-rakkude valimise kriteeriumid (joonis 7) - muud erinevad rakutüübid, mida vaadeldakse ja skooritakse CBMN Cyt analüüsis (joonis 7). Joonis 8), MNi (joonis 9) ja BN rakkude muude struktuuride, mis sarnanevad MNi-ga, kuid kujutavad tegelikult muid ebanormaalseid rakulisi sündmusi, tüüpiline suurus ja välimus (joonis 10).

      Veaotsing

    Elujõuliste ühe-, kahe- ja mitmetuumaliste rakkude skoorimise kriteeriumid

    Tsütostaatiliste mõjude ja mitootilise jagunemise määra määramiseks mõõdetakse elujõuliste ühe-, kahe- ja mitmetuumaliste rakkude sagedust, mida saab arvutada tuumajaotuse indeksi abil (vt 3. selgitus). Nendel rakutüüpidel on järgmised omadused:

    • Mono-, bi and multinucleated cells are viable cells with an intact cytoplasm and normal nucleus morphology containing one, two and three or more nuclei, respectively.

    • They may or may not contain one or more MNi or NBUDs and in the case of bi- and multinucleated cells they may or may not contain one or more NPBs.

    Necrotic and apoptotic cells should not be included among the viable cells scored.

    On rare occasions, multinucleated cells with more than four nuclei are observed if cell-cycle time is much shorter than normal or the cytokinesis-blocking time is too long.

    Figures 2, 3 and 7, 8, 9, 10 illustrate some typical examples.

    Criteria for scoring apoptotic cells

    Apoptotic lymphocytes are cells undergoing programmed cell death. They have the following characteristics:

    • Early apoptotic cells can be identified by the presence of chromatin condensation within the nucleus and intact cytoplasmic and nuclear membranes.

    • Late apoptotic cells exhibit nuclear fragmentation into smaller nuclear bodies within an intact cytoplasm/cytoplasmic membrane.

    • Staining intensity of the nucleus, nuclear fragments and cytoplasm in both kinds of apoptotic cell is usually greater than that of viable cells.

    Figures 1, 2, 3e and 8 illustrate typical examples of apoptotic cells.

    Criteria for scoring necrotic cells

    Necrosis is an alternative form of cell death that is thought to be caused by damage to cellular membranes, organelles and/or critical metabolic pathways required for cell survival such as energy metabolism. Necrotic lymphocytes have the following characteristics:

    • Early necrotic cells can be identified by their pale cytoplasm, the presence of numerous vacuoles (mainly in the cytoplasm and sometimes in the nucleus), damaged cytoplasmic membrane and a fairly intact nucleus.

    • Late necrotic cells exhibit loss of cytoplasm and damaged/irregular nuclear membrane with only a partially intact nuclear structure and often with nuclear material leaking from the nuclear boundary.

    • Staining intensity of the nucleus and cytoplasm in both types of necrotic cell is usually less than that observed in viable cells.

    Figures 1, 2, 3d and 8 illustrate typical examples of necrotic cells.

    Criteria for selecting BN cells suitable for scoring MNi, NPBs and NBUDs

    The cytokinesis-blocked BN cells that may be scored for MN, NPB and NBUD frequency should have the following characteristics:

    • The cells should be binucleated.

    • The two nuclei in a binucleated cell should have intact nuclear membranes and be situated within the same cytoplasmic boundary.

    • The two nuclei in a binucleated cell should be approximately equal in size, staining pattern and staining intensity.

    • The two nuclei within a BN cell may be attached by a nucleoplasmic bridge, which is no wider than 1/4th of the nuclear diameter.

    • The two main nuclei in a BN cell may touch but ideally should not overlap each other. A cell with two overlapping nuclei can be scored only if the nuclear boundaries of each nucleus are distinguishable.

    • The cytoplasmic boundary or membrane of a binucleated cell should be intact and clearly distinguishable from the cytoplasmic boundary of adjacent cells.

    Examples of the types of binucleated cells that may be scored are illustrated diagrammatically in Figures 1, 2, 3, 4, 5 and 7. The cell types that should not be scored for the frequency of MNi, NPBs and NBUDs frequency include mono- and multinucleated (with three or more nuclei) cells and cells that are necrotic or apoptotic (illustrated in Fig. 8).

    Criteria for scoring micronuclei

    MNi are morphologically identical to but smaller than nuclei. They also have the following characteristics:

    • The diameter of MNi in human lymphocytes usually varies between 1/16th and 1/3rd of the mean diameter of the main nuclei, which corresponds to 1/256th and 1/9th of the area of one of the main nuclei in a BN cell, respectively.

    • MNi are non-refractile and they can therefore be readily distinguished from artifact such as staining particles.

    • MNi are not linked or connected to the main nuclei.

    • MNi may touch but not overlap the main nuclei and the micronuclear boundary should be distinguishable from the nuclear boundary.

    • MNi usually have the same staining intensity as the main nuclei but occasionally staining may be more intense.

    Examples of typical MNi that meet the criteria set above are shown in Figures 1, 2, 3, 4, 5 and 9. Examples of cellular structures that resemble MNi but should not be classified as MNi originating from chromosome breakage or loss are illustrated in Figure 10.

    Criteria for scoring nucleoplasmic bridges

    An NPB is a continuous DNA-containing structure linking the nuclei in a binucleated cell. NPBs originate from dicentric chromosomes (resulting from misrepaired DNA breaks or telomere end fusions) in which the centromeres are pulled to opposite poles during anaphase. They have the following characteristics:

    • The width of an NPB may vary considerably but usually does not exceed 1/4th of the diameter of the nuclei within the cell.

    • NPBs should also have the same staining characteristics as the main nuclei.

    • On rare occasions, more than one NPB may be observed within one binucleated cell.

    • A binucleated cell with an NPB may contain one or more MNi.

    • BN cells with one or more NPBs and no MNi may also be observed.

    Examples of BN cells with NPBs are illustrated in Figures 1, 2, 3g, 5, 7c, 7d and 9c.

    It may be more difficult to score NPBs in BN cells with touching nuclei, and it is therefore reasonable to specify whether NPBs were scored in all BN cells regardless of proximity of nuclei within a BN cell or whether they were scored separately in those BN cells in which nuclei were clearly separated and those BN cells with touching nuclei. There is not enough evidence yet to recommend scoring NPB only in BN cells in which nuclei do not touch.

    Criteria for scoring nuclear buds

    An NBUD represents the mechanism by which a nucleus eliminates amplified DNA and DNA repair complexes. NBUDs have the following characteristics:

    • NBUDs are similar to MNi in appearance with the exception that they are connected with the nucleus via a bridge that can be slightly narrower than the diameter of the bud or by a much thinner bridge depending on the stage of the extrusion process.

    • NBUDs usually have the same staining intensity as MNi.

    • Occasionally, NBUDs may appear to be located within a vacuole adjacent to the nucleus.

    If it is difficult to determine whether the observed nuclear anomaly is an MN touching the nucleus or a nuclear bud, it is acceptable to classify it as the latter.

    A small protrusion of nuclear material from the nucleus without an obvious constriction between the nucleus and the protruding nuclear material should not be classified as a nuclear bud. This type of event is called a nuclear bleb (see Fig. 10d). The significance of this type of event is unknown.

    Typical examples of NBUDs are shown in Figures 2, 3h and 10c.

    Slides should be coded before scoring by a person not involved in the experiment so that the person who scores the slides is not aware of the treatment conditions, individual or groups to which the cells on the slides belong. Slides are best examined at × 1, 000 magnification using a good-quality bright-field or fluorescence microscope (eg, Leica DMLB, Nikon Eclipse E 600). A score should be obtained for slides from each duplicate culture ideally from two different scorers using identical microscopes (Fig. 6). The number of cells scored should be determined depending on the level of change (effect size) in the MN index that the experiment is intended to detect and the expected standard deviation of the estimate. The optimal way to score slides in the CBMN cytome assay is to first determine the frequency of mononucleated, binucleated and multinucleated viable cells as well as the necrotic and apoptotic cells in a minimum of 500 cells; then the frequency of DNA damage biomarkers (MNi, NPBs and NBUDs) are scored in a minimum of 1, 000 binucleated cells. For each slide, the following information should therefore be obtained:

    1. the number of viable mononucleated, binucleated, multinucleated (with three or more nuclei) cells per 500 cells scored (from this information the Nuclear Division Index can be derived; see Box 3);

    2. the number of apoptotic cells per 500 cells;

    3. the number of necrotic cells per 500 cells;

    4. the number of MNi in at least 1, 000 binucleate (BN) cells;

    5. the frequency of BN cells containing MNi in at least 1, 000 BN cells;

    6. the frequency of BN cells containing NPBs in at least 1, 000 BN cells;

    7. the frequency BN cells containing NBUDs in at least 1, 000 BN cells.

    The distribution of BN cells with zero, one or more MNi may be useful to record if abnormal distribution of MNi among cells may be expected owing to partial body radiation in the case of ionizing radiation exposure or if it is expected that the agent being tested might induce multiple MNi in affected cells (eg, spindle poisons such as colcemid). Because most BN cells with more than one NPB or more than one NBUD are rare, it is usually not necessary to record distribution of NPBs and NBUDs among BN cells.

    The frequency of MNi and NBUDs in non-divided mononuclear cells can also be scored if the level of pre-existing DNA damage needs to be measured; however, this approach cannot be used instead of the CBMN Cyt assay, because it does not account for DNA damage accumulated in the bulk of lymphocytes in vivo while circulating in the quiescent phase, it cannot be used to measure NPBs and does not give the same results as scoring MN and NBUDs in BN cells 3, 90, 91, 97 .

    The NDI provides a measure of the proliferative status of the viable cell fraction. It is therefore an indicator of cytostatic effects and, in the case of lymphocytes, it is also a measure of mitogenic response, which is useful as a biomarker of immune function 22 .

    NDI is calculated according to the method of Eastmond and Tucker 107 . Score 500 viable cells to determine the frequency of cells with 1, 2, 3 or 4 nuclei, and calculate the NDI using the formula

    NDI = ( M 1 + 2 M 2 + 3 M 3 + 4 M 4 )/ N ,

    where M 1 –M 4 represent the number of cells with 1–4 nuclei and N is the total number of viable cells scored (excluding necrotic and apoptotic cells). The NDI is a useful parameter for comparing the mitogenic response of lymphocytes and cytostatic effects of agents examined in the assay.

    The lowest NDI value possible is 1.0, which occurs if all of the viable cells have failed to divide during the cytokinesis-block period and are therefore all mononucleated. If all viable cells completed one nuclear division and are therefore all binucleated, the NDI value is 2.0. An NDI value can only be greater than 2.0 if a substantial proportion of viable cells have completed more than one nuclear division during the cytokinesis-block phase and therefore contain more than two nuclei. For example, if 50% of viable cells are binucleated, 10% trinucleated and 10% quadrinucleated, the NDI value is 2.2.

    Täissuuruses tabel

    Täissuuruses tabel

    Image

    ( a ) Ideal binucleate cell; ( b ) binucleate cell with touching nuclei; ( c ) binucleate cell with narrow NPB between nuclei; ( d ) binucleate cell with relatively wide NPB. Cells with two overlapping nuclei may be considered suitable to score as BN cells if the nuclear boundaries are distinguishable. Occasionally, BN cells with more than one NPB are observed.

    Täissuuruses pilt

    Image

    These cell types shown should not be scored for MN frequency: ( a ) viable mono-, tri- and quadrinuclear cells; ( b ) mononucleated and BN cells at early stage of apoptosis when chromatin condensation has occurred but nuclear membrane has not disintegrated and late-stage apoptotic cells with intact cytoplasm, no nucleus and apoptotic chromatin bodies within the cytoplasm; ( c ) cells at the various stages of necrosis including early stages showing vacuolization, disintegration of cytoplasmic membrane and loss of cytoplasm with an intact nucleus and late stages in which cytoplasm is partially or completely lost and nuclear membrane is visibly damaged and nuclear material is commencing to leak from the remnant nucleus.

    Täissuuruses pilt

    Image

    ( a ) Cell with two MNi one with 1/3 and the other 1/9 the diameter of one of the main nuclei within the cell. ( b ) MNi touching but not overlapping the main nuclei. ( c ) A BN cell with NPB between main nuclei and two MNi. ( d ) A BN cell with six MNi of various sizes; this type of cell is rarely seen in cells that are not exposed to high doses of genotoxins.

    Täissuuruses pilt

    Image

    These situations include ( a ) a trinucleated cell in which one of the nuclei is relatively small but has a diameter greater than 1/3 the diameter of the other nuclei; ( b ) dense stippling in a specific region of the cytoplasm; ( c ) NBUD that appears like an MN with a narrow nucleoplasmic connection to the main nucleus and ( d ) nuclear blebs consisting of nuclear material protruding from the nucleus but without an obvious constriction or bridge between the protruding nuclear material and nucleus.

    Täissuuruses pilt

    Veaotsing

    Blood and cell storage conditions

    The published evidence available suggests that storage of blood between 5 and 22 °C for up to 24 h has no significant impact on baseline or radiation-induced MN frequency 73 ; however, these observations need to be further verified and replicated. It is possible to perform the CBMN Cyt assay using cryopreserved lymphocytes, but there are conflicting reports on whether cryopreservation alters the frequency rate of MN in BN cells 74, 75, which means that it is essential to optimize and verify that the freezing and thawing protocol used does not induce DNA damage.

    Mitogen stimulation

    The optimal PHA concentration for maximizing proportion of BN cells should be verified for each batch of PHA using the BN frequency ratio and NDI to assess mitogenesis. The success of mitogen stimulation can be determined visually 24 h following PHA stimulation. If lymphocytes have been successfully stimulated, cultures will appear clumpy and grainy. Unstimulated cultures will appear cloudy and silty.

    Time of addition of Cyt-B and Cyt-B concentration

    The critical aspect regarding the time of addition of Cyt-B is to ensure that it is added before the first mitotic cells start to appear so that all the observed BN cells that are captured are in fact once-divided cells only. This is important because MN tend to get lost in subsequent divisions and the MN frequency in a second division cell is likely to be less than that in a first division cell after a genotoxic insult 4, 5 . Cyt-B may take up to 6 h before it starts to exert its cytokinesis-blocking action (unpublished observations), which means it should be added at least 6 h before cells start to enter M phase of the cell cycle. The optimal time to add Cyt-B with lymphocytes is usually 44 h after PHA stimulation; however, earlier addition of Cyt-B is acceptable if the culture conditions used cause an earlier than expected mitotic wave to occur.

    To capture all once-divided cells as BN cells, it is also essential to verify that the Cyt-B concentration is optimal to maximize the ratio of cytokinesis-blocked cells by doing a dose–response across the concentration range of 2–10 μg ml −1 of Cyt-B using a 24 h cytokinesis-blocking time. The dose–response should yield a plateau in response within the optimal concentration range for cytokinesis-blocking. Choose a concentration that is at least a dose-point past the inflection point of the dose–response and on the plateau. Experience has shown that concentrations of 4.5 and 6 μg ml −1 are optimal for isolated lymphocyte and whole blood lymphocyte cultures, respectively. These concentrations are usually also optimal for mammalian cell lines but this should be checked for each cell line.

    Cytokinesis-blocking time

    In maximizing the number of cytokinesis-blocked BN cells by increasing exposure time to Cyt-B, there is the risk of also increasing the proportion of cytokinesis-blocked multinucleated cells, which arise from BN cells that attempt another nuclear division while cytokinesis-blocked. Ideally, the proportion of BN cells among cytokinesis-blocked cells should be in excess of 80%. The proportion of BN and multinucleated cells among all cells will depend on the proportion of dividing cells in the culture and the cell-cycle time, which in turn depends on the cell line and the culture conditions. For human cells, a cytokinesis-blocking period of 24 h is usually optimal for most conditions. In situations when mitotic delay may be expected owing to high levels of DNA damage, a longer cytokinesis-block period may be considered to capture late dividing cells as BN cells.

    Controls and important variables

    It is important to include a concurrent control sample from a single individual or cell line with each assay run throughout a study period to verify that there are no major variations in experimental conditions that may have impacted on the observed results. Furthermore, a positive control in which cells are challenged with an MN-inducing agent (eg, ionizing radiation, mitomycin-C) is also recommended to verify that the system responds predictably from one assay batch to the next.

    Historical control data are particularly useful in human biomonitoring studies aimed at establishing normal range values for the CBMN assay and to identify key variables affecting the observed frequency of CBMN assay biomarkers, which typically include age, gender, B vitamin status (particularly folate and vitamin B12) and smoking status. It is important in case–control studies that the groups are matched properly for these variables. For more information on the use of controls in biomonitoring studies refer to Albertini et al . 76 and for important variables affecting MN frequency in the CBMN assay in human lymphocytes refer to Bonassi et al . 77 . The appropriate use of controls in in vitro studies is discussed in detail in the report of the In Vitro Micronucleus Assay Working Group 57 .

    Hypotonic treatment of cells

    Hypotonic treatment for slide preparation is not recommendable because it may destroy necrotic cells and apoptotic cells, making them unavailable for assay. Inclusion of necrosis and apoptosis is important for the accurate description of mechanism of action and measurement of cellular sensitivity to a chemical or radiation. Isolated lymphocyte culture assay or culture of cell lines does not require hypotonic treatment of cells for slide preparation, thus making it possible to preserve the morphology of both necrotic and apoptotic cells.

    Slide preparation and staining

    In our experience, most of the problems in the CBMN Cyt assay arise during slide preparation and staining. This is because the quality of the score depends on the quality of the slide. Main points to note: (i) avoid cell clumps by gently resuspending cells before harvest and transfer to slides; (ii) maintain a moderate cell density so that it is relatively easy to identify cytoplasmic boundaries; (iii) stain only one slide initially to ensure that staining is optimal before staining the whole batch.

    Number of BN cells that should be scored

    One of the most common questions is the number of BN cells to be scored in the CBMN assay. The accepted protocol is to score a minimum of 1, 000 BN cells per treatment or time point although reports vary between 500 and 2, 000 BN cells. An alternative approach is to keep on scoring BN cells until a fixed number of MNi are observed (eg, 45 MNi). The latter has the advantage that more BN cells are scored when fewer MNi are induced, thus maintaining similar statistical power across different treatments. The main disadvantage is that more than 2, 000 cells may have to be scored in cultures with low MN frequency. In our experience, scoring 1, 000 BN cells from each of the duplicate cultures (total 2, 000 BN cells) always yields robust results.

    Slide scoring

    With respect to scoring slides, it is best to first score the frequency of mononucleated, BN, multinucleated, apoptotic and necrotic cells to determine the NDI and frequency of apoptotic and necrotic cells and then focus on scoring BN cells for the presence of MNi, NPBs and NBUDs to determine the genome damage rate. Note that it is best to skip scoring a cell if one is uncertain on how to classify it.

    Attention should be given to ensure that MNi, NPBs and NBUDs are scored only in BN cells and not in multinucleated cells because multinucleated cells are not once-divided cells and tend to have greatly elevated MNi frequencies relative to BN cells 78, which would result in inaccurate genome damage estimates. This issue is particularly important in dense cell preparations, because it may be difficult to distinguish between the two cell types. The elevated MNi frequency in multinucleated cells is artifactual and caused by inability of the spindle to properly segregate the large number of chromosomes in multinucleated cells. For these reasons, it is important to optimize the CBMN Cyt assay protocol to maximize the frequency of BN cells and at the same time minimize the frequency of multinucleated cells.

    Reproducibility

    The use of duplicate cultures is critical for producing robust results because it also allows the measurement of the intraexperimental coefficient of variation (CV). Cytogenetic assays should be subject to the same rigor as analytical assays, which typically reject duplicate results with a CV greater than 10%. Owing to the visual scoring, greater latitude in the acceptable CV is understandable. However, in our experience and the results of international interlaboratory scoring comparison 79, CVs greater than 40% are not acceptable for baseline data. With radiation-exposed cultures in which more than 100 MN per 1, 000 BN cells are induced, CVs less than 20% are expected. Acceptable CVs for automated systems have yet to be established, but CVs of between 5.4% and 9.5% have been reported recently (see //www.imstar.fr/applications/genotoxicity/micronucleiassay/). Scores from inexperienced personnel (eg, students, new staff) should not be relied upon until they are able to achieve acceptable CVs (no greater than 40%) for repeat scores of standard control slides and absolute values that are within close range to those obtained by experienced personnel. Interscorer variability is one of the key sources of variation in the MN assay 79 . It is therefore essential that the same scorers are maintained throughout a single study and ideally two scorers are used, each providing a count from each of the duplicate cultures and their mean values calculated to take into account both experimental and scorer variation; however, it is also acceptable to use a single scorer if two experienced scorers are not available. An alternative approach is to calibrate scorers by using a common set of standard slides with “low”, “medium” and “high” MN frequencies. The scores of each scorer on the standard slides can then be used to calculate a corrected value. The latter approach is still in development but worth noting as an option because it can take account of differences in the visual capacity of scorers within the same laboratory and between laboratories. Another important source of variability between scorers and between laboratories is the quality of the microscopes and their optics. In our experience, scoring of NPBs is influenced by the quality of the microscope because fine bridges can be missed with low-quality optics. The main issue here is for scorers to avoid switching microscopes during experiments and for the laboratory manager to upgrade the optics of the microscopes to a uniform and high level whenever possible. An optimal sampling and scoring schedule for the CBMN Cyt assay is shown in Figure 6.

    Is it necessary to heat-inactivate FBS in the CBMN Cyt assay?

    Heat-inactivation (56 °C for exactly 30 min) is only required if it is considered necessary to destroy heat-labile complement proteins that may cause cell lysis. Triglia and Linscott 80 determined that levels of complement in FBS are a fraction of adult levels and in ten samples of commercial FBS no hemolysis was detected even in undiluted serum. Furthermore prewarming of FBS to 37 °C is enough to inactivate heat-labile complement. In addition, other heat-labile components such as certain vitamins (eg, folic acid), growth factors, amino acids, etc. may be diminished by the heat treatment. Therefore, the choice to use heat-inactivated FBS or nontreated FBS is optional and depends on whether the heat inactivation of FBS causes any significant effects on growth and genome stability of cells tested in the CBMN Cyt assay. The CBMN Cyt assay for lymphocytes can be performed using untreated FBS.

    Ajastus

    Timing information can be found in Table 1.

    Oodatud tulemused

    The anticipated results with the CBMN Cyt assay depend on the culture conditions, level of exposure to genotoxic or cytotoxic agents and their potency, the nutrient composition of the medium and the genetic background, age and gender of the donor of the cells being tested.

    For normal peripheral blood lymphocytes cultured under optimal conditions using the protocol described above, one can usually expect the following ranges of values

    • frequency of BN cells: 30–60%,

    • NDI: 1.3–2.2,

    • necrotic cells: 0–9%,

    • apoptotic cells: 0–7%,

    • MNi per 1, 000 BN cells: 0–30,

    • NPBs per 1, 000 BN cells: 0–10,

    • NBUDs per 1, 000 BN cells: 0–5.

    MNi frequency in human peripheral blood lymphocytes measured using the CBMN Cyt assay increases with age and tends to be higher in females relative to males by a factor of approximately 1.4 owing to the random loss of the inactive X chromosome, which may lag at anaphase as a result of defective centromere or kinetochore function 6, 13, 65, 46 .

    The frequency of the biomarkers in the CBMN Cyt assay may vary in their extent and relative to each other depending on the genotoxic and cytotoxic mechanism of specific chemicals, radiation type and nutrient deficiency at different doses. For example, X-rays are efficient in inducing genome damage biomarkers with relatively small effects on NDI and cell death, whereas on the other hand, exposure to hydrogen peroxide tends to induce high levels of cell death with relatively low levels of DNA damage biomarkers in human lymphocytes 6, 20, 23, 39 . Cells with genetic defects in DNA repair, antioxidant response or apoptosis may exhibit abnormally high levels of MNi, NPBs, NBUDs, necrosis and apoptosis as well as reduced NDI.

    Risk of false negative results if the assay is performed without cytokinesis-block

    There has been an interest in exploring the possibility of performing the in vitro MN assay without Cyt-B to minimize concern of a possible confounding effect of Cyt-B while running the potential risk of obtaining a false negative result because of inadequate control of cell division kinetics because, for example, inhibition of nuclear division by the agent being tested is likely to lead to an underestimate of MN expression given that both once-divided and nondivided cells are included in the denominator of the MN frequency ratio 9, 81 .

    One of the reasons for considering performing the MN assay without Cyt-B is the concern that Cyt-B, used to accumulate BN cells, may interfere with the expression of MN 63 . However, studies with normal cells do not show an induction of MNi by Cyt-B or a dose–response effect of Cyt-B with MN frequency in BN cells at doses that are usually used to block cells in cytokinesis 5, 78, 82, 83, 84 . One study suggested that MN expression induced by spindle poisons may be less than expected in cytokinesis-blocked BN cells because of pole-to-pole distance shortening, which may increase the probability of reinclusion of lagging chromosome fragments or whole chromosomes back into a nucleus, but this did not diminish the effectiveness of the CBMN assay 85 .

    Although the evidence of obtaining a false positive result with the CBMN assay in normal cells is lacking, there is already adequate evidence that performing the MN assay in a manner that does not account for inhibition of nuclear division can lead to false negative results or an underestimate of MN induction in human lymphocyte cultures 5, 6, 8, 81, 84 . An example of false negative result of MN assay without Cyt-B is shown in Figure 11, which would also have been predicted from the mathematical model that was developed to demonstrate the effect of altered cell division kinetics on MN assay outcomes 9 . Nevertheless, recent studies comparing the MN assay with or without Cyt-B suggest that if cell lines with good growth characteristics are used and culture and nuclear division conditions are optimal, it is possible to obtain comparable results between the CBMN assay and the MN assay without Cyt-B when strong clastogens are tested 86 . However, genotoxicity tended to be detected at lower concentrations with the CBMN assay because of the greater statistical power afforded by the fact that BN cells contain twice the number of MNi per cell than would be the case for their mononucleated daughter cells 81, 84, 87, 88 . Furthermore, without a cytokinesis-block it becomes impossible to score NPBs, which can only be observed in BN cells and this would result in a critical genotoxic event being missed. In addition, non-disjunction events studied using chromosome-specific centromeric probes are best observed in BN cells when the actual distribution of chromosomes between daughter nuclei within one cell after anaphase can be observed directly 15, 16, 17, 18, 19, 55 . In addition, the use of Cyt-B makes it easier to score apoptotic cells because it inhibits the disintegration of apoptotic cells into smaller apoptotic bodies because the latter process requires microfilament assembly 89, which is readily inhibited by Cyt-B 7 .

    Image

    ( a ) Comparison of the MN dose–response in human lymphocytes exposed in vitro in G1/S/G2 to mitomycin-C (MMC) measured either in mononucleated cells in cultures without Cyt-B (solid black bars) or in BN cells in cultures with Cyt-B (white bars). ( b ) The level of dividing cells assessed by measuring the percentage of BN cell in the cytokinesis-blocked cultures. It is evident that the assay without Cyt-B underestimates the extent of genetic damage induced by MMC, particularly at doses that inhibit nuclear division. The data represent the mean ±1 se of three replicate cultures.

    Täissuuruses pilt

    Finally, a mathematical model of MN expression predicts (i) that scoring MN in BN cells is the most reliable way of determining MN frequency and (ii) scoring MNi in mononucleated cells in cultures without cytokinesis-block is likely to generate false negative results when nuclear division is significantly inhibited by the chemical tested or the culture conditions do not allow an optimal number of dividing cells 9 . Consequently, results for MN frequency obtained by scoring MNi in mononucleated cells in cultures without Cyt-B cannot be considered conclusive and a negative result with this system should be confirmed using the CBMN Cyt assay. The mathematical model paper 9 is an essential reading to have a thorough appreciation of the effect of nuclear and cell division kinetics on MN frequency.

    When is it justifiable to also score MNi in mononucleated cells in the CBMN Cyt assay?

    It is justifiable to also score MNi in mononucleated cells in the CBMN Cyt assay under the following circumstances:

    (1) Information on the frequency of MNi already present within lymphocytes in vivo may be required in chronic exposure situations because this reflects the expression of MNi in lymphocyte precursor cells (in the thymus, bone marrow, spleen and lymph nodes) exposed to the genotoxic agent. This information may also be useful if it is considered necessary to correct the results of the CBMN Cyt assay for MNi already present within lymphocytes; however, this may not be justified because it remains unclear whether lymphocytes with pre-existing MNi can divide ex vivo . The best time point to measure MNi already present in lymphocytes is approximately 24 h after PHA stimulation when activated lymphocytes have a larger cytoplasmic area, which facilitates MNi scoring 90, 91 .

    (2) The agent being examined in an in vitro assay is suspected to cause mitotic slippage and thus prevent formation of BN cells following DNA replication 91 .

    Other important aspects of the CBMN Cyt assay

    In this manuscript, only the CBMN Cyt assay protocol for isolated lymphocyte cultures is described in detail; however, similar methods can be applied to whole blood lymphocyte cultures, other cell culture systems and other cell types, which are of similar importance as the isolated lymphocyte system in terms of usage. Furthermore, the CBMN Cyt assay includes other important aspects such as the use of molecular cytogenetic techniques to determine the mechanism of formation and DNA content of MNi and NPBs and abnormal distribution of chromosomes among nuclei in a BN cell. Therefore, it is the purpose of the following sections to provide further information and details on these other important aspects of the CBMN Cyt assay.

    CBMN Cyt assay in other cell culture systems

    Whole blood cultures for human lymphocytes

    The CBMN Cyt assay in human lymphocytes can also be performed using whole blood cultures. Typically, 0.5 ml of whole blood is added to 4.5 ml of culture medium (eg, RPMI 1640) supplemented with fetal calf serum containing L -glutamine, antibiotics (optional) and PHA. Cyt-B is added at 44 h after PHA stimulation. The recommended optimal concentration of Cyt-B for accumulating BN cells in whole blood cultures is 6 μg ml −13 . The BN lymphocytes are harvested 24 h after adding Cyt-B as follows.

    (1) the cells are centrifuged gently (300 g ) for 5 min and the supernatant culture medium is removed;

    (2) the cells are hypotonically treated with 7 ml of cold (4 °C) 0.075 M KCl to lyse red blood cells and centrifuged immediately (300 g ) for 8 min;

    (3) the supernatant is removed and replaced with 5 ml fixative consisting of methanol:acetic acid (3:1) (the fixative should be added while gently agitating the cells to prevent clumps forming);

    (4) the cells are then centrifuged again at 300 g for 8 min and washed with two further changes of fixative;

    (5) the cells are resuspended gently and the suspension is dropped onto clean glass slides and allowed to dry.

    As an alternative, it is also possible to isolate the BN lymphocytes directly from the whole blood culture using Ficoll gradient separation, followed by one wash in culture medium, and then transfer cells to slides by cytocentrifugation before fixation and staining. This approach precludes the requirement for hypotonic treatment and enables optimal preservation of the cytoplasm. The Ficoll separation method is preferable to the hypotonic treatment protocol for slide preparation because hypotonic treatment could result in loss of morphology and lysis of necrotic and apoptotic cells. Staining of cells can be carried out using either 10% Giemsa in potassium phosphate buffer (pH 7.3) or Diff-Quik for light microscopy or acridine orange (10 μg ml −1 in phosphate-buffered saline, pH 6.9) for fluorescence microscopy.

    Murine lymphocyte cultures

    Lymphocytes are isolated either from the spleen or peripheral blood and cultured according to the procedures described by Fenech et al . 92 . Because murine lymphocytes have shorter cell division cycles than human lymphocytes, it is essential to add Cyt-B no later than 18 h after stimulation by mitogen and to harvest the cells 20–30 h later. Depending on the culture conditions, it is possible to obtain good binucleate ratios at 42 h after mitogen stimulation.

    Other primary cell cultures

    The CBMN Cyt assay can be readily adapted to other primary cell types to assess DNA damage induced in vitro , in vivo or ex vivo . The most important points to remember are (a) to ensure that MNi, NPBs and NBUDs are scored in the first nuclear division following the genotoxic insult and (b) to perform preliminary experiments to determine the concentration of Cyt-B and incubation time at which the maximum number of dividing cells will be blocked at the binucleate stage. It is also important to remember that Cyt-B may take up to 6 h before it starts to exert its cytokinesis-blocking action (unpublished observation).

    When using established or primary cell lines from dividing cell populations, it is usual to add Cyt-B shortly after exposure to genotoxin to capture all cells undergoing their first nuclear division as BN cells-this usually requires an incubation period of about 24–48 h, depending on the cell-cycle time, before harvesting the cells.

    Attached cells can be trypsinized and then prepared by cytocentrifugation as described for human lymphocytes. Specific methods have been described for use with nucleated bone marrow cells 93, lung fibroblasts 94, skin keratinocytes 95 and primary tumor cell cultures 96 .

    It is generally more practical to assess in vivo induction of MNi by blocking cytokinesis in dividing cells after the cells have been isolated from the animal and placed in culture medium in the presence of Cyt-B; this approach has proven to be successful with a variety of cell types including fibroblasts, keratinocytes and nucleated bone marrow cells 93, 94, 95, 96 .

    Treatment schedules for in vitro genotoxicity testing

    The cytokinesis-block MN assay has become one of the standard methods for determining the safety of chemicals and pharmaceuticals 57, 58, 63, 81, 84, 86 . Ideally, each chemical under investigation should be tested for its genotoxic potential at the various stages of the cell cycle. Because human peripheral blood lymphocytes are in the G 0 phase when collected, they can be used for assessing damage induction at this stage. However, cells are expected to be more sensitive to genotoxic effects during S, G 2 and M phase, and for this purpose, it is essential to expose cell cultures when most cells are dividing. Because MN expression requires one nuclear division to be completed, the period between treatment and harvest time has to allow for this.

    With human peripheral blood lymphocytes treated in G 0, it is necessary to accumulate BN cells as early as possible and for as long as possible to ensure that even cells experiencing mitotic delay are examined. Typically, the standard protocol of adding Cyt-B at 44 h and harvesting cells at 72 h should suffice for this purpose; however, a second harvest of cells at 96 h may maximize the number of late-dividing BN cells available for analysis.

    If treatment of cells in G 1, S, G2 and M phases is required, as would be the case with cell lines, then exposure to the chemical should occur during the logarithmic growth phase of the culture, followed shortly afterwards by Cyt-B to accumulate dividing cells, and cells are then harvested 6 and 48 h later depending on the stage of the cell cycle that is being examined and whether the treatment causes substantial mitotic delay. At the very early harvest times, mainly cells exposed in G2 or late S phase are accumulated as BN cells, whereas at the later harvest time, cells exposed in all stages of the cell cycle are blocked in the binucleate stage. Thus, the harvest time relative to Cyt-B addition would affect the type of cell examined.

    The most efficient way to do the MN assay in a manner that minimizes false negative results is to use the Cyt-B method and a treatment phase of 24 h duration to cover all phases of the cell cycle and harvesting cells 24 and 48 h after Cyt-B addition in the recovery phase to allow for any cell-cycle delay in damaged cells as outlined in Figure 12. In the case of lymphocytes, it would be preferable to delay the start of the treatment phase to 48 h after mitogen stimulation at which point a large proportion of the mitogen-activated cells would have progressed from G1 to S, G2 and M phases of the cell cycle. By scoring MN in both mononucleated and BN cells, it should be possible to account for MN expressed before Cyt-B block as well as cells with MN that fail to divide and cells that undergo mitotic slippage 91, 97 . The suggested protocol also allows for harvesting of cells at the end of the treatment phase before Cyt-B addition if there is a need to test whether the chemical inhibits cytokinesis. Examples of other typical schedules for use of the CBMN Cyt assay for in vitro genotoxicity testing are summarized in Table 4. The use of a metabolic activation system such as S9 mix should be included as an option when testing new chemicals 57, 58, 63 but this could limit the exposure period owing to the possible cytotoxicity of S9 to the target cells. A better option may be the use of metabolically competent cells such as genetically modified MCL-5 cells 98 .

    Image

    The protocol also allows the harvesting of cells immediately before addition of Cyt-B if it was necessary to test for induction of polyploidy via multinucleation or cytokinesis-blocking action of the agent tested or if it was considered useful to score MN in cells without the Cyt-B block. It is assumed that the cell lines are already in log phase growth when tested. * The time points for lymphocytes refer to number of hours after mitogen stimulation. MNi, micronuclei; NPBs, nucleoplasmic bridges; NBUDs, nuclear buds; BN, binucleated; NDI, nuclear division index.

    Täissuuruses pilt

    Täissuuruses tabel

    Molecular techniques for studying mechanisms for MN and NPB formation and non-disjunction in BN cells

    To take full advantage of the CBMN assay, it is essential to distinguish between MNi originating from whole chromosomes or acentric fragments. This can be achieved by using probes that are specific for the centromeric DNA or antibodies that bind to the kinetochore proteins that are assembled at the centromeric regions of active chromosomes. The use of MN size as a discriminant is not recommended for human cells or other cell types in which the size of chromosomes is heterogenous because a small MN may contain either a fragment of a large chromosome or a whole small chromosome. The anti-kinetochore antibody method 52, 53 has some limitations because this approach does not distinguish between unique chromosomes and may not detect chromosome loss occurring due to absence of kinetochores on inactive centromeres as may occur in the case of the inactive X chromosome 54 . The use of ISH to identify centromeric regions is preferable because it does not suffer from these limitations. In addition, using centromeric probes that are specific for one or more unique chromosomes allows detection of non-disjunctional events (ie, unequal distribution of homologous chromosomes in daughter nuclei) in BN cells, which provides further information on events causing aneuploidy and altered gene dosage 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 . For details on the use of the kinetochore detection methods, refer to the paper of Fenech and Morley 53, and for methods relating to centromere detection by ISH, refer to the papers by Farooqi et al . 12, Hando et al . 13, Ehajouji et al . 15, 17, Schuler et al . 18 and Wang et al . 99 . The types of results that can be expected with the various techniques are illustrated in Figure 4.

    A combination of pancentromeric and pantelomeric probes can also be used to distinguish between (a) MN containing whole chromosomes or acentric chromosome fragments and (b) NPBs originating from misrepair of double strand breaks in non-telomeric DNA and NPB caused by telomere end fusion of chromosomes (Fig. 5). The use of molecular probes to determine the content of MNi has been extensively reviewed recently 46 .

    Measurement of excision-repaired DNA lesions in G 0 /G 1 human lymphocytes using the cytosine arabinoside MN assay in human lymphocytes

    After assessing the MN response in human G 0 lymphocytes following exposure to a variety of genotoxins, it became evident that the extent of MN formation in relation to cytotoxicity was low for chemicals and ultraviolet radiation which mainly induce base lesions and adducts on DNA rather than strand breakage or spindle damage 100 . We hypothesized that this was due to either efficient repair of the lesions or that such sites, if left unrepaired, do not convert to a double-stranded break in DNA following one round of DNA synthesis. Furthermore, we reasoned that inhibition of the gap-filling step in excision repair by cytosine arabinoside (ARA) would result in the conversion of such base lesions to a single-stranded break that would become a double-stranded break following DNA synthesis leading to the production of an acentric fragment, which would then be expressed as an MN within one division cycle 100, 101 .

    Using this concept (illustrated in Fig. 13), we showed that addition of ARA during the first 16 h of lymphocyte culture (ie, before DNA synthesis) did result in a dramatic increase (tenfold or greater) in the MN dose–response following ultraviolet or N -nitroso- N -methyl urea treatment. However, the ARA-induced increase following X-ray exposure was only 1.8-fold as would be expected from the proportion of DNA adducts or base lesions relative to the induction of DNA strand breaks. This method has since been used to identify pesticides that induce excision repair and to distinguish between genotoxic agents that do or do not induce excision repair 102 .

    Image

    DSB, double strand break; SSB, single strand break.

    Täissuuruses pilt

    The ARA protocol is an important adjunct to the basic CBMN assay in lymphocytes and should be attempted particularly if strong cytotoxic effects are observed in conjunction with weak MN induction. Precise measurement of excision-repaired DNA lesions using the ARA method is only possible using the CBMN assay because (a) the conversion of excision-repaired DNA lesions to MN occurs only in cells that have completed nuclear division and (b) the addition of ARA may also result in significantly altered cell division kinetics, which could confound results in MN assays without Cyt-B.

    ARA inhibition of DNA polymerase may cause DNA strand breaks in cells undergoing replicative DNA synthesis. Therefore, it is only possible to use this method in PHA-stimulated G 0 lymphocytes with ARA exposure occurring during the G 1 phase and before S phase, because excision repair is activated during G 1 . In practice, this means that lymphocytes are cultured in the presence of ARA during the first 16–20 h after PHA stimulation, following which the cells are washed to remove ARA and incubated in culture medium containing deoxycytidine to reverse ARA inhibition of DNA polymerase. After these steps, the standard CBMN protocol (described above) is followed with the exception that interleukin-2 is added to replenish this mitogenic cytokine, which is generated by activated lymphocytes but otherwise lost during the washing process. For more details on the procedure and typical results, refer to Fenech and Neville 100 and Surrales et al . 102 .

    Future developments

    It is evident that the ex vivo / in vitro MN assay has evolved into a robust assay for genetic damage with applications in ecotoxicology 103, nutrition 104, radiation sensitivity testing both for cancer risk assessment 105 and optimization of radiotherapy 64, 106, biomonitoring of human populations 60 and importantly testing of new pharmaceuticals and other chemicals 63, 86 . There is little doubt that there is a need for an automated scoring system for quicker and more reliable non-subjective data acquisition, which would ideally be based on the scoring of slides also prepared for visual scoring-this should enable consistent results to be obtained that are not influenced by the inter-individual and temporal variability of human scorers. For this goal to be achieved, it is essential that scoring criteria are well developed and that a robust slide preparation protocol be put in place and that slide preparations be permanent so that they can be re-examined visually if necessary. Automated image analysis systems have recently been developed for scoring of MNi in mammalian cells 66, 67, 68, 69, 70, 71 (see //www.imstar.fr/applications/genotoxicity/micronucleiassay/; //www.metasystems.de/ products/metafer/metafer_msearch.htm#Micronucleus; //www.biocompare.com/techart.asp?id=1247) but these systems do not take into account other important events such as NPBs, NBUDs, necrosis, apoptosis and cytostasis, which are essential for the correct interpretation of the result obtained. In the future, we should expect to have an automated system that can score reliably the various end points possible with the CBMN Cyt assay outlined in this paper.

    Finally, it is essential to keep abreast of more recent developments in our understanding of MN, NPB and NBUD formation and events that may alter expression of these genotoxicity end points. Furthermore, scoring criteria in the CBMN Cyt assay are continually being reviewed as part of the HUMN project activity and protocols for validation of automated systems are also currently under consideration by the HUMN project and will be developed in the near future.

    Muutuste ajalugu

    Kommentaarid

    Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.