Puru interakteerub xpd-ga tuumajaotuse juhtimiseks drosophilas | onkogeen

Puru interakteerub xpd-ga tuumajaotuse juhtimiseks drosophilas | onkogeen

Anonim

Õppeained

  • Arengubioloogia

Abstraktne

Puru (Crb) perekonna valgud on raku polaarsuse jaoks üliolulised. Värskeimad uuringud näitavad, et nad on seotud ka kasvu reguleerimise ja vähiga. Siiski pole hästi mõistetav, kuidas Crb mitootilistes protsessides osaleb. Siinkohal teatame, et Drosophila Crb osaleb tuumajaotuses kriitiliselt, suheldes Xeroderma pigmentosum D (XPD). Crb modifikaatorite geneetiliselt sõelumisel tuvastati uudne geen nimega galla-1 . Galla-1 valk näitab homoloogiat MIP18-ga, mis on mitootilise spindliga seotud MMS19 – XPD kompleksi alaühik. Funktsionaalsuse kaotusega galla-1 mutantide varajases embrüos ilmnevad tuumajaotuse ajal ebanormaalne kromosoomi segregatsioon, defektsed tsentrosoomide positsioonid ja hargnenud spindlid. Crb funktsiooni kaotuse või üleekspressiooniga embrüotel on sarnased mitootilised defektid ja geneetiline interaktsioon galla-1-ga . Nii Galla-1 kui ka Crb valgud näitavad tuumajaotuse ajal lokalisatsiooni kattumist spindli mikrotuubulitega. Galla-1 interakteerub füüsiliselt Crb rakusisese domeeniga. Huvitav on see, et Galla-1 seob vähe XPD Drosophila homoloogi, kuid seotud valk Galla-2 seob nii Crb kui ka Xpd. Funktsiooni kaotanud galla -2 mutantidel on sarnased mitootilised defektid kui galla-1 ja tugev geneetiline interaktsioon crb-ga . Xpd võib Crb-ga moodustada füüsilise kompleksi. Kujutavas ketas põhjustab Crb üleekspressioon kudede ülekasvu ja ka H2Av fosforüülimisega tähistatud DNA kahjustusi. Neid fenotüüpe surutakse alla Xpd redutseerimisega. Kokkuvõtlikult tuvastab see uuring uudse Crb – Galla – Xpd kompleksi ja selle funktsiooni kromosoomide õigeks eraldamiseks tuumajaotuse ajal, mis viitab võimalikule seosele Crbi ja Xpd-ga seotud genoomi ebastabiilsuse vahel.

Sissejuhatus

Mitoos on oluline kõigi eukarüootsete organismide arenguks. Drosophila embrüo varajast arengut iseloomustavad kiire sünkroonsed 13 tuumajagunemistsüklit pärast viljastamist. 1 Nende tuumajaotuste ajal koosneb iga mitootiline tsükkel ainult S- ja M-faasidest, millele ei järgne tsütokineesi, mille tulemuseks on mitmetuumaline rakk, mida nimetatakse süntsütiaalseks blastodermiks. Tsüklis 14 toimub protsess, mida nimetatakse rakuliseks, et moodustada embrüonaalne epiteel, mis läbib gastriidi.

Rakulisemise oluline sündmus on epiteeli apikaalse basaalse polaarsuse moodustumine. Transmembraanset valku Crumbs (Crb) on selles protsessis põhjalikult uuritud, kuna sellel on keskne roll embrüonaalse epiteeli apikaalse-basaalraku polaarsuse säilitamisel. 2, 3- Crb-valk lokaliseerub raku membraanis, mis paikneb adrensiinide ristumiskohtades (AJ), ja osaleb AJ-de küpsemises ja stabiliseerimises. 2, 4 Postembrüoonilise arengu ajal on Crb vajalik ka võrkkesta morfogeneesi ja säilimise jaoks. 1, 5, 6 Crb-funktsiooni säilitamine võrkkestarakkudes on oluline, kuna Crb-geeni (CRB1) inimese homoloogis esinevad mutatsioonid põhjustavad võrkkestahaigusi. 7, 8 Värsked uuringud on näidanud, et Crb osaleb ka kasvu reguleerimises, mõjutades raku signalisatsiooni radu. 9, 10, 11, 12 Crb-i võimendus ja funktsiooni kadumine põhjustavad jõehobu signaaliülekande defekte, mis kontrollib rakkude vohamist Drosophilas ja imetajates. Crb põhjustab jõehobu sihtgeenide ülesreguleerimist ja toimib füüsiliselt koos jõehobu raja komponentidega. 9, 10, 11 Teatati, et Crb osaleb Notchi signaliseerimises ka y-sekretaasi kompleksi aktiivsuse moduleerimise teel. Need leiud toetavad Crb rolli erinevates rakulistes protsessides, sealhulgas raku polaarsus, morfogenees ja kasvu reguleerimine.

Crb funktsioon epiteeli väljaarendamisel sõltub suuresti lühikesest rakusisest domeenist (Crb intra ), kuna see on vajalik apikaalse membraanidomeeni moodustamiseks ja võib osaliselt päästa crb- mutandi fenotüübid. 4, 5, 13 Crb-i üleekspresseerimine kahjustab ka rakkude polaarsust, kuna apikaalsed ja AJ-valgud on emakaväliselt värvatud. 4, 5 Crb intra koosneb kahest funktsionaalsest motiivist, juxtamembrane domeenist (JM) ja C-terminaalsest PDZ-d siduvast motiivist (PBM). Crb moodustab konserveerunud valgukompleksi oma PBM kaudu PDZ domeeni valgu Stardust ja Dpatj abil. 14, 15 JM domeeni kasutatakse FERM domeeni valgu Moesin 16 sidumiseks ja see osaleb AJ valkude nagu Armadillo ja Bazooka värbamises. 5, 13

Lisaks Crb teadaolevatele funktsioonidele tsellulariseerimises, morfogeneesis ja Hippo signaalimisel võib Crb olla seotud ka muude funktsioonidega. Üks neist piirkondadest, kus Crb-i ei ole uuritud, hõlmab sündmusi enne embrüo tsellulariseerumist. Tuumajaotuse tsüklid varajases embrüogeneesis on kriitilise tähtsusega rakulise epiteeli tekkeks, mis võib läbi viia gastrulatsiooni. Mitotootilist tuumajaotust kontrollitakse sel perioodil ema geenifunktsioonide abil, ilma et oleks zygotic geeni ekspressiooni vähe või üldse mitte. 17 Ei ole teada, kas Crb-l on selle varase embrüogeneesi ajal enne tsellulariseerumist roll mitoosis. Crb on vajalik munasarja folliikulite epiteeli arenguks. 18 Crb emade funktsiooni on uuritud iduliini kloonide abil, mis on loodud crb-i mutantsete poolrakkude siirdamisel ovo D1 steriilsetesse emastesse . See uuring näitas, et embrüo küünenaha ja närvisüsteemi crb- mutantsed fenotüübid võivad tuleneda ainuüksi zygotic geeni ekspressiooni kadumisest. 19 Kuna eelmises uuringus ei pruukinud varaseid defekte enne raku moodustumist tuvastada, tuleb veel uurida, kas Crb mängib rolli tuumajaotuse perioodil varases embrüos.

Arvestades, et on tuvastatud ainult piiratud arv Crb-interakteeruvaid valke, võib 20 uute Crb-partnerite sõeluuringud aidata tuvastada Crb-i uusi funktsioone. Huvitav on see, et sellise geneetilise sõeluuringu põhjal oleme tuvastanud konserveerunud uued crb-ga interakteeruvad geenid, mis viisid varajases embrüogeneesis Crb-funktsiooni ootamatu leidmiseni. See Crb uus funktsioon on seotud tuumajagunemise kontrolliga koos Xeroderma Pigmentosa-D (XPD), mis on seotud genoomi ebastabiilsusega. Xpd on TFIIH transkriptsioonifaktori oluline alaühik, mis on vajalik nukleotiidi ekstsisiooni parandamiseks ja transkriptsiooniks. 21 Hiljutine uuring tuvastas XPD valgukompleksist uued tsütoplasmaatilised valgud nimega MIP18 ja MMS19. 22, 23, 24 Ootamatult ei sisalda see MMS19 – XPD – MIP18 kompleks TFIIH muid alaühikuid ning selle valgukompleksi iga komponendi löömine põhjustas mitoosi ajal kromosoomide eraldamise defekte 22, põhjustades kromosoomi ebastabiilsust. 25 Lisaks on näidatud, et Drosophila Xpd mängib rolli kromosoomi segregatsioonis, reguleerides tsükliiniga aktiveeritud kinaasi aktiivsuse rakutsükli funktsiooni embrüogeneesi ajal. 26

Selles uuringus käsitleme uudset geeni nimega galla-1, mis on tuvastatud kui crb geneetiline modifikaator. Galla-1 näitab valgujärjestuse homoloogiat imetaja MMS19 – XPD kompleksi MIP18-ga, mis tekitab intrigeerivaid küsimusi galla -1 in vivo funktsiooni ja selle seoste kohta krabiga . Näitame, et Galla-1 ja sellega seotud valk Galla-2 on varase embrüo tuumajaotuse ajal vajalik kromosoomi õigeks eraldamiseks, mis vastab selle kattumisele spindli mikrotuubulitega. Crbi kaotus põhjustab varases embrüos enne rakulistumist sarnaseid mitootilisi defekte. Näitame geneetilist interaktsiooni galla geenide ja crb vahel ning Galla valkude ja Crb otsest seondumist. Lisaks moodustavad Crb ja Galla-2 Xpd-ga valgukompleksi. Xpd taseme vähendamine pärsib Crb fenotüüpe, näiteks H2Av, mis on DNA kahjustuse marker, ülekasv ja hüperfosforüülimine. Kokkuvõttes tehakse ettepanek, et mitoosi ajal kromosoomi eraldamiseks on vajalik Crb, värbates Galla ja Xpd uue kompleksi moodustamiseks. See uuring pakub mehhaanilisi teadmisi Crbi ja Xpd võimaliku seose kohta genoomi stabiilsuse ja vähi osas.

Tulemused

Uue geeni galla -1 hävitamine pärsib Crbi funktsiooni suurenemist

Crb-ga interakteeruvate täiendavate geenide tuvastamiseks, mis võiksid pakkuda Crb-funktsioonile uusi vihjeid, kasutasime silma pinna karestamist, mille põhjustas Crb-i üleekspressioon klaasist mitmikreporteriga (GMR) –Gal4 arenevas võrkkestas (märgistatud kui GMR) > Crb intra ; joonis 1a). Kasutades GAL4 – ülesvoolu aktiveeriva järjestuse (UAS) süsteemi, viisid 27 geneetilist ristamist GMR> Crb- sisese ja UAS- RNA-sekkumise (RNAi) joonte vahel meid geenide tuvastamiseni, mille silmade arendamine pärsib või pärsib GMR karedate silmade fenotüüpi > Crb intra (Mukhopadhyay ja Choi, avaldamata).

Image

Redutseeritud Galla-1 pärsib Crb-i fenotüüpi üleekspressioonis. a ) Crb-i üleekspressioon GMR - Gal4 all näitab väikest, kareda silma fenotüüpi. ( b ) galla -1 –RNAi pärsib silma sisemise GMR> Crb toimet. c ) GMR> galla-1-RNAi ise omab vähe mõju. ( d ) P-elemendi galla -1 EY01427 ebatäpne ekstsisioon tekitas galla -1 A52 ja galla -1 A182 , mis on kaks deletsioonimutanti, millel puudub suurem osa galla-1 kodeerivast järjestusest. Ei täiskasvanud galla -1 A52 ega galla -1 A182 ei anna tuvastatavat galla -1 Messenger-RNA (mRNA) ja valgu ekspressiooni, mida kinnitavad vastavalt pöördtranskriptsiooni PCR (RT – PCR) ( e ) ja Western blot analüüs ( f ). ( g ) GMR> Crb intra / +. h ) Crb- sisesest üleekspressioonist põhjustatud karedate silmade fenotüüp on homosügootsetes galla -1 Δ182 mutantides märkimisväärselt pärsitud. i ) kontrollina täiskasvanute päästerõngas galla -1 Δ182 . ( j ) Galla-1 valgu järjestuse joondamine selle ClustalW-ga toodetud homoloogidega. C-terminaalne piirkond on väga konserveerunud, kuid selgroogsete MIP18 perekonna valkudel puudub Galla-1 N-terminaalne piirkond. Väga konserveerunud jäägid on tähistatud halli (identsed viiest kuuest liigist) ja musta (identsed kõigis loetletud liikides) lahtritega. Geenipanga liitumisnumbrid loetletud valkudele: pärm (P38829), uss (CAB07619), sebrakala (AAH59535), hiir (NP_080911) ja inimene (NP_115607).

Täissuuruses pilt

Sellel ekraanil leidsime, et iseloomustamata geeni CG30152 RNAi pärssimine surub tugevalt silma silmasisese fenotüübi Crb (joonis 1b). CG30152 RNAi metsiktüüpi taustal ilmnevad silmad näitavad ainult peent mõju (joonis 1c). CG30152 sai nimeks galla -1 (korea sõna lõhestamiseks) pärast funktsionaalse kadumise fenotüüpide ebanormaalseid mitootilisi kromosoome, nagu on näidatud allpool. galla-1 kodeerib 218 aminohappe (aa) valku konserveerunud C-terminaalse piirkonnaga (aa111-aa218) ja hooldamata N-terminaalse piirkonnaga (joonis 1j). Huvitaval kombel on Galla-1 C-terminaalne piirkond 59% identne inimese MIP18-ga, mis on MMS19 alaühik (34% identne Drosophila CG12005) –XPD (MMS19 – XPD – MIP18) kompleksiga. 22

Galla-1 funktsiooni uurimiseks lõime galla -1 geenis deletsioonid P-elemendi EY01427 ebatäpse ekstsisiooniga, mis oli sisestatud galla -1 5'-piirkonda (115 aluspunkti allapoole translatsiooni alguskohta). Kaks ebatäpset ekstsisioonijoont, galla -1 A52 ja galla -1 A182 , näitasid vastavalt 894 bp ja 968 bp kustutusi, mis mõlemad eemaldavad P-elemendi sisestamiskohast allavoolu peaaegu kogu kodeeriva järjestuse (aa38-218) (joonis 1d) ). Täiskasvanute kudedes pöördtranskriptsiooni-PCR-ga ei tuvastatud Messenger RNA ekspressiooni kas galla -1 A52 või Galla-1 A182 mutantidelt (joonis 1e). Kuna Western blot analüüs ei näita nii vastse, pupilli kui ka täiskasvanu staadiumis kummaski mutandis tuvastatavat Galla-1 valku (joonis 1f), on nii galla -1 A52 kui ka Galla-1 A182 tõenäoliselt nullmutatsioonid.

Homosügootsed galla -1 Δ182 mutandid näitavad temperatuurist sõltuvat letaalsust (täiendav joonis S1A), mis viitab sellele, et Galla-1 mängib rolli normaalses arengus. Kui umbes 50% mutantidest sureb arengu ajal temperatuuril 25 ° C, siis 95% loomadest sureb temperatuuril 29 ° C. Temperatuuril 29 ° C sureb embrüonaalsetes staadiumides enam kui 70% mutantidest ja ülejäänud surevad kogu vastse ja pupilli staadiumis. Järgmisena testisime, kas galla -1 Δ182 mutatsioon võib ka suruda silma fenotüüpi, mis on põhjustatud Crb-i üleekspressioonist. Galla-1 osaline redutseerimine galla-1 / + heterosügootides ei surunud ilmselgelt Crb-i üleekspressiooni väikest ja karedat silma fenotüüpi (pole näidatud), kuid homosügootne galla-1 mutatsioon tõi kaasa Crb- sisese fenotüübi olulise päästmise (joonis 1h ). Sarnane Crb- sisese fenotüübi mahasurumine RNAi või galla-1 mutatsiooni abil näitab, et mahasurumine on tingitud Galla-1 funktsiooni vähenemisest.

Galla-1 kaotamine põhjustab defekte kromosoomi segregatsioonis

Kuna suurem osa galla-1 mutantidest sureb embrüogeneesi ajal, kontrollisime, kas mutantsetel embrüotel pole crb- mutantidega seotud defekte. Ootamatult näitasid galla-1 mutantsed embrüod laigulisi alasid, millel on tsentrosoomid, kuid mitte kromosoomid (joonised 2b ja c). Neid kromosoomivabu tsentrosoome võib täheldada ajukoore piirkonnas, kui valesti jagunevad tuumad langevad embrüo sisemusse. 26 Metsiku tüübi korral ilmnesid umbes 10% (± 3, 4%) 2-h vanustest varajasetest embrüodest enne rakuliseerumist (edaspidi „varased embrüod”) aeg-ajalt ebanormaalseid tuumajaotusi (joonis 2a). Seevastu peaaegu 40% -l (± 5, 6%) galla-1- mutantsetest embrüotest ilmnesid defektse jaotuse suured alad nagu kromosoomsillad ja tsentrosoomide ebanormaalne positsioneerimine puuduliku segregatsiooni tõttu 28, 29 (joonis 2e, täiendav joonis S1B). Need tulemused viitavad sellele, et Galla-1 mängib rolli kromosoomi korrektses eraldamises mitootilise jagunemise ajal.

Image

galla-1 mutantsetes embrüodes ilmnevad defektid kromosoomi segregatsioonis. ( a - a '') 2-h vanad (tsükkel 13) embrüod näitavad regulaarset 4 ', 6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI) ja tsentrosomiini (CNN) värvimist. ( b - b '') galla-1 mutantsetel embrüotel on kromosoomivabade tsentrosoomidega laigulised alad, millel puudub DAPI värvimine (nool). c ) suurenenud vaade kastiga alale, kus on näha kromosoomivabad tsentrosoomid ( b ''). ( d ) Suurema suurendusega metsiktüüpi (WT) embrüod näitavad faasidevahelisi kromosoome, kus kaks tsentrosoomi asuvad vastaspoolustel. e ) Galla-1 mutantsetes tuumades nähakse kromosoomsildu (nooli) ja ektoopilisi tsentrosoome. Kaalulatid = 20 μm.

Täissuuruses pilt

Mitootiliste defektide fenotüüpide analüüsimiseks kasutati homosügootseid galla-1 mutantseid embrüoid, kuna embrüod on osaliselt homosügootidena elujõulised. Selliste galla-1 mutantide ebanormaalsete kromosoomifenotüüpide kinnitamiseks tuumajagunemise käigus uurisime trans-heterosügootseid embrüoid ( galla-1 / Df ), mis sisaldasid iga galla-1 mutandi koopiat ja puudust Df (2R) Exel6070 (57A6-57B3), mis kattis galla-1 . Nendel trans-heterosügootsetel embrüodel ilmnesid ka kromosoomi segregatsiooni järjepidevad fenotüübid, näiteks kromosoomsillad, ektoopilised tsentrosoomid ja spindli mikrotuubulite ebanormaalne muster (lisajoonis S2).

Et kontrollida, kas galla-1 mutantsetel embrüodel on DNA defekte, uurisime fosforüülitud histooni variandi H2AX Drosophila homoloogi γ-H2Av taset, mis on DNA topeltsidemete katkemise marker. 30 Tulemused näitasid, et galla -1 mutantsete embrüote korral on y-H2Av tase metsiktüüpi omadega võrreldes märkimisväärselt suurenenud (täiendavad joonised S3A ja B). y-H2Av tuvastati tugevalt piirkonnas, kus tuumad langevad embrüo sisemusse, näidates seeläbi piirkonda, kus tuuma jagunemine on ebaõige.

Galla-1 mutantide mitootiliste defektide aluse mõistmiseks koostasime anti-Galla-1 antikeha, mis tunneb Galla-1 valgu spetsiifiliselt ära Western blot'is ja kudedes (täiendav joonis S4). Varaste embrüote immunovärvimine näitas Galla-1 värvumise märkimisväärset kattumist tubuliiniga apikaalses piirkonnas (joonis 3a). Tangentsiaalsed konfokaalsed lõigud näitasid Galla-1 olulist kattumist spindli mikrotuubulitega metafaasi ajal (joonis 3b). Nende andmete toetuseks näitas S2 rakkudes ekspresseeritud Galla-1 valk lokaliseerumist spindli mikrotuubulitega (joonis 3c). See viitab sellele, et kromosoomi segregatsiooni ebanormaalne muster võib olla seotud spindli mikrotuubulite puuduliku korraldusega. Tõepoolest, galla-1 mutantsed embrüod näitasid tsentrosoomide ebanormaalset paigutust ja spindli mikrotuubuli hargnemist (joonised 3e ja f).

Image

galla-1 mutantsed embrüod kattuvad mikrotuubulite spindlitega. ( a - a '′) Tsükli 14 metsikut tüüpi (WT) embrüote külgvaated näitavad Galla-1 ja α-tubuliini värvimise osalist kattumist. 4 ', 6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI) värv on näidatud siniselt. ( b - b '') 12. tsükli metsiktüüpi embrüote puhul on Galla-1 rikastatud mitootiliste kromosoomide punktsioonimustriga ja kattub mitootiliste spindlite α-tubuliiniga. ( c - c ′ ′) Galla-1 – FLAG-i ekspresseerivad S2 rakud näitavad α-tubuliini ja Galla-1 kattumist. d ) 11. tsükli metafaasides kasutatavad metsiktüüpi embrüod, värvitud tubuliini (rohelise) ja tsentrosomiini (CNN) (punase) jaoks. ( e ) galla-1 mutantsed embrüod näitavad mikrotuubulite spindlite ja tsentrosoomide (nooled) ebanormaalseid mustreid. ( f ) Galla-1 mutantsete embrüote ebanormaalsete mikrotuubulite lähivaade näitab tsentrosoomide ja spindlite ebanormaalset hargnemist. Kaalulatid = 5 μm.

Täissuuruses pilt

Crb on vajalik kromosoomi õigeks eraldamiseks mitoosi ajal varases embrüogeneesis

Kuna crb- messengeri RNA on teadaolevalt 0–3 h embrüodes, 2 ja crb näitasid geneetilist interaktsiooni galla -1-ga , uurisime, kas Crb osaleb tuumajaotuses ka varajases embrüogeneesis. Esiteks kasutasime Crb 11A22 nullmutanti, et uurida Crb rolli varajastes embrüodes. Ligikaudu 32% -l (± 4, 2%) selle genotüübi 2-h vanustest embrüodest ilmnesid kromosoomidefektid, näiteks kromosoomivabad tsentrosoomid, kromosoomsillad ja ebanormaalne mikrotuubulite muster mitoosi ajal (joonis 4a).

Image

Kromosoomi õigeks eraldamiseks on vajalik Crb. ( a - a ′) crb 11A22 mutantsete embrüotega (tsükkel 12) on kromosoomivabade tsentromeeridega ( a, valged kastid), kromosoomsildadega ( a ′, nooled), ebanormaalsete mikrotuubulite spindlitega ( a ′, nooled) paiknevad alad. . ( b - b ′ ′) matt> crb RNAi embrüod näitavad ka painutatud kromosoome ja kromosoomsildu ( b, nooled), monopolaarseid spindleid ( b ′, nool) ja sulandumist naabervõllidega ( b ′ ′, nool). ( c - c '′) crb 8F105 null alleelil on sarnased kromosoomi eraldamise defektid kui crb 11A22 nullmutandil ( c ' ', nooled). ( d, e ) crb ΔJM ja crb ΔPBM mutantsed alleelid ei sisalda selliseid mitootilisi defekte. Kaalulatid = 20 μm.

Täissuuruses pilt

Kuna 0–2 h embrüos on zygotic geeniekspressiooni vähe või üldse mitte, viitab crb 11A22 mutantsete embrüote kromosoomipuuduste vaatlus sellele, et Crb 11A22 vähenenud Crb funktsiooni tase ei pruugi olla varajaste embrüote normaalseks tuumajaotuseks täielikult piisav. Oleme proovinud iduliini kloone genereerida mitootilise rekombinatsiooni abil, kasutades ovo D1 FRT 31, kuid me ei suutnud leida crb 11A22 kloone. Ema Crb ekspressiooni spetsiifiliseks hävitamiseks ületasime crb RNAi ema-gal4-ga , mis võib juhtida Gal4 ekspressiooni idutee rakkudes. 32 Crb RNAi spetsiifilisuse testimiseks viidi embrüo värvimine läbi Crb antikehaga ja Crb üldine Crb RNAi embrüodes vähendati metsiktüübiga (täiendav joonis S5B). crb RNAi vähendas oluliselt ka Galla-1 taset varases embrüos (täiendav joonis S5D). Nagu galla-1 mutantide puhul, ilmnesid mat> crb RNAi emasloomade embrüod tõsiste kromosoomidefektidega nagu kromosoomsillad ja painutatud kromosoomid (joonis 4b). Samuti ilmnesid spindli mikrotuubulite, näiteks monopolaarsete spindlite, defektid ja sulandumine ühe või mitme naabervõlliga (joonised 4b ′ ja b ′ ′). Testisime, kas Galla-1 uuesti ekspressioon võib päästa crb- mutantsete embrüote defekte. Enam kui 80% -l ( n = 113 138 embrüost skooritud) mat> crb RNAi embrüodest ilmnesid kromosoomide segregatsiooni puudused. Galla-1 üleekspressioon mat> crb RNAi taustal vähendas defektsete embrüote väärtust ~ 30% -ni ( n = 47 141 embrüost skooriti) (täiendavad joonised S5E – E ′ ′). See viitab sellele, et Crbi funktsiooni vahendab vähemalt osaliselt Galla-1.

Põhinedes crb 11A22 fenotüübil, testisime teise null-alleeliga crb 8F105, mis kustutab C' -otsa 23a, mis sisaldab kahte funktsionaalset motiivi, PBM ja JM. 33 Järjepidevalt ilmnesid crb 8F105 mutantsetel embrüodel mitootilise jagunemise ajal sarnased defektid kui crb 11A22 mutantsete embrüotega (joonised 4c ja c ''). Et teha kindlaks, kas JM- ja PBM-motiivid on vajalikud ka mitootilise funktsiooni jaoks, kontrollisime geneetilist interaktsiooni, kasutades iga JM- ja PBM-puuduliku mutandi alleeli. 10 Huvitav on see, et crb- mutantsed alleelid, mis kas kustutasid PBM-i ( crb ΔPBM ) või muudetud JM-i ( crb ΔFBM , Y10A, E16A asendused JM-s), ei põhjustanud crb 11A22 või crb 8F105 null-alleelides täheldatud fenotüüpe (joonised 4d ja e) . Seega näivad crb- mutantsete embrüote mitootilised defektid PBM- ja JM-motiividest sõltumatud.

Crb ekspresseerub üldjoontes varajastes embrüodes võrgusilma võrgus. Tubuliinvärvimisega topeltmärgistamine näitab, et iga silma kaks külge kattuvad metafaasi kromosoomide ja mitootiliste spindlitega (joonis 5a). See Crb värvimine sarnaneb Galla-1 lokaliseerimise võrgusilma mustriga sama etapi embrüos (joonis 5c), kooskõlas spindli mikrotuubulite defektidega. Kasutasime ka Crb :: rohelise fluorestsentsvalgu sissetungimise alleeli 34, et kinnitada Crb-vastase antikeha abil tuvastatud Crb lokaliseerumise mustrit. Crb :: rohelise fluorestsentsvalgu reporteriga värvunud antikeha näitas samasugust ekspressioonimustrit kui Crb valk (joonis 5b). Nii Crb :: roheline fluorestsentsvalk kui ka Crb-valk näivad olevat rikkalikumad võrgusõlme piirkonnas, kus tsentrosoomid paiknevad. Need andmed viitavad sellele, et märkimisväärne osa Crb-st lokaliseerub kromosoomi segregatsiooni piirkonnas, kooskõlas crb RNAi ja varasetes embrüodes esineva defektse tuumajaotuse mutantsete fenotüüpidega.

Image

( a - a '′) Crb väljendatakse võrgusilma mustrina ja kattub metsiktüüpi (WT) embrüote metafaasi spindli mikrotuubulitega. ( b - b '') Crb :: rohelise fluorestsentsvalgu (Crb :: GFP) alleeli kandvas embrüos on GFP reporteri ekspressioon sarnane Crb valgu mustriga, nagu näidatud joonisel 5a. ( c - c '') Crb lokaliseerub Galla-1-ga, näidates samasugust võrgusilma mustrit varajastes embrüodes. Kaalulatid = 20 μm. ( d ) S2 rakuekstraktidega kaasuvas immunosadestamise katses seostub Galla-1 intravenoosselt Myc-märgisega Crb-ga. ( e ) GST-tõmbetestides seostub Galla-1 otse Crb-i rakusisese domeeniga.

Täissuuruses pilt

Galla-1 ja crb geneetiline interaktsioon suurendab võimalust, et need kaks valku võivad füüsiliselt interakteeruda. Kaasimmunosadestamise testides, milles kasutati kultiveeritud S2 rakkude ekstrakte, sadestus Galla-1 Myc-märgistatud Crb-vastane antikeha Myc-märgisega Crb (joonis 5d). Selle tulemuse toetuseks näitasid glutatiooni S-transferaasi (GST) väljatõmbekatsed, et Galla-1 seostub otseselt Crb rakusisese domeeniga (joonis 5e).

Galla-2 tuvastamine, mis seob eelistatult Drosophila Xpd

Inimese MIP18 on MMS19 – XPD – MIP18 kompleksis seotud Xpd-ga. MMS19 – XPD – MIP18 kompleksi löömine põhjustab mitoosi ajal kromosoomide segregatsiooni defekte. Xpd Drosophila homoloog on seotud ka mitme ülesandega, näiteks spindli mikrotuubulite õige orientatsioon, kromosoomide eraldamine ja mitootilise kinaasi aktiivsuse reguleerimine. 26 Kuna galla-1 mutantidel on märkimisväärselt sarnaseid tuumajaotuse defekte nagu Drosophila xpd mutantembrüodes , võib Galla-1 olla seotud Xpd funktsiooniga. Nii kontrollisime, kas Xpd hävitamine võib pärssida Crb-i sisemise üleekspressiooni fenotüüpi, nagu seda tegid galla -1 RNAi või mutandid. Tõepoolest, Xpd taseme vähendamine kas xpd RNAi või + / xpd - heterosügootsuse tõttu põhjustas Crb- sisese fenotüübi tugeva surumise (täiendavad joonised S6B ja C).

Kuna Galla-1 C-terminaalne pool näitab suurt järjestuse sarnasust MIP18-ga (joonis 1j), siis testisime, kas Galla-1 on füüsiliselt interaktsioonis Xpd-ga. Ootamatult näitasid bakteriaalse puhastatud Galla-1 ja Xpd-ga ripptestid vähest seondumist in vitro . Et testida, kas Galla-1 N-terminaalne pool võib pärssida Galla-1 MIP18-taolise domeeni seondumist Xpd-ga, viisime läbi sarnased tõmbetestid eraldi N- ja C-terminaalse poolega. Kuid Galla-1 N-terminaalne pool ega MIP18-taoline C-terminaalne pool ei seostunud märkimisväärselt Xpd-ga (joonis 6a). Lisaks näitasid kaasimmunosadestamise testid S2-rakke kasutades, et Galla-1 ei moodusta Xpd-ga tugevat kompleksi (joonis 6b). See viitas sellele, et võib olla ka teisi Galla-1-taolisi valke, mis võivad Xpd-d siduda.

Image

Galla-2 seob Drosophila Xpd ja on vajalik normaalse mitoosi korral. ( a ) Xpd ei seondu Galla-1-ga, vaid näitab järjepidevat seondumist Galla-2-ga. ( b ) S2 rakuekstraktide kaasimmunosadestamise testides ei moodusta Xpd Galla-1-ga valgukompleksi. ( c ) Galla-2 deletsioonimutant ( galla -2 A203 ) genereeriti P-elemendi galla -2 EPG5485 ebatäpse ekstsisiooni teel. Kustutatud piirkond on näidatud nurksulgudega. ( d - d '') metsiktüüpi (WT) embrüod tsüklis 12, värvitud 4 ', 6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI) ja tsentrososomiiniga (CNN). ( e - e '') galla-2 mutantsetel embrüodel on kromosoomivabad tsentrosoomid (valge kast e '′) ja kromosoomsillad (nooled e ' ′). Skaalariba = 20 μm.

Täissuuruses pilt

BLAST-i otsingu põhjal tuvastasime iseloomustamata Galla-1-ga seotud valgu (CG7949), mis on 51% identne Galla-1-ga (lisajoonis S7). Sellel geeniproduktil nimega Galla-2 puudub Galla-1 N-terminaalne piirkond, nagu MIP18. Galla-1 ja Galla-2 näitavad vastavalt 59 ja 71% valgujärjestust inimese MIP18-ga. Et teha kindlaks, kas Galla-2 funktsioonid on sarnased Galla-1 funktsioonidega, genereerisime kõigepealt deletsioonimutandi, galla -2 A203 , millel puudub kogu (526 bp) kodeeriv järjestus (joonis 6c). See mutatsioon on embrüonaalselt surmav, mis näitab, et Galla-2 on oluline embrüogeneesi jaoks. Seejärel testisime, kas galla-2 mutandid võivad pärssida silmas silma Crb-i üleekspressiooni fenotüüpi. galla -2 Δ203 / + heterosügootid surusid märkimisväärselt silmasisese Crb-fenotüübi (täiendav joonis S6F), nagu gala -1 homosügootmutandi puhul näha. Silmasisese Crb-fenotüübi pärssimine galla mutatsioonide abil näitas, et Crb-i intra- üleekspressioon võib tõsta Galla-1 / -2 valkude taset. Peaekstraktide Western blot analüüs näitas aga, et Crb-i intra- üleekspresseerimine GMR – Gal4 abil ei muuda Galla-1 / -2 valgu taset metsiktüübi omaga võrreldes märkimisväärselt (täiendav joonis S8). Seega ei ole GMR> Crb-i mitootilised defektid tõenäoliselt tingitud Galla-1 / -2 valkude suurenenud sisaldusest.

Järgmisena üritasime geneetilise iduliini galla -2 A203 mutantseid kloone genereerida ovo D FRT abil, et analüüsida funktsiooni kaotuse fenotüüpi. Me ei suutnud leida idutee mutantseid kloone, mis viitab sellele, et Galla-2 osaleb oogeneesis. Kuid 0–2- tunnistel galla -2 Δ203 mutantsetel embrüotel ilmnesid sarnased tuumajaotuse defektid, mis ilmnesid crb ja galla -1 mutantide puhul, näiteks kromosoomsillad ja kromosoomivabad tsentrosoomid (joonis 6e, täiendav joonis S9). Need tulemused näitavad, et Galla-1 ja Galla-2 on mitoosis sarnased. Kooskõlas galla-1 mutantsete embrüotega näitasid galla -2 mutantsed embrüod ka y-H2Av taseme tõusu (lisajoonis S3C).

On tähelepanuväärne, et kuigi Galla-1 ja Galla-2 jagavad konserveerunud valgujärjestusi, ei ole nad oma funktsioonides täielikult ülearused, kuna kummagi geeni mutatsioonid viivad sarnaste fenotüüpideni. Galla-2 näib siiski olevat kriitilisem kui Galla-1, kuna galla-2 nullmutandid on 100% surmavad, samas kui galla-1 nullmutandid näitavad osalist letaalsust. Galla-1 mutantide osaline letaalsus paranes märkimisväärselt, vähendades galla-2 annust galla- 2 / + abil (lisajoonis S10). See kinnitab, et normaalseks arenguks ja tuumajaotuse nõuetekohaseks jaotamiseks on vaja nii Galla-1 kui Galla-2, kuid Galla-2 saab selle puudumisel Galla-1 funktsiooni asendada ainult osaliselt.

Crb moodustab Galla – Xpd-ga kompleksi ja on vajalik fosfohoitooni H3 (PH3) lokaliseerimiseks

Testisime, kas Galla-2 suudab Xpd-d siduda. Erinevalt Galla-1-st näitas Galla-2 valk pidevat seondumist Xpd-ga tõmbetestides (joonis 6a) ja see sadestati tõhusalt koos Xpd-ga S2 rakuekstraktides (joonis 7a). Nagu võib seostada Galla-1 ja intravenoosse Crb vahel, interakteerus Galla-2 ka otseselt Crb intra-ga (joonised 7b ja c). Need tulemused viitavad sellele, et Crb moodustab Galla valkude ja Xpd-ga uudse valgukompleksi. Kuna Galla-2 võib siduda nii Crb kui ka Xpd (joonised 7a ja b), on võimalik, et Crb võib suhelda Xpd-ga. Tõepoolest, Crb intra võib moodustada Xpd-ga valgukompleksi (joonis 7d). Eksogeense Crb puudumisel suutis Galla-2 koos immunosadestuda Xpd-ga, nagu on näidatud varem (joonis 7a ja rada 3 joonisel 7e). Lisaks tõstis Crb-i lisamine transfektsiooni abil märkimisväärselt kaasimmunosadestatud Xpd taset (keskmiselt kolmest testist umbes 2, 1 korda) (joonis 7e), näidates Crb-i annusest sõltuvat interaktsiooni. Kooskõlas varem näidatud geneetilise interaktsiooniga (joonised 4d ja e) näitas füüsiline interaktsioon, et Galla / Xpd valgud võivad ikkagi seostuda Crb-i- sisese JM-ga, Crb-i sisese PBM-ga ja isegi Crb-i intra-JM- A- PBM-ga, millel on mutatsioonid nii JM-is kui ka PBM (lisajoonis S11). Need tulemused viitavad sellele, et ei JM ega PBM domeen pole Galla / Xpd valkude sidumiseks ja Crb mitootilise funktsiooni jaoks olulised.

Image

Crb moodustab Galla – Xpd-ga kompleksi ja on vajalik PH3 lokaliseerimiseks. ( a ) S2-rakkude kaasimmunosadestamise (Co-IP) testid näitavad, et Galla-2 seob FLAG-märgistatud Xpd. ( b, c ) Crb moodustab Galla-2-ga valgukompleksi otsese seondumisega, mida kinnitab Co-IP ( b ) ja GST-tõmbekatse ( c ). ( d ) S2 rakuekstraktidega immuunosadestamise testides tõmbab Myc-märgisega Crb intra- Xpd alla. ( e ) Galla-2-ga immunosadestatud Xpd tase tõuseb, kui transfektsiooni teel lisatakse Crb. f ) tsükli 12 anafaasi metsiktüüpi (WT) embrüod, värvitud PH3 jaoks (punane). 4 ', 6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI) värv on näidatud siniselt. ( g ) matt> crb RNAi embrüod näitavad kogu kromosomaalses piirkonnas suurenenud PH3 värvumist võrreldes metsiktüübiga. Kaalulatid = 20 μm.

Täissuuruses pilt

On tõestatud, et Drosophila Xpd on vajalik mitootilise kinaasi aktiivsuse ja kromosoomi stabiilsuse reguleerimiseks, sõltumata nukleotiidi ekstsisiooniparandusest. 26, 35 See uuring näitab, et tsükliiniga aktiveeritud kinaasi kompleksi õigeks lokaliseerimiseks on vajalik Xpd, kontrollides sel viisil spindli dünaamikat ja kromosoomi segregatsiooni. Metsikut tüüpi embrüote puhul väheneb PH3 värvumine anafaasi kromosoomide polaarses piirkonnas oluliselt. Kuid xpd- mutantsetes embrüodes ilmnes suurenenud kromosoomide osas suurenenud PH3 värvumistase tänu mitootilise kinaasi aktiivsuse ebaõigele reguleerimisele. 26 Kui Crb osaleb Xpd – Galla kompleksi moodustamises ja / või säilitamises, võib Crb redutseerimine jäljendada xpd mutantsetes embrüodes leiduvaid mitootilisi defekte. Tõepoolest, mat> crb RNAi embrüote korral näitasid anafaasilised kromosoomid kõigis kromosomaalsetes piirkondades kõrget PH3 värvumist võrreldes metsiktüübiga, mis näitab, et PH3 värvumine püsib polaarses kromosomaalses piirkonnas (joonised 7f ja g). On näidatud, et xpd mutantsetes embrüodes leiduvad kromosoomsillad on seotud PH3 säilimisega. 26 Sarnased kromosoomsillad ja PH3 säilimine mat> crb RNAi embrüote anafaaskromosoomides toetavad ideed, et Crb ja Xpd toimivad valgukompleksis.

Crb , galla -1 ja xpd interaktsioon rakkude proliferatsiooniks kujutluslikus ketas

Nii funktsiooni kadumise kui ka Crb-i üleekspressiooni tulemuseks on kujutluslike ketaste ülekasv, mis näitab, et Crb õige tase on oluline selle funktsiooniks kasvu regulatsioonis ja Crb intra võib toimida domineeriva-negatiivse tegurina. 9 Testisime, kas ketta kasvu Crb-funktsioon on seotud ka Galla ja Xpd valkudega. Crb intra- ekspressioon tiibkettas, kasutades MS1096-Gal4, põhjustas dramaatilise ülekasvu (joonis 8d). Seda Crb intra-sisest kasvamist pärssis tugevalt Galla-1 või Xpd redutseerimine RNAi poolt (joonised 8e ja f). See toetab seda, et Crb vajab tiivaketta kinnikasvamise soodustamiseks Gallat ja Xpd-d.

Image

Emakaväline Crb-i aktiivsus, mis põhjustab DNA kaheahelalisi purunemisi, pärsitakse galla -1 ja xpd -i löögi abil . ( a ) MS1096-Gal4 / + tiivaketas värvitud y-H2Av jaoks. Sisestus näitab MS1096> rohelise fluorestsentsvalgu ekspressioonimustrit. ( b, c ) Tiivaketta galla -1 RNAi ( b ) ja xpd RNAi ( c ) üleekspressioon näitab madalat fosforüülitud H2Av taset, mis sarnaneb kontrolliga ( a ). ( d ) Crb liigne ekspressioon tiibketastes, kasutades MS1096-Gal4 , suurendab fosforüülitud H2Av taset. ( e, f ) Galla-1 RNAi ja xpd RNAi vähendavad märkimisväärselt fosforüülitud H2Av taset. Kaalulatid = 100 μm. ( g ) Graafik näitab y-H2Av-positiivsete rakkude arvu kudede piirkonnas. Vearibad näitavad sd

Täissuuruses pilt

Tähelepanuväärselt tõi Crb- sisene üleekspressioon kaasa ka fosforüülitud H2Av taseme olulised tõusud (joonised 8d ja g), nagu on näha galla- mutantsete embrüote puhul (täiendav joonis S3). See viitab sellele, et Crb- sisene üleliigne levik kutsub esile DNA kahjustusi ja DNA kahjustuste vastuseid, näiteks H2Av fosforüülimist. Võimalik, et Crb- sisese üleekspressiooni tagajärjel moodustub Gallaga ülemäärane kompleks, mis võib valdavalt häirida endogeense Crb – Galla kompleksi funktsiooni. Sel juhul võib Galla taseme osaline vähendamine vähendada Crb-Galla kompleksi taset, pärssides sellega Crb domineerivat mõju üleekspressioonile. Tõepoolest, kui Galla-1 või Xpd redutseeriti RNAi poolt, pärssiti ka Crb-i poolt tõstetud y-H2Av taset. Need tulemused vastavad Crb interaktsiooni olulisusele Galla-1 ja Xpd-ga kudede ülekasvu jaoks ja sellega kaasnevatele DNA kahjustustele Crb-i siseselt .

Arutelu

Crb on seotud kasvu kontrollimisega ja kasvajageneesiga. 10, 11, 20, 36 On teada, et Crb kaotus või üleekspressioon põhjustab kujutluslike ketasrakkude ülemäärast levikut. On tehtud ettepanek, et kasvaja supressori Salvador – Warts – Hippo raja aktiveerimiseks on vajalik Crb, laiendatud FERM-i domeeni valgu lokaliseerimisel. 10, 11 Crb kaotamine või üleekspresseerimine põhjustab Ex eksliku kalkuleerimise, põhjustades Yorkie-sõltuvat rakkude proliferatsiooni ja rakkude ellujäämist. 9, 10 Vaatamata ulatuslikele uuringutele Crbi kohta, pole endiselt teada, kas Crb on otseselt seotud mitootiliste sündmustega. Uuringus tuvastasime kaks uudset geeni, galla-1 ja galla-2 , mis interakteeruvad crb-ga . See viis meid leidma Crb-i üllatavalt uus funktsioon kromosoomi eraldamisel ja stabiilsusel mitoosi ajal. Lisaks andsid Galla valgud seose Crb ja Xpd vahel, mis on mitoosi ja genoomi stabiilsuse kriitiline regulaator.

Hiljutine uuring on näidanud, et MIP18 või Xpd löömine inimese kultuurirakkudes põhjustab ebanormaalseid mitootilisi spindle, nagu näiteks monopolaarsed või multipolaarsed spindlid. 22 Kuid ülesvoolu teguritest, mis võivad reguleerida MIP18 ja Xpd lokaliseerimist ja / või funktsiooni, on vähe teada. Meie uuring näitab, et MIP18 / Xpd knockdown-rakkude mitootilised defektid sarnanevad Drosophila embrüote fenotüüpidega, mille galla või crb geeni funktsioon on vähenenud. Kuna Galla-1 on Crbi emalöömisel tugevalt vähenenud, näib, et Galla ja Xpd värbamine sõltub Crb-st. Hiljutised uuringud on seostanud Crb-i tuumori supressiooniga, 37 aga kuidas Crb on seotud mitootiliste sündmustega. Meie andmed pakuvad tõendeid Crb lokaliseerimise kohta Galla abil mitootiliste spindlitega. Üks võimalus on see, et Crb võib osaleda kromosoomi segregatsiooni stabiilsuse reguleerimises, värvates Xpd mitootilisteks spindliteks, kooskõlas Crb-i parendatud interaktsiooni-Xpd interaktsiooniga, lisades Crb intra . Seega annab see uuring mehhaanilise ülevaate Crb uudsest funktsioonist kui võimalikest jälgedest täiendavate valkude, sealhulgas Galla ja Xpd, värbamiseks, mis on seotud mitootiliste spindlite stabiliseerimisega ja kromosoomide eraldamisega. Pole teada, kuidas saab transmembraanset valku Crb lokaliseerida mitootiliste spindlite piirkonda. Huvitav on see, et hiljutised uuringud on näidanud, et endosoomid mängivad rolli astraalsete mikrotuubulite ja mitootilise spindli, 38 ning kromosoomi joondamise korraldamisel mitoosi ajal. 39 Seetõttu on võimalik, et tuumajaotuse ajal Crb lokaliseerimist reguleerib vesiikulitest sõltuv kaubitsemine. Meie andmed viitavad mudelile, kus Crb- sisene domeen toimib platvormina uue valgukompleksi moodustamiseks, mida me nimetame „CGX (Crb – Galla – Xpd) kompleksiks“, et reguleerida tuumajaotust varase embrüogeneesi ajal. Enne embrüo tsellulariseerumist jaotatakse Crb võrgusilmavõrgus, mis kattub märkimisväärselt mitootilise spindli mustriga ja värbab Galla-1 ja Galla-2 valke otsese seondumisega Crb-i intradomeeniga. Crb intra võib samuti värvata Xpd ja soodustada Galla-2 ja Xpd vahelist seondumist. Huvitav on see, et meie andmed viitavad sellele, et füüsilised interaktsioonid Crb intra ja Galla / Xpd vahel võivad hõlmata teistsugust Crb regiooni, välja arvatud JM ja PBM motiivid. Tegelikult näib, et nii JM kui ka PBM motiivide muteerumisel seostub Xpd paremini Crb-ga, mis viitab sellele, et JM ja PBM esinemine võib segada Xpd seondumist. Kuna aga Crb- siseses PBM-is on asendusmutatsioonid ainult kahes jäägis (Y10A ja E16A), mitte kogu JM domeeni deletsioonil, on ikkagi võimalik, et Galla / Xpd sidumiseks võivad olla vajalikud muud JM domeeni jäägid. Huvitav on see, et crb 8F105 alleel, millel on C-terminaali 23 aa deletsioon, näitab sarnaseid mitootilisi defekte nagu crb 11A22 null alleel, mis viitab sellele, et JM ja PBM vaheline piirkond võib olla oluline. Crb ja Galla / Xpd vahelise füüsikalise interaktsiooni spetsiifiliste motiivide selgeks tuvastamiseks on vaja täiendavaid uuringuid.

Vaatamata Galla-1 ja Galla-2 sarnastele valgujärjestustele, seob Xpd eelistatult Galla-2. Seega võib Galla-2 olla CGX kompleksi moodustamisel kriitilisem kui Galla-1. See võib olla seotud ka asjaoluga, et (i) galla-2 nullmutatsioon näitab tõsisemat letaalsust kui galla-1 nullmutatsioonid ja (ii) + / galla-2 heterosügoot võib tõhusalt suruda silma Crb-i silmade fenotüüpi üleekspressiooniks, samas kui galla -1 saab seda alla suruda ainult homosügootina. Meie andmed näitavad, et CGX kompleksi iga komponendi kadumine või vähenemine põhjustab spindli mustri ja kromosoomi segregatsiooni sarnaseid defekte. Xpd on vajalik mitootilise kinaasi aktiivsuse, spindli dünaamika ja kromosoomi segregatsiooni reguleerimiseks, 26 kuid pole täpselt teada, kuidas see on reguleeritud. Meie andmed annavad uue vihje, näidates, et Crb ja Galla osalevad siduvate partneritena Xpd värbamisel funktsionaalsesse kompleksi. Lisaks nende rollile tuumajaotuses varases embrüos näitasime, et tiivaketta ülekasvu Crb intra abil saab pärssida, vähendades kas Galla-1 või Xpd. Seega võib CGX kompleksi funktsioon olla vajalik ka rakkude paljunemiseks arenevates elundites. Vähki iseloomustavad mitoosi ja genoomi ebastabiilsuse valed eeskirjad. Meie leiud CGX kompleksi kohta võivad anda ülevaate imetajate Crb perekonna valkude toimimisest ja nende võimalikust seosest MIP18 – XPD kompleksiga.

materjalid ja meetodid

Kärbesgeneetika

Kõiki Drosophila tüvesid kasvatati ja hoiti toatemperatuuril. Intra -Crb üleekspressiooniks ristuti intraperitoneaalne UAS-Crb GMR-Gal4-ga (Bloomington). Galla-1 RNAi liin on pärit Riikliku Geneetika Instituudi aktsiakeskusest (Jaapan). Puudusjoon Df (2R) Exel6070 , xpd RNAi , UAS-crb RNAi, crb 8F105 ja ema-gal4 on pärit Bloomingtoni aktsiakeskusest ; Crb :: roheline fluorestsentsvalk, crb ΔFBM , crb ΔPBM alleelid on pärit Dr Yang Hongilt ja xpd p on Dr Beat Suterilt .

Galla nullmutantide genereerimine

galla-1 ja galla-2 deletsioonialleelid tekitati vastavalt P-elemendi sisestuse galla -1 EY01427 ja galla -2 [EP] G5485 ebatäpse ekstsisiooni teel. Võimalikud ekstsisioonijooned tuvastati w- markerite kaotuse kaudu ja PCR-mallidena kasutati nendest joontest pärit genoomset DNA-d. Kustutamise katkestuspunktid kinnitati sekveneerimisega. Galla-1 ja galla-2 mutantide embrüo letaalsust päästsid vastavalt aktiin> galla-1 või aktiin> galla-2 .

Galla-1 ja Galla-2 antikehade genereerimine

Galla-1 kogu kodeeriv järjestus amplifitseeriti ja klooniti pGEX-4T1-sse EcoRI ja XhoI saitide kaudu. GST – Galla-1 sulandvalku ekspresseeriti BL21-is isopropüül P-D-1-tiogalaktopyranoside indutseerimise teel ja küülikute immuniseerimiseks kasutati puhastatud valku (Peptron, Daejeon, Korea). Täispikk Galla-2 klooniti pGEX-4T1 BamHI ja XhoI saitide kaudu. GST – Galla-2 sulandvalk ekstraheeriti ja seda kasutati küülikute immuniseerimiseks (Abfrontier, Soul, Korea).

Embrüote immunovärvimine

Embrüo fikseerimine viidi läbi vastavalt standardsetele meetoditele. Embrüod fikseeriti 20 minutiks lahuses, mis sisaldas heptaani (Sigma, St Louis, MO, USA) ja 3, 7% formaldehüüdi (Polysciences, Warrington, PA, USA) PEM puhvris (PIPES – EGTA – MgCl2). Tububuliinivastaseks värvimiseks fikseeriti mikrotuubulite struktuuride säilitamiseks metanool. Embrüo värvimiseks näidatud tingimustes kasutati järgmisi antikehi: küüliku anti-tsentrosomiin (Dr Thomas Kaufmanilt) 40 vahekorras 1: 500, hiire anti-α-tubuliin 1: 100 (Sigma), roti anti-Crb 1: 500, küüliku anti-Dpatj 1: 500, küüliku anti-PH3 1: 200 (Millipore, Billerica, MA, USA), küüliku anti-γ-H2Av 1: 1000 (Rockland, Gilbertsville, PA, USA) ja küülik anti-Galla-1 vahekorras 1: 200. Sekundaarsed antikehad, mis on konjugeeritud Cy3, Cy5 või fluorestseiini isotiotsüanaadiga, olid pärit ettevõttelt Alexa Flour (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA). Paigaldamiseks kasutati Vectashieldi 4 ', 6-diamidino-2-fenüülindooliga (H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Fluorestsentskujutised saadi Carl Zeissi konfokaalmikroskoobi abil (Carl Zeiss, Jena, Saksamaa).

Rakukultuur, transfektsioon, immunosadestamine ja Western blot analüüs

Drosophila S2 rakke kasvatati M3 söötmes (Sigma) 10% putukakeskkonna lisandiga (Sigma). Transfekteerimine viidi läbi vastavalt Effectene reagendile (Qiagen, Hilden, Saksamaa) vastavalt tootja juhistele. Iga transfektsiooni jaoks kasutati kokku 1–2 μg DNA-d. Immunosadestamiseks lüüsiti rakud 0, 1% CHAPS puhvris (50 mM NaCl, 200 m M HEPES, 1 mM EDTA ja proteaasi inhibiitori kokteil) ja lüsaadid puhastati eelnevalt inkubeerimisel valgu G-sefaroosi helmestega (Amersham Bioscience, Amersham, UK). 1 tund temperatuuril 4 ° C. G-sepharose graanulid immunosadestati anti-Myc-ga (Abcam, Cambridge, MA, USA) temperatuuril 4 ° C 1 tund. Valgu G-sefaroosiga hõivatud immunosademeid inkubeeriti selgete lüsaatidega öö läbi temperatuuril 4 ° C. Immunosadesid pesti ja neile viidi läbi SDS-polüakrüülamiidi geelelektroforees. Western blot viidi läbi küüliku Galla-1 (1: 2000), küüliku Galla-2 (1: 5000) ja hiire V5-ga 1: 5000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

In vitro GST tõmmatavad testid

GST tõmbamiseks transformeeriti isopropüül-P-D-1-tiogalaktopüranosiid-indutseeritavad R2 rakud (BL21 derivaat) MBP – Crb intra, GST – Galla-1 ja GST – Galla-2 plasmiididega. Bakteriaalsed rakulüsaadid valmistati vastavalt kirjeldusele. Kasutati järgmistes tingimustes tõmmatavat puhvrit: 20 mM Tris, pH 7, 5, 150 mM NaCl, 0, 5 mM EDTA, 10% glütserooli, 0, 1% Triton X-100, 1 mM ditiotreitooli ja proteaasi inhibiitori kokteili. Lääne-blotimiseks kasutati küüliku MBP-vastaseid antikehi (Santa Cruz, Dallas, TX, USA) ja sekundaarset küülikuvastast antikeha (Jackson, Newmarket, Suurbritannia).

Liitumised

GenBank / EMBL / DDBJ

  • AAH59535
  • CAB07619
  • NP_080911
  • NP_115607
  • P38829

Täiendav teave

Piltfailid

  1. 1

    Lisajoonis 1

  2. 2

    Lisajoonis 2

  3. 3

    Lisajoonis 3

  4. 4

    Lisajoonis 4

  5. 5

    Täiendav joonis 5

  6. 6

    Lisajoonis 6

  7. 7

    Lisajoonis 7

  8. 8

    Täiendav joonis 8

  9. 9

    Täiendav joonis 9

  10. 10.

    Täiendav joonis 10

  11. 11

    Täiendav joonis 11

Wordi dokumendid

  1. 1

    Täiendavad joonise legendid

    Täiendav teave on lisatud käesolevale paberile Oncogeeni veebisaidil (//www.nature.com/onc)