Vähirakkude konserveerunud tunnused määratlevad nende tundlikkuse hamleti põhjustatud surma suhtes; c-myc ja glükolüüs | onkogeen

Vähirakkude konserveerunud tunnused määratlevad nende tundlikkuse hamleti põhjustatud surma suhtes; c-myc ja glükolüüs | onkogeen

Anonim

Õppeained

  • Vähi ainevahetus
  • Vähiravi
  • Rakusurm
  • Onkogeenid

Abstraktne

HAMLET on uus kasvajavalkude-lipiidide komplekside perekonna esimene liige, mis tapavad vähirakud laialdaselt, hoides samal ajal terveid diferentseeritud rakke. Paljud ja erinevad kasvajarakutüübid on surmava toime suhtes tundlikud, mis viitab sellele, et HAMLET tuvastab ja aktiveerib vähirakkudes konserveerunud surmaradu. Siin uurisime vähirakkude ja tervete rakkude tundlikkuse erinevuse molekulaarseid aluseid. Kasutades väikese juuksenõelaga RNA (shRNA) inhibeerimise, proteoomilise ja metaboomilise tehnoloogia kombinatsiooni, tuvastasime c-Myc onkogeeni HAMLET-i tundlikkuse oluliseks määrajaks. Kõrgenenud c-Myc ekspressioonitasemed soodustasid tundlikkust HAMLETi suhtes ja c-Myc shRNA löömine pärssis surmavat vastust, viidates sellele, et onkogeenne muundamine c-Myc-ga loob HAMLET-tundliku fenotüübi. Lisaks muutis HAMLET-i tundlikkust kasvajarakkude glükolüütiline seisund. Glükoosipuudus sensibiliseeris kasvajarakke HAMLET-i indutseeritud rakusurma suhtes ja shRNA-ekraanil heksokinaas 1 (HK1), 6-fosfofrukto-2-kinaas / fruktoos-2, 6-bifosfataas 1 ja hüpoksiast indutseeritav faktor 1a modifitseeris HAMLETi tundlikkust. Näidati, et HK1 seob HAMLET-i valgu massiivi, mis sisaldab ∼ 8000 sihtmärki, ja HK aktiivsus vähenes 15 minuti jooksul pärast HAMLET-ravi, enne kasvajarakkude surma morfoloogilisi tunnuseid. Paralleelselt vallandas HAMLET kartsinoomirakkudes kiire metaboolse halvatuse. Samuti näidati, et kasvajarakud sisaldavad suures koguses oleiinhapet ja selle derivaate juba 15 minuti pärast. Tulemused tuvastavad HAMLETi kui uudse vähivastase aine, mis tapab kasvajarakud, kasutades ära vähirakkude ühendavaid tunnuseid, näiteks onkogeenisõltuvus või Warburgi efekt.

Sissejuhatus

Vaatamata onkogeense muundamise molekulaarsele keerukusele kannatavad vähirakud sageli onkogeenisõltuvuse all ja ühe onkogeeni häirimine võib onkogeneesi tagasi pöörata või olla surmav (Weinstein ja Joe, 2008). C-Myc onkogeen on klassikaline näide (Felsher ja Bishop, 1999) ja see on dereguleeritud vähemalt 40% -l kõigist inimvähkidest (Dang et al., 2009). C-Myc laialdast muundavat toimet on seletatud selle võimega seostuda vähemalt 30% kõigi tuntud geenide promootoritega (Dang jt, 2009) ja transgeensetes hiirtes c-Myc üleekspressioon koos apoptoosi pärssimisega on piisav kõhunäärmevähi moodustumise juhtimiseks (Pelengaris jt, 2002). Hiljuti tehti ettepanek c-Myc pärssimiseks, et peatada vähi kasv ja võimaldada isegi kudede paranemist ja funktsionaalse fenotüübi taastamist (Soucek et al., 2008). Tervislikel rakkudel on seevastu piiratud replikatsioonipotentsiaal tänu nende vastuvõtlikkusele programmeeritud rakusurma, kasvuvastaste signaalide ja muude molekulaarsete interaktsioonide tõttu, mis piiravad pikaealisust ja säilitavad koe normaalse homeostaasi (Hanahan ja Weinberg, 2000, 2011).

Onkogeeni aktiivsus võib põhjustada ka muutusi glükolüütilistes seadmetes (Hsu ja Sabatini, 2008) ning vähirakud sõltuvad suuresti glükolüüsist (Mathupala et al., 1997). Esmalt püütakse glükoos rakkudesse heksokinaaside 1 ja 2 (HK1 ja HK2) abil kinni (Wilson, 2003) ja seejärel muundatakse need püruvaadiks. Vastupidiselt tervetele rakkudele juhivad vähirakud püruvaadi muutumist laktaadiks isegi hapniku juuresolekul, seda protsessi nimetatakse Warburgi efektiks (Warburg, 1956). Värsked uuringud on näidanud, et oksüdatiivne fosforüülimine on enamikus vähirakkudes funktsionaalne (Vander Heiden jt, 2009) ning on pakkunud, et Warburgi efekt võib kajastada püruvaat kinaasi isovormi M2 (PKM2) ekspressiooni (Christofk jt, 2008)., mis katalüüsib fosfoenolpüruvaadi defosforüülimist püruvaadiks ja vastutab ATP netotootmise eest glükolüütilises järjestuses. Erinevalt tervetest diferentseerunud rakkudest ekspresseerivad embrüonaalsed rakud ja enamik vähirakke peamiselt M2 isovormi (Mazurek et al., 2005) ja mõnedes kasvajates pöörab M2 asendamine M1-ga Warburgi efekti ja vähendab tumorigeensust (Christofk jt, 2008). Lisaks PKM2-le on c-Myc-l põhiline roll metabolismi ümberprogrammeerimisel teatud tuumorirakkudes ja on tõestatud, et see suurendab aeroobset glükolüüsi, aktiveerides otseselt geene, näiteks HK2 , PKM1 ja LDHA (Shim jt, 1997; Dang jt) ., 2009). Transkriptsioonifaktori hüpoksiast indutseeritav faktor 1 (HIF1) reguleerib ka glükolüüsi, suurendades glükoositransportööride, HK-de ja fosfo-fruktokinaaside (PFK) ekspressiooni (Denko, 2008).

HAMLET on osaliselt voltimata a-laktalbumiini ja oleiinhappe kompleks, mis tapab eelistatult vähirakud ja ebaküpsed rakud (Svanborg et al., 2003). Lai kasvajavastane toime hõlmab leukeemia-, kartsinoomi- ja glioomirakke, samal ajal kui terved diferentseerunud rakud elavad HAMLET-i väljakutse all (Fischer jt, 2004). HAMLET näib seega olevat suunatud väga konserveerunud ellujäämismehhanismidele, mis on vähirakkude jaoks üliolulised. Seda selektiivsust on in vivo kinnitatud inimese glioblastoomi ksenotransplantaadi mudelis ja hiire põievähi mudelis (Fischer jt, 2004; Mossberg jt, 2010). Naha papilloomide ja kusepõievähkide kliinilistes uuringutes (Gustafsson jt, 2004; Mossberg jt, 2007) näitas HAMLET tuumoriidide toimet piiratud kõrvaltoimetega.

Selles uuringus uuriti HAMLET-i tundlikkuse molekulaarseid aluseid vähirakkudes, kasutades skriiningtehnikaid transkriptsiooni, valkude koostoime ja metabolismi tunnuste tuvastamiseks, mis muudavad ellujäämist pärast HAMLET-iga kokkupuudet. Näitasime, et tundlikkus HAMLETi suhtes sõltub c-Myc-st ja glükolüüsist ning tuvastasime HAMLETi potentsiaalseks otseseks sihtmärgiks glükolüütilise ensüümi HK1. Tulemused näitasid ka, et HAMLET muudab vähirakkude metabolismi ja võib häirida glükolüüsi, mis on Warburgi efekti tõttu vähirakkudes muutunud.

Tulemused

ShRNA-ekraan tuvastab c-Myc ja glükolüütiliselt seotud valgud HAMLET-i tundlikkuse modifikaatoritena

HAMLET-tundlikkuse jaoks olulistest geenidest erapooletu ülevaate saamiseks kasutasime RNA häirete vöötkoodide skriinimistehnoloogiat (Brummelkamp ja Bernards, 2003; Silva jt, 2005, 2008). Vöötkoodiekraanid kasutavad DNA mikromõõtmeid, et jälgida iga väikese juuksenõelaga RNA (shRNA) vektori suhtelist arvukust shRNA vektorkoguga nakatunud rakkude suures populatsioonis (joonis 1a). Kasutades retroviirusinfektsiooni, võtsime kasutusele 4603 shRNA-de kogumi, mis on kavandatud 1650 vähiga seotud inimese geeni sihtmärgiks (Silva jt, 2005) RNA interferentsi supresseerimiseks A549 kopsukartsinoomirakkudesse, mis on teadaolevalt HAMLET-tundlikud. Nakatunud rakud jaotati kolmeks kogumiks, millest ühte jäeti töötlemata ja kasutati võrdlusmaterjalina, ülejäänud kaks eksponeeriti HAMLETi madala (7 μM) ja kõrge (35 μM) kontsentratsiooniga. Pärast 2-tunnist HAMLET-töötlust saime shRNA-kassetid PCR-amplifikatsiooni abil ja analüüsisime nende suhtelist arvukust hübridiseerimisel DNA mikrokihtidega, nagu eelnevalt kirjeldatud (Zender et al., 2008).

Image

ShRNA vöötkoodiekraan tuvastab c-Myc ja metaboolsed valgud HAMLET tundlikkuse määrajatena. ( a ) shRNA-ekraani töövoog. A549 rakud nakatati vöötkoodiga shRNA-de raamatukoguga, mis oli suunatud 1650 vähiga seotud geenile. Pärast 2-tunnist HAMLET-i kokkupuudet koguti vöötkoodid, amplifitseeriti ja märgistati Cy3 / Cy5-ga ning iga shRNA suhtelist arvukust mõõdeti mikrokiirtega. ( b ) Väike arv juuksenõelasid rikastati, nagu on näha kontrollproovide (Cy3) ja HAMLETi shRNA-de graafiku MA (log-intensiivsuse suhted ( M- väärtused) versus log-intensiivsuse keskmised ( A- väärtused)) graafikul MA (35) μ M) proovid (Cy5). ( c, d ) HK1-le ja metabolismi reguleerivatele geenidele PFKFB1 , HIF1α ja c-Myc suunatud shRNA -d muudavad HAMLET-i tundlikkust oluliselt. Diagramm näitab iga geeni kohta kõige kõrgemat skoori. ( e, f ) Kõiki ShRNA-ekraanil saadud positiivseid kokkulangevusi sisaldava geeninimekirja suhtes viidi läbi geenikomplekti rikastamise analüüs, kasutades kanooniliste radade kogumit, et tuvastada ühised rajad, millele positiivsed shRNA-d suunatud. Ras-rajal ja glükolüüsiga seotud radadel olid kõrgeimad normaliseeritud rikastamise skoorid (NES).

Täissuuruses pilt

HAMLET-iga ravitud populatsioonis oli väike arv shRNA vektoreid rikastatud või kahanenud; 43 inhibeerival ja 44 sensibiliseerival shRNA-l oli absoluutne MaxMeani skoor> 0, 5 nii kõrge kui ka väikese annusega ravirühmas või absoluutne skoor> 2 ükskõik millises rühmas (joonis 1b ja täiendav tabel S1). Tuvastatud geenide hulka kuulusid onkogeenid nagu c-Myc ja glükolüüsiga seotud valgud. HK1 ja HIF1α vastased shRNA-d sensibiliseerisid rakud HAMLET-i suhtes (joonised 1c ja d), mis viitab sellele, et HK1 ja HIF1a suurenenud ekspressioon juhib HAMLET-i suhtes vastupidavamat fenotüüpi. Seevastu 6-fosfofrukto-2-kinaasi / fruktoos-2, 6-bifosfataasi (PFKFB1) ja c-Myc-i sihtiv shRNA päästis rakud (joonised 1c ja d). HAMLET-iga rikastatud bioloogilised rajad identifitseeriti geenikomplekti rikastamise analüüsi (GSEA) abil, kasutades kanooniliste radade geenikomplekti. GSEA algoritm testib üksuste komplekti rikastamist selliste esemete suuremas järjestatud loetelus. Tuvastatud rajad kinnitasid glükolüüsi olulisust, kuna neli glükolüüsiga seotud rada muutsid HAMLET-i tundlikkust märkimisväärselt (joonised 1e ja f). Lisaks tuvastati HAMLET-i tundlikkuse määrajana Ras-rada, mis reguleerib c-Myc ekspressiooni (joonis 1f).

ShRNA-ekraan näitas, et onkogeenne muundamine c-Myc-ga sensibiliseerib rakke HAMLET-i poolt põhjustatud rakusurma ja glükolüütiline mehhanism mõjutab vähirakkude HAMLET-tundlikkust.

C-Myc onkogeen määrab HAMLETi kasvajavastase toime

Järgnevalt uurisime, kas HAMLET-i tundlikkus peegeldab c-Myc ekspressioonitaset. Inimese kopsukartsinoomirakud (A549), neeruvähirakud (A498) ja pooldiferentseeritud terved neerurakud (inimese neeru proksimaalsed tuubulrakud) eksponeeriti HAMLET (21 μM) ja ATP taset jälgiti (joonis 2a). Kopsu- ja neeruvähirakkudes täheldati ATP taseme kiiret langust, kuid terved rakud jäid 3, 6 ja 24 tunni pärast muutumatuks. Kuid kõrgemate HAMLET kontsentratsioonide korral nähti nendes rakkudes ka osalist vastust (täiendav joonis S1A). C-Myc ekspressiooni erinevus kajastas erinevust HAMLET tundlikkuses, kuna kopsu ja neeru kartsinoomirakud näitavad c-Myc suuremat ekspressiooni kui terved rakud (joonised 2b ja c).

Image

c-Myc muudab tundlikkust HAMLET-i indutseeritud rakusurma suhtes. ( a ) Tervislikke neerurakke (HRPTEC), neeru kartsinoomi rakke (A498) ja kopsu kartsinoomi rakke (A549) töödeldi HAMLET-iga (21 μM) ja ATP taset mõõdeti 3, 6 ja 24 tunni pärast. HAMLET vähendas ATP taset kartsinoomirakkudes, kuid mitte tervetes rakkudes. ATP tase on esitatud protsendina töötlemata rakkudest samal ajahetkel. Kolme katse keskmine + sem ( b ) c-Myc mRNA tasemete qPCR kvantifitseerimine. Näidatud on c-Myc mRNA suhteline tase (c-Myc / GAPDH, % tervete rakkude tasemest). Kahe katse keskmine väärtus + sem ( c ) c-Myc Western blot koos aktiiniga laadimiskontrolliks. ( d, e ) c-Myc ekspressiooni pärssimist A549 rakkude transfekteerimisega c-Myc shRNA-dega (72 h) kinnitasid qPCR (paneel d ) ja c-Myc Western blot, kasutades aktiini laadimiskontrolliks (paneel e ). C-Myc mRNA suhteline tase on näidatud (c-Myc / GAPDH, protsendina CT (kontroll) shRNA-ga transfekteeritud rakkude tasemest). Kahe katse keskmine + sem ntf = transfekteerimata. ( f ) c-Myc shRNA-ga transfekteeritud A549 rakud (72 tundi) muutuvad vastupidavamaks HAMLETi surmava mõju suhtes. HAMLET tsütotoksilist toimet kvantifitseeriti pärast 3 tundi ATP taseme või rakkude arvu vähenemisena, võrreldes mittetransfekteeritud rakkude (ntf) ja CT shRNA-ga transfekteeritud rakkudega. ATP tase protsentides vastavate töötlemata rakkude tasemest. Keskmine 2–3 katset + sem (ATP) või ühe katse korduste korduste keskmine + sd (rakkude ellujäämine). ( g ) A549 rakud rakutsükli abil peatati seerumi nälgimise (48 tundi) või topelt-tümidiini blokeerimise teel ja töödeldi HAMLET-iga. Vähirakkude elujõulisust hinnati 3 tunni pärast pärast trüpaansinise välistamise või ATP mõõtmiste kasutamist. Kolme katse keskmine + sem.

Täissuuruses pilt

Et uurida, kas c-Myc aktiivsus mõjutab HAMLET-i indutseeritud rakusurma, transfekteeriti A549 kopsukartsinoomi rakke ajutiselt inhibeerivate c-Myc shRNA-de või ebaolulise shRNA-ga ning c-Myc ekspressiooni vähenemist kinnitati 72 tunni pärast (joonised 2d ja e). Vähendatud c-Myc ekspressiooniga rakud muutusid HAMLETi surmava mõju suhtes vastupidavamaks (21, 36 μM, 3 h), samas kui ebaolulise shRNA-ga transfekteeritud rakud säilitasid tundlikkuse, LC50 sarnanes transfekteerimata rakkudega (joonis 2f). Tulemused viitavad sellele, et c-Myc ekspressiooni tase on HAMLET-i tundlikkuse otseseks määrajaks vähirakkudes.

Kuna c-Myc-i löömine põhjustab paljudes rakuliinides kasvu peatumist (Watson et al., 1991), indutseerisime teadlikult kasvu peatamise ja katsetasime mõju HAMLET-i tundlikkusele. A549 kopsukartsinoomirakkudele tehti seerumi ärajätmine või topelt-tümidiini blokeerimine ja kasvu peatamist kinnitati voolutsütomeetria abil pärast propiidiumjodiidi värvimist (täiendav joonis S1b). Kasvu peatamine ei muutnud aga oluliselt HAMLET-i tundlikkust (joonis 2g), mis näitab, et c-Myc shRNA mõju HAMLET-i tundlikkusele ei sõltu võimalikust kasvu seiskumisest, mis on põhjustatud c-Myc-i röövimisest.

Glükoosipuudus ja glükolüüsi inhibiitorid soodustavad HAMLET-i indutseeritud rakusurma

ShRNA sõel ja GSEA analüüs tuvastasid HAMLET tundlikkuse määrajatena glükolüüsiga seotud valgud. Otseseks uurimiseks, kas glükolüüs mõjutab tundlikkust HAMLETi suhtes, jäeti A549 kopsukartsinoomirakud 30 minutiks glükoosist ilma, lisati HAMLET (21 ja 36 μM) ja kvantifitseeriti rakusurm (15 minutit, 1 ja 3 tundi). Glükoosipuudus sensibiliseeris HAMLET-i rakke, põhjustades dramaatiliselt ATP taseme ja trüpaansinise tõrjutuse vähenemist, samuti laktaatdehüdrogenaasi vabanemise suurenemist ja see mõju kahanes glükoosi lisamisega (joonis 3a ja täiendavad joonised S2). Lisaks suurendas glümolüüsi pärssiv glükoosianaloog 2-deoksüglükoos HAMLET toksilisust annusest sõltuval viisil (joonis 3b ja täiendav joonis S2).

Image

Glükoosipuudus ja glükolüüsi pärssimine soodustab HAMLET-i indutseeritud rakusurma. Glükoosi (G) puudumine ja glükolüütilise inhibiitori 2-desoksüglükoos (2DG) tugevdavad HAMLETi surmavat toimet, samas kui glükoos (0, 5, 2, 5, 5, 0 mM) päästab rakud annusest sõltuval viisil. HAMLETi tsütotoksilist toimet kvantifitseeriti ATP taseme mõõtmise või trüpaansinise (TB) väljajätmisega ja muutused morfoloogias registreeriti konfokaalse mikroskoopia abil. ( a ) Glükoosipuudus või 2DG (2, 5 mM) suurendas HAMLET (HL, 21 μM) tsütotoksilist toimet A549 rakkudes. ATP tasemed on toodud protsendina töötlemata rakkude sisaldusest 2, 5 mM glükoosisisalduses. Keskmine 2–4 katset + sem (1 tund) * P 0, 05, *** P 0.001 (vs HL, 5 mM glükoos ATP ja vs HL, 2, 5 mM glükoos TB kohta). ( b ) Glükolüüsi pärssimine 2DG abil tugevdas HAMLETi surmavat toimet glükoosipuuduses A549 rakkudes annusest sõltuval viisil. ATP tase töötlemata rakkude sisaldusest protsentides. Kahe katse keskmine + sem ( c ) Glükoosipuudus suurendas verejooksu (seda tähistab nool, b) ja suurendas ümarate surnud rakkude arvu, mis olid tugevalt värvitud HAMLETiga (näidatud noolega, d). A549 rakkudest jäeti glükoos välja, neid töödeldi Alexa Flour 568-märgisega HAMLET-iga (21 μM, punane) ja morfoloogia muutused registreeriti elusrakkude konfokaalse mikroskoopia abil 3 tunni jooksul. Tuumad visualiseeritakse Hoechstiga (sinine). Kaalulatid: 10 μm.

Täissuuruses pilt

Et täiendavalt uurida glükoosi mõju raku vastusele HAMLETile, lisati Hoechstiga värvitud vähirakkudele Alexa Fluor 568-märgisega HAMLET ja uuriti neid reaalajas konfokaalse pildistamise abil. Glükoosipuuduses rakkudes oli verejooks 1 tunni pärast rohkem kui glükoosiga toidetud rakkudel ja 3 tunni möödudes oli enamikul glükoosipuuduses rakkudest morfoloogia muutunud ja neil oli tugev HAMLET värvumine (joonis 3c). Lisaks suurendas 3-bromopüruvaat, mis pärsib glükolüüsi ja mitokondriaalset ATP tootmist (Ihrlund jt, 2008), HAMLET-i indutseeritud rakusurma (lisajoonis S2F). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et vähirakud on tundlikud HAMLETi surmava toime suhtes glükolüüsi pärssimisel.

HAMLET seondub HK1-ga

HAMLETi potentsiaalsed seondumispartnerid glükolüütilises rajas tuvastati suure sisaldusega funktsionaalse valgu massiivi abil, millel leiti 8000 inimese rekombinantset valku (joonis 4a). Ranget statistilist filtreerimist kasutades tuvastati 87 olulist kokkulangevust, sealhulgas nukleotiide siduvad valgud, proteiinkinaasid ja GTP-d siduvad valgud. Glükolüütiline ensüüm HK1, mille Z- tulemus oli 5, 09 (joonis 4a), oli üks populaarsemaid tulemusi. Lisaks näitasid mitmete glükolüütiliste ensüümide signaali intensiivsuse suurenemine HAMLETi kontsentratsiooni tõustes, kuid madalamate Z- skooride korral, mis ei vasta seega selles ekraanis rangetele positiivse tabamuse kriteeriumidele ( Z- tulemus> 3 ja korduvad punkt- ja massiivivahelised variatsioonikordajad) (CV) <50%). Nende ensüümide hulka kuulusid PFKFB2 ja PFKFB4 (vastavalt Z- skoor 0, 3 ja 0, 9), GAPDH (glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaas, Z- skoor 0, 5) ja PKM2 ( Z- skoor 0, 1). HAMLET-i seondumise kinnitamiseks glükolüütiliste ensüümidega laotati polüvinülideenfluoriidi membraanidele inimese rekombinantse HK1 ja PKM2, küüliku glükoos-6-fosfaadi isomeraasi (GPI, 93% identne inimesega) ja veise seerumi albumiiniga negatiivse kontrollina . Membraane inkubeeriti järjestikku HAMLET või a-laktalbumiiniga, kitse anti-α-laktalbumiini antikehaga ja küüliku kitsevastase mädarõika peroksiidiga konjugeeritud antikehaga. HAMLET seostub tugevalt inimese HK1-ga, kuid mitte inimese PKM2, küüliku GPI ega veise seerumi albumiiniga (joonis 4b). Seda tugevat koostoimet α-laktalbumiiniga ei täheldatud, mis viitab sellele, et HAMLET kompleksil on oluliselt suurem afiinsus HK1 suhtes kui natiivsel rasvhapetevabal valgul.

Image

HAMLET seondub HK1-ga. ( a ) 8000 valku sisaldava valgumassi korral seondus HAMLET HK1-ga annusest sõltuval viisil (5 või 50 ng / μl), kuid mitte PKM2 või muude glükolüütiliste ensüümidega. ( b ) Kaug-lääne dot-blot'iga seondus HAMLET tugevalt inimese HK1-ga, kuid mitte ülejäänud kolme valguga. Inimese rekombinantsed H-märgistatud HK1 ja PKM2, küüliku lihase GPI ja BSA kanti PVDF-i membraanidele ja inkubeeriti HAMLET (HL) või a-laktalbumiiniga (ALA) (mõlemad 0, 2 mg / ml) või puhvriga kontrollina. Seotud HAMLET või α-laktalbumiin tuvastati kitse anti-α-laktalbumiini ja HRP-ga konjugeeritud küüliku kitsevastaste antikehade abil ning kvantifitseeriti ImageJ tarkvara abil. Keskmine nelja (HK1 ja PKM2) või seitsme (GPI, BSA) katse + HAMLET-i keskmine väärtus. Tulemused ühest α-laktalbumiini katsest. ( c ) HAM1-ga kolokaliseeritud HAMLET, eriti perinukleaarses piirkonnas. A549 rakke töödeldi Alexa Fluor 568-märgistatud HAMLET-iga (HL, punane) 15 minutit ja värviti anti-HK1 ja Alexa Fluor 488-märgistatud antikehadega (roheline). Kaalulatid: 20 μM. ( d ) HAMLET vähendas HK aktiivsust, kuid mitte annusest sõltuval viisil püruvaat kinaasi või glükoos-6-fosfaadi isomeraasi aktiivsust. A549 rakke töödeldi 15 minutit erinevate HAMLET kontsentratsioonidega, lüüsiti ja lüsaatide aktiivsus kvantifitseeriti seotud spektrofotomeetrilises testis. Kolme katse keskmine + sem

Täissuuruses pilt

HAMLET ja HK1 interaktsiooni visualiseerimiseks vähirakkudes kasutati konfokaalset mikroskoopiat. A549 kopsukartsinoomi rakke töödeldi Alexa Fluor 568-märgistatud HAMLET-iga (15 min, 21 μM), fikseeriti ja värviti anti-HK1 antikehadega (joonis 5c). PKM2-vastaste antikehadega värvitud rakke kasutati kontrollina (täiendav joonis S3). Ravimata rakud näitasid perinukleaarses piirkonnas suurima intensiivsusega granuleeritud HK1 (joonis 5c). HAMLET-iga töödeldud rakkudes täheldati tugevat kolokalisatsiooni HAMLET ja HK1 vahel, eriti perinukleaarsete ümardatud agregaatide korral. Seevastu tuvastati ainult PKM2 nõrk kolokalisatsioon HAMLETiga (täiendav joonis S3).

Image

Glükolüüsiga seotud valkude hävitamine muudab HAMLET-i tundlikkust. ( a, b ) A549 rakud transfekteeriti kontroll-siRNA-de või siRNA-dega, mis olid suunatud HK1 või PKM2. 2 päeva möödudes kinnitati löömine qPCR-ga ( a ) ja Western blot-analüüsiga GAPDH-ga laadimiskontrolliks ( b ). Näidatud on mRNA suhteline tase (PKM2 / PPIA ja HK1 / PPIA protsentides CT siRNA-ga transfekteeritud rakkude tasemest). Keskmine 3–5 katset + sem ( c ) HK1 siRNA-d võimendasid HAMLET tsütotoksilist toimet A549 rakkudes. A549 rakud transfekteeriti siRNA-dega, mis olid suunatud HK1-le, kontroll-siRNA-de või siRNA-dega, mis olid suunatud PKM2-le, ja 2 päeva pärast töödeldi HAMLET-iga (3 tundi). ATP tase ja elujõulisus protsentides vastavates töötlemata rakkudes. 3–5 katse keskmine + sem * P <0, 05. ( d, e ) PFKFB1 siRNA vähendas HAMLET tsütotoksilist toimet A549 rakkudes. A549 rakke transfekteeriti 48 tundi PFKFB1 siRNA või kontroll-siRNA-ga ja töödeldi HAMLET-iga. ( d ) ATP tase protsentides vastavate töötlemata rakkude tasemest. Kolme katse keskmine + sem * P <0, 05. ( e ) PFKFB1 hävimist kinnitati qPCR ja Western blot meetodil.

Täissuuruses pilt

HAMLET vähendab HK aktiivsust vähirakkudes

Selleks, et teha kindlaks, kas HAMLET häirib vähirakkude glükolüüsi, mõõdeti HK, PK ja GPI aktiivsust HAMLET-iga töödeldud A549 kopsukartsinoomirakkude puhastusainevabades lüsaatides (7, 21 ja 36 μM) sidestatud spektrofotomeetriliste testide abil. HK aktiivsus näitas annusest sõltuvat suundumust languse suunas pärast HAMLET-ravi 15 minutit (joonis 4d), kuid GPI ja PK aktiivsust ei muudetud oluliselt. Sellel varasel ajahetkel ei olnud muutusi raku morfoloogias ega raku HK1 tasemes (täiendavad joonised S4a ja b). ATP tase langes annusest sõltuval viisil juba 15 minuti pärast, kuid laktaadi tootmine vähenes alles 3 tunni pärast (lisajoonis S4c). Tulemused viitavad sellele, et HAMLET võib vähendada HK aktiivsust kopsukartsinoomirakkudes.

HK1 või PFKFB1 löömine moduleerib HAMLET-i tundlikkust

ShRNA sõeluuringu kontrollimiseks ja glükolüüsiga seotud valkude rolli edasiseks uurimiseks HAMLET-i indutseeritud rakusurmas transfekteeriti A549 kopsukartsinoomirakud ajutiselt HK1, PFKFB1 ja PKM2 sihtivate väikeste segavate RNA-dega (siRNA-d). Knockdown kinnitati qPCR ja Western blot analüüsidega (joonised 5a, b ja e) ning tundlikkus HAMLET suhtes kvantifitseeriti, mõõtes ATP taset ja trüpaani sinist välistamist (joonised 5c ja d). HK1 siRNA-ga transfekteeritud rakud näitasid AAM-i selgemat kaotust vastusena HAMLET-ile (21 ja 36 μM, P <0, 05) kui transfekteerimata rakud või kontroll-siRNA-ga transfekteeritud rakud. Seevastu PKM2 siRNA ei muutnud tundlikkust HAMLETi suhtes (joonis 5c). Sarnaseid tulemusi täheldati trüpaansinise välistamise korral. Lisaks vähendas shRNA ekraanil resistentsuse tekitanud PFKFB1 koputamine tundlikkust HAMLETi suhtes (joonis 5d). Need tulemused kinnitavad, et HK1 ja PFKFB1 löömine suurendab vastavalt HAMLET tundlikkust ja vähendab seda.

HAMLET häirib kiiresti vähirakkude metabolismi

Hindamaks, kas HAMLET muudab rakkude metaboolset olekut, võrdlesime HAMLET-iga töödeldud kopsukartsinoomirakkude (36 μM, 15 minutit ja 1 tund) metaboomilist profiili töötlemata rakkude omaga (joonis 6 ja täiendav joonis S5). HAMLETi võimalike metaboolsete mõjude uurimiseks kasutati kolme erinevat sihtimata metaboliitide profileerimise meetodit. Hüdrofoobsete metaboliitide (nagu lipiidid) võrdlemiseks kasutati pöördfaasilist vedelikkromatograafiat, mis oli ühendatud elektropihustus-ionisatsiooni massispektromeetriaga (LC-MS), hüdrofiilsete interaktsioonide kromatograafiat ning LC-MS kasutati paljude polaarsete metaboliitide ja gaasikromatograafia uurimiseks. massispektromeetria (GC-MS) põhiliste metaboliitide profiilimiseks (Baran jt, 2009). LC-MS pöördfaasi profileerimise abil tuvastati 560 tunnust (sealhulgas sama metaboliidi erinevad aduktid, isotoobid ja lähtekohas lagunemisproduktid), mis määratleti m / z väärtuse ja LC peetumisajaga ( m / z väärtuse ja retentsiooniaeg, vt joonis 6a). Analüüs näitas, et 560 tunnusest 125 olid pärast 15-minutist HAMLET-ravi oluliselt muutunud (107 suurenes, 18 vähendati). 1 tunni pärast vähenes enamus 76 muudetud tunnusest (22 suurenes, 54 vähendati) (joonis 6d). Nagu HAMLET-i kasutuselevõtu põhjal võis oodata, tuvastati HAMLET-iga töödeldud rakkudes mõlemal ajahetkel kõige suurema signaalitugevusega tunnused ja mitmed sarnase peetumisajaga tunnused oleiinhappe, HAMLETi lipiidikomponendi, erineva ionisatsiooni ja isotoobi variantide põhjal täpse massi ja LC retentsiooniaja kohta.

Image

HAMLET häirib vähirakkude ainevahetust. ( a - e ) Metaboliitide muutused HAMLET-iga töödeldud (15 min ja 1 tund) A549 rakkudes analüüsiti LC-MS pöördfaasikromatograafia abil. a ) Kokku tuvastati 520 tunnust, mis olid määratletud peetumisaja ja m / z väärtusega. ( b ) Signaali intensiivsuse log 2-ga muudetud voldimuutuste sageduse jaotus HAMLET-iga töödeldud ja kontrollrakkude vahel. Pärast signaali keskmise intensiivsuse kiiret tõusu 15 minuti möödudes täheldati vastusena HAMLETile keskmise signaali intensiivsuse langust. c ) Omadusi, millel on absoluutne logi kahekordne muutus 1 ja P-väärtus 0, 05, peeti märkimisväärselt muudetuks. ( d ) Seda määratlust kasutades leiti, et HAMLETiga töödeldud rakkudes 15 minuti jooksul muudeti 125 tunnust ja 1 tunni jooksul töödeldud rakkudes 76 tunnust, võrreldes vastavate kontrollrakkudega. Kokku muudeti 24 neist omadustest mõlemal ajahetkel märkimisväärselt. e ) Oluliselt muutunud omaduste graafikud log 2-ga muudetud voldi muutusega, mida tähistavad värvid.

Täissuuruses pilt

Sihtotstarbeline profileerimine hüdrofiilse interaktsiooni kromatograafiat kasutades. LC-MS oli kooskõlas pöördfaasi analüüsiga, näidates pärast HAMLET-ravi olulisi metaboolseid muutusi. Avastatud 1120 tunnusest leiti, et 15 minuti pärast muutuvad 103 (28 suurendati, 75 vähendati HAMLET-iga töödeldud rakkudes) ja 114 pärast 1-tunnist HAMLET-ravi (64 suurendati, 50 vähenesid HAMLET-iga ravitud rakkudes) rakud). Mitu neist metaboliitidest tuvastati täpse massi ja peetumisaja võrdluse põhjal analüütiliste standarditega. S- adenosüül-L-homotsüsteiin, kreatiin, fosfokreatiin, tauriin ja glutatioondisulfiid vähenesid kõik HAMLET-iga töödeldud rakkudes, kajastades tõenäoliselt aminohapete metabolismi häireid ja oksüdatiivset stressi. Kreatiini ja glutatioondisulfiidi identsust kinnitati ka järgneva MS / MS analüüsiga. Tulemused näitavad, et HAMLET muudab kiiresti vähirakkude metabolismi.

Seejärel viidi läbi rakuliste metaboliitide GC-MS profileerimine A549 kopsukartsinoomirakkudes, mida töödeldi HAMLET-iga 15 ja 60 minutit. Hierarhilise rühmitamise teel vaadeldi kolme eraldi klastrit, millest esimene sisaldas kontrollproove (15 ja 60 minutit), teine ​​HAMLET-iga töödeldud proove, mis saadi vastavalt 15 minuti järel ja kolmas 60 minuti järel (joonis 7a, täiendav tabel S2). Metaboliitide üldised kontsentratsioonid olid HAMLET-60 proovides madalamad kui kontrollides, kinnitades sihipärase profiilimise käigus tuvastatud ainevahetuse üldist seiskumist. Oluliselt muudetud metaboliitide saamiseks tuletati andmete ja metaboliitide jaoks lineaarset mudelit, mille absoluutne log 2-kordne muutus oli 1 ja valede avastusmääraga (FDR) kohandatud P- väärtusi <0, 05 peeti oluliseks. Pärast 15-minutist HAMLET-ravi oli 20 metaboliiti oluliselt muutunud (joonis 7b). Nagu HAMLETi teadaolevalt kasutusele võis oodata, oli oleiinhappe ja selle derivaadi elaidhappe hape kõige märkimisväärsem (vastavalt 120-kordne, korrigeeritud P- väärtus = 4 × 10 –6 ja 84 ning 8, 1 × 10 –6 ). Lisaks sellele olid 15 minuti pärast rikkalikumad mitmed muud metaboliidid, sealhulgas glükoonhape (3, 3-kordne), glükonaat-laktoon (2, 6-kordne), glütseriinhape (2-kordne) ja püruvaat (1, 7-kordne). Oluliselt redutseeritud metaboliitide hulgas olid tauriin, glütsiin, sidrunhappe tsükli vahesaadus aconitate ning polüamiinid putrestsiin ja spermidiin.

Image

GC-MS analüüsi tulemustel põhinev hierarhiline rühmitamine eraldab HAMLETi ja kontrollproovid. ( a, b ) Üldiselt analüüsiti 113 metaboliiti, kasutades GC-MS 15 minutit ja 1 tund pärast HAMLET-ravi. a ) Hierarhiline rühmitamine, kasutades kõiki metaboliite, eraldab kontrollproovid HAMLET-iga töödeldud (15 min ja 1 h) proovidest. Suurem osa mõõdetud metaboliitidest reguleeriti (punane) 1 tund pärast HAMLET-ravi alla. Reguleerimata metaboliitide (rohelised) hulka kuulusid oleiinhape ja selle derivaadid. b ) Hierarhiline rühmitus, mis põhineb oluliselt muutunud metaboliitidel 15 ja 1 tunni pärast.

Täissuuruses pilt

1 tunni pärast tuvastati, et 41 metaboliiti on oluliselt muutunud (joonis 7b). Oleiinhape (log2-kordne muutus 5, 1 ja P = 2 × 10 –10 ) näitas koos selle derivaatidega, sealhulgas elaidhappe ja palmitoleiinhappega, kõige suuremat kasvu. Püruvaat ja mitmed sidrunhappe tsükli vaheühendid, sealhulgas suktsinaat, akoniit, fumaraat ja malaat, olid pärast HAMLET-ravi vähem rikkalikud, kinnitades HAMLETi inhibeerivat toimet glükolüüsile. Lisaks vähenes paljude teiste peamiste metaboliitide metabolism, sealhulgas aspartaat, glutamaat ja spermidiin. Lõpuks, kinnitamata sihipärast metaboomilist analüüsi, põhjustas HAMLET glutatiooni metabolismiga seotud metaboliitide ammendumist. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et HAMLET põhjustab kiiresti vähirakkude metabolismi massilisi muutusi, mis võivad osaliselt olla põhjustatud glükolüüsi katkemisest.

Arutelu

HAMLET on tuumoritsiidsete voltimata valgu-lipiidide komplekside uue perekonna esimene liige, mis tapavad vähirakud laialdaselt, hoides samal ajal diferentseerunud, transformeerumata rakke (Hakansson jt, 1995; Svensson jt, 2000). Lisaks võimele tappa vähirakke in vitro on HAMLET näidanud terapeutilist efektiivsust naha papilloomide vastu ja kiiret paikset toimet inimese põievähkidele (Gustafsson jt, 2004; Mossberg jt, 2007). Inimese glioblastoomi või põievähi loommudelites on näidatud, et HAMLET pikendab ellujäämist ja aeglustab kasvaja arengut (Fischer jt, 2004; Mossberg jt, 2010). Siiani pole toksilisi mõjusid tervislikele kudedele tuvastatud, mis viitab sellele, et HAMLET kasutab oma tegevuseks vähirakkude konserveerunud omadusi. Mõned neist konserveerunud tunnustest tuvastati siin. Näidati, et vähirakkude tundlikkus HAMLET sõltub c-Myc onkogeeni ekspressioonist ja glükolüütilistest mehhanismidest, eriti HK1 ja PFKFB1 ning HIF1α, mida aktiveerib hüpoksia ja onkogeeni aktiivsus ning mis suurendab glükolüütiliste ensüümide, glükoositransportööride transkriptsiooni. ja laktaatdehüdrogenaas (Kim jt, 2006; Papandreou jt, 2006).

c-Myc-i on nimetatud esmatähtsaks onkogeeniks (Li jt, 1984; Nilsson ja Cleveland, 2003), kuid selle mõju on paradoksaalne, kuna ainuüksi c-Myc-i sisseviimine normaalsetesse rakkudesse põhjustab rakusurma (Evan jt. 1992). Vähirakkudes mõjutab c-Myc üleekspressioon vähemalt 30%, kui mitte kõiki ekspresseeritud geene, kas otse või erinevate regulatiivsete vooluringide kaudu. Kuna HAMLET on näidanud aktiivsust> 40 erinevat tüüpi kasvajarakkude suhtes, mis pärinevad erinevatest liikidest, kudedest ja isenditest, ei olnud üldlevinud onkogeeni c-Myc sensibiliseeriv toime täiesti ootamatu. Kasvajarakud, mis ekspresseerisid kõrgemat c-Myc taset, surid HAMLETiga kokkupuutel kergemini kui terved diferentseerunud rakud, ja c-Myc raputamine vähendas HAMLET tundlikkust. C-Myc onkogeeni kohta on tehtud ettepanek edendada Warburgi efekti ja vähirakkude sõltuvust aeroobsest glükolüüsist. Seega võib üliaktiivne c-Myc muuta vähirakud HAMLET-i poolt glükolüüsi dereguleerimise suhtes liiga tundlikuks. Lisaks c-Myc-le identifitseeriti GSEA analüüsi abil HAMLET-i tundlikkuse määravaks Ras-signaalirada ja c-Myc-i aktiveeritakse Ras-st allavoolu, kontrollides nii rakkude proliferatsiooni ja ellujäämist koos teiste efektoritega nagu fosfoinositiid-3-kinaas. Leidsime, et HAMLET põhjustab nihe mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi kinaasilt / rakuväliselt signaaliga reguleeritud kinaasilt kasvajarakkudes signaaliülekande p38-le ja et p38 osaleb HAMLET-i varase rakusurma vastuses (Storm et al. , Käsikiri on ettevalmistamisel) . Tervislikke rakke, vastupidiselt, iseloomustab madal sisemine aktiivsus Ras / mitogeeni aktiveeritud proteiinkinaasi rajas ja c-Myc ekspressioon ning nad säilitavad HAMLETi ajal tasakaalustatud mitogeeniga aktiveeritud proteiinkinaasi aktiivsuse, vähese p38 aktiveerimisega, mis vastab nende madalale aktiivsusele HAMLETi tundlikkus. Onkogeenisõltuvus ja mutantse c-Myc põhjustatud kõrge metaboolne aktiivsus vähirakkudes võivad muuta need rakud HAMLET-i poolt glükolüüsi dereguleerimise suhtes liiga tundlikuks, sidudes veelgi c-Myc-i mõju vähirakkude surmaga.

Lisaks c-Myc-le osales HAMLET-i tundlikkuse reguleerimisel ka HIF1α, teine ​​onkogeen, mis teadaolevalt moduleerib vähirakkude metabolismi. HIF1α toimib glükolüütilise masina kriitiliste koostisosade, sealhulgas glükoositransporterite ja HK1, transkriptsiooni tõhustamise teel (Dang jt, 2008). On tehtud ettepanek, et ainult HIF1 suudab juhtida onkogeense muundamisega kaasnevaid suuri metaboolseid muutusi, nagu on tuvastanud Otto Warburg (Denko, 2008). See sünergia on kooskõlas HR1 ja HIF1 HAMLET-i sensibiliseeriva toimega shRNA ekraanil. Lisaks teeb onkogeense c-Myc dereguleeritud ekspressioon HIFla-ga koostööd, et anda kasvaja metaboolne fenotüüp. Paradoksaalsel kombel võib HIF1α füsioloogilistes tingimustes pärssida c-Myc aktiivsust ja HIF1α mõjutab otseselt MXI1 ekspressiooni, mis seob MAX-i, antagoniseerides seeläbi c-Myc toimet (Zhang et al., 2007). HIF1α vähendab ka c-Myc aktiivsust, nõrgendades c-Myc valgu taset proteasoomist sõltuva raja kaudu. Vastupidiselt HIF1α-le on näidatud, et HIF2α stabiliseerib MYC – MAX kompleksi, stimuleerides sellega c-Myc-indutseeritud transkriptsiooni. Seetõttu ei kajasta c-Myc mõju HAMLET-i tundlikkusele tõenäoliselt ainult selle glükolüüsi regulatsiooni. Selles kontekstis on kontekstist sõltuv c-Myc-vahendatud transkriptsioon tuumori progresseerumisel ülioluline ja võib olla ka HAMLET-i tundlikkuse jaoks.

Kasvajarakkude glükolüütiline seisund määratleti ShRNA-sõelu abil HAMLET-i tundlikkuse määrajana ja näidati, et rakuvälised glükoositasemed moduleerivad kasvajarakkude tundlikkust HAMLET-i suhtes. Lisaks tuvastas shRNA sõeluuringu GSEA analüüs HAMLET tundlikkuse jaoks oluliseks mitmed glükolüüsiga seotud rajad. HK1 oli HAMLETi otsene sihtmärk, mida näitas seondumine 8000 valku hõlmavas proteomilises sõelumis ja dot-blotidega, milles kinnitati inimese puhastatud HK1-HAMLET-i interaktsiooni. Eeldatakse, et HK1 ja HK1 homoloogi HK2 pärssimine vähendab glükoosi fosforüülimist, luues seeläbi seisundi, mis sarnaneb glükoosipuudusega, pärssides vähirakkudes glükolüüsi. HK1 / 2 isovormid on seotud mitokondriaalse membraaniga, kus nad kontrollivad glükoosi kasutamist. Lisaks vähendab HK1 pingest sõltuvat anioonikanali juhtivust, kaitstes seega rakke tsütokroom c vabanemise ja apoptootilise surma eest (Abu-Hamad et al., 2008). Paralleelses uuringus näitasime, et ioonikanali aktiveerimine on HAMLET-i indutseeritud rakusurma kriitiline membraanisündmus (Storm jt , käsikiri on ettevalmistamisel), suurendades võimalust, et lisaks oma mõjule glükolüüsile toimib HK1 ka moduleerides HAMLET interaktsioon ioonikanalitega mitokondriaalses membraanis. Samuti oleme näinud, et käärsoolevähiga APC min- hiirte peroraalne HAMLET-ravi muutis mitmete glükolüüsiga seotud valkude transkriptsiooni (Puthia jt , käsikiri on ettevalmistamisel), mis viitab nende sihtmärkide olulisusele ka in vivo .

ShRNA sõel tuvastas ka PKFKB1 HAMLET tundlikkuse olulise määrajana, kuid erinevalt HK1-st oli PKFKB1 shRNA-l kaitsev toime. Selle taga olev mehhanism pole kohe ilmne, kuna neljal PFKFB isovormil on vastandlikud kinaasi ja bisfosfataasi aktiivsused, sõltumatute domeenidega, mis katalüüsivad vastavalt fruktoos-2, 6-bifosfaadi sünteesi või lagunemist. Saadud mõju glükolüüsile määrab kinaasi: bisfosfataasi üldine suhe igas rakus. PFKFB1, PFKFB2 ja PFKFB4 omavad peaaegu võrdset kinaasi ja bisfosfataasi aktiivsust, samas kui PFKFB3 omab tugevamat kinaasi aktiivsust (740: 1) ja on vähirakkudes üleekspresseeritud (Yalcin et al., 2009). PFKFB1 pärssimine võib suurendada PFKFB3 isovormi domineerimist, mille tulemuseks on kõrgem fruktoos-2, 6-bisfosfaadi tase ja tugevdatud glükolüüs. See oleks kooskõlas päästmisega pärast PFKFB1 koputamist, kuna Warburgi fenotüübiga raku vähendatud glükolüüs näib soodustavat HAMLET-i põhjustatud rakusurma.

Lõpuks näitas lai metaboomne sõel, et HAMLET-iga töödeldud rakud kaotavad kiiresti metaboolse aktiivsuse. HAMLET vallandas vähirakkude metaboolses olekus kiireid ja põhjalikke muutusi, nagu näitasid LC-MS ja GC-MS profiilid. 1 tunni pärast näitas enamus metaboliitide intensiivsuse langust, mis oli kooskõlas glükolüüsi kiire allasurumisega ja sellest tuleneva energiakadu, mis on vajalik normaalse metaboolse mehhanismi säilitamiseks, eriti vähirakkudes. Nihe oli dramaatiline ja on usutav, et rakusurma kiire reageerimine HAMLETile võib osaliselt tuleneda sellest mõjust, kuna energiast ja metaboolsest aktiivsusest ilma jäetud rakud läbivad teadaolevalt rakusurma (Kroemer ja Pouyssegur, 2008). MS / MS analüüs tuvastas metaboliidid, mis olid tugevalt redutseerunud, sealhulgas S- adenosüül-L-homotsüsteiin, kreatiin, fosfokreatiin, tauriin ja glutatioondisulfiid, mis on põhilised vaheühendid kaitseks oksüdatiivse stressi eest (Balendiran et al., 2004). GC-MS sihipärane profiilimine tuvastas HAMLET-iga töödeldud kasvajarakkudes suures koguses oleiinhapet juba 15 minuti pärast, mis näitab, et HAMLET-i esimese kiire reageerimise eest võib vastutada rasvhapete ülemäärane kogus ja rasvhapete metabolismi masina küllastumine. Võime hilisematel ajahetkedel järjekindlalt näha oluliste glutatiooni vaheainete ammendumist. Suurenenud aktiivsus antioksüdantide radades koos p38 aktiveerimisega võib näidata, et reaktiivsed hapniku liigid on olulised HAMLET-i indutseeritud rakusurma jaoks.

Huvi vähirakkude metaboolsete muutuste, näiteks nende kõrgema glükolüüsi määra vastu on üles äratanud avastus, et tuntud onkogeenide mutatsioonid mõjutavad vähirakkude metabolismi ja uute tehnoloogiate kasutuselevõtt raku metaboomi uurimiseks. On selge, et metaboolsed rajad on tihedalt seotud radadega, mis reguleerivad vähktõve klassikalisi tunnuseid, nagu kontrollimatu vohamine ja rakusurma resistentsus. Seega on glükolüüsi pärssimine muutumas oluliseks uueks terapeutiliseks sihtmärgiks. On tõestatud, et glükoosianaloog 2-desoksüglükoos tapab in vitro mitmeid vähiraku liine, pärsib alasti hiirtel kõhunäärme vähirakkude kasvu ning suurendab surmaretseptori ligandide, radiatsiooni ja tsütotoksiliste ravimite mõju (Coleman et al., 2008). ; Hernlund jt, 2008). Praegu on 2-deoksüglükoos kliinilistes uuringutes üksikravimina või kombineeritud ravis. Lisaks sellele likvideeris 3-bromopüruvaat rottidel kaugelearenenud vähid, millel ei olnud ilmseid kahjulikke mõjusid (Ko et al., 2004). HAMLET on uus terapeutiline võimalus, toimides potentsiaalselt laiemalt, pärssides glükolüüsi ja muid rakuradu, mida reguleerib c-Myc- ja Ras-sõltuv transformatsioon. HAMLETi kliinilist potentsiaali suurendavad ka HAMLET-i tundlikkuse puudumine tervetes diferentseerunud rakkudes ja in vivo toksilisuse puudumine erinevates kasvajamudelites.

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendavad joonised S1 – S5

Wordi dokumendid

  1. 1

    Täiendavad arvandmed Legendid

  2. 2

    Täiendavate tabelite legendid

Exceli failid

  1. 1

    Lisalaud S1

  2. 2

    Lisalaud S2

    Täiendav teave on lisatud Oncogeeni veebisaidil (//www.nature.com/onc) olevale paberlehele