Sekreteeritud geeniekspressiooni retseptiivse endomeetriumi profileerimine näitab, et progesterooni reguleeritud enpp3 ekspresseerub diferentsiaalselt ja sekreteeritakse glükosüülitud kujul | teaduslikud aruanded

Sekreteeritud geeniekspressiooni retseptiivse endomeetriumi profileerimine näitab, et progesterooni reguleeritud enpp3 ekspresseerub diferentsiaalselt ja sekreteeritakse glükosüülitud kujul | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Diagnostilised markerid
  • Viljatus

Abstraktne

Endomeetriumi vastuvõtlikkuse keerukust molekulaarsel tasemel tuleb viljatuse juhtimise parandamiseks põhjalikult uurida. Siin näitasid transkriptoomide diferentsiaalne ekspressioon vastuvõtlikes endomeetriumi näärmetes ja stroomas ektonukleotiidi pürofosfataasi / fosfodiesteraasi 3 (ENPP3) kui progesterooni reguleeritud faktorit ja seda kinnitavad erinevad meetodid, nii mRNA kui ka valgu tasemel. ENPP3 osalemist embrüo kinnitumises testiti inimese embrüo implanteerimise in vitro mudelis. Huvitav on see, et stroomas oli kõrge ENPP3 mRNA ekspressioon, kuid mitte valk. N-glükosüülitud ENPP3 sisaldus emaka emakavedelikus retseptiivses faasis naistel kinnitab selle regulatsiooni progesterooni abil ja võimaldab seda kasutada mitteinvasiivsel endomeetriumi vastuvõtlikkuse testis.

Sissejuhatus

Naiste viljatuse oluliseks põhjustajaks (ülemaailmselt 10–15%) on suutmatus luua vastuvõtlikku endomeetriumi, kusjuures viimast põhjustab peamiselt progesteroon (P). Hoolimata abistava reproduktiivtehnoloogia kriitiliste sündmuste optimeerimisest, ei ületa raseduse määr 30% 1 . Olulised piirangud on teadmiste puudumine implantatsiooniprotsessi kohta, sealhulgas endomeetriumi vastuvõtlikkus ja vastuvõtlikkuse usaldusväärse diagnoosi puudumine. Viimased edusammud omikutehnoloogias, kas genoomse või proteoomilise lähenemisviisi abil, on andnud paljusid vastuvõtlikus faasis reguleeritud molekule: integriinid αvβ3 2, LIF, gp130 3, tuuma pooride valgud 4, HB-EGF 5, mütsiinid 6, süda ja närvihari. derivaadid 2 7, homeoboxi geenid 8, anneksiin A2 9, anneksiin IV 10, Calreticulum 11, Stathmin 1 9 ja Ezrin 12, kuid inimestel pole veel üheselt defineeritud vastuvõtlikkuse markerit.

Võttes arvesse endomeetriumi dünaamilist olemust, muutuvad rakulised ja molekulaarsed signatuurid munasarjade hormonaalse regulatsiooni tõttu antud menstruaaltsüklis kiiresti 13 . Endomeetriumi koeproovid biomarkerite tuvastamiseks endomeetriumi vastuvõtlikkuses mikrokiibi uuringute abil hõlmavad erinevaid kohorte: normaalse ovulatsiooniga naised 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, viljakad doonorid 23, viljakas kesksekretatsioonifaas ja viljatud naised 24, 25, loomulikud ja stimuleeritud tsüklid 16, 26 ning korduva implantatsiooni ebaõnnestumise või raseduse katkemisega naised 27, 28 . Suur heterogeensus põhjustab vastuvõtlikkuse geenide kohta järelduste tegemise raskusi. Lisaks sellele viidi ülaltoodud uuringutes läbi kogu endomeetriumi kude, mis kujutab endast erinevat tüüpi rakke erinevates suhetes, millel on selgelt eristuv genotüübi ja fenotüübi ekspressioon, mille tulemuseks on erinevad tulemused.

Tsükli päeval LH + 2 manustatud antiprogestiini mifepristooni on varem kasutatud P-reguleeritud endomeetriumi vastuvõtlikkuse 29, 30, 31 uurimiseks . Potentsiaalselt võiks seda lähenemisviisi kasutada ka võimaliku endomeetriumi vastuvõtlikkuse biomarkeri tuvastamiseks. Sellistest segavatest teguritest nagu kudede varieeruvus ja subjektide vahelise variatsiooni minimeerimiseks isoleerisime viljakatelt ja viljatutelt naistelt sekretoorse faasi näärme epiteeli ja stroomi valikuliselt laser-haardumise mikrolõikamise (LCMD) abil, millele järgnes mikrokiht. Tulemusi kinnitati reaalajas PCR ja immunohistokeemia abil. Meie avastustest teatame siin P-reguleeritud molekuli, ektonukleotiidi pürofosfataasi / fosfodiesteraasi 3 (ENPP3), mis võib olla potentsiaalne biomarker progesterooni poolt reguleeritud endomeetriumi vastuvõtlikkusele. Selle glükoproteiini ekspressiooni kvantifitseeriti ka emakavedelikus eesmärgiga töötada välja mitteinvasiivne endomeetriumi vastuvõtlikkuse test.

Tulemused

LCMD ja geeniekspressiooni analüüs

Ligikaudu 200 raku LCMD andis vähemalt 500 pg RNA-d, mis võeti amplifikatsiooniks. Mikrokiibi andmete analüüs näitas, et epiteeli sektsioonis oli 47 geeni 47 geenist ülesreguleeritud ja 15 geeni alareguleeritud, samas kui stromaalses osas oli 85 geenist 79 üles ja 6 reguleeritud mifepristoonraviga (täiendav tabel) 1). Võrreldes mifepristoonravi saanud stroomaga täheldati näärmetes rohkem märkimisväärselt allareguleeritud geene (joonis 1).

Image

Progesterooni poolt reguleeritud geenid soojuskaarte näidates endomeetriumi näärme- (G, vasak paneel) ja strooma (S, parempoolne paneel) sektsioonides. Geeniekspressiooni uuriti töötlemata tsükli retseptori endomeetriumis (C) ja mitteretseptiivset endomeetriumi (T) progesterooni retseptori antagonisti mifepristooni raviga. Iga uuringus osalenud naine käitus oma kontrolli all.

Täissuuruses pilt

Bioloogilise ja molekulaarse raja analüüs

Analüüsiti 132 oluliselt reguleeritud (üles või alla) geeni ülesvoolu regulaatorite, kanooniliste radade ja bioloogiliste võrkude osas. Viis peamist saadud kanoonilist rada olid vastavalt NRF2-vahendatud oksüdatiivne stressireaktsioon, munasarjavähi signaalimine, superoksiidradikaalide demutatsioon, eesnäärmevähi signaalimine ja multiformse glioblastoomi signaalimine. Uudsusraja analüüs (IPA) ennustab eelnevate regulaatorite aktiveerimist või pärssimist, mis võivad olla vastutavad eksperimentaalses andmekogumis täheldatud geeniekspressiooni muutuste eest, mis aitab mõista kudedes või rakkudes esinevaid bioloogilisi aktiivsusi. Praeguses andmekogumis ennustati, et transkriptsioonifaktor Chromobox Homolog 5 (CBX5) on erapooletu Z-skooriga –2, 236 ja ülesvoolu paiknevate regulaatori molekulidega inhibeeritud. Kolooniaid stimuleerivat faktorit 2 (CSF2) ja varajast B-rakufaktorit 1 (EBF1) ennustati aktiveeritavaks vastavalt Z-skooriga 2, 43 ja 2, 0.

Mikrokiibi valideerimine reaalajas PCR abil

Reaalajas PCR-analüüs oli kooskõlas mikrokiibi uuringuga, kuna mõlemas meetodis kinnitati vastavalt 13 ja 11 erinevalt ekspresseeritud geeni strooma ja epiteeli sektsioonist (täiendav tabel 2). Sekreteeritud frizzled-seotud valku 4 (SFRP4) reguleeriti stroomasahtkonnas 8, 76-kordselt (p = 0, 013) ja epiteeliruumis 16, 25-kordselt (p = 0, 0001). Karboksüpeptidaas M (CPM) reguleeriti stroomakambris 29-kordselt (p = 0, 005), epiteeli sektsioonis aga ubikvitiini konjugeerivat ensüümi E2E 2 (UBE2E2) 7 korda (p = 0, 024). MT1G reguleeritakse stroomades 7 korda (p = 0, 008) ja epiteeli sektsioonides 519 korda (p = 0, 005) ja MT2A reguleeritakse strooma 3 korda (p = 0, 031) ja 7 korda (p = 0, 03). ) epiteeli sektsioonides. ENPP3 oli märkimisväärselt alareguleeritud nii strooma (−55, 93 korda; p = 0, 015) kui ka epiteeli (−9, 46 korda; p = 0, 035) sektsioonides (joonised 2 ja 3).

Image

Stromaalse sektsiooni oluliste geenide Tukey graafikud, mida analüüsiti reaalajas PCR-ga. Progesterooni pärssimine reguleeris uuesti CPM-i ja SFRP4-i ning reguleeris MT1G, MT2A ja ENPP3 allapoole.

Täissuuruses pilt

Image

Endomeetriumi epiteeli sektsioon näitas MT2A, MT1 ja ENPP3 regulatsiooni koos P inhibeerimisega mifepristooni poolt. SFRP4 ja UBE2E2 geeniekspressioon oli progesterooni pärssimisega märkimisväärselt ülesreguleeritud.

Täissuuruses pilt

Immunohistokeemiline analüüs

Kirjanduse ülevaate, mikrokiibi ekspressioonitasemete ja antikehade kättesaadavuse põhjal uurisime stanniokaltsiin 1 (STC1) valgu ekspressiooni; Katepsiin C (CTSC); Secrteoglobiini perekonna 2A liige2 (SCGB2A2); 1. kromatiini alamperekonna SWI / SNF-ga seotud maatriksiga seotud aktiinist sõltuv regulaator (SMARCA1); suure liikuvusega rühma nukleosoomi siduv domeen 5 (HMGN5); ja B-raku CLL / lümfoom 11A (tsingi sõrmevalk) (BCL11A). Tervetel viljakatel naistel täheldati ENPP3 immuuntuvastust kõigis kudedes ja see erines rühmade vahel märkimisväärselt. Tulemused olid kooskõlas mikrokiibi tulemustega (joonis 4A – C).

Image

ENPP3 ekspressiooni täheldati P domineeriva kesk-luteaalfaasi näärmete tipu piirides, mida uuriti immunohistokeemiaga ( A, C, D ) naistel, kellel ei olnud mifepristoonravi (kontroll). ENPP3 alareguleerimist täheldati endomeetriumi näärmetes koos progesterooni toime pärssimisega mifepristoonravi abil ( B, C ). Mifepristoonravi mittesaanud naiste endomeetriumis täheldati P-u ülesreguleeritud sekretoorse faasi ajal ENPP3 kõrget taset, võrreldes menstruaaltsükli proliferatiivse faasiga. Skaalariba näitab 50 μm.

Täissuuruses pilt

ENPP3 ekspressioon endomeetriumis

Mikrokiibi analüüs näitas ENPP3 alareguleerimist epiteeli sektsioonis 59-kordselt (p = 0, 04) P inhibeerimisega. ENPP3 immunohistokeemiline analüüs näitas epiteeli sektsiooni apikaalse pinna ja näärmete sekretsioonide spetsiifilist ekspressiooni, kuid oli ravirühmas väga napp. Kontrollrühma keskmine immunoreaktiivne skoor (IRS ± SD) oli 8, 8 ± 4, 41 ja ravirühm oli väga madal - 0, 42 ± 1, 13 (p = 0, 0007). Huvitaval kombel ei täheldatud kummaski rühmas stroomas ENPP3 valgu ekspressiooni, ehkki mRNA ekspressiooni nähti mõlemas rühmas vastavalt Western blot analüüsile ja immunohistokeemiale. ENPP3 näitas tsüklilist ekspressiooni kõrgeimat sekretsiooni keskel ja madalaimat proliferatiivses faasis, vastavalt keskmised IRS ± SD skoorid proliferatiivse, keskmise ja hilise sekretsiooni faasis olid vastavalt 1, 97 ± 2, 21, 10, 25 ± 3, 88 ja 7, 12 ± 3, 83. Võrreldes proliferatiivse faasiga täheldati EN domineeriva keskmises sekretoorses faasis ENPP3 suuremat ekspressiooni (p = 0, 0001). Puudus oluline erinevus keskmise ja hilise sekretoorse faasi vahel (joonis 4D).

ENPP3 valgu ekspressioon emakavedelikus ja kogu endomeetriumi koe lüsaatides

Emaka loputused viljakatelt naistelt ja samadelt naistelt, keda raviti LH + 2 ühekordse annusega 200 mg mifepristooni, koguti LH + 6/7 ja neid testiti ENPP3 valgu ekspressiooni suhtes Western blot meetodil. Tugevat riba täheldati umbes 165 kd juures, mis osutas glükosüülitud ENPP3-le, ja see näitas olulist allareguleerimist P-pärsitud rühmas (AUC - kontroll 17, 85: ravi mifepristooniga: 9, 47; p = 0, 002), sarnanedes koe ENPP3-ga (AUC-kontroll) 18, 98: töötlemine mifepristooniga 11, 94; p = 0, 002). ENPP3 ekspressioon endomeetriumi koe lüsaadis oli rikkalikum kui emakavedelikus (joonis 5).

Image

Wes'i tehtud ENPP3 Western blot analüüs retseptori faasi endomeetriumi koe lüsaatides ( A, B ) ja emakavedelikus ( C, D ) näitas ENPP3 head ekspressioonitaset kontrollproovides (rajad 2–7). Antiprogestiinravi ( A, C ): rajad 8–13) ei näidanud ENPP3 taseme tuvastamist nii endomeetriumi koes kui ka emakavedelikus, mis kinnitab ENPP3 valgu reguleerimist progesterooni poolt. ( B, D ) näitavad immuunsusega tuvastatava ENPP3 semikvantitatiivset analüüsi Wesi poolt, väljendatuna log 2 AUC (kõvera alune pindala). Rada 1: valgu molekulmassi marker.

Täissuuruses pilt

ENPP3 hindamine glükoproteiinina

ENPP3 eeldatav molekulmass on umbes 100 kd, kuid Western blot analüüs näitas ribalaiust 165 kd, mis viis meid selle glükosüülimise edasisele uurimisele. Emaka vedeliku ja endomeetriumi koe lüsaate testisime pärast peptiid-N-glükosidaas F-ga (PNGaas F) seedimist, mis lõhustab asparagiini ja N-atsetüülglükoosamiinide vahelise glükoaminidaasi lüli. Vaatasime deglükosüülitud proovides nihet 165 kD-lt 110 kD-le, mis kinnitas, et ENPP3 on N-glükosüülitud tervete viljakate naiste emakavedelikus ja endomeetrias (joonis 6).

Image

Emaka vedeliku kraadi glükosüülimine näitas riba muutumist 165 kD-lt ühele ribale 110 kD juures, mis tähendab, et emaka vedelikus sisalduv ENPP3 on selle glükosüülitud vormis. ENPP3 glükosüülitud (rajad 2–7) vorm näitas riba 165 kD ja deglükosüülitud (rajad 8–13) ühel ribal 110 kD.

Täissuuruses pilt

In vitro funktsionaalne test

Embrüo kinnistumist uuriti eelnevalt kirjeldatud kolmemõõtmelises endomeetriumi rakukultuuri mudelis, et uurida inimese implantatsiooniprotsessi in vitro 32, ja see näitas, et kontrollrühmas oli endomeetriumi konstrukti külge kinnitatud 10-st blastotsüstist seitse 10-st. Kontrollides nähti reaalajas PCR-i abil uuritud ENPP3 väga head ekspressioonitaset. Kokkupuude mifepristooniga (0, 5 μM) põhjustas ENPP3 märkimisväärse (p = 0, 004; Fisheri täpne test) allapoole reguleerimise, kusjuures ükski embrüo ei olnud kinnitatud in vitro endomeetriumi konstruktsiooni külge (p = 0, 004, joonis 7).

Image

Inimembrüo, mis on kinnitatud in vitro kolmemõõtmelise rakukultuuri mudeliga kokkupuutel progesterooniga ( A ). Ükski antiprogestiiniga ravitud rühma 8st embrüost, kus ENPP3 oli oluliselt madaldatud, polnud kinnitunud. Kontrollrühmas oli 10-st blastotsüstist 10 (7) külge kinnitatud konstrukti külge väga ENPP3 ekspressiooniga kolmemõõtmelises endomeetriumi rakukultuurisüsteemis.

Täissuuruses pilt

Retseptiivse ja mitteretseptiivse faasi emakavedeliku analüüs nano-ESI-LC / MS / MS abil

Tuvastasime ja kvantifitseerisime ENPP3 valgu ekspressiooni 35 ENPP3 spetsiifilise peptiidiga, saades emakavedeliku massispektromeetrias 53, 4% järjestuse katvuse. Üldise normaliseeritud valguintensiivsuse põhjal leiti, et ENPP3 valk on P domineeriva LH + 8 ajal ülesreguleeritud (keskmine voldi muutus + 35, 0, p = 0, 003), võrreldes loodusliku menstruaaltsükli varase sekretoorse faasiga (LH + 2) (joonis fig. 8).

Image

Nano-ESI-LC / MS abil kvantitatiivselt mõõdetud ENPP3 ekspressiooni graafik emakavedelikes, mis pärinevad sama naiste komplekti varasest sekretoorsest faasist (LH + 2) ja keskmise sekretsiooni faasist (LH + 8). P-domineerivas retseptiivses faasis (LH + 8) täheldati ENPP3 olulist ülesreguleerimist (p = 0, 0032) võrreldes mitteretseptiivse faasiga (LH + 2).

Täissuuruses pilt

Arutelu

Meie uuring näitab süstemaatiliselt, et ENPP3, N-glükosüülitud valk, mida reguleerib P, jaguneb nii endomeetriumi näärmetes kui ka emaka sekretsioonides vastuvõtliku faasi ajal. ENPP3 reguleerimist progesterooni abil ja rolli implanteerimisprotsessis testiti inimese embrüo implanteerimismudelil, kus kokkupuude P-retseptori inhibiitoriga pärssis inimese embrüo kinnistumist ja seega embrüo implanteerimisprotsessi koos ENPP3 ekspressiooni alareguleerimisega. Kuna ENPP3 ekspressioon endomeetriumis oli korrelatsioonis emakavedelikus esinevaga, pakume välja, et ENPP3 analüüsi emakavedelikus võib kasutada potentsiaalse markerina mitteinvasiivsetes P-reguleeritud endomeetriumi vastuvõtlikkuse testides. Enne kasutamist kliinilises keskkonnas peame valideerima korduva implantatsiooni puudulikkusega naiste andmed. Selleks on vaja suurt hulka proove statistilise olulisuse saamiseks, et kohaneda erinevate RIF-i mõjutavate teguritega.

Endomeetriumi transkriptoomi tuvastamiseks massiivitehnoloogia abil on läbi viidud mitmeid uuringuid, et uurida endomeetriumi vastuvõtlikkuse markereid, eesmärgiga tõlkida need kliiniliseks kasutamiseks, peamiselt diagnoosimiseks 20, 26, 33, 34 . Üheski ülaltoodud uuringus, sealhulgas uuringutes, milles võrreldi mRNA-d ja valkude profileerimist varajase (LH + 2) ja keskmise (LH + 7 või 8) luteaalfaasi vahel, ei ole teatatud ENPP3 ekspressioonist 35, 36, 37 . Siinkohal teatame esimest korda, et ENPP3 ekspresseerub kõrgel progesterooni domineerival luteaalfaasil (LH + 8), võrreldes varase luteaalse faasiga (LH + 2), kui P tase on madalam. Huvitaval kombel näitas RIF-i patsientide endomeetriumi transkriptoomi profiili dešifreerimiseks tehtud hiljutine uuring 303 ennustavat geeni ja ENPP5 - molekuli, mis kuulub ektonukleotiidide pürofosfataasi perekonda 38 . Ehkki need esitatud andmed on massiivipõhiste ennustusmeetodite 39, 40 tuvastamiseks ja arendamiseks potentsiaalse väärtusega, tuleb nende molekulide funktsionaalset rolli alles uurida ja enamiku transkriptide osas ei tea me, kas neid transkribeeritakse veelgi nende valk. Selles uuringus näitame ENPP3 ekspressiooni nii mRNA kui ka valgu tasemel endomeetriumis ja proovime näidata ka selle võimalikku rolli inimese embrüo implanteerimisprotsessis parima võimaliku in vitro mudeli abil inimese embrüo implantatsiooni protsessi uurimiseks. Oluline on edasi uurida ENPP3 molekulaarset mehhanismi endomeetriumi vastuvõtlikkuses ja implanteerimises, eriti naiste viljatuse korral.

Praegu väidab endomeetriumi vastuvõtlikkuse massiiv 34, 39 (ERA) olevat parem ja täpsem meetod endomeetriumi vastuvõtlikkuse hindamiseks, võrreldes endomeetriumi histoloogilise dateerimisega, kasutades Noyesi kriteeriume 41 . Selle analüüsi jaoks on siiski vaja arenenud tehnoloogiat koos kvaliteedikontrollitud kesklaboritega42. Hiljuti väljatöötatud meetodil, mis põhineb integriinide 43 ekspressioonil (E-tegrity test ® ), võib olla potentsiaali, kuid see vajab täiendavaid kliinilisi uuringuid. Tuleb märkida, et mõlemad meetodid on invasiivsed, kuna analüüsiks on vajalik endomeetriumi biopsia. Selle uuringu kohaselt on P-i suur mõju ENPP3 ekspressioonile vastuvõtliku endomeetriumi emakavedelikus paljutõotav ja toetab selle võimalikku kasutamist vastuvõtlikkuse testis embrüo siirdamise efektiivse tsükli ajal. Emaka vedeliku kogumine nõuab elastse kateetri sisestamist emakaõõnde, kuid see ei põhjusta endomeetriumi vigastamist. Veelgi olulisem on see, et emakavedeliku proovide võtmine embrüo siirdamistsüklis ei vähenda implantatsiooni ega raseduse määra 44 . Seetõttu teeme ettepaneku, et ENPP3 võiks kasutada markerina emakavedeliku mitteinvasiivsel testimisel progesterooni reguleeritud endomeetriumi funktsiooni jaoks. Sellised testid pole olulised mitte ainult vastuvõtliku endomeetriumi väljaselgitamisel enne kalli viljakusravi alustamist, vaid on kasulikud ka embrüo isikupäraseks siirdamiseks, mis on andnud mõnele RIF-iga naisele võimaluse rasestuda 45 .

Selle uuringu uudsus võrreldes varasemate teadetega seisneb selles, et uurisime peamiste rakutüüpide geeniekspressiooni tõestatud viljakate naiste kohortist, kes olid nende endi kontrolli all, minimeerides idiopaatilise viljatuse võimalikke suuri erinevusi. Teiseks eraldati nii vastuvõtlikus kui ka mitteretseptiivses endomeetriumis olevad strooma ja näärmed laseriga hõivamise mikrolõikamise teel, välistades erinevate geenide võimaliku globaalse ekspressiooni kogu endomeetriumi kasutamisel. Enamik varem avaldatud mikrokiibil põhinevaid geeniekspressiooniuuringuid viidi läbi kogu endomeetriumi koe 14, 15, 20, 21, 23, 46, 47 abil, mis andis kõigi endomeetriumi kõigi rakutüüpide kumulatiivse geeniekspressiooni efekti. Me kasutasime mikrokiibi, mis on võimas tehnika, et sõeluda arvukalt võimalikke erinevalt ekspresseeritud geene. ENPP3 ekspressioon transkriptoomi tasemel kinnitati tundlikuma ja spetsiifilisema meetodi, reaalajas PCR abil. Edasi uurisime immunohistokeemia abil ENPP3 ekspressiooni ja jaotust valgu tasemel. Kuna ENPP3 ekspressioonitase oli P pärssimisega järsult reguleeritud, otsisime selle ekspressiooni emakavedelikus, eesmärgiga uurida täiendavalt võimalust tuvastada marker, mida saaks kasutada vähem invasiivse meetodi väljatöötamiseks. Selle jaoks kasutasime ühte hiljuti kasutusele võetud tundlikku ja kiiret meetodit Wes 48, 49, mis sobib madala valgu taseme analüüsimiseks väga väikeses prooviruumis, kuna naistelt võidi proovid võtta ainult väga väikeses koguses valku ja emakavedelikku. ENPP3 ekspressiooni uurimiseks menstruaaltsükli vastuvõtlikus ja mitteretseptiivses faasis kasutasime veel ühte ülitundlikku märgisevaba valgu analüütilist tehnoloogiat, nano-ESI-LC / MS / MS 50 . Varem ei ole teateid markerite funktsionaalse rolli kohta endomeetriumi vastuvõtlikkuses, kuna uuringud inimestega on eetilistel põhjustel võimatud. Siin kontrollisime ENPP3 funktsionaalset rolli endomeetriumi rakkudes, kasutades eelnevalt kirjeldatud, väljakujunenud in vitro mudelit embrüo kinnitamiseks 32 .

ENPP3 reguleerimine endomeetriumi rakkudes on intrigeeriv, kuna mitteretseptiivse endomeetriumi stromaalsetes sektsioonides reguleeriti transkriptsiooni 55-kordselt, kuid ilma valgu sisalduseta. Seda uuriti kasutades kahte erinevat antikeha, nii immunohistokeemia kui ka Western immunoblot abil. Pealegi oli ENPP3 mRNA ekspressioon stroomakambris enam kui kahekordne, võrreldes näärmesektsiooniga. See kõrge mRNA tase, millel puudub valgu ekspressioon ENPP3 stromaalses sektsioonis, ei kajasta mitte ainult translatsioonijärgseid mehhanisme valgu tasemel, vaid sellel võib olla oluline bioloogiline roll, mida tuleb põhjalikult uurida. Endomeetriumi epiteelirakkudes reguleerib ENPP3 P, kuna menstruaaltsükli sekretoorses faasis täheldati kõrgeid tasemeid võrreldes proliferatiivse faasiga. Kuid keskmise ja hilise sekretsiooni faasi vahel ei näe me statistilist olulisust, ehkki nende keskmised väärtused on vähenenud. Võib juhtuda, et ENPP3 tootmiseks vajalik P lävitase on väiksem ja kuigi P on hilises sekretoorses faasis alareguleeritud, eksisteerib endiselt P põhitase ja sellest võib piisata ENPP3 märkimisväärse taseme saavutamiseks, mida täheldatakse hilistes luteaalides faas. Endomeetriumis on teateid, et ENPP3 ekspresseerub epiteeli näärmetes, nagu näitas menopausieelsete naiste kvantitatiivne mass-spektromeetriline analüüs 51 .

Proovisime iseloomustada ENPP3, mida leidub endomeetriumis ja emakavedelikus. ENPP3 korral on oodata immunoblot-riba 100 kd molekulmassi ümber. Üllatavalt täheldati kõrgema molekulmassiga riba umbes 165 kd, mis edasisel uurimisel osutus emaka vedeliku proovides sisalduvaks glükosüülitud vormiks. Me kinnitasime, et see suure molekulmassiga riba on ENPP3 glükosüülitud vorm, kuna emaka emaka vedeliku retseptiivsete proovide töötlemine N-glükanaasiga põhjustas immunoblot-riba kadumise 165 kd juures ja selle olemasolu 100 kd juures. Tõestatud viljakatel naistel oli ENPP3 ekspressioon emakavedelikus ja endomeetriumi koes menstruaaltsükli vastuvõtulises faasis sarnane glükosüülitud ENPP3 vormiga. ENPP3 esinemisest näärmesekreetides eksosoomidena on varem teatatud, kuna see esineb inimese parotiidsete näärmete sekretsioonides, mis on kapseldatud eksosoomidesse 52 .

ENPP3 on üks äsja kirjeldatud molekulidest ja seega vähem uuritud. ENPP3 ekspressioonist teatatakse üldiselt basofiilides ja nuumrakkudes 53 . ENPP3 on II tüüpi transmembraanne valk ja puudub dileutsiin, mis on iseloomulik membraanivalkudele 54 . See on kooskõlas meie endomeetriumi vaatlusega, kuna ENPP3 on näha ainult epiteelirakkude tipus. Ainus ENPP valguperekond, mida inimese endomeetriumis on teatatud, on I tüüpi transmembraanne valk ENPP5 ja selle funktsiooni kohta pole andmeid 38 . Huvitav oleks uurida ENPP3 bioloogilist funktsiooni, eriti seoses selle väljenduse ja mõistmisega RIF-i juhtudel. Üks väljakutseid ENPP3 rolli RIF-is endomeetriumi tasemel statistilise olulisuse loomisel võib nõuda suurt hulka proove, kuna lai valik molekule võib RIF-i omaette või ühiselt kaasa aidata.

ENPP3 ektoensüüm osaleb rakuvälises nukleotiidi hüdrolüüsis ja omab nii ATPaasi kui ka ATP pürofosfataasi aktiivsust. See lõhustab mitmesuguseid fosfodiester- ja fosfosulfaatsidemeid, sealhulgas deoksünukleotiide, nukleotiidsuhkruid ja NAD 55, 56, 57 . Hiljuti näidati, et ENPP3 reguleerib glükosüültransferaasi aktiivsust, mis hõlbustab paljude valkude glükosüülimist, pärssides N-atsetüülglükoosaminüültransferaasi GnT-IX (GnT-Vb) sisemist faktorit hiire neuroblastoomi Neuro 2a rakkudes 58 . Huvitav on see, et Korekane jt . näitab, et ENPP3 võib kas suurendada või vähendada glükaanide 59 aktiivsust ja glükaanid esinevad nii endomeetriumi kui ka emaka sekretsioonides, omades olulist rolli endomeetriumi vastuvõtlikkuse reguleerimisel. Le (Y) oligosahhariidi ekspressiooni vastuvõtlikul perioodil reguleerib teadaolevalt varajase luteaalfaasi P pärssimine mifepristooni poolt ahvide endomeetrias 60 . Samuti on teada, et MUC16 ekspressioon kaob embrüo implantatsiooni ajal endomeetriumist, kattudes ENPP3 ekspressiooni perioodiga 61 . Me ei tea konkreetseid ENPP3-ga reguleeritud glükaanid endomeetriumis, kuid seda tasub lähemalt uurida, pidades silmas selle regulatsiooni erinevates günekoloogilistes tingimustes.

Meie tulemuste põhjal järeldame, et ENPP3 võib kasutada molekulmarkerina progesterooni toimimiseks endomeetriumi tasemel naistel. Edasiste uuringute abil saab seda kasutada vähem invasiivse meetodi väljatöötamiseks, et enne kavandatud embrüo siirdamist veenisüsmetest otsivad naised emakavedeliku abil endomeetriumi vastuvõtlikkust skriinida. Teisest küljest võib olla võimalik välja töötada ka inhibiitor või molekul, mis võiks muuta ENPP3 funktsiooni, nii et seda saaks kasutada viljakuse kontrollimiseks. Selleks võib esimene samm olla molekulaarsete raamatukogude sõelumine, et tuvastada tugev inhibiitor. Oluline on üksikasjalik uuring selle molekuli füsioloogilise funktsiooni mõistmiseks endomeetriumis ja emakavedelikus.

Meetodid

Eetilised load

Kõik katsed viidi läbi vastavalt heakskiidetud juhistele. Koeproovide võtmise katseprotokollid kiitsid heaks Karolinska ülikooli haigla ja piirkondlik eetikakomitee (EPN), Stockholm, Rootsi. Tartu ülikooli eetikakomitee kiitis heaks loa nende keskusesse kogutud emakavedeliku kogumiseks ja analüüsimiseks. Kõigist uuringus osalenud vabatahtlikelt saadi teadlik ja kirjalik nõusolek ning dokumendid esitati vastavalt institutsionaalse dokumentatsiooni juhenditele.

Endomeetriumi biopsiad

Endomeetriumi biopsiad koguti tõestatud tervetelt viljakatelt naistelt (n = 9) vanuses 22–37 aastat endomeetriumi õõnsuse ülemisest osast aspiraatori Pipelle abil (Prodimed, Neuilly en Thelle, Prantsusmaa). Nendel naistel ei esinenud mingeid günekoloogilisi häireid ja nad ei võtnud hormonaalset rasestumisvastast vahendit ega kasutanud emakasiseseid vahendeid vähemalt kolm kuud enne biopsiat. Kõik katsealused kontrollisid LH piigi uriiniproovides kaks korda päevas umbes 10. tsüklipäevast kuni LH + 2-ni, kasutades kiiret enesetesti (Clearplan, Searle Unipath Ltd., Bedford, Suurbritannia). Biopsiad saadi igalt naiselt tsükli päeval LH + 7 kontrolltsüklis ja seejärel ravitsüklis. Ravitsüklis said naised LH + 2-ga ühekordse annuse 200 mg mifepristooni. Iga biopsia jagati kaheks osaks, millest üks fikseeriti 4% paraformaldehüüdis immunohistokeemia jaoks ja teine ​​klõpsutati vedelas lämmastikus lasermikromatograafilise eraldamise ja RNA ekstraheerimise teel. . Tervete naiste (n = 27) endomeetriumi proovid saadi ka menstruaaltsükli proliferatiivses, keskmises sekretoorses ja hilis-sekretoorses faasis, iga rühma kohta tehti üheksa endomeetriumi proovi.

ENPP3 valgu ekspressiooni kinnitamiseks vastuvõtlikus faasis koguti tervetelt naistelt 6 endomeetriumi biopsiat kontroll- ja ravitsüklist (200 mg mifepristooni LH + 2-l) LH + 6 kuni LH + 9 ajal ja külmutati vedelas vormis lämmastikku kuni edasise kasutamiseni. Kolmemõõtmeliste rakukultuuride in vitro funktsionaalseks analüüsiks koguti endomeetriumi biopsiad tõestatud viljakatelt naistelt (n = 30) LH + 4-l, millele järgnes strooma- ja epiteelirakkude isoleerimine väljakujunenud protokollide abil, nagu eelnevalt kirjeldatud 62 .

Endomeetriumi rakkude eraldamine

Lühidalt, peenestati kude mõõtmetega 1 × 1 mm Ham F10-s (Life Technologies, Rootsi) ja inkubeeriti pankreatiin-trüpsiin-EDTA-ga (0, 05 g / ml trüpsiin-EDTA lahust) 30 minutit temperatuuril 4 ° C, millele järgnes seedimine kollagenaasiga 4 (125 RÜ / ml, Worthington Biochemical, Lakewood NJ) ja DNAse (lõppkontsentratsioon 40 μg / ml, Sigma, Rootsi) ja filtriti läbi 40-mikronise võrgusilmaga rakufiltri, mis võimaldas stroomarakkudel läbi pääseda ja epiteelnäärmetel jääda kurn. Epiteeli näärmed lagundati kollagenaas 3 (45 RÜ / ml, Worthington Biochemical, Lakewood, NJ) ja DNAse-ga ning filtriti läbi 40 mikronise silmaga rakufiltri. Seejärel eraldati strooma- ja epiteelirakud taastunud rakukultuuri söötmes (Life Technologies) ja säilitati vedelas lämmastikus kuni endomeetriumi ühiskultuuri sulamiseni.

Blastotsüstid

Selle uuringu embrüod / blastotsüstid (n = 18) saadi standardse in vitro viljastamise (IVF) või intratsütoplasmaatilise sperma süstimise (ICSI) abil. Selles uuringus kasutatud embrüod olid vähemalt 3BB klassi (Gardneri klassifikatsioon) ja embrüo siirdamiseks kliiniliselt kehtivad.

Kolmemõõtmelised endomeetriumi rakukultuurid

Endomeetriumi rakukultuurid viidi läbi vastavalt Lalitkumar jt kirjeldusele . 63 . Pärast viiepäevast kultiveerimist töödeldi ühte kultuuride rühma mifepristooni kontsentratsiooniga (Sigma Aldrich) 0, 5 μM (n = 8) ja kontrollrühma ainult vehiikli etanooliga (n = 10). Mõlemale kultuurile lisati üks embrüo samal päeval, kui alustati mifepristooniga töötlemist. Söödet vahetati iga kahe päeva tagant valguse mikroskoobi all ja kultuure uuriti embrüote kinnitumise osas. Viiendal päeval pärast embrüo sisestamist täheldati pärast mehaanilist testimist kinnistumiskiirust, raputades kultuure ja pestes neid kaks korda PBS-iga. Enne kultuuride lõpetamist eemaldati kõik kinnitunud või kinnitamata embrüod. Pärast lõpetamist eraldati kultuurid raku insertidest ja lahustati 1 ml Trizoli reagendis (Invitrogen) ja säilitati enne RNA ekstraheerimist temperatuuril -80 ° C.

Emaka vedelik

Emakavedelik koguti tõestatud viljakatelt naistelt, kellel oli LH + 7, koos mifepristoonraviga või ilma. 10 ml süstlale kinnitati modifitseeritud söötmiskateetri abil Nutrisafe 2, Fr-L, 75 cm, Vycon Value Life, Ecouen, Prantsusmaa, 2 ml süstitava kvaliteediga vett (Gibco). Süstla abil imeti koos emaka loputusega tagasi umbes 1 ml ja tsentrifuugiti 200 g juures 10 minutit, et eemaldada kõik rakud või rakujäägid. Supernatant lüofiliseeriti ja lahustati 50 μl steriilses vees ja viidi edasiseks analüüsiks.

Teises viljakate naiste komplektis (n = 6; Tartu Ülikool, Eesti) koguti emakavedelikku samas tsüklis varajases sekretoorses faasis (LH + 2) ja progesterooni domineerivat keskmist sekretoorset faasi (LH + 8) kasutades ENPP3 ekspressiooni märgiseta proteoomiline analüüs.

Automatiseeritud Western blot

Täielikult automatiseeritud Western-blot viidi läbi, kasutades tootja juhiste järgi lihtsaid Wes (Protein Simple, San Jose, CA). Lühidalt, standardsesse fluorestsentssegussegusse lisati kudede lüsaatidest või emakavedelikust 2 μg valku ja laaditi eeltäidetud Wesi analüüsiplaadi vastavatesse süvenditesse koos antikeha lahjendiga (Protein Simple), ENPP3-vastase antikehaga (lahjendus 1:50). Sigma LifeSciences, HPA043772), küülikuvastane sekundaarne antikeha (Protein Simple) ja Streptavidiin, millele järgneb luminoolperoksiidi segu. Kujutis ja analüüs tehti kompassi tarkvaraga (Protein Simple).

Nano-ESI-LC / MS / MS abil märgistuseta proteoomiline analüüs

Emaka vedelikud jaotati SDS-PAGE (Invitrogen) abil molekulmassi põhjal kuueks fraktsiooniks. Seejärel proteiinid redutseeriti, alküüliti ja geelis lagundati dimetüülitud sea trüpsiiniga (Sigma), millele järgnes analüüs nano-ESI-LC / MS / MS-ga (Dionex Ultimate 3000 RSLC ja Q Exactive MS / MS, Tartu Ülikooli Thermo Fisher Scientific ), kasutades 2-tunnist pöördfaasi gradienti ja 10 parima andmest sõltuvat omandamismeetodit. Saadud etiketivabad massispektromeetrilised andmed tuvastati ja kvantifitseeriti tarkvaraga MaxQuant tarkvarapaketiga 64 (UniProtKB inimese referentsproteoomide andmebaas, 2014. aasta septembri versioon). Sildivabad andmed normaliseeriti MaxLFQ algoritmiga 50 ja võrreldi paaritud või paarimata kahepoolse t-testiga.

Fluorestsents-aktiveeritud rakkude sortimine (FACS)

Stromaalsed rakud eraldati selektiivselt endomeetriumi rakkude kogumist FACS-ga negatiivse selektsiooni abil. Lühidalt, rakke pesti ja värviti epiteelirakkude jaoks EPCAM / CD326-ga 30 minutit ja sorteeriti MoFLOW® XDP voolurakuga aktiveeritud rakusorteerija abil (Beckman Coulter, USA).

Immunohistokeemia

5 μm parafiiniga manustatud endomeetriumi koeproovid deparafineeriti, kasutades 2100 retriiveri autoklaavi (Histolab, Göteborg, Rootsi) ja antigeeni otsimist tehti Diva Decloakeriga (Biocare Medical, Concord, CA). Pärast peroksüdaasi kustutamist inkubeeriti lõike lõigul Background Sniper (Biocare Medical), millele järgnes inkubeerimine primaarsete antikehadega (täiendav tabel 3) üleöö temperatuuril 4 ° C. Primaarsed antikehad lahjendati lahjendis DaVinci Green (Biocare Medical, Concord, CA). Avastamiseks kasutati biotiinivaba tuvastamissüsteemi Jänese / Hiire HRP polümeerikomplekti MACH 3 TM (Biocare Medical, Concord, CA). Reaktsioon töötati välja Betazoid DAB Chromogen kit abil (Biocare Medical, Concord, CA). Vastupidine hematoksüliini (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) lõigud kinnitati ksüleenil põhineva söötme Pertex® abil (Histolab, Göteborg, Rootsi) ja neid analüüsiti Zeiss Axiovert 200 M mikroskoobis (Zeiss, Göttingen, Saksamaa) 62 . Kõik slaidid pimestati ja neid skoorisid kaks sõltumatut vaatlejat. Poolkvantitatiivset IRS-skoori 65 kasutati positiivsete rakkude protsendi (PC) ja värvumise intensiivsuse (SI) hindamiseks. Kahe vaatleja erinevuse osas analüüsis kolmas sõltumatu vaatleja pimestatud slaidid ja edasiseks analüüsiks võeti kahe lähima tulemuse keskmine tulemus.

Deglükosüülimine

Endomeetriumi koe lüsaadid ja emakavedeliku proovid denatureeriti kergelt 0, 2% Rapigest SF pindaktiivse aine (Waters, 186001861) ja DTT-ga (5 mM) ning proove denatureeriti 5 minutit temperatuuril 95 ° C. Lisati jodoatseetamiid (lõppkontsentratsioon 15 mM) ja inkubeeriti 30 minutit pimedas. Lahusesisene ensümaatiline lagundamine viidi läbi inkubeerimisega 1 μl proovi PNGase F-ga (Roche, 11365169001) 2 tundi temperatuuril 37 ° C ja analüüsiti programmi Simple abil. Wes.

Statistiline analüüs

Paaris T-test ja SAM meetodid viidi läbi mikrokiibi andmete analüüsimiseks MultiExperiment Vieweri abil. Mann-Whitney U testi kasutati immunohistokeemilise värvimise võrdlemiseks kontroll- ja ravirühmade vahel. Statistiliste eelduste põhjal viidi reaalajas PCR ja Western blot andmete analüüsimiseks läbi kas paarimata T-test või Mann Whitney test. Blastotsüstide kinnitumise määra analüüsimiseks viidi läbi Fisheri täpne test. Kogu statistiline analüüs tehti XLSTAT 2015 (Addinsoft) ja Prism 6 (GraphPad Software) abil.

Lisainformatsioon

Pöörduskood: mikrokiibi andmed, GEO hoidla liitumisnumber GSE59447.

Kuidas seda artiklit tsiteerida : Boggavarapu, NR jt . Retseptiivse endomeetriumi segmenteerunud geeniekspressiooniprofiilide põhjal selgub, et progesterooni reguleeritud ENPP3 ekspresseeritakse diferentsiaalselt ja sekreteeritakse glükosüülitud kujul. Sci. Rep. 6, 33811; doi: 10.1038 / srep33811 (2016).

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.