Tsirkuleeriva tuumorirakkude tuvastamine: metastaatilise rinnavähiga patsientide otsene võrdlus rakuotsingusüsteemi adnatest ja ck-19 / mammaglobiini rt – pcr vahel | Briti vähiväljaanne

Tsirkuleeriva tuumorirakkude tuvastamine: metastaatilise rinnavähiga patsientide otsene võrdlus rakuotsingusüsteemi adnatest ja ck-19 / mammaglobiini rt – pcr vahel | Briti vähiväljaanne

Anonim

Seda artiklit on värskendatud

Abstraktne

Taust:

Tsirkuleerivate kasvajarakkude (CTC) avastamisel, loendamisel ja eraldamisel on märkimisväärne potentsiaal mõjutada rinnavähiga patsientide kliinilist ravi. Olemasolevaid avastamismeetodeid kasutades võib positiivsete proovide määr siiski oluliselt varieeruda. Tehnoloogia standardiseerimise puudumine takistab CTC mõõtmise rakendamist tavapärases kliinilises praktikas.

Meetodid:

Selle uuringu eesmärk oli otseselt võrrelda kolme tehnikat CTC tuvastamiseks vereproovides, mis võeti 76 metastaatilise rinnavähiga (MBC) patsiendilt ja 20 tervislikust kontrollrühmast: CellSearchi CTC süsteem, AdnaTest rinnavähi valimise / tuvastamise ja varem välja töötatud reaalse aeg-qRT-PCR-test CK-19 ja mammaglobiini transkriptide tuvastamiseks.

Tulemused:

Selle tulemusel oli CellSearch System positiivne 36% MBC-ga patsientidest, 22% AdnaTestiga, 26% CK-19 puhul RT-PCR -ga ja 54% mammaglobiini RT-PCR-iga. Proovid olid positiivse tõenäosusega vähemalt ühe mRNA-markeri suhtes positiivsed, kasutades RT-PCR-i, kui CellSearchi süsteemi ( P = 0, 001) või AdnaTesti ( P <0, 001) korral.

Järeldus:

Kolme erineva tehnika abil täheldasime rinnavähiga patsientide veres CTC-de avastamise määra olulist varieerumist. Positiivsete proovide kõrgemat määra täheldati, kasutades CK-19 ja mammaglobiini kombineeritud qRT-PCR lähenemisviisi, mis viitab sellele, et see on praegu kõige tundlikum tehnika CTCde tuvastamiseks.

Peamine

Metastaasid on rinnavähiga seotud surmade peamine põhjus, kuid kasvajarakkude varajane levik jääb tavaliselt märkamatuks isegi kõrgresolutsiooniga pilditehnoloogia abil. Traditsioonilised prognostilised tegurid ei ennusta täpselt, millised patsiendid pärast esmast ravi lõpuks taastuvad, ning annavad adjuvandi ravi efektiivsuse kohta ainult piiratud teavet. Kogunevad aruanded näitavad, et ringlevate tuumorirakkude (CTC) tuvastamisel kehavedelikes on rinnavähiga patsientide kliinilise juhtimise parandamiseks märkimisväärne potentsiaal (Cristofanilli jt, 2004, 2005; Budd jt, 2006; Hayes jt, 2006; Wong jt, 2006; Benoy jt, 2006a; Rack jt, 2009). Viimase paari aasta jooksul on välja töötatud erinevad lähenemisviisid vere CTC avastamiseks, loendamiseks ja eraldamiseks. Immunotsütokeemilist analüüsi kasutatakse tavaliselt koos tihedusgradiendiga tsentrifuugimisega (Balic jt, 2005; Muller jt, 2005; Wiedswang jt, 2006), suuruse filtreerimisega (Kahn jt, 2004; Wong jt, 2006) või voolutsütomeetriaga. (Meng jt, 2004; Allan jt, 2005) kasvajarakkude rikastamiseks enne nende avastamist. Lisaks on kirjeldatud nukleiinhappel põhinevaid lähenemisviise rakkude tuvastamiseks (Lambrechts jt, 1999; Smith jt, 2000; Aerts jt, 2001; Stathopoulou jt, 2002; Benoy jt, 2004). Olemasolevaid tehnikaid kasutavate positiivsete proovide määrade erinevus on siiski oluliselt erinev. Tehnoloogia standardiseerimise puudumine takistab CTC mõõtmise rakendamist tavapärases kliinilises praktikas.

Selle uuringu eesmärk oli otseselt võrrelda kolme tehnikat CTC tuvastamiseks metastaatilise rinnavähiga (MBC) patsientide veres. Esimeseks meetodiks on CellSearch System (Veridex LLC, Raritan, NJ, USA), mis on välja töötatud perifeersest verest pärinevate CTC-de automaatseks rikastamiseks ja immunotsütokeemiliseks tuvastamiseks (Allard et al, 2004) ning on praegu ainus rutiinse kliinilise kliinilise heakskiidu saanud instrument. kasutamine MBC patsientidel. See süsteem koosneb CellSave säilitusainetega tuubidest, mis hoiab ära CTC lagunemise kuni 96 tundi; CellSearch CTC komplekt, eelpakendatud komplekt CTC eraldamiseks ja identifitseerimiseks; CellSearchi kontrollrakud, mis tagavad igapäevase või käivitatava toimivuse; süsteem CellTracks AutoPrep reagentide automaatseks lisamiseks ja CellTracks Analyzer II, poolautomaatne mikroskoop tulemuste skannimiseks ja lugemiseks. Epiteelirakud on immunomagnetiliselt eraldatud ja fluorestsentsmärgistatud ning CTC-deks loetakse nukleaarsed (DAPI +) rakud EpCAM +, tsütokeratiin (CK) 8/18/19 + ja CD45-fenotüübiga. Riethdorf jt (2007) valideerisid mitmeotselises uuringus CellSearchi süsteemi ja järeldasid, et see süsteem võimaldab CTC-sid usaldusväärselt tuvastada veres ja sobib MBC-ga patsientide rutiinseks hindamiseks kliinilises laboris. Cristofanilli jt (2004, 2005) uuringus testiti CellSearch süsteemi abil 177 MBC-ga patsienti CTC olemasolu. Uuringus jõuti järeldusele, et CTC avastamine enne esmavaliku ravi alustamist MBC-ga patsientidel ennustab progresseerumisvaba ja üldist elulemust. Lisaks näidati hiljuti, et CTC-sid, mis püsivad pärast tsütostaatilist, endokriinset ja zoledronaatravi, võib täheldada olulisel arvul kliiniliselt taastekkevaba rinnavähiga patsientidel. Nende patsientide pikem jälgimine annab täiendava ülevaate nende prognostilisest olulisusest ja näitab, kas neid saab kasutada kasvaja fenotüüpide määramiseks reaalajas või olla nende ravimise sihtmärgiks (Rack et al, 2009). Teine CTC tuvastamise meetod on AdnaTest rinnavähi valimise / tuvastamise meetod (AdnaGen AG, Langenhagen, Saksamaa), milles immunomagnetilisele eraldamisele järgneb tuumoriga seotud transkriptide HER2 , Muc-1 ja GA773-2 multipleksne RT-PCR. See meetod on osutunud ülitundlikuks lähenemiseks kahe kasvajaraku avastamispiiriga (Zieglschmid et al, 2005). Seda tehnikat kasutades tuvastati CTC 69% -l MBC-ga patsientidest (Zieglschmid jt, 2007a). Selle rinnavähi diagnostilise süsteemi kliinilisest valideerimisest ei ole veel teatatud. Kolorektaalse vähi korral andis aga AdnaTest käärsoolevähi valimise / tuvastamise tehnika abil tuvastatud CTC esinemine enne operatsiooni kogutud perifeerses veres, samuti järelproovides prognostilist teavet (Zieglschmid et al, 2007b).

Viimane analüüsimeetod on multimarker reaalajas qRT-PCR test. See test on varem välja töötatud meie laboris CK-19 ja mammaglobiini transkriptide tuvastamiseks rinnavähiga patsientide perifeerses veres ja luuüdi proovides (Benoy et al, 2004). CK-19 ekspresseerub enamikus rinnakartsinoomides (Bartek jt, 1985) ja seda on laialdaselt kasutatud CTC markerina (Slade jt, 1999; Smith jt, 2000; Aerts jt, 2001; Stathopoulou jt.), 2003; Benoy jt, 2004; Ring jt, 2005). Mammaglobiini spetsiifilisust rinnavähirakkude tuvastamisel vereloometoodetes on hinnatud mitmetes uuringutes (Leygue jt, 1999; Zach jt, 1999; Suchy jt, 2000; Corradini jt, 2001; Silva jt, 2002). ; Lin jt, 2003). Hiljutises uuringus täheldasime, et CK-19 ja mammaglobiini transkriptide tuvastamine rinnavähiga ravimata patsientide luuüdi proovides oli patsientide prognoosimisel parem immunotsütokeemiast (Benoy et al., 2006a, 2006b). Kaplan – Meieri elulemuse analüüs näitas, et kõrgenenud CK-19 ja mammaglobiini mRNA tasemega luuüdis patsientide üldine elulemus on märkimisväärselt vähenenud. Kuid CTC esinemine veres ei mõjutanud patsientide üldist elulemust.

materjalid ja meetodid

Patsiendid ja proovide kogumine

Perifeerse vere proovid saime 76 MBC-ga patsiendilt ja 20 tervelt vabatahtlikult. Kõik patsiendid andsid teadliku nõusoleku oma vereproovi kasutamiseks ja vereproovide uurimine viidi läbi pärast Sint-Augustinuse üldhaigla (Antwerpen, Belgia) institutsionaalse ülevaatuskomitee nõusolekut. Vereproovid võeti 60-st MBC-ravi saanud patsiendist (ravitud patsiendid) ja 16-st patsiendist, kes esinesid meie kliinikus ravimata MBC-ga (ravimata patsiendid). Ravitavaid patsiente raviti erinevalt tsütostaatilistest ravimeetoditest, mis enamasti sisaldasid taksaane, vinorelbiini, antratsükliine või kapetsitabiini ( N = 40), endokriinset ravi ( N = 17) või trastutsumabi üksi või kombinatsioonis teiste ravimitega ( N = 18). Enamikku patsiente raviti ulatuslikult. Proovid võeti vähemalt 3 nädalat pärast eelmist keemiaravi ja kõigilt patsientidelt võeti proove ainult üks kord. Kontrollpopulatsiooni mediaanvanus oli 39 (vahemik, 25–54) aastat ja 62 (vahemik, 34–85) aastat rinnavähi populatsioonis. Kliinopatoloogilised muutujad sisestati andmebaasi ja on loetletud tabelis 1. Haiguse seisundit hinnati, kasutades ravivastuse hindamise kriteeriume soliidtuumorite rühmas (RECIST), ilma patsientide CTC tulemuste teadmata (Therasse et al, 2000). Haiguse staatus muudeti seejärel progresseeruvaks (RECIST: PD) või mitteprogresseeruvaks (RECIST: SD, PR, CR). Uuring viidi läbi topeltpimedalt: vereanalüüse teinud isikud ei teadnud patsientide haigusseisundit (IVdA, DP, IB, HE ja SVL) ning haiguse tulemusi registreerinud isikutele ei olnud teada testi tulemusi olek (PVD, PH, AP ja LD). Rinnavähi valimise / tuvastamise meetod AdnaTest viidi molekulaarbioloogia (IB) laboris (Labo Lokeren, Campus RIATOL, Antwerpen, Belgia) kahest ülejäänud CTC-testist sõltumatult läbi, mis muude katsetulemuste jaoks pimestati.

Täissuuruses tabel

CellSearch CTC test

Perifeerne veri (10 ml) koguti igalt doonorilt CellSave'i vere kogumistorudesse (Immunicon Inc., Huntingdon Valley, PA, USA), mis evakueeriti EDTA ja rakulise säilitusainet sisaldava verevõtu torudega ning töödeldakse maksimaalselt 72 tunni jooksul. pärast vere võtmist (toatemperatuuril). Ringlevad tuumorirakud loendati CellSearch System (Veridex, Raritan, NJ, USA) abil, nagu on kirjeldanud Allard jt (2004). Lühidalt, 7, 5 ml verd segati õrnalt 6, 5 ml lahjenduspuhvriga, tsentrifuugiti (800 g, 10 minutit, aeglane aeglustamine) toatemperatuuril ja kanti üle CellTracks AutoPrep süsteemi. Pärast plasma ja lahjenduspuhvri kihi aspireerimist lisati EpCAM-vastase antikehaga kaetud ferrofluidid. Pärast inkubeerimist ja magnetilist eraldamist seondumata rakud ja järelejäänud plasma eemaldati ning ferrofluidiga märgistatud rakud suspendeeriti uuesti puhvris, permeabiliseeriti ja fluorestsentsmärgistati, kasutades fükoerütriiniga konjugeeritud anti-tsütokeratiinivastaseid antikehi, mis tunnevad ära tsütokeratiinid (valdavalt tsütokeratiinid 8, 18 ja 19). konkreetselt tuvastada epiteelirakud; koos allofütsütsüaniiniga konjugeeritud CD45-vastase antikehaga, et tuvastada WBC, ja tuumvärviga (4 ', 6-diamidino-2-fenüülindool, DAPI), et fluorestsentsmärgistada raku tuumasid. Proov viidi automaatselt MagNesti kassetti, milles immunomagnetiliselt märgistatud rakud liiguvad pinnale, mida põhjustab MagNesti seadme tugev magnetväli. MagNest pandi CellTracks Analyzer II-le, neljavärvilisele poolautomaatsele fluorestsentsmikroskoobile, ja jäädvustati pildiraamid, mis hõlmasid kasseti kogu pinda kõigi nelja fluorestsentsfiltrikuubi jaoks. Jäädvustatud pildid, mis sisaldasid objekte, mis vastasid eelnevalt kindlaksmääratud kriteeriumidele, esitati automaatselt veebitoega brauseris, kust operaator lahtrite lõpliku valiku tegi. CTC all määratletava objekti peamised kriteeriumid hõlmasid ümarast kuni ovaalset morfoloogiat, nähtavat tuuma (DAPI +), positiivset värvumist tsütokeratiini ja negatiivset värvumist CD45 jaoks. Rakkude loendamise tulemusi väljendati rakkude arvuna 7, 5 ml vere kohta ja testi positiivseks määramiseks valiti CT2 CTC piir. Igat proovi analüüsisid kaks lugejat (HE ja PV) sõltumatult. Küsitavaid tõlgendusi hinnati uuesti, kuni jõuti üksmeelele.

AdnaTesti rinnavähi valimine / tuvastamine

Vereproovid (2 × 5 ml) võeti AdnaCollect vere kogumistorude abil (AdnaGen, Langenhagen, Saksamaa) ja asetati kohe jääle. Iga doonori puhul kasutati AdnaTesti rinnavähi valimise / tuvastamise tehnikat kahel eraldi vereproovil vastavalt tootja juhistele.

AdnaTesti rinnavähi valimine

BreastSelect bead'id (100 μl) lisati 5 ml verele ja inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril (5 p / min). Pärast inkubeerimist pesti rakke korduvalt PBS-ga ja lüüsiti, lisades lüüsimis- / sidumispuhvrit (AdnaGen). Supernatant saadi tagasi.

AdnaTesti rinnavähi tuvastamine

Seejärel eraldati mRNA magnetilise eraldamise teel, kasutades Oligo (dT) 25 Dynabeads. Kogu mRNA / raku segu (29, 5 μl ) transkribeeriti pöördtranskriptsiooni teel, kasutades 0, 5 μl RNaasi inhibiitorit (40 U μl −1 ; Promega, Madison, WI, USA), 4 μl RT puhvrit, 4 μl dNTP-sid ja 2 μl Sensiscripti pöördtranskriptaasi (Qiagen, Valencia, CA, USA). Pöördtranskriptsioon viidi läbi üheastmelise reaktsiooniga (60 minutit temperatuuril 37 ° C, 5 minutit temperatuuril 93 ° C). Seejärel jahutati segu jääle ja hoiti temperatuuril -20 ° C.

Kasvajaga seotud mRNA-de analüüsimiseks viidi läbi multipleksne PCR. Praimerisegu koosnes neljast spetsiifilisest praimeripaarist kolme tuumorimarkeri ( Muc-1 , HER2 ja GA733-2 ) ja ühe majapidamisgeeni ( aktiin ) amplifitseerimiseks . PCR-analüüsid viidi läbi lõppmahus 50 μl PCR-segus, mis sisaldas 8 μl cDNA, 4 μl praimerisegu (PrimerMix BreastDetect; AdnaGen), 25 μl Hot Star Taq põhisegu (Qiagen) ja 13 μl. l destilleeritud vett. PCR analüüsid viidi läbi järgmiselt: eeldenatureerimine 15 minuti jooksul temperatuuril 95 ° C, millele järgnes 35 denatureerimise tsüklit temperatuuril 94 ° C, lõõmutamine temperatuuril 60 ° C 1 minut, pikendamine temperatuuril 72 ° C 1 minut ja lõplik pikendamine etapp temperatuuril 72 ° C 10 minutit.

Negatiivsete kontrollide korral asendati mRNA ja cDNA veega pöördtranskriptsiooni ja PCR katsetes.

Hindamine

Andmete visualiseerimiseks viidi läbi BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), kasutades DNA 1000 LabChip. Testi tulemuse tõlgendamiseks pidi igas proovis olema kontrollgeeni aktiini fragment (PCR-i sisemine kontroll). AdnaTest loeti positiivseks, kui tuvastati selgelt vähemalt ühe kasvajaga seotud transkripti PCR fragment (piigi kontsentratsioon> 0, 30 ng μl −1 ). Piigid, mida ülaltoodud seadistusel ei tuvastatud, olid negatiivsed (kontsentratsioon <0, 15 ng μ l −1 ). Piike keskmise kontsentratsiooniga 0, 15–0, 30 ng μ l −1 peeti ebaselgeteks. Selles uuringus osaleja diagnoosimiseks veres CTC-testi positiivsena pidi AdnaTest mõlemal vereproovil olema positiivne tulemus.

Kvantitatiivne multimarker RT-PCR test

RNA täielik ekstraheerimine

Igalt doonorilt koguti verd (9 ml) VenoSafe EDTA vere kogumistorudesse (Terumo Europe, Leuven, Belgia). Esiteks juhiti veri läbi LeukoLOCK filtri (Ambion / Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), mis hõlmab kogu leukotsüütide populatsiooni. Seejärel stabiliseeriti filtril hõivatud rakkude RNA Ambion RNAlater Solution (Ambion / Applied Biosystems) abil ja stabiliseeritud rakke hoiti filtril temperatuuril -20 ° C kuni edasise kasutamiseni. Kogu RNA puhastati LeukoLOCK süsteemi (Ambion / Applied Biosystems) helmeste sidumise tehnoloogia abil ja kvantifitseeriti NanoDrop ND-1000 abil (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE, USA).

RT – PCR

RNA (2 μg ) transkribeeriti pöördmahuga 100 μl, kasutades suure mahutavusega cDNA arhiivikomplekti (Applied Biosystems). Kõik PCR reaktsioonid viidi läbi 7900HT kiire reaalajas PCR süsteemis (Applied Biosystems). CK-19 ja mammaglobiini fluorogeensed proovid ja praimerikomplektid sünteesiti kohandatud ettevõttes Applied Biosystems ja need on loetletud mujal (Benoy et al, 2004). Normaliseerimiseks kasutati müügilolevaid sonde ja ACTB ja TBP praimerikomplekte (Applied Biosystems). Fluorogeenne PCR-analüüs viidi läbi reaktsiooni ruumalas 25 μl ja see sisaldas 12, 5 μl TaqMani geeniekspressiooni põhisegu (Applied Biosystems) ja 10 μl cDNA lahust. Iga proovi analüüsiti kahes eksemplaris ja edasiseks analüüsiks kasutati keskmisi Ct väärtusi.

Kvantifitseerimine

CK-19 Ct väärtused normaliseeriti ACTB ja TBP ekspressioonitasemete jaoks ja väljendati positiivse kontrollproovi suhtes, kasutades 2 ΔΔ Ct kvantifitseerimismeetodit (Livak ja Schmittgen, 2001). Nende mõõtmiste tähistamiseks kasutame lühendit RGE (suhteline geeniekspressioon). Seejärel normaliseeriti RGE järgmise võrrandi abil:

Image

kus NRGE on normaliseeritud RGE, väljendatud suhtelise sihtkontsentratsioonina vere milliliitris; C RNA - proovi kohta ekstraheeritud kogu RNA kontsentratsioon; V RNA - pärast ekstraheerimist saadud RNA elueerimismaht; V ext ekstraheeritud vere maht; C cDNA cDNA kontsentratsioon ja V PCR PCR amplifikatsiooniks kasutatud cDNA lahuse maht.

Statistiline analüüs

Mitteparameetriliselt jaotunud muutujate erinevuste hindamiseks kasutati Manni – Whitney U- testi. Pidevate mitteparameetriliste muutujate korrelatsioone hinnati Spearmani astme korrelatsioonikordaja arvutamisega või kategooriliste muutujate korral κ- testi abil (Landis ja Koch, 1977). Positiivsete proovide määrade erinevusi kolme CTC tuvastamismeetodi vahel uuriti McNemari testi abil. Positiivsete proovide kiiruse ja patsiendi omaduste vahelise seose hindamiseks kasutati Pearsoni χ 2- testi või madala sageduse korral raku kohta Fisheri täpset meetodit. Kahepoolset P 0, 05 peeti statistiliselt oluliseks. Kõik statistilised arvutused tehti kasutades SPSS, versioon 11.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).

Tulemused

CTC tuvastamine CellSearch CTC testi abil

Rakkude otsingu CTC-süsteemi kasutati CTC-de loendamiseks 76 MBC-ga patsiendi ja 20 terve vabatahtliku veres. Selles uuringus oli 59% MBC-ga patsientidest ja 10% -l tervetest kontrollidest vähemalt üks tuvastatav CTC 7, 5 ml veres ( P <0, 001, Pearsoni χ 2- test). Ühe patsiendi puhul ei võimaldanud proovi kvaliteet CTC täpset loendamist. MBC-ga patsientide vereproovides oli CTC arv märkimisväärselt suurem kui tervetel kontrollidel: 7, 5 ml veres tuvastatud CTC-de arv oli MBC-ga patsientidel ( N = 75) 1 (vahemik 0–2617) ja 0 (vahemik), 0–1) kontrollides ( N = 20) ( P <0, 001, Mann – Whitney U- test) (joonis 1A). CTC arvud ei erinenud ravitud ja ravimata patsientide vahel ( P = 0, 302, Mann – Whitney U- test): CTC-de keskmine arv ravitud patsientide rühmas ( N = 59) oli 1 (0–2617) ja mediaanarv CTC-de arv ravimata patsientide rühmas ( N = 16) oli 0, 5 (0–153). Patsientide proovide arv, mis saavutas 2 või enama CTC piirmäära 7, 5 ml veres, oli 36%. Seda lähenemisviisi kasutades saime CellSearch-süsteemi abil positiivsed CTC testi tulemused 41% -l ravitud patsientidest ja 19% -l ravimata patsientidest ( P = 0, 427, Pearsoni χ 2- test).

Image

( A ) Tervete kontrollidega ( N = 20) ja metastaatilise rinnavähiga (MBC) patsientidelt ( N = 76) avastatud CTC-de arv 7, 5 ml veres, kui proove analüüsiti CellSearch CTC testiga. ( B ) MBC-ga patsientide ( N = 76) veres tuvastatud CK-19 normaliseeritud suhteline geeniekspressioonitase, kui proove analüüsiti reaalajas RT-PCR testi abil. ( C ) MBC-ga patsientide ( N = 76) veres tuvastatud mammaglobiini normaliseeritud suhteline geeniekspressioonitase, kui proove analüüsiti reaalajas RT-PCR testi abil. Ravitud: MBC-ga patsiendid ravi ajal. Ravimata: MBC-ga patsiendid, kes ei saa ravi.

Täissuuruses pilt

Järgmisena hindasime CTC-de korrelatsiooni veres ja tuumori progresseerumisega (tabel 1). CTC mediaanarv oli 1 (vahemik, 0–2617) progresseeruva haigusega ( N = 46) ja 0 (vahemik, 0–39) mitteprogresseeruvatel ( N = 26) ( P = 0, 004, Mann– Whitney U- test). Lisaks täheldati positiivset korrelatsiooni CTC-de arvu ja seerumi CA15.3 taseme ( r = 0, 669, P <0, 001) või patsientide vanuse vahel ( r = 0, 376, P = 0, 001). Kahe või enama CTC olemasolu ja primaarse kasvaja ER, PR, HER2 või P53 ekspressiooni vahel seoseid ei leitud.

CTC tuvastamine AdnaTesti rinnavähi valimisel / tuvastamisel

AdnaTesti rinnavähi tuvastust peetakse positiivseks, kui tuvastatakse selgelt vähemalt ühe kasvajaga seotud transkripti ( Muc-1 , GA733-2 või HER2 ) PCR-fragment (piigi kontsentratsioon> 0, 30 ng μl −1 koos BioAnalyzer 2100-ga)., loetakse ebaselgeks, kui piikide vahekontsentratsioon on (0, 15–0, 30 ng μ l −1 ) ja negatiivseteks, kui piikide kontsentratsioonid on <0, 15 ng μ l −1 . Neid kriteeriume kasutades diagnoositi AdnaTestiga 18 tervisliku kontrollpopulatsiooni ( N = 20) 18 vabatahtlikku negatiivsena, ühel tervislikul kontrollproovil oli üks positiivne vereproov ja ühel tervislikul kontrollkontrolli tulemused olid vaieldamatud. 76 MBC-ga patsiendist oli 16 patsiendil (22%) kaks positiivset vereproovi, 7 patsiendil (9%) ainult üks positiivne vereproov ja 51 patsiendil (68%) polnud positiivseid vereproove. Kahe patsiendi puhul täheldati ebaselget testi tulemust ja need jäeti edasiseks analüüsiks. Positiivse testitulemuse (kaks positiivset vereproovi) sagedus oli MBC-ga patsientidel oluliselt kõrgem kui tervetel kontrollgruppidel, 22 vs 0% ( P = 0, 03, Pearsoni χ 2- test). Ravitud ja ravimata patsientide rühmas olulisi erinevusi ei täheldatud.

AdnaTesti positiivset tulemust seostati kõrge CA15.3 tasemega (võrreldes patsiendi populatsiooni keskmise tasemega) ( P = 0, 001, Pearsoni χ 2- test), kuid mitte tuumori progresseerumisega ( P = 0, 22, Pearsoni χ 2 - test). Lisaks ei leitud seost tuumori progresseerumise ja positiivsete vereproovide arvu vahel ( P = 0, 35, Pearsoni χ 2- test). AdnaTesti tulemus korreleerus primaarse kasvaja ER staatusega ( P = 0, 02, Pearsoni χ 2- test), kuid mitte PR, HER2 ega P53 staatusega. Andmed on kokku võetud tabelis 1.

CTC detekteerimine kvantitatiivse multimarker-RT-PCR testiga

CK-19 ja mammaglobiini kvantitatiivse reaalajas RT-PCR testi tundlikkust ja spetsiifilisust on varem kirjeldatud (Benoy et al, 2004). Keskmine NRGE tase MBC-ga patsientidel ( N = 76) oli CK-19 korral 0, 105 (vahemik, 0–163, 15) ja mammaglobiini korral 0, 001 (vahemik, 0–120, 44) (joonised 1B ja C). Ravitud ja ravimata patsientide rühmas ei täheldatud CK-19 ega mammaglobiini keskmise NRGE taseme erinevusi ( P = 0, 87 ja 0, 91, Mann – Whitney U- test). Mõlema mRNA-markeri mediaan NRGE tasemed olid olulises korrelatsioonis ( r = 0, 321, P = 0, 005). NRGE CK-19 või mammaglobiini tase korreleerus CA15.3 tasemega ( r = 0, 481, P <0, 001 ja r = 0, 386, P = 0, 001), kuid mitte patsiendi vanusega.

Samuti analüüsisime CK-19 PCR tulemusi kategooriliste muutujatena, määrates positiivsuse piirväärtuse, mis vastas 100% spetsiifilisusele (kontrollpopulatsioonis mõõdetud maksimaalsed NRGE väärtused). Selle põhjal oli 76-st patsiendist 20 (26%) 20 positiivne CK-19 suhtes . Kuna üheski kontrollproovis ei tuvastatud mammaglobiini PCR-signaale, loeti patsiendi proov positiivseks, kui tuvastati mammaglobiini PCR-signaal. Mammaglobiini ekspressioon oli mõõdetav 41-l 76-st (54%) MBC-ga patsiendist. MBC-ga patsientide 76 vereproovist olid 14 (18%) positiivsed nii CK-19 kui ka mammaglobiini osas , 33 (43%) olid positiivsed ainult ühe mRNA-markeri osas ja 29 (38%) olid negatiivsed nii CK-19 kui ka mammaglobiin . CK-19 ja / või mammaglobiini mRNA ekspressiooni positiivne tulemus leiti 69% -l ravimata patsientidest ( N = 16) ja 60% -l ravitud patsientidest ( N = 60) ( P = 0, 52, Pearsoni χ 2- test). CK-19 ja mammaglobiini suhtes ei olnud positiivsete ega negatiivsete proovide vahel olulist kooskõla ( κ = 0, 16, P = 0, 09, κ- test).

Järgnevalt analüüsisime seost CK-19 või mammaglobiini RT-PCR abil tuvastatud CTC ja tuumori progresseerumisega (tabel 1). CK-19 + või mammaglobiini + vereproovide tuvastamise määr ei olnud seotud kasvaja progresseerumisega ( P = 0, 19 ja 0, 84, Pearsoni χ 2- test). CK-19 või mammaglobiini ekspressiooni ja ühegi kliinilise patoloogia muutuja (ER, PR, HER2 ja P53) vahel ei leitud seoseid.

Kolme CTC tuvastamismeetodi võrdlus

Kvantitatiivselt täheldati AdnaTesti poolt positiivseks peetud vereproovides kõrgemat CTC arvu CellSearch System'i poolt ja kõrgemat NRGE taset CK-19 korral kui negatiivsetes proovides ( P <0, 001 ja 0, 002, Mann – Whitney U- test). Mammaglobiini ekspressioonis erinevusi ei täheldatud ( P = 0, 09, Mann – Whitney U- test). Lisaks täheldasime RT-PCR-iga head korrelatsiooni CellSearch CTC-testiga tuvastatud CTC-de arvu ja CK-19 ( r = 0, 453, P <0, 001) või mammaglobiini ( r = 0, 477, P <0, 001) NRGE tasemete vahel (Joonis 2).

Image

Seos tsirkuleerivate kasvajarakkude arvu järgi CellSearchi süsteemi ja CK-19 ( A ) või mammaglobiini ( B ) normaliseeritud suhtelise geeniekspressioonitaseme vahel RT-PCR abil MBC patsientidel.

Täissuuruses pilt

McNemari testi kohaselt täheldati CellSearchi CTC testi ja AdnaTestiga olulist erinevust positiivsuses (36 vs 22%, P = 0, 013). MBC-ga patsientidel oli tõenäosus CK-19 ja / või mammaglobiini suhtes positiivne, kui nad kasutasid reaalajas RT-PCR, kui kasutades CellSearchi CTC testi (63 vs 36%, P = 0, 001, McNemari test) või AdnaTesti (61%). vs 22%, P <0, 001, McNemari test).

Samaaegsed proovid määratleti proovidena, milles mõlemal võrreldaval tuvastamismeetodil märgiti patsiendi proov positiivseks või negatiivseks. Selle tulemusel oli CellSearch CTC testiga analüüsitud proovide ja AdnaTesti analüüsitud proovide vastavus mõõdukas ( κ = 0, 543, P <0, 001, κ- test). Mõlema tuvastamismeetodi vahelist kokkulangevust täheldati 81% vereproovidest. Kui CellSearchi CTC testi võrreldi CK-19 ja mammaglobiini RT – PCR analüüsidega, täheldasime vastavalt 72 ja 60% protsendimäära ( κ = 0, 356, P = 0, 002 ja κ = 0, 220, P = 0, 04, κ- test) ). CK-19 ja mammaglobiini määramise AdnaTesti ja RT-PCR testide vahel leiti vastavalt 78 ja 53% vereproovidest ( κ = 0, 415, P <0, 001 ja κ = 0, 082, P = 0, 375, κ- test). Andmed on kokku võetud tabelis 2. Kaheksa MBC-ga patsiendi (10%) korral saadi kolme meetodi abil positiivne testi tulemus.

Täissuuruses tabel

Arutelu

Vaatamata varajase diagnoosimise ja ravi olulistele edusammudele ilmneb metastaatiline haigus umbes 50% -l näiliselt lokaliseeritud rinnavähiga juhtudest ja isegi 30% -l sõlme-negatiivse haigusega patsientidest tekivad kauged metastaasid (Braun jt, 2001). Kartsinoomipatsientide staadium kliinilises praktikas põhineb kasvaja omadustel, nagu tuumori suurus, kasvaja raskusaste, lümfisoonte osalus, metastaaside esinemine piirkondlikes lümfisõlmedes esmase operatsiooni ajal, steroidiretseptori staatus ja inimese epidermaalse kasvufaktori retseptori 2 amplifikatsioon ( Singletary jt, 2002). CTCde hindamist perifeersetes vereproovides ei peeta rinnavähi kliinilises ravis tavapäraseks protseduuriks mitmel põhjusel (Riethdorf et al, 2007). Kõige olulisem on asjaolu, et kasutatavad erinevad tehnilised lähenemisviisid, analüüsitud vere milliliitrite arvu suured laboritevahelised erinevused, tundlikkuse ja spetsiifilisuse testide kvaliteet, patsientide arv võrreldes kontrollide ja andmete tõlgendamisega muudavad kindlate järelduste tegemise väga keeruliseks CTC avastamise mõju vähi prognoosimisel ja järelkontrollil (Paterlini-Brechot ja Benali, 2007). Selle uuringu põhieesmärk oli võrrelda kolme erinevat meetodit CTC tuvastamiseks MBC-ga patsientide veres: (1) CellSearch System, mis kujutab endast automatiseeritud, standardiseeritud ja regulatsioonide poolt heaks kiidetud süsteemi CTC immunotsütokeemiliseks tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks. veres; (2) AdnaTesti rinnavähi valimine / tuvastamine, mis hõlmab tuumoriga seotud transkriptide tuvastamist RT-PCR abil pärast kasvajarakkude immunomagnetilist rikastamist ja (3) ettevõttesiseselt välja töötatud multimarkeri reaalajas RT-PCR test, mis See hõlmab kasvajaga seotud transkriptide kvantifitseerimist reaalajas RT-PCR abil pärast perifeerse vere mononukleaarsete rakkude rikastamist filtrimisega. Kolme tuvastamismeetodi tehnilised üksikasjad on kokku võetud tabelis 3.

Täissuuruses tabel

Kolmes testis täheldasime olulisi erinevusi CTC-de avastamissageduses. Kasutades CellSearchi CTC testi, leidsime, et meie MBC-ga patsientide uuringus oli CTC-de arv vahemikus 0 kuni 2617. 59% -l vereproovidest tuvastati vähemalt üks CTC ja 36% -l vereproovidest kaks või enam CTC-d. tuvastati. Seevastu ükski kontrollpopulatsiooni vereproov ei sisaldanud kahte või enamat CTC-d, mis vastab 100% spetsiifilisusele. Sama piirväärtust kasutades saadi Allard jt (2004) positiivsuse määraks 372, mis hõlmas 422 patsiendilt erinevatel puhkudel saadud 1616 vereproovi koondatud analüüsi. Kuid ravitud ja ravimata patsientide eraldi analüüsimisel oli ainult 19% meie uuringus osalenud ravimata patsientidest ( N = 16) kaks või enam CTC-d 7, 5 ml vere kohta, mis on oluliselt madalam kui Cristofanilli jt (2004) leitud arv. ) 177 MBC-ga patsiendil enne uue raviskeemi alustamist (61%) (tabel 4). Selle lahknevuse põhjus jääb ebaselgeks, kuid see võib olla tingitud meie uuringus ravimata patsientide väikesest valimi suurusest. AdnaTesti kasutamisel ei leitud ükski tervete inimeste vereproov positiivset. Patsientide rühmas täheldati suhteliselt madalat kahe positiivse vereproovi määra (22%). Võrdluseks - Zieglschmid jt (2007a) teatasid CTC esinemisest 69% -l MBC-ga patsientide vereproovidest, kasutades sama tehnikat. Kuid Aktas jt (2009) hiljutises uuringus, milles uuriti EMT ja tüvirakumarkerite ekspressiooni AdnaTesti abil tuvastatud CTC-des, leiti CTC-d 69-st 226-st (31%) vereproovist, mis olid võetud MBC-ga patsientidelt (Aktas et al, 2009; tabel 4). Kasutades meie eelnevalt välja töötatud kvantitatiivset reaalajas RT-PCR testi, mõõtsime vähiga patsientide normaliseeritud RGE taset vahemikus 0 kuni 163 CK-19 ja 0 kuni 120 mammaglobiini korral . Madal CK-19 mRNA sisaldus leiti ka tervete doonorite veres. CK-19 tuvastamine tervetel doonoritel RT-PCR abil on omistatav CK-19 geeni ebaseaduslikule transkriptsioonile perifeerse vere mononukleaarsetes rakkudes (Novaes et al, 1997) ja / või tsütokiinide suurenenud sekretsioonist, mis võib indutseerida koespetsiifiliste geenide transkriptsioon perifeerse vere leukotsüütides (Chelly jt, 1989; Jung jt, 1998). Selle küsimuse lahendamiseks valisime positiivsuse läbilõike, mis vastas 100% spetsiifikale. Selle põhjal oli 26% patsientide proovidest positiivne CK-19 mRNA suhtes. Kuna tervislike kontrollide vereproovides ei tuvastatud mammaglobiini ekspressiooni, kutsuti patsientide proovid positiivseteks, kui tuvastati mammaglobiini mRNA PCR-signaal. Selle põhjal oli 54% patsientide proovidest positiivne mammaglobiini ekspressiooni suhtes. Nimelt oli 61% patsientidest positiivne vähemalt ühe kahest transkriptsioonimarkerist, mis näitab eelist, kui RT-PCR-i amplifitseerimiseks kasutatakse rohkem kui ühte sihtmärki. Multimarkeri reaalajas RT-PCR testi tundlikkus ületas märkimisväärselt CellSearch CTC testi ja AdnaTesti testi.

Täissuuruses tabel

Lisaks erinevate tehnikate suhtelisele tundlikkusele ja eripäradele huvitas meid ka tehnikate ja nende kooskõla korrelatsioon. Vaatasime olulisi korrelatsioone CellSearch süsteemi abil tuvastatud rakuarvude ja CK-19 ning mammaglobiini mRNA normaliseeritud RGE tasemete vahel reaalajas RT-PCR abil. Kui tuvastati positiivsuse piir, oli CellSearch süsteemi ja reaalajas RT-PCR testi vahelise vastavuse väärtus 72 ja 60%, sõltuvalt ärakirja markerist. Üldiselt olid tehnikate vahelised kooskõlad vahemikus 53% (AdnaTesti ja mammaglobiini RT-PCR puhul) kuni 81% (AdnaTesti ja CellSearchi süsteemi puhul). Nii erinesid positiivse või negatiivse nimega proovid vastavalt CTC tuvastamise tehnoloogiale. The low concordance between our real-time RT-PCR assay and the AdnaTest may be explained by several reasons: (1) the AdnaTest is based on an immunomagnetic enrichment of tumour cells by epithelial and tumour-associated antigens, whereas in our assay, filter technology is used to remove red blood cells; (2) different RNA isolation and RT protocols are used in both assays; (3) the presence of tumour cells is indicated by different transcript markers and (4) in the AdnaTest, PCR products are visualised using microfluidic gel electrophoresis after which peak concentrations are measured, whereas the real-time PCR assay allows for a more sensitive quantification of mRNA expression levels by which also the exact amount of background transcription can be assessed.

Although, in general, approaches based on RT–PCR have a high sensitivity for the detection of CTC, an important limitation of these methods is that these cannot quantify the number of CTCs and no morphological evaluation of cells can be obtained. Furthermore, it remains unclear whether the minute tumour dissemination detected by PCR is capable of causing clinically relevant distant metastasis. In contrast to RT–PCR assays, the CellSearch CTC test allows for the counting of target cells. Advantages of the CellSearch System are its capability of standardising pre-analytical preparation of CTCs, the use of CTC preservative tubes that allow stabilisation of CTCs for up to 96 h and the inclusion of a positive control for assuring proper performance on a daily or run-to-run basis. All these features are beneficial in a multi-centre setting in clinical trials. One of the limitations of the CellSearch System, however, is the anti-EpCAM antibody-based enrichment strategy. Several authors reported the heterogeneous expression of EpCAM in mammary carcinomas (Thurm et al, 2003) and downregulation of EpCAM has been reported for disseminated tumour cells in bone marrow and CTCs in peripheral blood (Thurm et al, 2003; Rao et al, 2005). Recently, Deng et al (2008) showed that CTC enrichment with anti-cytokeratin antibodies, in combination with anti-EpCAM antibodies, significantly enhances assay sensitivity.

Summarising the results of this study, our multimarker quantitative RT-PCR assay showed superior sensitivity for the detection of CTCs in MBC compared with the CellSearch System and the AdnaTest. However, further studies are needed to clarify the prognostic value of this highly sensitive and standardised qRT-PCR approach for CTC detection in peripheral blood of patients with breast cancer.

Muutuste ajalugu