Ringlevad folliikulite t abistajarakud ja tsütokiini profiil inimestel pärast vaktsineerimist rvsv-zebovi ebolavaktsiiniga | teaduslikud aruanded

Ringlevad folliikulite t abistajarakud ja tsütokiini profiil inimestel pärast vaktsineerimist rvsv-zebovi ebolavaktsiiniga | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Haigused
  • Nakkushaigused

Abstraktne

Viimane Zaire'i Ebolaviiruse (ZEBOV) puhang oli ajaloo jooksul kõige suurem ja levinum, rõhutades vajadust tõhusa vaktsiini järele. Siin analüüsisime inimese rakulisi immuunvastuseid, mille põhjustas rVSV-ZEBOV-i vaktsiinikandidaadi ühekordne annus, mis näitas olulist kaitsvat efektiivsust Guinea endeemilistes populatsioonides. See on ZEBOV-GP-spetsiifiliste tsirkuleerivate follikulaarsete T-rakkude (cTfh) esimene põhjalik iseloomustus. Kuna antikehade tiitrid korreleerusid kaitsega ZEBOV-nakkuse prekliinilistes mudelites, ennustati, et Tfh korreleerub kaitsega. Tõepoolest, ZEBOV-spetsiifilised cTfh andmed korreleerusid inimese vaktsiinide antikehade tiitritega ja ootamatult Tfh17 alamhulgaga. Kahe tipptasemel tehnoloogia kombinatsioon võimaldas haruldaste rakupopulatsioonide immuunprofiilimist ja võib aidata selgitada mitmesuguste vaktsiinide kaitse korrelaate.

Sissejuhatus

Perekond Ebolavirus kuulub perekonda Filoviridae (filovirus) ja hõlmab mitmeid kõrge patogeensusega viiruseliike, mida saab inimestele edasi anda metsloomadelt 1 ja hõlpsalt inimeselt inimesele 2 . Ebola viirushaigus (EVD) on inimeste raske haigus, millega on seotud suremus, mis on registreeritud 25% -lt 90% -ni haiguspuhangute anamneesis 2, 3 . EVD-st teatati esmakordselt 1976. aastal kahes samaaegses haiguspuhangus Sudaanis ja Kongo Demokraatlikus Vabariigis (KDV), kus märkimisväärsete haiguspuhangutega seostati kaht eraldiseisvat Ebolaviiruse liiki - Zaire Ebolaviirust (ZEBOV) ja Sudaani Ebolaviirust (SEBOV) 4, , ületas viimane haiguspuhang geograafilise ulatuse ja haigusjuhtude arvu osas kõik varasemad epideemiad 3 .

Kuigi seda haigust seostatakse suure suremusega, on profülaktika ja ravivõimalused napid ning nende kliinilist efektiivsust ei ole veel täielikult hinnatud. ZEBOV-vaktsiini soovitavad sihtomadused on kõrge efektiivsus pärast ühekordset immuniseerimist, kiiret kaitse algust ja pikaajalist immuunsust. Selliste omadustega vaktsiinil on potentsiaal peatada haiguse levik kiiresti või isegi vältida olulisi puhanguid. Hinnatud on mitmesuguste vaktsiiniplatvormide efektiivsust prekliinilistes mudelites, sealhulgas ahvilistel. Üks juhtivate vaktsiinide platvormidest põhineb elusal replikatsioonikompetentsel rekombinantsel vesikulaarse stomatiidi viirusel (rVSV) 5, milles VSV glükovalgu (VSV-GP) geen on asendatud ZEBOV glükoproteiiniga. See vaktsiin kaitses edukalt ahvilisi (NHP) ZEBOV 6, 7-ga nakatamise eest. Veelgi enam, see vaktsiin näitas NHP mudelis kokkupuutejärgset kaitset (PEP), mis on tinginud selle uuritava vastusmeetmena eriolukorra protokollide alusel kahtlustatud Ebola Zaire'i kokkupuute korral kokkupuutejärgse teraapiana 8, 9, 10 ; varased kliinilised uuringud USA-s, Euroopas ja Aafrikas on näidanud, et vaktsiinikandidaadi üksik inokuleerimine on immunogeenne 11, 12, 13 ja on enamikul vaktsineeritud isikutest talutav, ehkki reaktogeensust täheldati 11, 12 . III faasi efektiivsuskatse koos rõngasvaktsineerimisega, mille käigus vaktsineeriti ZEBOV-iga patsientide lähedased kontaktid kohe või kolm nädalat pärast äsja tuvastatud juhtumi diagnoosimist, on näidanud, et see elus, nõrgestatud, üheannuseline vaktsiinikandidaat on väga tõhus 14 .

Praeguseks on EBOVi poolt vaktsiinist põhjustatud immuunsuse kaitse korrelaadid siiski erinevad, prekliiniliste mudelite andmed viitavad nii rakulise kui ka humoraalse mehhanismi osalusele 7, 15, 16, 17 . Kaitseni viivate immuunmehhanismide tüüp võib sõltuda vaktsiiniplatvormist. RVSV-ZEBOV vaktsiinide indutseeritud immuunmehhanisme on uuritud hiiremudelites 15 ja NHP 7 . Viimases immuniseeriti loomad rVSV-ZEBOV-iga pärast CD4 + või CD8 + T-rakkude ammendumist immuniseerimise ajal või vahetult enne nakatamist. Kuigi CD8 + T-rakkude kahanemine ei mõjutanud vaktsiini efektiivsust, mõjutas CD4 + T-rakkude kadumine vaktsineerimise ajal suurt mõju antikehade reageeringutele (depressioonitiitrid) ja sellest tulenevale kaitsele. CD4 + T-rakkude ammendumine nakatamise ajal ei mõjutanud, et sellel T-rakkude populatsioonil ei oleks otsest efektorfunktsiooni.

Käesoleva analüüsi eesmärk oli iseloomustada rVSV-ZEBOV vaktsiini indutseeritud tsirkuleerivate folliikulite abistaja T-rakke (cTfh) ja tsütokiini immuunprofiile, kuna selle vaktsiinikandidaadi indutseeritud immuunprofiili kohta on olemas minimaalsed andmed inimeste kohta (st ainult seroloogia) . Vaktsiini töötas algselt välja Kanada Health Health, litsentsiga NewLink Genetics Corp., kes algatas vaktsiini (tähisega BPSC1001) kliinilised testid ja GMP-de valmistamise ning seejärel litsentseeris selle eranditult Merck & Co-le, kes tegeleb hilises staadiumis väljatöötamisega vaktsiinikandidaadi (V920). Käesolev uuring loob V920-ga immuniseeritud inimestest koosneva kohordi jaoks väga detailsed immunoprofiilid (kliinilise uuringu kirjeldus vt viide 13) ning tööriistad ja parameetrid, mis võimaldavad võrrelda vastuseid ZEBOV-iga kokkupuutunud inimestel, andes seega teavet immuunvastuse hinnangud, mida võib hiljem rakendada kaitse immuunsuse korrelatsioonide tuvastamiseks.

Tulemused

ZEBOV-GP tsütokiini profiil stimuleeris immuunvastuseid PBMC-s

ZEBOV-GP-spetsiifiliste perifeerse vere mononukleaarsete rakkude (PBMC) tsütokiini profiili iseloomustamiseks analüüsiti ZEBOV-GP-peptiidiga stimuleeritud rakkude kultuuride supernatanti Mesoscale tsütokiini multiplekstesti platvormi abil (tabel 1). Analüüsitud tsütokiinid esindavad erinevaid funktsionaalseid kategooriaid: IL-1β ja IL-8 (põletikuvastane), IFN-y, IL-12, IL-2, TNF-α (Th1), IL-4, IL-6, IL-13 (Th2) ja IL-10 (immunomoduleerivad). Kõigi kolme vaktsiini annuse kohordi rakkude poolt eritati kõige rikkalikumalt IFN-y tsütokiini vastusena ZEBOV-GP peptiididele. Uuringusse kaasatud isikud jagati kolme annuserühma ja nad said vastavalt ühe intramuskulaarse inokulatsioonina vastavalt rVSV-ZEBOV 3 x 106, 2 x 107 või 1 x 108 naastu moodustavaid ühikuid (pfu).

Täissuuruses tabel

Iga kohordi tsütokiini signatuurid määrati korrelatsioonimaatriksi abil (joonis 1), mille tulemuseks olid järgmised peamised tähelepanekud: (1) kohordis 1 on korrelatsioonide klaster antigeeni stimuleerimise tulemus, mis koosneb IL-1β, IL-4, IL-10 ja TNF-a. IL-12 ja IL-13 vahel on ka tugev korrelatsioon, kuid ainult kahe teguriga ei saa seda pidada tõeliseks klastriks. Ehkki stimuleeritud rakkude kõrgel tasemel ekspresseeritud IFN-γ ei oma muid korrelatsioone. (2) 2. kohordi jaoks on kaks tsütokiinide klastrit, mis näitavad korrelatsioone: Esimene klaster koosneb IL-2, IL-6, IL-12 ja IL-13, samas kui 2. klaster koosneb IL-1β, IL-4, IL -10 ja TNF-a. IFN-y-l on IL-8-ga ainult negatiivne korrelatsioon. (3) 2. kohordi klastrid: 1. klaster, mis koosneb IL-2, IL-8, IL-12, IL-13 ja 2. klastrist koos IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10 ja TNF- α. IFN-y-l on endiselt ainult negatiivsed, ehkki nõrgad korrelatsioonid, nimelt IL-8 ja IL-2-ga. Me järeldame, et vaktsiini annuse suurendamine muutis stimuleeritud PBMC tsütokiini signaali. Kui IL1β, IL-4, IL-10 ja TNF-α klaster on tuvastatud kõigis kolmes kohordis, ilmneb IL-2, IL-12, IL-13 põhiklaster alles 2. kohordis. IL-6 on osa kohordi 2 klastrist 1, see liigub rühmas 3 rühmasse 2. IL-6 ja IL-8 vahel on tugev negatiivne korrelatsioon. Põletikulise tsütokiini vabanemise määr suurenes vaktsiini annusega. Annuse rühmad erinesid IL-2 vastuse suurusest (p = 0, 03, ANOVA, IL-6 (p = 0, 016, ANOVA) ja TNF-α (p = 0, 017, ANOVA). Samuti erinesid rühmad ka oma IL -8 vastus, ehkki mitte märkimisväärselt (p = 0, 08, ANOVA).

Image

Correlogramm kujutab seoseid tsütokiinide vahel, mille PBMC on tootnud kohortis 1 (paneel a), kohordis 2 (paneel b) ja kohordi 3 (paneel c), vastusena stimulatsioonile ZEBOV-GP-peptiididega. Värvid tähistavad korrelatsiooni taset (sinine - positiivne, punane - negatiivne, valge - korrelatsiooni pole). Tsütokiinide tegelikke andmeid leiate tabelist 1.

Täissuuruses pilt

Immuniseerimine rVSV-ZEBOV-GP-ga indutseerib cTFH märkimisväärset taset

CD154 kasutamist aktivatsioonimarkerina ja vahendina haruldaste rakkude tuvastamiseks on varem kirjeldatud 18 . ZEBOV-GP-spetsiifiliste CD4 + CXCR5 + T-rakkude esialgsel hindamisel, mis põhines CD154 ekspressioonil pärast ZEBOV-GP-peptiididega stimuleerimist, selgus, et cTfh-rakkude sagedus oli väga madal (joonis 2) ja põhjalik selle populatsiooni funktsionaalsete alamhulkade analüüs nõudis voolutsütomeetrilise analüüsi logistika muutmist. Platseebokontrolliga katsealuste vastused ei ületanud päeval 0 mõõdetud vastuseid vaktsineeritud isikutel. Seega stimuleeriti päevadest 0, 28 ja 56 saadud PBMC-sid kattuvate ZEBOV-peptiidide või kontrollstimulatsiooniga ning rikastati vastavalt aktivatsioonimarkeri ekspressioonile. CD154. CXCR5 + CD4 + T-rakkude sagedus rikastatud populatsioonis suurenes kõigis kolmes vaktsiinigrupis algtasemest (päev 0) (joonis 3). CXCR5 + T-rakkude sagedus oli kolmes kohordis 28. päeval (p <0, 001, ANOVA) ja 56. päeval (p = 0, 009, ANOVA) oluliselt erinev. Ajapunkti ja kohordi vahel oli oluline interaktsioon (p = 0, 001, kahesuunaline ANOVA) (täiendav tabel S1). Päeva 28 ja 56 vahel ei täheldatud olulisi muutusi sageduses. Suure annusega kohordil (kohord 3) oli kõige suurem vastus, kuid kas kõrgemad vastused on seotud cTfh-rakkude muutunud funktsiooni või püsivusega, tuleb veel kindlaks teha.

Image

Kohortidele 1, 2 ja 3 manustati ühekordse IM-ga vastavalt 3x106, 2x107 või 1x108 pfu. Päeva 0, 28 ja 56 lümfotsüüdid stimuleeriti EBOV-peptiididega ja värviti CD3, CD4, CD154, CXCR5 ekspressiooniks. Lahtri graafik tähistab n = 10 isikut vaktsiini kohordi ja ajapunkti kohta. Siin esitatud sagedused on CD154 + (ZEBOV-spetsiifilised) CD4 + CXCR5 + rakud protsentides elujõulises CD3 + PBMC populatsioonis. Statistilised erinevused vaktsiinigruppide vahel leiti 28. päeval (p = 0, 004, ANOVA) ja 56. päeval (p = 0, 013, ANOVA).

Täissuuruses pilt

Image

Kohortidele 1, 2 ja 3 manustati ühekordse IM-ga vastavalt 3x106, 2x107 või 1x108 pfu. Päeva 0, päeva 28 ja päeva 56 lümfotsüüdid stimuleeriti ZEBOV-GP-peptiididega ja rikastati aktivatsioonimarkeri CD154 ekspressiooni põhjal. Lahtri graafik tähistab n = 10 isikut vaktsiini kohordi ja ajapunkti kohta. Vtimisstrateegiat leiate täiendavalt jooniselt S1. Esitatud sagedus on CXCR5 + rakkude protsent rikastatud CD4 + CD154 + T rakkudes. Sagedused olid statistiliselt erinevad kohortide vahel 28. päeval (p <0, 001, ANOVA) ja 56. päeval (p = 0, 009), kuid mitte päeval 0 (p = 0, 78). Tärniga sulgudes on märgitud ajapunktide statistilised erinevused. Üksikasjaliku statistilise analüüsi jaoks vaadake lisa tabelit S1.

Täissuuruses pilt

Vaktsiini annus ja selle mõju cTfh alarühmade diferentsiaalsele induktsioonile

Et täiendavalt uurida erinevusi ZEBOV-GP-spetsiifiliste CD4 + T-raku vastuste koostises ja rakulise vastuse potentsiaalset polariseerumist sõltuvalt vaktsiini annusest, hindasime kemokiini retseptorite (CXCR3 ja CCR6) ekspressiooni, mis on seotud erinevate CXCR5 alamhulgad inimese perifeerses veres 19, 20 . Analüüs näitas cTfh17 rakkude märkimisväärset ülekaalu, millele järgnes cTfh2 ja cTfh1 rakkude alamhulk (joonis 4). Immuniseerimine rVSV-ZEBOV vaktsiiniga suurendas cTfh17 alamhulga sagedust (eriti 3. rühmas), kuid mitte teistes Tfh alamrühmades. Statistilise analüüsi laiendamisel, et hõlmata mõlemad tegurid, ajahetk pärast vaktsineerimist ja vaktsiinigrupp, oli nende tegurite vahel oluline koostoime cTfh17 alampopulatsiooni jaoks (kahesuunaline ANOVA, p <0, 001), kuid mitte cTfh1 ega cTfh2 alampopulatsioonide jaoks. (Lisalaud S2). Alamrühma muutuste kineetika näitab ka seda, et need Tfh alamhulgad säilivad vähemalt, kuna ZEBOV-GP-spetsiifilise cTfh sagedused säilivad 56. päeval.

Image

Seejärel analüüsiti aktiveerimismarkeri CD154 ekspressiooni alusel rikastatud PBMC-d CD3, CD4, CXCR5 ja alamhulga spetsiifiliste markerite CCR6 ja CXCR3 ekspressiooniks voolutsütomeetria abil. Vastused erinevates kohordides (kohord 1 (paneel a, b), kohord 2 (paneel c, d), kohord 3 (paneel e, f)) on näidatud päeva 28 (paneel a, c, e) ja päeva 56 ( Paneelid b, d, f) kastides. Paksus joon iga kasti graafiku kõrval tähistab iga cTfh populatsiooni mediaansagedust 0. päeval. Andmed on väljendatud CD3 + CD4 + CXCR5 + CCR6 - CXCR3 - (Tfh2), CD3 + CD4 + CXCR5 + CCR6 - CXCR3 + absoluutarvudena. (Tfh1) ja CD3 + CD4 + CXCR5 + CCR6 + CXCR3 - (Tfh17) CD4 + CD154 + T-rakkudes (vt täiendav joonis S1 väravate strateegia kohta). Üksikasjaliku statistilise analüüsi jaoks vt lisa tabelit S2.

Täissuuruses pilt

CTfh alamhulkade sageduste ja ZEBOV-GP-spetsiifiliste antikehade tiitrite korrelatsioon

Vaktsiiniga indutseeritud antikehade tiitrite (lisatabel S3) võrdlus cTfh sagedustega näitas olulist korrelatsiooni ZEBOV-spetsiifiliste cTfh rakkude (CD154 + CD4 + CXCR5 + ) vahel 28. päeval (R2 = 0, 372, p = 0, 033) (joonis fig. 5, ülemine rida). Korrelatsioon kaob 56. päeval ja antikehade andmed hilisemate ajapunktide kohta pole veel kättesaadavad. ZEBOV-GP-spetsiifiliste cTfh alamhulkade ja antikehade tiitrite vahelise seose edasisel analüüsimisel leiti 28. päeval Tfh17 tasemete ja antikehade tiitrite vahel ootamatu korrelatsioon (joonis 5, alumine rida, R2 = 0, 422, p = 0, 014) ) ja 56. päev (R2 = 0, 37, p = 0, 031), kuid puudub tähendus Tfh1 ja Tfh2 ning antikehade tiitri suhtes (täiendav joonis. S2).

Image

Jaotusgraafikud, milles võrreldakse ELISA tiitrit (mõõdetuna ELISA ühikut / ml) ja CD154 + CD4 + CXCR5 + (cTfh, ülemine rida) sagedust või CD154 + CD4 + CXCR5 + CCCR6 + CXCR3 - (cTfh17, alumine rida) sagedust 28. päeval (vasak veerg) ja 56. päev (parem veerg). Näidatud on Pearsoni korrelatsioonikordaja R 2 ja p-väärtused. Kõigi kohortide andmed ühendati, et saada suur valim. Antikeha tiitri ja cTfh1 või cTfh2 vahel korrelatsioone ei täheldatud (täiendav joonis 2).

Täissuuruses pilt

Arutelu

Selles uuringus kasutatakse kahe eriti tundliku tehnoloogia kombinatsiooni ja see annab üksikasjaliku ja esimese ZEBOV-glükoproteiini (GP) -spetsiifilise immuunvastuse tsütokiiniprofiili inimestel. Kolm vabatahtlike gruppi said rVSV-ZEBOV vaktsiini suureneva annuse ühe lihasesisese süste. Teisele kohordile antud annus vastab Guinea ringkatsetes kasutatud doosile, mille tulemuseks oli 2014. aasta puhangu ajal väga kõrge kaitseefektiivsus infektsiooni vastu. Kui seda in vitro stimuleeritakse peptiidide kogumiga, mis vastab ZEBOVi järjestustele -GP, vaktsiini annus korreleerus laiema ja keerukama tsütokiini mustriga üha keerukamate assotsiatsioonidega. Madala annuse vaktsiinigrupi (kohort 1) rakkude vastuseid domineeris peamiselt IFN-y sekretsioon. See tsütokiin suurenes vaktsiini annusega, kuid ei korreleerunud positiivselt ühegi kolmest rühma kuuluvate vabatahtlike ühegi teise tsütokiiniga (tabel 1, joonis 1). See aga korreleerus negatiivselt IL-8-ga kohortsis 2 ja lisaks IL-2-ga grupis 3. Kohortides 2 ja 3 vaktsineeritud katsealuste tsütokiinide allkirjad paljastasid kaks peamist korrelatsiooniklastrit: (1) 1. klaster IL-iga -2, IL-12 ja IL-13 - sõltuvalt vaktsiini annusest, kuuluvad sellesse klastrisse kas IL-6 ja IL-10 (kohort 2) või IL-8 (kohort 3). Üldiselt võivad paljud neist teguritest soodustada T-rakkude ja B-rakkude proliferatsiooni, üksteisest sõltumatult. (2) Teine klaster sisaldas IL-1-β, IL-4, IL-10 ja TNF-α. Hüpotees on, et vaktsiini annuse suurendamine põhjustab humoraalseid immuunvastuseid soodustava tsütokiini profiili moonutamist, mida toetavad seroloogilised andmed 13 ja täiendav tabel S3. Tulevaste funktsionaalsete uuringute abil tuleb kindlaks teha nende kahe parameetri vaheline põhjuslik seos. Täiendava ülevaate võib saada tsütokiini tootvate rakkude sugupuu iseloomustamisel. Uuringus kasutasime stimuleeritud PBMC-de kultuuri supernatantide analüüsimiseks ülitundlikku hulgituvastusmeetodit, nimelt Mesoscale platvormi. Sellised hulgilugemise meetodid kajastavad tsütokiini profiile ja tsütokiini absoluutkoguseid populatsiooni tasemel ning iseloomustavad seetõttu individuaalse vaktsiini saaja üldist tsütokiini vastust. Mitmekordistamistestide kasutamine võimaldab immuunvastuse ulatuslikku iseloomustamist piiratud koguse rakkudega, kuid erinevalt rakusiseseid tsütokiini värvimist ei saa tsütokiini / kemokiini tootvate rakkude sageduse ja identsuse osas järeldusi teha. Haruldaste rakkude, näiteks antigeenispetsiifilise cTfh analüüsimisel piiratud koguse proovis, võib nende sagedus olla siiski alla voolutsütomeetri avastamisläve (vaadatud viites 18). Seega piirduvad sellised analüüsid tavaliselt väheste teguritega ega suuda genereerida laia tsütokiini profiili. Selle uuringu jaoks otsisime välja lugemisprotokolli, mida saaks rakendada paljudes vaktsiiniuuringutes, mille korral patsiendi materjali hulk on piiratud, kuid kaitse immuunsuse korrelatsioonide otsimiseks on vaja suure tihedusega andmekogumeid.

Eelnevad prekliiniliste mudelite uuringud on näidanud, et antikehad ja CD4 + T-rakud on seotud kaitsega ZEBOVi vastu, mida vahendab rVSV-ZEBOV vaktsiin 7, 15 . Seega, lisaks tsütokiini profiili iseloomustamisele, püüdsime saada teadmisi funktsionaalsetest CD4 + T-rakkude alamrühmadest, nimelt Tfh-rakkudest, kuna need rakud on T-rakust sõltuva humoraalse immuunvastuse vahendamisel üliolulised. Käesolev uuring iseloomustab funktsionaalseid CD4 + T-raku alamhulki, mis põhinevad varem loodud alamhulkade markeritel 19, 20 . Ehkki cTfh-rakkude täpset fenotüüpi käsitletakse endiselt aruteludes, kasutasime selle vaktsiinikandidaadi immunoloogilisel hindamisel vaktsiinist põhjustatud cTfh-profiili iseloomustamiseks väljakujunenud paneeli 19 . Tavapärase voolutsütomeetrilise analüüsi muutmine oli vajalik, kuna antigeenispetsiifiliste cTfh-rakkude sagedus oli madal (joonis 2), mis oli ootuspärane, arvestades uuringus osalejate immunoloogilist naiivsust ZEBOV-GP suhtes ja immuniseerimist ühe vaktsiiniannusega . Selle väljakutse ületamiseks rikastasime antigeenspetsiifilisi T-rakke, mis põhinesid CD154-l, ja viisime seejärel läbi antigeenispetsiifiliste CD4 + CXCR5 + T-raku alamhulkade põhjaliku iseloomustamise (joonis 3). Liigitasime CD4 + T-raku alamrühmad CXCR5 (kemokiini retseptori, mis juhib leukotsüütide migratsiooni lümfoidsete kudede B-raku sektsioonidesse) ekspressiooni, CXCR3 (ekspresseeritud aktiveeritud T-rakkudes, eelistatult Th1 rakkudes) ekspressiooni põhjal ja CCR6 (ekspresseeritakse) mälu T-rakkudel, eelistatavalt Th17 rakkudel) 21 (joonis 4). Viimati nimetatud rakupopulatsiooni peetakse üha olulisemaks nakkushaiguste vastase immuunsuse mängimisel ja on oletatud, et Th17 rakud mängivad rolli vaktsiinidest põhjustatud immuunmälus. Tfh alampopulatsioonide tegelikku jaotust kudede ja perifeerse vere vahel tuleb veel täielikult kirjeldada (ülevaade viites 22). Ehkki see on teaduslikult oluline, on selle tüübi iseloomustus vähese tähtsusega mis tahes analüüsi kontekstis, mille eesmärk on kirjeldada immunoprofiili, et suunata vaktsiini väljatöötamist, kuna perifeerne veri on selliseks ettevõtmiseks kõige hõlpsamini kättesaadav immuunrakkude allikas. Seega on cTfh-rakkude kasutamine kaitse korrelatsioonide otsimisel, vastupidiselt koe-residentide Tfh-rakkudele, kasutamine 22 22

Tfh17 rakkude roll vaktsiinidest põhjustatud immuunsuses on kujunemisjärgus uurimisvaldkond. Kuni viimase ajani oli neid rakke seostatud valdavalt haiguse progresseerumise ja patoloogiaga, kuid nüüd mõistetakse üha enam, et nad mängivad olulist rolli kaitse vahendamisel mitmesuguste patogeenide 23, 24, 25 vastu ja et neid võivad esile kutsuda peamiselt elusad, nõrgestatud vaktsiinid 23, 26 ja limaskestavaktsiinid 27 . Nii Tfh2 kui ka Tfh17 alamkomplektid on osutunud tõhusaks B-raku abistamisel 20 . Lõpuks tuvastati Tfh2 ja Tfh17 rakkude sagenenud sagedus isikutel, kellel olid laias laastus neutraliseerivad HIV 28 antikehad, mis toetab praegust hüpoteesi, et lisaks Tfh2-le võivad Tfh17 olla olulised ka humoraalsete immuunvastuste edendamisel. Meie andmed näitavad, et rakulised immuunvastused püsivad tõhusalt 56. päeval pärast rVSV-ZEBOVi erinevate annuste ühekordset immuniseerimist (joonis 4). Tulevaste uuringute keskmes peaks olema piiritleda praeguse immunoloogilise analüüsi seost immunoloogiliste parameetritega, mida reguleerib Tfh ja B-rakkude koostoime, eriti antikehade afiinsus ja Fc funktsionaalsus, samuti mälu püsivus.

Vaatlus, et antikehade tiitrid korreleerusid ZEBOV-GP spetsiifiliste cTfh17 rakkude sagedusega (joonis 5), oli ootamatu, kuna traditsiooniliselt arvatakse, et Tfh2 soodustab enamust humoraalsest vastusest. Kuid mõned hiljutised uuringud on näidanud, et IL-17 mängib rolli antikehade vastuste esilekutsumisel, isotüübi ümberlülitamisel ja suguelundite keskpunkti moodustumisel 29, 30 . Lisaks on üha enam tõendeid selle kohta, et Th17 mängib otsustavat rolli bakteriaalsetele, seen- ja viiruspatogeenidele suunatud vaktsiinide põhjustatud reageeringute tagasivõtmisel (vaadatud viites 21). Käesolev uuring laiendab neid teadmisi inimese immuunvastustele ZEBOV-i vastu, millest varem pole teatatud. Me ei saa välistada, et teised T-raku alamhulgad, näiteks Tfh2, eriti lümfikoe germinaalsete keskuste kudedes asuvad rakud, aitavad kaasa antikehade reageerimisele ja võivad seega toimida sünergistlikult cTfh17-ga. Siin esitatud andmed piirduvad vastustega, mida saab mõõta perifeerses veres, ja seega annavad need ainult ZEBOV-i efektiivse vaktsiinivastuse asendusmarkeri.

Mis puutub käesolevas uuringus vaktsiini annusele reageerimisele, siis teistest haigusmudelitest on ülimuslik, et kuigi kõrgete antigeeni annustega immuniseerimisel saadakse antigeenispetsiifilisi rakke sagedamini, on nende rakkude T-raku retseptori (TCR) afiinsus vähendatud 31, 32 . Värske uuring näitab, et antigeeni afiinsus mõjutab suuresti T-raku vastuste diferentseerumist 33 . Näitame vaktsiini annuse silmatorkavat mõju Tfh1 / Tfh2 / Tfh17 suhtele esimest korda inimese ZEBOV-vaktsiini kontekstis. Antigeeni annuse, T-raku vastuse kvaliteedi ja sellest tuleneva Tfh alampopulatsioonide püsivuse vahelise seose mõistmine on vaktsineerimisrežiimide kavandamisel ja vaktsiinide tõhususe parandamisel vaktsiinide tõhususe parandamisel vahetult ZEBOV-i vastu ülioluline.

Tulevaste uuringute eesmärk peaks olema selles uuringus esitatud analüüsi laiendamine, kasutades välitingimustes vaktsineeritud katseisikute proove, samuti ellujäänute tsütokiini ja cTfh vastuste profileerimine. Analüüsipaneeli suurendamine, et hõlmata ZEBOV-spetsiifiliste mälu B-rakkude sageduse hindamine, samuti antikehade vastuse iseloomustamise intensiivistamine seoses immunoglobuliini raske ahela afiinsuse, isotüübi profiili ja isegi glükosüülimismustritega (vaadatud viites 34 ) viib meid veelgi lähemale ZEBOV-vastase kaitse lõpliku korrelatsiooni kehtestamisele, samas kui käesolev uuring kujutab endast olulist esimest hüpet selle eesmärgi saavutamiseks.

Materjalid ja meetodid

Uuringu kujundus ja proovid

Proovid saadi isikutelt, kes osalesid I faasi kliinilises uuringus (NCT02269423), mis viidi läbi kliiniliste uuringute keskuses WRAIR 13 . Meetodid viidi läbi vastavalt kinnitatud suunistele. Kõik katseprotokollid kiitis heaks WRAIR-i inimsubjektide kaitse osakond (WRAIR # 2163) ja kõik uuritavad olid andnud teadliku nõusoleku proovide edasiseks kasutamiseks. Perifeerse vere mononukleaarsed rakud (PBMC) koguti päeval 0 ja erinevatel ajahetkedel pärast vaktsineerimist ning külmutati.

ZEBOV Kikwit GP Consensus peptiidide ühendamine

15-meersed lüofiliseeritud peptiidid (kattuvad 11 aminohappega) osteti firmast Atlantic Peptides (Lewisburg, PA) ja taastati DMSO-s kontsentratsiooniga 10 mg / ml. Seejärel ühendati võrdsed kogused peptiide ja jagati 6 võrdseks alikvoodiks (0, 45 mg iga peptiidi); hüdrofoobsed peptiidid jäeti basseinidest välja.

Inimese 10-pleksiline tsütokiini pro-põletikuline paneel

Iga uuritava subjekti külmsäilitatud PBMC-sid stimuleeriti päevast 0 ja 28 päeva pärast immuniseerimist ZEBOV-GP peptiidikogumitega (15-meersed peptiidid kattuvad 11 AA-ga) lõppkontsentratsioonil 0, 5 μg / ml 48 tunni jooksul. Mesoscale Discovery 10-pleksilise inimese põletikuvastase paneelide komplekt (IL-1β, IL-8, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, IFN-y, TNF- a) kasutati kultuuri supernatantide analüüsimiseks vastavalt tootja juhistele. Plaate loeti QuickPlex SQ120 abil.

Polükromaatiline voolutsütomeetriline värvimine

Päevadest 0, 28 ja 56 saadud külmsäilitatud PBMC-sid kasvatati ZEBOV-GP Megapooliga (kõigi peptiidide kogum) kontsentratsiooniga 1, 0 μg / ml või ainult söötmega (kontrollstimulatsioon). Rakke kasvatati 16 tundi (37 ° C, 5% CO 2 ) täissöötmes (RPMI-1640 (Life Technologies, Waltham, MA)), mis sisaldas 10% inimese seerumit (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA) kontsentratsioon 5 × 107 rakku / ml. Inimesele lisatud CCR6-APC (REA190) ja CD40 (HB14) lisati kultuurile vastavalt lahjendusega 1:10 ja 1: 100. Pärast stimuleerimist pesti rakke ja värviti inimese anti-CD154-biotiiniga (5C8) 15 minutit 4 ° C juures FACS lahuses (0, 5% inimese seerum ja 0, 1% naatriumasiid PBS-is). Rakke inkubeeriti täiendavalt biotiinivastaste mikrohelmestega (ülipuhas, Miltenyi Biotec, San Diego, CA) 15 minutit temperatuuril 4 ° C. Pärast pesemist eelnevalt tiitritud ja optimeeritud antikehade kokteil fluorokroomiga konjugeeritud antikehadega CD3-VioBlue (BW264 / 56), CD4-PerCPVio700 (M-T466), CD185-PEVio770 (REA103), CD183-VioBrightFITC (REA232), REA232 vastu. Lisati -PE (5C8) ja Zombie Aqua Fixable värvaine (BioLegend, San Diego, CA) ja inkubeeriti 45 minutit temperatuuril 4 ° C. Kõik rakukultuuri ja analüüsi jaoks mõeldud monoklonaalsed antikehad osteti firmalt Miltenyi Biotec (San Diego, CA). Pärast pesemist ja resuspendeerimist PBS-is rikastati rakke ja saadi MACSQuant Analyzer 10-ga.

Lülitusstrateegiat on kujutatud täiendavas joonisel 1. Lümfotsüüdid viidi kõigepealt laiali hajumisega ja seejärel elujõulisuse ja põlvnemismarkeri CD3 alusel. Rikastatud antigeenispetsiifilised rakud suleti CD4 ja CD154 koekspressiooni teel, millele järgnes CD4 ja CXCR5 ekspressioon. Rakkudes CD4 + CXCR5 + identifitseeriti alamhulgad veelgi - CCR6 ja CXCR3 ekspressiooni põhjal - kui Tfh1, Tfh2 ja Tfh17 rakud. Kvantitatiivne analüüs viidi läbi kasutades FlowJo 10 (Treestar, Ashland, OR).

Statistiline analüüs

Erinevate kohordide ja ajapunktide andmeid testiti statistilise olulisuse suhtes ANOVA (Minitab tarkvarapakett, Minitab Inc., State College, PA) abil. Tfh sageduste ja antikehade tiitrite korrelatsioonid vastavatel ajapunktidel (päev 0, päev 28, päev 56) määrati Pearsoni korrelatsiooni (Minitab) abil. Korrelatsioonimaatriks / korrelogramm arvutati ja joonistati, kasutades tarkvara R (STHDA veebisait).

Lisainformatsioon

Kuidas seda artiklit tsiteerida : Farooq, F. jt . Tsirkuleerivate folliikulite T abistajarakud ja tsütokiini profiil inimestel pärast vaktsineerimist rVSV-ZEBOV Ebola vaktsiiniga. Sci. Rep. 6, 27944; doi: 10.1038 / srep27944 (2016).

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.