Mere diatomit nakatava viiruse promootorite kirjeldus diatom phaeodactylum tricornutum mudelis | teaduslikud aruanded

Mere diatomit nakatava viiruse promootorite kirjeldus diatom phaeodactylum tricornutum mudelis | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Rakenduslik mikrobioloogia
  • Geenitehnoloogia
  • Molekulaartehnika

Abstraktne

Viiruseid peetakse ookeanide fütoplanktoni populatsiooni kontrolli võtmeisikuteks. Kuid mehhanismid, mis kontrollivad viiruse geeni ekspressiooni silmapaistvates mikrovetikates, näiteks ränivetikutes, jäävad suuresti tundmatuks. Selles uuringus ühendati potentsiaalsetest promootorpiirkondadest, mis olid isoleeritud mitmest mere diatomit nakatavatest viirustest ( DIV ), egfp reportergeeniga ja muudeti Pennales diatomiks Phaeodactylum tricornutum . Analüüsisime nende aktiivsust erinevates tingimustes kasvatatud rakkudes. Võrreldes diatomi endogeensete promootoritega vahendas uudne DIV promootor (ClP1) reporterite transkriptsiooni ja translatsiooni märkimisväärselt kõrgemal tasemel. Nii valguse kui ka pimeduse tingimustes kasvatatud transformantides täheldati stabiilseid ekspressioonitasemeid ja statsionaarse faasi rakkudes täheldati kõrgeid ekspressioonitasemeid võrreldes eksponentsiaalse kasvufaasiga. Samuti leiti konserveerunud motiive DIV promootorite järjestuses. Need tulemused võimaldavad tuvastada uudseid regulatiivseid piirkondi, mis juhivad DIV-geeni ekspressiooni, ja täiendavalt uurida mehhanisme, mis kontrollivad viiruse vahendatud õitsemise kontrolli ränivetikas. Lisaks võib tuvastatud ClP1 promootor olla uudne vahend diatomede metaboolseks konstrueerimiseks. See on esimene aruanne, mis kirjeldab DIV-ide promootorit, mis võib olla kasulik diatomi uuringutes.

Sissejuhatus

Diatoomid on üks tõhusamaid ja mitmekesisimaid üherakulisi fotosünteesivaid eukarüoote, mida võib veekeskkonnas leida kuni 200 000 säilinud liiki 1 . Ränidioomide vastu tuntakse suurt huvi tänu nende olulisele panusele globaalsesse süsiniku tsüklisse ja hapniku tootmisse 2, nende keerulisest evolutsioonitaustast sekundaarsete endosümbiontidena 3 ja nende ainulaadsest võimest toota ränidioksiidil põhinevaid raku seinu 4 . Lisaks on diatomeeridel suur potentsiaal inimtegevuses kasutatavate kasulike kemikaalide allikana, kuna need toodavad biokütuse eelkäijaid nagu rasvhapped ja süsivesinikud, mis võivad osutuda kasulikuks ökoloogiliste probleemide, näiteks energiakriisi lahendamisel. Diatomibioloogia ja diatomi kasutamise võimaluste mõistmiseks biotehnoloogias on viimastel aastatel välja töötatud uudseid genoomilisi ressursse ja molekulaarseid vahendeid. Diatomeemudelite Pennales Phaeodactylum tricornutum ja Centrics Thalassiosira pseudonana genoomijärjestuste andmebaasid ja ekspresseeritud järjestussilt (EST) on avalikkusele kasutamiseks välja antud, võimaldades tuvastada ränimandlite erinevaid metaboolseid tunnuseid 6, 7, 8, 9 . Viimasel ajal on teiste ränide , näiteks Pseudo-nitzschia multiseries (//genome.jgi-psf.org/Psemu1/Psemu1.home.html) ja Fragilariopsis cylindrus (//genome.jgi-psf.org/Fracy1/Fracy1) genoomsed järjestused .home.html) on tehtud kättesaadavaks ka USA energeetikaministeeriumi ühise genoomiinstituudi veebisaidil (//jgi.doe.gov/). Lisaks on mitme räniliigi , sealhulgas Pennales P. tricornutum 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, Cylindrotheca fusiformis 17, 18, Navicula saprophila 19, jaoks välja töötatud geneetilise muundamise meetodid biolistliku pommitamise ja / või elektroporatsiooni abil. Pseudo-nitzschia arenysensis 20, Pseudo-nitzschia multistriata 20, Centrics Cyclotella cryptica 19, Thalassiosira pseudonana 21, Thalassiosira weissflogii 22, Chaetoceros sp. 23, Cha. gracilis 24 ja Fistulifera sp. 25 . Lisaks on hiljuti P. tricornutumi ja Thalassiosira pseudonana 26 jaoks välja töötatud pärmidest saadud järjestustel põhinev episomaalne vektoritehnoloogia.

Paljusid diatomi bioloogiat ja merekeskkonna kasvu kontrollivaid protsesse tuleb siiski veel välja selgitada. Hiljuti tehti ettepanek, et mereviirused mängiksid ränivetikate populatsiooni õitsengu kontrollimisel võtmerolli 27, 28 . Viirused võivad mõjutada ka merekoosluste koostist ja olla peamiseks jõuks biogeokeemiliste tsüklite taga 29, 30 . Siiani on nii Centrics kui ka Pennales diatomitest 28, näiteks Cha, eraldatud mitmed mere diatomiga nakatavad DNA / RNA viirused, mis põhjustavad peremeeste diatomite lüüsi . debiilsust nakatav DNA viirus (CdebDNAV) 31, Cha. lorenzianust nakatav DNA viirus (ClorDNAV) 32 ja Thalassionema nitzschioides nakatav DNA viirus (TnitDNAV) 33 . Nende genoomide ränianalüüs näitas selliste oletatavate avatud lugemisraamide (ORF) olemasolu nagu replikatsiooniga seotud valgu (VP3) geen, struktuurvalgu (VP2) geen ja tundmatu funktsiooniga geenid 28, 32 .

Mere diatomit nakatavate viiruste (DIV) panuse määramiseks fütoplanktoni bioloogiasse ja ökoloogiasse on oluline täiendavalt uurida DIV genoomi ja tuvastada mehhanismid, mis kontrollivad viiruse geeni ekspressiooni viiruse promootorite iseloomustamise kaudu. Lisaks võib DIV-promootori iseloomustamine edendada ka ränivedelikes geeni ekspressiooni manipuleerimist ja moduleerimist. Siiani kasutatakse seda strateegiat peamiselt endogeensete promootorite kaudu, nagu näiteks genooni kodeeriv fukoksantiini klorofülli a / c -siduva valgu (FCP) geen ( fcp , nüüd Lhcf ), mis kodeerib kerge korjekompleksi üleperekonna 10, 18 liikmeid. 21, 24, frustuliin 17, nitraatreduktaas (NR) 18, 21, 24, atsetüül-CoA atsetüültransferaas 24, atsetüül-CoA karboksülaas 19, β-karboanhüdraas 1 (CA1) 34, pika ahelaga rasvhapete atsüül-CoA süntetaas 24, β-tubuliin 24, ATP süntaasi alaühik C 24 ja pikenemistegur 2 (EF2) 16 .

Endogeensetest promootoritest on fcp promootorit sageli kasutatud biotehnoloogilistes rakendustes, mis hõlmavad ränidioomi 35, 36, 37, 38, 39 . Kuid aruanded viitavad ka sellele, et fcp promootori aktiivsus ei pruugi olla piisavalt tugev sissetoodud geenide üleekspresseerimiseks ja see võib soodustada sihtproduktide märkimisväärset suurenemist 35, 39 . Teised uuringud kinnitavad, et transgeeni ekspressioon järgib tsirkadiaanlikku mustrit, kuna fcp promootoris on valgusele reageerivaid cis- regulatoorseid elemente 16, 40, 41 . Mõnel juhul juhivad diatomi endogeensed geenipromootorid liigispetsiifilist transgeeni ekspressiooni ja ei toimi erinevates diatomiliikides 18, 20, 22 . Need probleemid piiravad märkimisväärselt diatomi teisendustehnikate kasutamist, vähendades potentsiaalselt diatomide kasulikkust põhi- ja rakendusuuringutes. Nende probleemide lahendamiseks on oodata selliste promootorite arengut, mis stabiilselt indutseerivad geeni kõrgel tasemel ekspressiooni, mille tulemuseks peaks olema sissetoodud geenitranskriptide ja valkude suurte kogumite loomine. Taimi või imetajaid nakatavate viiruste promootoreid on üldiselt kasutatud paljude kõrgemate taimede ja imetajate transformeerimiseks, võimaldades sissetoodud geenide konstitutiivset ja tugevat ekspressiooni. Näiteks on teada, et lillkapsa mosaiikviiruse 35S (CaMV 35S) ja tsütomegaloviiruse (CMV) promootorid hõlbustavad tõhusalt taimede ja imetajate transformatsioone, vastavalt 42, 43 . Kuid ainult vähesed aruanded keskenduvad diatomide muutmisele CaMV 35S ja CMV promootorite 19, 44 abil P. tricornutumis ja samad promootorid ei tundu olevat tõhusad teiste liikide, näiteks Centrics diatom Cyc puhul. krüptika 19 .

DIV-ide promootorid võimaldavad meil lahendada ülalkirjeldatud piiranguid ränivetikate bioehituses ja tuletada meelde DIV-de ökoloogilisi rolle mereökosüsteemides. Seega eraldati selles uuringus ORF-idest ülesvoolu asuvad potentsiaalsed promootoripiirkonnad, nagu replikatsiooniga seotud valgu (VP3) geen ja DIV genoomis sisalduv struktuurvalgu (VP2) geen (joonis fig 1a). Hinnati Pennales diatom P. tricornutumi DIV promootorit juhtiva geeni ekspressioonivõimet ja võrreldi endogeense fcp promootori omadega (joonis 1b). Seejärel uurisime DIV promootorite stabiilsust erinevates kasvutingimustes kasvatatud rakkudes. Uuriti kasvufaasi, toitainete kontsentratsiooni söötmes ja fotoperioodide mõju viiruse promootori aktiivsusele. Samuti uuriti viiruspromootorite kasutamist Centrics diatomi ja üherakuliste rohevetikate suhtes. Seejärel arutasime DIV promootori struktuuri, et näidata, kuidas geeniekspressioonimehhanismidel võib olla diatomiumi õitsemise kontrollimiseks keskne roll ja kuidas DIV promootorit saab kasutada diatomite rakendusuuringutes.

Image

a ) Transformatsioonivektorite ja teisenduste konstrueerimise ülevaade. Pärast oletatavate ORF-i positsioonide 32 ennustamist määrati ORF-ide ülesvoolu piirkonnad potentsiaalseteks promootorpiirkondadeks. Transformatsioonivektorite konstrueerimiseks kasutati PCR-ga amplifitseeritud potentsiaalseid promootorpiirkondi. Topeltkassettivektor, mis sisaldab reportergeeni egfp, mida juhib iga testitud promootor, ja antibiootikumiresistentset geeni Sh, mida juhib tsüklist saadud fukoksantiinklorofülli a / c- siduva valgu (FCP) A-1A promootoripiirkond . konstrueeriti fusiformis (nimetatakse CffcpA pro.). b ) Projekti edendaja tegevuse hindamine. Promootorite aktiivsus määrati egfp mRNA transkripti taseme ja Sh ble mRNA transkripti suhte suhte keskmistamisel kümnes transformandis, et minimeerida koopiaarvude mõju transgeenide ekspressioonile. Neid transformante kasutati ka eGFP valgu ekspressioonimustrite uurimiseks. CffcpA ter: FCP A-1A geeni terminaatorpiirkond, mis on saadud Cyl. fusiformis . ClorDNA genoomi struktuuri muudeti Tomaru et al. 32 . * Nitraatreduktaasi geeni promootori transformeerimisvektori jaoks kasutasime pNICgfp 18 (täiendav joonis 5a).

Täissuuruses pilt

Tulemused

DIV potentsiaalsete promootorpiirkondade isoleerimine

DIV potentsiaalsed promootorpiirkonnad määrati silikoanalüüside abil CdebDNAV ja TnitDNAV genoomijärjestustest. Kahe DIV ORF-id tuvastati ORF-leiduri abil (Riiklik biotehnoloogia teabekeskus, //www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/). CdebDNAV ja TnitDNAV genoomides tuvastati vastavalt kolm (VP1, VP2 ja VP3) ja kaks (VP2 ja VP3) ORF-i. ClorDNAV-i osas kirjeldasid nelja ORF-i (VP1, VP2, VP3 ja VP4) varem Tomaru jt. 32 (joonis 1a). Prognoositi, et DIV genoomis oletatava ORF translatsiooni initsiatsioonikoodonist (ATG) ülesvoolu olevad piirkonnad (umbes 500 alust) on potentsiaalsed promootorpiirkonnad (tabel 1, joonis fig 1a ja täiendav joonis 1).

Täissuuruses tabel

Transformatsioonivektorite konstrueerimine

Iga ORF potentsiaalset promootorpiirkonda amplifitseeriti polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil, kasutades DIV genoomset DNA-d ja spetsiifilisi praimereid (täiendav tabel 1). Lisaks potentsiaalsetele DIV promootoritele amplifitseeriti P. genoomsest DNA-st P. tricornutumi endogeensed fcp promootorid ja mõned välised promootorid, näiteks CaMV 35S, CMV ja Agrobacterium tumefaciens nopapiini süntaasi geeni ( nos ) promootor. vastavalt trikornutiumi ja kaubanduslikult saadavate vektorite PCR-amplifikatsiooni abil ( lisatabel 1). Iga testitud promootori aktiivsuse uurimiseks konstrueerisime topeltkasseti transformatsioonivektori (joonis 1a), mis sisaldas iga testitud promootori poolt juhitud tõhustatud rohelise fluorestsentsvalgu (eGFP) geeni ( egfp ) ja Sh ble juhitud antibiootikumiresistentset geeni poolt Cyl. fusiformis FCP A-1A geeni promootor (nimetusega CffcpA pro.). Samuti konstrueerisime transformatsiooni efektiivsuse uurimiseks ühe kasseti teisendusvektori, mis sisaldab iga testitud promootori (täiendav joonis 2) ja DIV-promootorite, näiteks CdP1 ja ClP1 (täiendav joonis 3) poolt juhitavat Šlee-d.

Sissetoodud geeni ja promootori kinnitus transformantides

Kolooniad saadi tahkest f / 2 söötmest, mis sisaldas 500 μg ml −1 antibiootikume, pärast selle muundamist topeltkasseti transformatsioonivektorite abil mikroosakestega pommitades. Kahe kasseti sisestamise kinnitamiseks viidi läbi genoomne PCR-analüüs, kasutades erinevaid praimerikomplekte (täiendavad tabelid 1 ja 2 ning täiendavad joonised 4a ja 5a) ning kasutades kolooniaid moodustavaid rakke mallidena. Saime enam kui kümme DNA fragmendi eeldatava pikkusega transformanti, mis sisaldasid testitud promootoriga egfp , välja arvatud pNICgfp 18- ga transfekteeritud transformandid. Kuus pNICgfp 18- ga transfekteeritud transformanti omasid eeldatava pikkusega DNA fragmente, sealhulgas egfp , mis paiknes Cyl-i NR-geeni ( nr ) promootori kontrolli all . fusiformis (nimetatakse Cfnr pro.) ja Sh ble geeniks CffcpA pro all. Kõigi transformantide amplikonide tüüpiline elektrofortogramm on näidatud lisajoonistel 4b ja 5b. Kümme transformanti koos kõigi testitud promootoritega ja kuus transformanti Cfnr proga. analüüsiti edasi.

Promootorite aktiivsuse kvantitatiivne analüüs

Sisestandardi geenile normaliseeritud egfp mRNA transkriptide taseme erinevused (ribosomaalse valgu väikese alaühiku 30S geen, rps ) mRNA transkriptide detekteerimisel kasutati kvantitatiivset pöördtranskriptsiooni PCR-i (qRT-PCR) 6–10 transformandis, kusjuures egfp-d juhib igaüks testitud promootorite kogus (täiendav joonis 6). 6–10 transformandi hulgas leiti ka diatomi endogeense promootori (CffcpA pro.) Ajendatud Sh ble mRNA transkriptide taseme erinevusi rps- ile normaliseerituna (täiendav joonis 6). Enne iga promootori aktiivsuse määramist jagati egfp mRNA transkripti tasemed igas transformandis Sh ble mRNA transkriptide omadega. Seda meetodit on kasutatud geeniekspressioonitasemete võrdlemiseks sõltumatutes ridades ja erinevate väärarengukoopiate arvu ning võimalike saitide integreerimise mõjude tõttu väära tõlgendamise ärahoidmiseks. Joonis 2 näitab promootori aktiivsuse keskmisi väärtusi ja vahemikke 6-10 iseseisvas transformandis, mille egfp juhib iga testitud promootor. Võrdlesime iga testitud promootori ja endogeense promootori PtfcpA pro aktiivsust. sest PtfcpA pro. on üldiselt kasutatud mere diatomi P. tricornutum 10, 11, 13, 39 muundamiseks . Keskmine promootorite aktiivsus Cfnr pro-ga transformantide puhul. ( P = 0, 010), TnP1 ( P = 0, 012), TnP2 ( P = 0, 016), CaMV 35S promootor ( P = 0, 014), CMV promootor ( P = 0, 021) ja nos promootor ( P = 0, 034) (keskmine) : 0, 0833–0, 499) leiti olevat oluliselt madalam kui PtfcpA pro-ga transformantidel. (keskmine: 2, 08, vahemik: 0, 0296-5, 97) (joonis 2). Seevastu leiti, et keskmine promootori aktiivsus ClP1-s (keskmine: 10, 3, vahemik: 2, 06 - 25, 1, P = 0, 0058) oli umbes viis korda kõrgem kui PtfcpA pro korral. (Joonis 2). Keskmine CdP1 (keskmine: 1, 99, vahemik: 0, 0917−7, 34, P = 0, 93) ja ClP2 aktiivsus (keskmine: 3, 09, vahemik: 0, 352 - 21, 4, P = 0, 64) ei näidanud olulisi erinevusi keskmisest PtfcpA pro-st. aktiivsuse tase (joonis 2). CdP1, ClP1 ja ClP2 kümnes transformandis olid maksimaalsed aktiivsuse tasemed kõrgemad kui PtfcpA pro-ga transformantidel. (Joonis 2).

Image

Analüüsiti kümme promootorit sõltumatut transformanti. Promootori aktiivsuse tasemed määrati, jagades egfp mRNA tasemed Sh ble mRNA tasemetega. Ringid tähistavad sõltumatute transformantide keskmisi kolmekordset mõõtmist. Teemandid tähistavad Cfnr pro kuue transformandi keskmisi väärtusi. või teistest promootoritest pärit kümnest transformandist. Pro-less tähistab juhtumeid, kus transformatsioonivektoris ei olnud promootorit egfp geeniga seotud (negatiivne kontroll). PtfcpA pro. näitab positiivset kontrolli transformatsioonivektoris egfp, mida juhib PtfcpA pro. Tärnid näitavad PtfcpA pro-st tuletatud statistiliselt olulist erinevust. transformandid (** P <0, 01 ja * P <0, 05).

Täissuuruses pilt

Kultuuritingimuste mõju DIV promootori tegevusele

Promootorite tegevused reageerivad teadaolevalt keskkonna ja rakusiseste tingimuste muutustele. Kultuuritingimuste ja kasvufaaside mõju uurimiseks kõrgeima aktiivsustasemega DIV promootori (ClP1) aktiivsusele (joonis 2) analüüsiti qRT-PCR abil egfp mRNA taseme arvukust kahes sõltumatus ClP1 transformandis. erinevates kultuuritingimustes (joonis 3). Madala toitainekultuuri tingimustes (f / 10 sööde) oli ClP1 poolt juhitud egfp mRNA transkriptide arv peaaegu identne standardse toitainekultuuri tingimuste (f / 2 sööde) korral esitatud arvuga (joonis 3b). Egfp mRNA transkriptide arv statsionaarses faasis näis olevat kõrgem kui logifaasi korral nii madala kui ka standardse toitainekultuuri tingimustes (joonis 3b). ClP1 suudab statsionaarse faasi ajal efektiivselt juhtida egfp mRNA transkriptide ekspressiooni nii heledas kui ka pimedas (joonis 3b).

Image

a ) Kahe transformaatori kasv ClP1 juhitud egfp- ga f / 10 söötmes ja f / 2 söötmes. ( b ) egfp mRNA suhteline arvukus, mis saadakse egfp mRNA transkripti taseme jagamisel ribosomaalse valgu väikese subühiku 30S geeni ( rps ; sisemise kontrolli geen) mRNA transkriptide tasemega f / 10 ja f / 2 söötmes inkubeeritud ja koristatud erinevad kasvufaasid ja erinevatel aegadel heledal ja pimedal perioodil. Nooled näitavad rakkude kogumispunkte qRT-PCR analüüsi jaoks.

Täissuuruses pilt

EGFP fluorestsentsi tasemed

EGFP reporteri fluorestsents erinevates ülalkirjeldatud transgeensetes liinides kvantifitseeriti voolutsütomeetria abil. Joonis 4 näitab normaliseeritud eGFP fluorestsentsi taset raku suuruse korral 9–10 sõltumatus transformandis, mille egfp juhib iga testitud promootor. Keskmine eGFP fluorestsentsi tase transformaatorites, mis sisaldavad TnP1 ( P = 0, 0071), TnP2 ( P = 0, 012), CaMV 35S promootorit ( P = 0, 0063), CMV promootorit ( P = 0, 021) ja nos promootorit ( P = 0, 012). ) (keskmine: 2, 53–3, 24) leiti olevat oluliselt madalam kui PtfcpA pro-d sisaldavatel transformantidel. (keskmine: 6, 10, vahemik: 2, 21–11, 6) (joonis 4). Statistilise analüüsi tulemused näitavad, et ClP1 sisaldavate transformantide keskmised eGFP fluorestsentsi tasemed (keskmised: 13, 2, vahemik: 2, 52-25, 0, P = 0, 020) olid oluliselt kõrgemad kui PtfcpA pro sisaldavate transformantide puhul. CdP1 (keskmine: 5, 27, vahemik: 2, 38–16, 7, P = 0, 63) ja ClP2 (keskmine: 7, 45, vahemik: 2, 37–31, 8, P = 0, 67) transformantide keskmised eGFP fluorestsentsitasemed ei näidanud olulisi erinevusi muundajad PtfcpA pro-ga. (Joonis 4). Leiti, et eGFP fluorestsentsi maksimaalsed tasemed CdP1, ClP1 ja ClP2 transformantides on kõrgemad kui PtfcpA pro transformantidel. (Joonis 4). EGFP fluorestsentsi tase ilma normaliseerimiseta oli sarnane nendega, mida täheldati fluorestsentssignaalide normaliseerimisel raku suurusega (täiendav joonis 7).

Image

Analüüsiti kümmet sõltumatut transformanti, mis olid saadud erinevatest promootoritest, välja arvatud CaMV 35S promootor. CaMV 35S promootori jaoks analüüsiti üheksat sõltumatut transformanti. Normaliseerimise huvides jagati eGFP fluorestsents raku suurusega, mis hinnati voolutsütomeetria abil saadud edasise hajumise pindalade (FSC-A) väärtuste põhjal. Ringid tähistavad sõltumatute transformantide umbes 10 000 raku keskmist väärtust. Teemandid tähistavad transformantide keskmisi väärtusi. Tärnid näitavad statistiliselt olulisi erinevusi, mis tulenevad PtfcpA pro-st. transformandid (** P <0, 01 ja * P <0, 05). Katkendjoon tähistab 488 nm juures ergastatud metsiktüüpi rakkude autofluorestsentsi taset.

Täissuuruses pilt

Transformatsiooni efektiivsus DIV promootorite abil

Samuti hindasime, kas selles uuringus tuvastatud erinevad promootorid võivad mõjutada transformatsiooni efektiivsuse taset P. tricornutumis . Sel eesmärgil PtfcpA pro juhitud selektiivset markerit Sh ble sisaldavad ühe kasseti vektorid. või ClP1 (täiendav joonis 2) viidi P. tricornutum'i mikroosakeste pommitamise teel. PtfcpA pro keskmised transformatsiooni efektiivsused. ja ClP1 saavutas vastavalt 13 ja 13, 5 transformanti 108 raku kohta (n = 4). Moodustatud kolooniate arvul põhinev statistiline analüüs näitas, et transformatsiooni efektiivsus, kasutades PtfcpA pro. ja ClP1 ei olnud oluliselt erinevad.

Diatomit nakatavate DIV promootorite rakendamine teistele vetikatele

Uurisime, kas DIV promootorit võib rakendada ka sellistele Centrics diatomide liikidele nagu Chaetoceros sp. Tüvi CCK09. Selleks analüüsisime selle liigi transformatsiooni efektiivsuse taset, kasutades ühe kasseti vektoreid koos DIV promootorite CdP1 ja ClP1 ajendatud antibiootikumiresistentse geeniga (täiendav joonis 3). Chaetoceros sp.-Le transfekteeritud CdP1 ja ClP1 keskmised transformatsiooni efektiivsused olid vastavalt 4 ja 2 transformanti 108 raku kohta (n = 3).

Uuriti ka DIV promootorite aktiivsuse taset üherakulistel rohevetikatel Chlamydomonas reinhardtii - liigil, mis fütogeneetiliselt erineb ränivetikest. Testis kasutati ühe kasseti vektoreid, milles She ble'i ajendas DIV promootor (näiteks CdP1 ja ClP1) või Chlamydomonas endogeenset promootorit rbcS2 (pSP108) 45 . Transformatsiooniks kasutati standardset elektroporatsioonimeetodit 46 ja seinata Chlamydomonas tüve CC503. PSP108 transformatsiooni efektiivsus registreeriti 168 transformandi juures 2, 5 x 107 raku kohta (n = 14). Seevastu CdP1 ja ClP1 kaudu leitud keskmine transformatsiooni efektiivsus registreeriti vastavalt 0 ja 0, 14 transformandil 2, 5 x 107 raku kohta (n = 14). Viiruse promootorite abil saadud transformatsiooni efektiivsuse tasemed ei erinenud oluliselt promootorivaba vektori omadest (keskmine: 0 transformanti, n = 14).

DIV promootorpiirkondade in silico analüüsid

Otsisime DIV-i promootoritest potentsiaalseid cis- regulatoorseid elemente, kasutades programme PLACE 47 ja PlantCARE 48 . Mõlemad programmid paljastasid Myb 49, bZIP 50, CCAAT-siduva 51, homeobox 52 ja E2F-DP 53-ga seotud transkriptsioonifaktorite (TF) cis- regulatoorsete elementide olemasolu (mis on juba leitud Pennalesi P genoomsest järjestusest) tricornutum ja Centrics Thalassiosira pseudonana 54 ) DIV promootorites (täiendav joonis 1). Programm PlantCARE 48 näitas ka seda, et kõik DIV promootoripiirkonnad sisaldavad taimetüüpi valgusele reageerivat cis- regulatoorset elementi (täiendav joonis 1). Muude DIV-i ja endogeensete promootorite seas säilinud regulatiivsete järjestuste tuvastamiseks uurisime JASPAR-i andmebaasis 55 saadaval olevate TF-i siduvate saitide (TFBS-ide) sagedust oPOSSUM-i versiooni 3 abil promoomeomealüüside 41 abil. OPOSSUM versiooni 3 ühe saidi analüüsi (SSA) algoritm ei suutnud tuvastada TFBS-i konsensust DIV-promootorite ja P. tricornutumi võimalike promootoripiirkondade vahel. Kasutades TFP klastrianalüüsi (TCA) algoritmi, mis on saadaval oPOSSUM versioonis 3, tuvastati viies DIV promootoris ja P. tricornutumi 99, 9% potentsiaalse promootori piirkonnas mõnede putukate ja selgroogsete tüüpi homeoboxi sidumissaitide järjestuste motiivid (12 234 12 237 järjestust, Z-skoor: 14, 406, Fisheri skoor: 0, 001) (täiendav joonis 1 ja täiendavad andmed). DIV-promootoritelt ekspressiooni juhtivate konkreetsete mehhanismide kohta teabe saamiseks proovisime leida konserveerunud motiive DIV-promootoripiirkondade (CdP1, ClP1 ja ClP2) hulgast, kasutades konsensusmotiivide leidmise algoritmi (CONSENSUS), mis on saadaval Melina II 57 kaudu ja kasutades vaikimisi parameetrid. Järjestus „GGCAGGCG” tuvastati CONSENSUS-algoritmi abil CdP1, ClP1 ja ClP2-s. ClP1 mõttesfääris on kolm GGCAGGCG motiivi tandemi kordust, mis on järjestatud vahemikust 5 ′ kuni 3 ′ (täiendav joonis 1). ClP2-s on kolm tandemikordust, motiivide suund on vahemikus 3 ′ kuni 5 ′. CdP1 sensoorses ahelas leiti ainult üks motiiv suunda 5 'kuni 3' (täiendav joonis 1).

Arutelu

See on esimene aruanne, mis kirjeldab erinevate DIV-idest tuvastatud ja isoleeritud promootorite funktsionaalset iseloomustamist. Testisime viiruse promootori aktiivsuse taset spetsiifiliste vektoritega transformeeritud diatomirakkudes, kus viiruse promootor ajas eGFP reportergeeni ekspressiooni. Iga testitud promootori aktiivsust hinnati eGFP geeni transkripti suhtelisest arvukusest võrreldes endogeense fcp promootori juhitava antibiootikumiresistentse geeniga (joonis 1b). Omakorda tuvastasime sõltumatute transgeensete liinide vahel tugevaimad promootorid ja lahendasime geeniekspressiooni varieeruvuse probleemid, mis võivad olla tingitud peremeesgenoomi 58 integreeritud transgeenide koopiate arvu erinevustest ja sissetoodud vektori positsioonist genoomis, st, positsiooniefekt 59 . Sarnastest erinevustest on teatatud ka mitme promootori iseloomustamisel 60 . Lisaks kasutati eGFP valgu fluorestsentsi taseme varieerumist translatsiooniefektiivsuse võimalike erinevuste hindamiseks erinevates transgeensetes liinides. Need analüüsid võimaldasid meil esimest korda näidata, et eraldatud DIV promootorid on P. tricornutumis funktsionaalsed. Eelkõige leidsime, et ClorDNAV 32- st tuletatud oletatava replikatsiooniga seotud (VP3) geeni ClP1 promootor juhib reporteri stabiilset ekspressiooni rakkudes, mis on kasvatatud nii heledas kui ka pimedas tingimustes, ning see näitab kõrgemat aktiivsuse taset kui diatom endogeenne promootor.

Huvitav on see, et viiruse promootorite aktiivsuse taset võib kasvufaasis tugevalt muuta. Schizosaccharomyces pombis indutseeritakse CaMV 35S promootori vahendatud geeniekspressioon pigem logifaasi kui statsionaarse faasi 61 ajal . Meie uuringus indutseeriti ClP1-ga kontrollitud reporteri ekspressioon pigem P. tricornutumi kasvu statsionaarses faasis kui logi faasis. Vastavalt meie andmetele uurimus Cha-i suhetest . tenuissimuusi nakatav DNA viirus (CtenDNAV) II tüüp ja Cha kasvufaas . tenuissimus näitas, et kui CtenDNAV II tüüpi inokuleeritakse peremeesrakkudesse statsionaarses faasis, siis peremeesraku kogused vähenesid päev pärast inokuleerimist 28 . Logifaasis olevates peremeesrakkudes toimus peremeesraku koguste vähenemine alles pärast seda, kui rakud jõudsid statsionaarsesse faasi 28 . I tüüpi CtenDNAV nakkavus oli samuti märkimisväärne, kui peremeesorganism oli statsionaarses faasis 62 . Peale selle täheldati I tüüpi CtenDNAV viiruse genoomi aktiivset replikatsiooni pärast seda, kui peremeesrakud jõudsid statsionaarsesse faasi 62 . Need tulemused kokku viitavad sellele, et DIV promootori aktiveerimine statsionaarses faasis peremeeslooma diatomis võib hõlbustada diatomi lüüsi. Ehkki geeniekspressiooni reguleerimine DIV promootorite poolt P. tricornutumis ei ole täielikult mõistetav, viitavad need leiud sellele, et DIV geeni ekspressiooni kontrollivate mehhanismide parem mõistmine võib viia ookeanide DIV-de tugevama arusaamise järgi ränivedeliku populatsiooni kontrolliprotsessidest.

Meie hinnang viiruse promootori aktiivsusele võimaldas meil ka tuvastada ClP1 kui uudset DIV promootorit, mis juhib tugevat ja stabiilset geeniekspressiooni räniveres. ClP1 on kasulik tööriist, mida saab kasutada diatomibiotehnoloogia rakendustes kasulike materjalide kõrgel tasemel tootmisel ja geenifunktsionaalsete diatomite geenifunktsioonide uurimisel 63, 64 . Hiljuti P. tricornutum 16- st eraldatud "stabiilse" endogeense EF2 geeni promootori aktiivsus suurendas 1, 2 korda tugevama transgeeni ekspressiooni kui see, mida fcp promootor ajendas kergetes tingimustes 16 . Võrdluseks leiti, et ClP1 transformantides rf-le normaliseeritud egfp mRNA tase oli 3, 3 korda tugevam kui PtfcpA pro-l. transformandid (täiendav joonis 6). See tulemus viitab sellele, et ClP1 võib indutseerida transgeenide tugevamat ekspressiooni kui EF2 geeni promootor kogu fotoperioodi vältel. Lisaks püsib ClP1 aktiivsus stabiilsena madala toitainesisaldusega kultuuritingimustes. Stabiilse ClP1 aktiivsuse taseme kombinatsioon kerge / pimeda tsükliga madalates toitaineoludes ja kõrge ClP1 aktiivsuse tase statsionaarses faasis võivad omada väärtust biotehnoloogilistes rakendustes.

Arutledes selle üle, kas DIV promootoreid saab kasutada erinevate räniliikide puhul, on oluline arvestada ränivetikate fülogeeniat, mis koosneb kahest järjekorrast Pennales ja Centrics 1, 65 . Selles uuringus leiti, et ClP1 saab rakendada nii Centrics diatom Chaetoceros sp. ja Pennales diatom P. tricornutum viitavad sellele, et DIV promootoripiirkond sisaldab konserveerunud regulatoorseid elemente, mida võib ära tunda Pennalesi ja Centricsi liikides tuvastatud konserveeritud TF-de kaudu 54 . Arvestades fülogeneetilist suhet, TF-perekondade säilitustasemeid Pennalesi ja Centricsi ränide vahel ning meie tulemusi, võib DIV promootoreid, sealhulgas ClP1, kasutada erinevate räniliikide puhul.

Mõlemad DIV promootorid CdP1 ja ClP1 on pärit Chaetoceros spp., Kuigi P. tricornutumi transformatsiooni efektiivsus leiti olevat kõrgem kui Chaetoceros sp. Teatati, et P. tricournutum 13 endogeense fcp promootori abil mitme impulsi elektroporatsiooni abil saadud transformatsiooni efektiivsus oli umbes 10 korda kõrgem kui Chaetoceros gracilis 24 oma, mis viitab sellele, et Chaetoceros on transformatsiooni efektiivsuse tase madalam kui Phaeodactylumis, sõltumatult transgeeni ekspressiooni juhtimiseks kasutatud promootori osa. ClP1 seevastu ei saa rohelistes vetikates Chl toimida . reinhardtii , viidates sellele, et promootorpiirkondade ja transkriptsiooniregulaatorite regulatoorsed elemendid erinevad Heterokonti ja Plantae liini vahel.

DIV promootorite in silico analüüsi abil uurisime konserveerunud motiive, mis võivad olla seotud diatomiviiruse geeniekspressiooni algatamisega. Paikselt koosnevad eukarüootsed promootorid kahest piirkonnast: tuuma regioonist ja ülesvoolu reguleerivast piirkonnast 66 . Tuuma piirkond koosneb umbes 50 - 100 aluspaari (bp) järjestusest. See hõlmab transkriptsiooni alguskohta, mida nimetatakse initsiaatoriks (Inr), ja külgnevaid järjestusi, näiteks TATA kast 67 . Regulatiivne piirkond sisaldab cis- regulatoorseid elemente, mis kontrollivad geeniekspressiooni interaktsiooni kaudu TF-dega 66 . Cis- regulatoorsed elemendid vahendavad indutseeritavat, koespetsiifilist või arenguetapispetsiifilist geeniekspressiooni 66 . Inr-järjestuste osas on mõnede euküootide 67, 68, 69 osas leitud Inri konsensus. Põhinedes P. tricornutumi transkriptsiooni alguskohale, on mõnede FCP geenide 70 ülesvoolu piirkondadest toodud transkriptsiooni alguskohti ümbritsev konserveerunud järjestus (CAY +1 A, degenereerunud alused on kirjeldatud vastavalt IUPAC nukleotiidikoodile). Lisaks leiti, et P. tricornutumis CA1 geeni ( ca1 ) transkriptsiooni alguskoha suhtes 2 - +2 järjestused on CACA 34 . Keskendusime CAYA ümbritsevatele järjestustele, mis asuvad FCP geenide ülesvoolu DNA järjestuses, ja diatomide teisi endogeenseid geene uuriti visuaalse vaatluse abil. Leidsime P. tricornutum FCP geenides, näiteks fcpC , fcpD ja fcpE ning P. tricornutum CA1 geenides (TCAH 1 W) Inr-taolise järjestuse, mis asub translatsioonipaiga bp 26–61 vahel (geenid fcpC , fcpD ja fcpE ja P. tricornutum CA1) (täiendav tabel 3). Testitud DIV promootoripiirkondades leidsime ka selle Inr-taolise järjestuse bp 14–65 vahel kavandatud translatsiooni kohast ülesvoolu (CdP1: 14 ja 35 ülesvoolu, ClP1: 36 ja 61 ülesvoolu, ClP2: 40 ülesvoolu, TnP1: 35 ülesvoolu) ja TnP2: 65 ülesvoolu) (lisatabel 3 ja täiendav joonis 1). „TCAH +1 W” universaalsuse määramiseks P. tricornutum geenide 5′-külgnevates järjestustes (80 alust) otsisime 12, 237-st 5'-külgnevast järjestusest “TCAH +1 W” ja leidsime “ TCAH +1 W ”8 306-s 12 237 järjestusest (67, 9%) P. tricornutum geenide potentsiaalsest promootorpiirkonnast. Nendest leidudest esitleme uut konsensuse motiivi “TCAH +1 W”, mis on diatomis potentsiaalne Inri-sarnane järjestus.

Teiste DIV ja endogeensete promootorite seas konserveerunud regulatoorsete järjestuste tuvastamisel leidsime promootoromeetrilise analüüsi abil viiest DIV promootorist ja P. tricornutumi 99, 9% potentsiaalsest promootorpiirkonnast mõnede putukate ja selgroogsete tüüpi homeoboxi sidumissaitide järjestuste motiivid. 41 . See leid näitab, et need motiivid võivad mängida rolli P. tricornutumi transkriptsioonis.

Lisaks kanooniliste cis- regulatoorsete elementide olemasolu paljastamisele on mitmed uuringud teatanud ka muude cis- regulatoorsete elementide olemasolust diatomi endogeensetes geenipromootorites. P. tricornutumi ca1 promootorist pärinevad kolm oletatavat cis- regulatoorset elementi , mis reageerivad muutustele CO 2 ja cAMP kontsentratsioonides, 34, 71 . Kaks raua suhtes reageerivat konserveerunud cis- regulatoorset elementi leiti raua nälgimisega indutseeritud valgugeenide ülesvoolu DNA järjestustes P. tricornutum 72-s . Leiti, et FCP geenide ekspressioonitasemed võnguvad ööpäevase vastusena fcp promootori 40, 41, 73, 74, 75 taimes tüüpi valgusele reageerivale cis- regulatoorsele elemendile. CO 2 / cAMP 71 või raua 72 cis- regulatoorseid elemente ei leitud visuaalse vaatluse teel üheski DIV promootori piirkonnas. Programm PlantCARE 48 näitas, et kõigil DIV promootoripiirkondadel on taimse tüüpi valgustundlik cis- regulatoorne element. Kuid valguse ja pimeduse tsüklid ei mõjutanud ClP1 aktiivsust (joonis 3), mis viitab sellele, et tuvastatud elemendid ei reageeri valgusele. Samuti leiti, et EF2 geeni promootori aktiivsus on P. tricornutumis stabiilne kogu valguse ja pimeduse tsüklites. EF2 geeni promootorpiirkonna järjestuses tuvastati PlantCARE programmi 48 kaudu ka taimeliiki valgusele reageeriv cis- regulatoorne element, mis toetab arvamust, et taimetüüpi valgusele reageerivad cis- regulatoorsed elemendid ei suuda valgusele reageerida aastal P. tricornutum .

Järjestus „GGCAGGCG” tuvastati CONSENSUS-algoritmi abil CdP1, ClP1 ja ClP2-s. Selle konsensuse motiivi kogus, suund ja lähedus varieerusid nende promootorite vahel. ClP1, millel oli kõrgeim promootori aktiivsuse aste (joonis 2), sisaldas kolme GGCAGGCG motiivi tandem-kordust mõttesuunalises ahelas suunas 5'-3 '. ClP2 jaoks, mis näitas tagasihoidlikku aktiivsust (joonis 2), leiti suund 3'-5 'isegi siis, kui promootoripiirkonnas oli kolm tandemi kordust (täiendav joonis 1). CdP1 sensoorses ahelas leiti ainult üks motiiv, mis näitas ka tagasihoidlikku aktiivsust (joonis 2 ja täiendav joonis 1). Nina ja CMV promootorite antisenss-ahelates leiti aga vastavalt üks ja kolm “GGCAGGCG” järjestust, mis näitasid nende väga nõrka aktiivsust (joonis 2). Viimasel juhul on kolm motiivi hajutatud promootoripiirkonda (täiendav joonis 8). Need leiud viitavad sellele, et uudse konsensuse motiivi kogus, suund ja lähedus võivad tugevalt mõjutada promootori aktiivsuse stabiilsust hele / pimedas tsüklites ja promootori kõrgetasemelise aktiivsuse taset statsionaarses faasis P. tricornutumis . Lisaks ülalkirjeldatud motiividele võivad DIV-de promootorpiirkondades nagu ClP1 esineda tundmatuid uusi motiive.

Kokkuvõtlikult võib öelda, et meil on esimest korda isoleeritud promootorid mitmest merepiirkonna DIV-st. ClP1 DIV promootori aktiivsus transformantides oli statsionaarses faasis kõrgem kui logi faasis. Võrreldes diatomi endogeense promootoriga näitas vahendatud ClP1 reporteri transkriptsiooni ja translatsiooni märkimisväärselt kõrgemat taset. DIV promootorite järjestustes leiti konservatiivsed motiivid. Lõpuks võivad meie leiud aidata selgitada DIV-geeni ekspressiooni mehhanismi, mis võib mängida võtmerolli ookeanide ränivetikate õitsemise moodustamisel / lagunemisel. Lisaks peaksid teatatud stabiilsed ja kõrged ClP1 promootori aktiivsuse tasemed olema kasulikud diatomide metaboolseks kujundamiseks.

Meetodid

Vetikukultuur

Pennales P. tricornutum Bohlin (Jaapani kalandusuuringute agentuuri vesiviljeluse riiklik teadusinstituut, tüvi NRIA-0065), Centrics Chaetoceros sp. (Jaapani mereteaduse ja tehnoloogia keskus, Jaapan, tüvi CCK09) 23 ja üherakulised rohelised vetikad Chl. Selles uuringus kasutati reinhardtii (tüvi CC-503). P. tricornutum kasvatati temperatuuril 20 ° C valguse ja pimeduse tsüklis 12 h valguses ja 12 h pimedas ca. 90 μmol footonid m −2 s −1 vedelas f / 2 keskkonnas 76 . Chaetoceros sp. kasvatati temperatuuril 20 ° C pideva valgustuse tingimustes 300 μmol footonite m −2 s- 1 juures SWM3 söötmes 77 . Chl. reinhardtii tüve CC-503 tarnis Chlamydomonas Resource Center (Minnesota ülikool). Rakke kasvatati mixotroofiliselt 25 ° C juures Tris-atsetaatfosfaadi (TAP) söötmes 78 pideva valge fluorestsentsvalguse tingimustes (84 μmol footonid m −2 s −1 ), loksutades õrnalt.

DIV promootorpiirkondade eraldamine

DIV-d ja viiruse genoomi järjestused eraldati meetodil, mida on kirjeldanud Tomaru et al. 32 . Lühidalt - 450 ml eksponentsiaalselt kasvavat diatomikultuuri inokuleeriti 5 ml DIV suspensiooniga ja lüüsiti. Lüsaat filtriti rakujäätmete eemaldamiseks läbi 0, 4 μm poorisuurusega polükarbonaatmembraanifiltri (Whatman®; GE Healthcare UK Ltd., Buckinghamshire, Inglismaa). Filtritud lüsaat segati polüetüleenglükooliga 6000 (lõppkontsentratsioon: 10 massiprotsenti; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Jaapan) ja segu hoiti öö läbi pimedas temperatuuril 4 ° C. Viiruseosakeste kogumiseks pesti sade pärast tsentrifuugimist kiirusel 57 000 x g 4 ° C juures 1, 5 tundi, tsentrifuugiti 4 tundi temperatuuril 217 000 x g ja pH 4, 2 temperatuuril pH 7, 2. Viiruse genoomne DNA ekstraheeriti graanulitest, kasutades DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN Inc., CA) vastavalt tootja juhistele. Me eraldasime kolm viirusgenoomi: CdebDNAV 31 genoom, ClorDNAV 32 genoom ja TnitDNAV 33 genoom. ClorDNAV 32 ORF-id on identifitseerinud Tomaru jt. 32 . Tuvastasime CdebDNAV 31 ja TnitDNAV 33 ORF-id ORF-i leidja abil, järgides meetodit, mille on kirjeldanud Tomaru et al. 32 . ORF-ide ülesvoolu regioonide fragmente, nagu replikatsiooniga seotud valgu (VP3) geen ja promootorregioonidena struktuurvalgu (VP2) geen (joonis fig 1a), amplifitseeriti PCR abil. Eraldatud viiruse promootorid ja promootorite allikad on kokku võetud tabelis 1. Selles uuringus kasutatud praimerid on toodud lisas tabelis 1. Kõiki DNA fragmente, sealhulgas promootoripiirkondade fragmente, amplifitseeriti, kasutades PrimeSTAR ® GXL DNA polümeraasi ( Takara Bio Inc., Otsu, Jaapan) vastavalt tootja juhistele.

DNA fragmentide võimendamine vektorite konstrueerimiseks

Transformatsioonivektorite (joonis 1 ja täiendavad joonised 2 ja 3), DNA fragmentide, mis sisaldavad erinevaid promootorpiirkondi, reportergeeni ( ntfp ), antibiootikumiresistentsete geenide, näiteks bleomütsiiniresistentse geeni ( Sh ble ) ja nourseothricin-resistentsete, konstrueerimiseks geen ( nat ) ja terminaatorpiirkond klooniti Gateway® Pro doonorvektoritesse, kasutades Gateway® kloonimissüsteemi vastavalt MultiSite Gateway® Pro (Life Technologies Corporation, CA) juhistele iga fragmenti sisaldavate sisestusvektorite valmistamiseks. PtfcpA pro., CaMV 35S promootorit, CMV promootorit ja nos promootorit sisaldavad DNA fragmendid amplifitseeriti tüve P. tricornutum UTEX 646 genoomsest DNA-st (vetikate kultuurikollektsioon (UTEX, Texase ülikool Austinis)) ), pCAMBIA2301 (CAMBIA: rahvusvahelise põllumajanduse molekulaarbioloogia rakenduskeskus, Canberra, Austraalia), phMGFP (Promega, WI) ja pBI101.2 (Clontech, CA); neid kasutati mallidena. Egfp fragment amplifitseeriti matriitsina pNICgfp 18- st. Cyl- ist saadud FCP A-1A geeni terminaatorpiirkond . fusiformis (nimetatakse CffcpA ter.) amplifitseeriti matriitsina ka pNICgfp 18- st. Thalassiosira pseudonana'st (mida nimetatakse Tpfcp ter.) Saadud FCP geeni terminaatorpiirkond amplifitseeriti matriitsina pTpfcp / nat 21-st . Antibiootilised geenid, Sh ble ja nat , amplifitseeriti mallidena pNICgfp 18 ja pTpfcp / nat 21 . Kõiki DNA fragmente amplifitseeriti, kasutades PrimeSTAR ® GXL DNA polümeraasi (Takara Bio Inc., Otsu, Jaapan), kusjuures praimer lisati Gateway ® süsteemi att- saitidele (täiendav tabel 1) vastavalt tootja juhistele. Amplikonid puhastati agaroosgeeli elektroforeesi abil, kasutades QIAquick® geeli ekstraheerimise komplekti (QIAGEN Inc., CA).

Topeltkassettivektorite konstrueerimine

Promootorite aktiivsuse taseme hindamiseks erinevate transgeeni koopiate koguste ja võimalike saidi integreerimise efektide põhjal koostasime topeltkasseti vektorid, nagu on näidatud joonisel 1, kasutades Gateway ® kloonimissüsteemi vastavalt MultiSite Gateway ® Pro juhistele (Life Technologies Corporation, CA) ). Sisenemisvektorite, mitmesuguste promootorpiirkondadega DNA fragmentide, reportergeeni ( ntfp ) ja CffcpA ter valmistamiseks. klooniti vastavalt pDONR221P1-P4, pDONR221P4r-P3r ja pDONR221P3-P2, kasutades ensüümide segu Gateway® BP Clonase ® II (Life Technologies Corporation, CA) vastavalt juhistele, mis on määratud ettevõttele MultiSite Gateway ® Pro (Life Technologies Corporation, CA). Juhtudel, mis hõlmavad promootorivaba vektori konstrueerimist, on egfp geen ja CffcpA ter. klooniti vastavalt pDONR221P1-P5r ja pDONR221P5-P2. Topeltkassettvektorite konstrueerimiseks valmistati sihtvektor, kloonides Gateway® kloonikasseti ja lugemisraami kasseti A (Life Technologies Corporation, CA) pCfcpble 18 Kpn I saiti, mis sisaldas antibiootikumi geeni Sh ble CffcpA pro. LR rekombinatsioonireaktsioonid, mis võimaldavad kolme (promootor-reportergeeni terminaator) või kahte fragmenti (reportergeeni terminaator) rekombineerida sisendvektorist sihtvektoriks, viidi läbi Gateway ® LR Clonase ® II PLUS ensüümsegu abil (Life Technologies Corporation, CA) vastavalt juhistele, mis on määratud ettevõttele MultiSite Gateway ® Pro (Life Technologies Corporation, CA). Lõpuks konstrueerisime transformatsioonivektori, mida on kirjeldatud kui testiga Pro / EGFP / Cffcp Ter (P-ble) (joonis 1a). Cfnr pro. Promootori aktiivsuse testimiseks kasutasime pNICgfp 18 (täiendav joonis 5a).

Üksikassettide vektorite konstrueerimine

Transformatsiooni efektiivsuse määramiseks konstrueeriti lisajoonistel 2 ja 3 näidatud ühe kasseti vektorid, järgides topeltkasseti vektorite konstrueerimise meetodit. Antibiootikumi geenid ( Sh ble ja nat ) ja terminaatori piirkonnad (CffcpA ter. Ja Tpfcp ter.) Klooniti vastavalt pDONR221P4r-P3r ja pDONR221P3-P2 vastavalt MultiSite Gateway ® Pro juhistele (Life Technologies Corporation, CA). . Promootorivaba vektori konstrueerimiseks klooniti antibiootikumigeen ja terminaator vastavalt pDONR221P1-P5r ja pDONR221P5-P2. Ühe kasseti vektorite konstrueerimiseks valmistati sihtvektor, kloonides Gateway ® kloonimiskasseti, lugemisraami kasseti A (Life Technologies Corporation, CA) pBluescripti SK (-) Eco RI saiti (Agilent Technologies, CA). . LR rekombinatsioonireaktsioonid, mis võimaldavad kolme fragmendi (promootor-antibiootikumi geeni terminaator) või kahe fragmendi (antibiootikumi geeni terminaator) rekombineerimist sisendvektorist sihtvektorisse, viidi läbi Gateway LR Clonase II PLUS ensüümsegu abil ( Life Technologies Corporation, CA) vastavalt MultiSite Gateway ® Pro (Life Technologies Corporation, CA) juhistele. Lõpuks konstrueerisime ühe kasseti vektorid (täiendavad joonised 2 ja 3). P. tricornutumi muundamiseks kasutatakse PtfcpA pro. ja ClP1 uuriti. Chaetoceros sp. ja Chl. uuriti reinhardtii CC-503, CdP1 ja ClP1.

P. tricornutumi transformatsioon

Transformatsioonivektorid viidi P. tricornutum rakkudesse kasutades Biolistic PDS-1000 / He osakeste kohaletoimetamise süsteemi (Bio-Rad Laboratories, CA) vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetodile 10, 12, 23 . Ligikaudu 1 × 10 8 rakku laotati keskosale, kattes ühe kolmandiku tahke f / 2 söötme plaadist, mis sisaldas 1% agaroos-HGS-i (Nacalai Tesque, Kyoto, Jaapan) ca. 1 tund enne pommitamist. Plaat paigutati pommitamiseks teisele tasemele (6 cm kaugusel peatamisekraanist) Biolistic kambris. Volframiosakesed M17 (läbimõõt 3 mg, läbimõõt 1, 1 μm, Bio-Rad Laboratories, CA) kaeti tootjapoolsete juhiste kohaselt viieks laskmiseks 5 μg transformatsioonivektoriga CaCl2 ja spermidiini juuresolekul. Seejärel pommitati rakke 600-ng DNA-ga kaetud volframiosakestega, kasutades kahekihilist 650 psi (1300 psi) rebendketta. Pärast pommitamist koguti rakud plaatidelt ja inkubeeriti vedelas f / 2 söötmes standardsetes kasvutingimustes 24 tundi. P. tricornutum kultuurid kontsentreeriti tsentrifuugimise teel ja resuspendeeriti 100 μl f / 2 söötmes. Rakususpensioonid laotati tahke f / 2 söötme plaatidele, mis sisaldasid 0, 5% agaroosi HGS-i (Nacalai Tesque, Kyoto, Jaapan), millele oli lisatud 500 μg ml −1 Zeocin TM (InvivoGen, CA). Pärast 5-nädalast selektiivset inkubeerimist standardsetes kasvutingimustes ekstraheeriti plaatidele moodustunud üksikud kolooniad plaatina silmuse abil ja suspendeeriti vedelasse keskkonda 300 μg ml- 1 Zeocin TM-ga .

Chaetoceros sp

Ühe kasseti vektorid Centrics diatomite transformeerimiseks (täiendav joonis 3) viidi Chaetoceros sp. rakud, kasutades Biolistic PDS-1000 / He osakeste kohaletoimetamise süsteemi (Bio-Rad Laboratories, CA) vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetodile 23 . Rakke pommitati kahekihilise 650 psi (1300 psi) rebendketta abil.

Chl. reinhardtii CC-50 3

Tuumamuundumine viidi läbi, kasutades elektroporatsioonimeetodit 46 . Lühidalt öeldes kasvatati rakud TAP söötmes 4 × 106 rakku ml- 1 . Subsequently, 2.5 × 10 7 cells were harvested by centrifugation and suspended in 250 μl of TAP medium supplemented with 50 mM sucrose (TAP/sucrose). Electroporation was performed by applying an exponential electric pulse of 0.7 kV at a capacitance level of 50 μF (Electro Cell Manipulator ® 600; BTX ® Harvard Apparatus, MA) and using 300 ng of non-linearized plasmids according to the manufacturer's instructions. Transgenic strains were selected directly from TAP/agar plates containing Zeocin TM (10 μg ml −1 ), and the plates were incubated under continuous fluorescent light conditions (20 μmol m −2 s −1 ) at 25 °C.

PCR analysis of the introduced genes and of their promoters in the transformed cells

To determine whether the egfp gene with the tested promoters and the Sh ble gene with CffcpA pro. were introduced into colony-forming cells that showed resistance to Zeocin TM, regions containing the promoters and genes were amplified using the cells as a template. Genomic PCR analyses were conducted using Tks Gflex TM DNA Polymerase (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). The amplicons were analysed using agarose gel electrophoresis. The primers used in the genomic PCR analysis are listed in Supplementary Tables 1 and 2.

RNA isolation

Total RNA was isolated from approximately 5 × 10 7 transformed cells using an RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN Inc., CA) coupled with a RNase-Free DNase Set (QIAGEN Inc., CA). Reverse transcription (RT) was performed using a PrimeScript ® RT reagent Kit (Perfect Real Time) (Takara Bio, Otsu, Japan). We also used a SuperPrep TM Cell Lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, Osaka, Japan) to isolate total RNA and RT from some of the transformed cells.

Assessment of relative promoter activities

qRT-PCR experiments to quantify egfp and Sh ble transcripts in the transformed cells were performed in triplicate on a Thermal Cycler Dice ® Real Time System Single MRQ (Takara Bio Inc., Otsu, Japan) using 2 μl of the cDNA mixture added as a template and SYBR ® Premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus) (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). The cycling conditions involved denaturing for 30 s at 95 °C and 40 cycles of melting (5 s at 95 °C) and annealing coupled with an extension (30 s at 60 °C). To determine promoter activities, each qRT-PCR measurement was performed in triplicate using primers to identify the abundance of Sh ble mRNA and egfp mRNA (shown in Supplementary Table 1). The egfp mRNA levels were normalized by dividing by the Sh ble mRNA levels to minimize variations in transgene expression due to multiple insertions (Fig. 1b).

Effect of culture conditions on DIV promoter activity

To explore the effects of nutrient concentrations in media, growth phases of the tested strain, and light cycles on DIV promoter activity, two transformants with ClP1 were cultured in a low nutrient medium (f/10 medium) and standard nutrient medium (f/2 medium). Transformants at the log and stationary growth phases were collected at approximately 13:30. Transformants cultured in f/2 medium at the stationary growth phase were collected during various photoperiods. Total RNA samples from approximately 5 × 10 7 transformed cells were isolated using the above methods. Using qRT-PCR, we determined the abundance of egfp mRNA and that of rps mRNA. The transcript number of egfp was divided by that of rps , the expression of which was found to be constitutive under various growth conditions 74 and which was used as an internal control. The primers for detecting rps mRNA are listed in Supplementary Table 1.

Voolutsütomeetria

To measure the eGFP fluorescence for the transformed cells, approximately 1 × 10 4 cells were analysed using a BD LSRFortessa™ X-20 flow cytometer system equipped with BD FACS Diva™ software (BD Biosciences, CA). The eGFP fluorescence was analysed using a 488 nm laser and a 530/30 nm bandpass filter. Endogenous chlorophyll fluorescence was analysed using a 488 nm laser and a 610/20 nm bandpass filter. We evaluated cell sizes by measuring the mean forward scatter area (FSC-A) using a 488 nm laser and a 488/10 nm bandpass filter. The data were analysed using FlowJo software (FlowJo, LLC, OR). The cells were gated on endogenous chlorophyll fluorescence so that debris could be eliminated from the analysis conditions. The average values of approximately 1 × 10 4 cells for each sample were used for the statistical analysis.

Statistilised analüüsid

Statistical analyses were performed on the activity levels of the promoters at the transcriptional and translational levels using Student's t -test for two group mean values (the PtfcpA pro. transformants and the other promoter transformants), and statistical significance was achieved when P < 0.01 (**) and P < 0.05 (*). In regard to the transformation efficiency of P. tricornutum , statistical analyses were performed using Student's t -test for two group mean values (the colony number of PtfcpA pro. and that of ClP1). With regard to transformation efficiency in Chl. reinhardtii , statistical analyses were performed using Student's t -test for two group mean values (the colony number of pSP108 and those of DIV promoters, or that of the promoter-less vector and those of DIV promoters).

In silico analyses

Putative cis -regulatory elements in potential DIV promoter regions and other extrinsic promoters (the CaMV 35 S, CMV, and nos promoters) were identified by searching the PLACE 47 and PlantCARE 48 databases. The promoterome analysis was performed following the method described by Russo et al. 41 . In brief, we obtained 12, 237 of the 5′-flanking sequences of the P. tricornutum genes from Ensembl Protists BioMart (Dataset: ASM15095v2 (2013-07-EBI-Phatr3)) 79, 80 . Using the oPOSSUM version 3 56 program, SSA and TCA tests were performed using default parameters. The TFBS profile matrix file for vertebrates, insects, nematodes, and fungi was used in the SSA. For the TCA, the TFBS profile matrix file for vertebrates, insects, and nematodes was used. A consensus sequence for the amplified regions of the tested promoters was also analysed using the consensus motif-finding algorithms CONSENSUS from Melina II 57 and using default parameters amongst potential DIV and extrinsic promoters (CaMV 35S, CMV, and nos promoters).

Lisainformatsioon

How to cite this article : Kadono, T. et al. Characterization of marine diatom-infecting virus promoters in the model diatom Phaeodactylum tricornutum . Sci. Rep. 5, 18708; doi: 10.1038/srep18708 (2015).

Täiendav teave

Wordi dokumendid

  1. 1

    Täiendav teave

Exceli failid

  1. 1

    Supplementary Dataset

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.