Difraktsioonitõkke purustamine fluorestsentsi emissioonierinevuse mikroskoopia abil | teaduslikud aruanded

Difraktsioonitõkke purustamine fluorestsentsi emissioonierinevuse mikroskoopia abil | teaduslikud aruanded

Anonim

Õppeained

  • Biofotoonika
  • Kujutis ja tunnetamine
  • Mittelineaarne optika
  • Üliresolutsiooniga mikroskoopia

Abstraktne

Pakume välja uue füüsikalise mehhanismi difraktsioonitõkke purustamiseks kaugemal. Kui nimetatakse fluorestsentsi emissioonierinevuse mikroskoopiat (FED), põhineb meie lähenemisviis intensiivsuse erinevusel kahe erinevalt omandatud pildi vahel. Fluorestsentsküllastuse rakendamisel saab FED-i lahutusvõimet veelgi suurendada. Tehakse üksikasjalik teoreetiline analüüs ja simulatsioonitestide seeria. FEDi kehtivust praktilises kasutuses näitavad fluorestsentsi tekitavate nanoosakeste ja bioloogiliste rakkudega tehtud katsed, mille ruumiline lahutusvõime on <λ / 4. Kuna sellel on suur kujutisekiiruse realiseerimise potentsiaal, võib seda lähenemisviisi laialdaselt kasutada nanomõõtmetes tehtavates uuringutes.

Sissejuhatus

Hajutisüsteemi difraktsiooni tõttu piirdus tavaliste optiliste mikroskoopide külgmine eraldusvõime kahe viimase aastakümne jooksul umbes poole valgustuslainepikkusest1. Alates 1990. aastatest on difraktsioonipiiri ületamiseks pakutud mitmeid meetodeid, sealhulgas stohhastiline optilise rekonstrueerimise mikroskoopia (STORM) 2, fotoaktiveeritud lokaliseerimismikroskoopia (PALM) 3, stimuleeritud emissiooni kahandamise mikroskoopia (STED) 4, struktureeritud valgustusmikroskoopia (SIM) 5, 6, digitaalne piltide töötlemine 7, 8 ja täieliku sisemise peegelduse mikroskoopia nanostruktureeritud substraadil 9 . Nende hulgas on kõige laiemalt rakendatavad STORM, PALM, STED ja SIM. On tõestatud, et neil kõigil on superresolutsioon kaugetes väljades 10, 11, 12, 13, kuid kõigil on siiski oma piirangud. STORM ja PALM on pikka aega piiratud pildistamiskiirusega. Nende pildistamisprotsessis tuleb omandada tuhandeid kaadreid, seega võtab üliresolutsiooniga pildi rekonstrueerimine kaua aega. Ehkki STORMi kuvamiskiirust parandati hiljuti ~ 3 s-ni pildi kohta 14, 15, on see elusrakkude uurimiseks siiski liiga madal. Veelgi enam, nende kahe meetodi lokaliseerimistäpsus on järsult piiratud teadmata juhusliku orientatsiooniga pöörlemisprobleemidega fluorofooride kuvamisel, mis piirab saavutatavat eraldusvõimet 16 . Teise kiirgust rakendades stimuleeritud emissiooni kaudu võimaliku fluorestsentsi ruumiliseks kitsendamiseks, saab STED realiseerida ülikiire eraldusvõimega kujutise suhteliselt suure kiirusega. STED-mikroskoopia jaoks saadaval olevad fluorestsentsvärvid on siiski endiselt piiratud, kuna nii ergutus- kui ka emissioonispektrid peavad vastama antud ergutus- ja kahanemislainepikkusele. SIM-i saab kasutada ka difraktsioonitõkke purustamiseks. Ergastusvalgust perioodiliselt mustriga muutes nihutab see proovi kõrgsagedusliku teabe madalama sagedusega tuvastamisvahemikku. Kuna valgustusmustri perioodilisust piirab difraktsioon, saab SIM eraldusvõimet laiendada ainult 2 korda. Lisaks nõuab SIM-kaart kallist seadistamist, et praktikas kasutada video kiirusega pildistamiskiirusi. Kuigi küllastunud fluorestsentsi korral saab SIM-i eraldusvõimet veelgi parandada, on niinimetatud SSIM 10, 17 samuti kulukas ja keeruline teostada. Veelgi enam, SSIM-i fluorestsents muutub kergesti valgendatavaks ja see põhjustab fototoksilisust, kuna proov on pikaajaliselt kokku puutunud suure võimsusega tihedusega valgustuskiirega. Seetõttu on vaja jätkuvaid jõupingutusi uute meetodite väljatöötamiseks, mis täiendavalt kasutaksid optilise mikroskoopia potentsiaali ülresolutsiooniga pildistamisel.

Subtraktiivne pildistamine 18, 19 võib pakkuda uusi võimalusi ruumilise eraldusvõime parandamiseks. Selle meetodi puhul suurendatakse ruumilist eraldusvõimet konfokaalsete signaalide lahutamisega erineva nööpaugu suuruse korral. Signaali-müra suhe (SNR) on siiski suhteliselt madal. Põhjus on see, et konfokaalseid signaale, mis võetakse erineva suurusega augudes, ergastab sama valgustuskiir. Selle tulemusel saadakse pärast lahutamist signaale, mis konstrueeritakse lõpliku superresolutsiooniga kujutise jaoks, ergastuspunkti äärealale. Kuid tegelikud efektiivsed signaalid, mida kiirgatakse erutuskoha keskpunkti, on protsessi käigus lahutatud. Hiljuti pakuti välja veel üks pildi lahutamisel põhinev täisvälja mikroskoop, mis võib aksiaalset eraldusvõimet parandada, säilitades külgmise 20 . Kahjuks saab selle eraldusvõimet parendada ainult lähiümbruses.

Siin pakume välja uudse kujutamismeetodi, fluorestsentsi emissioonierinevuse mikroskoopia (FED), mis pakub uut viisi uuringute tegemiseks nanomõõtmetes. Proovi valgustamiseks kasutatakse kahte erinevalt moduleeritud tala, saades sellega kahe skaneeriva pildi. Pärast lahutamist on saadud erineva pildi superresolutsioon koos suhteliselt kõrge SNR-iga.

Tulemused

FED-is tuleb töödelda kahte erinevat skannimispilti. Üks on tavapärane konfokaalne pilt, mis saadakse, kui näidist valgustab kindel ergutusmuster; teine, negatiivne konfokaalne pilt, saadakse siis, kui näidist valgustatakse sõõrikujulise ergutusmustriga, mille saab luua valgustuskiire muutmisel keeristorul 0–2

Image

faasiplaat. Mõlemat pilti tuvastab sama nööpnõel, mis toimib ruumilise filtrina. Lõplik superlahutuslik FED-pilt konstrueeritakse nende kahe pildi intensiivsuse lahutamise teel,

Image
kus
Image
on vastavalt konfokaalse, negatiivse konfokaalse ja FED - pildi normaliseeritud intensiivsuse jaotus;
Image
on lahutav tegur. Mõned negatiivsed intensiivsuse väärtused ilmuvad pärast lahutamist paratamatult erinevuste pildile. Kujutise kvaliteedi parandamiseks jätame need negatiivsed intensiivsused pildist lihtsalt välja. 21

Konfokaalse pildi töötlemisel võib punktjaotuse funktsiooni (PSF) arvutada kui 22

Image
kus
Image
tähistab fluorestsentsi ergastamiseks kasutatava objektiivi PSF-i, nagu on näidatud joonisel 1 (a), ja
Image
tähistab objektiivläätse PSF-i, mida hinnatakse fluorestsentsi lainepikkusel. Lisaks
Image
on nööpaugu edastamise funktsioon. Joonis 1 (c) näitab saadud tulemust
Image
arvutatud Eq. 2. Modifitseeritakse keerise 0–2 abil
Image
faasiplaadil, on ergastamise mustri PSF sõõrikujuline, nagu näidatud joonisel fig 1 (b). Pärast konvolutsiooni koos
Image
, PSF negatiivse konfokaalse pildistamise jaoks,
Image
, moodustab ka sõõrikuju, nagu on näidatud joonisel fig 1 (d). Lahutades
Image
alates
Image
kasutades Eq. 1, FED-i polüesterstaapelkiud,
Image
, saadakse, nagu näidatud joonisel 1 (e).

Image

a) Konfokaalse ergastamise polüesterstaapelkiud. b) Negatiivse ergastuse mustriga polüesterstaapelkiud. c) polüesterstaapelkiud konfokaalse pildistamise jaoks. d) polüesterstaapelkiud negatiivse konfokaalse kujutise jaoks. e) FED-kujutise polüesterstaapelkiud.

Täissuuruses pilt

FED lahutusvõime demonstreerimiseks eeldame, et kaks fluorestsentsosakest eraldatakse vahemaaga λ / 4, ja arvutame vastava FED-pildi simulatsiooni teel. Siin

Image
on valgustuskiire lainepikkus. Vastavate konfokaalsete, negatiivsete konfokaalsete ja FED-piltide normaliseeritud joone intensiivsuse profiilid on näidatud vastavalt joonistel 2 (a), (b) ja (c). Nagu arvati, on konfokaalse joone intensiivsuse profiilil ainult üks tipp, mis näitab suutmatust neid kahte osakest lahendada. Seevastu FED-pildil saame selgelt eristada kahte intensiivsuse tippu joonprofiilis. See tulemus näitab teoreetiliselt, et ruumiline lahutusvõime λ / 4, mis on difraktsioonibarjäärist palju kaugemal, on saavutatav FED abil.

Image

Kahe nanoosakese vahel, mis on eraldatud λ / 4-ga, on a) konfokaalse, b) negatiivse konfokaalse ja c) FED-pildi normaliseeritud joone intensiivsuse profiilid. Polüesterstaapelkiudude jooneprofiilid d) negatiivse konfokaalse ja e) FED kuvamise jaoks erinevate küllastustegurite korral:

Image
(punane kõver),
Image
(roheline kõver) ja
Image
(sinine kõver). f) FED saavutatav eraldusvõime valgustuskiire lainepikkuse ühikutes küllastusteguri funktsioonina
Image
erinevate lahutavate tegurite all: r = 0, 7 (punane kõver), r = 0, 85 (sinine kõver) ja r = 1 (must kõver). Kõik simuleeritud tulemused on esitatud objektiiviga NA = 1, 4.

Täissuuruses pilt

FED eraldusvõimet saab veelgi parandada, kui arvestada fluorestsentsi küllastumisega. Fluorestsentsi teooria kohaselt võib iga fluorofoorimolekul eraldada keskmiselt ühe footoni elu jooksul

Image
10 . Seega, kui seda valgustavad läve kohal olevad valgustugevuse intensiivsused
Image
, muutub selle fluorestsentsi emissioon küllastunud ja reageerib ergastusintensiivsusele mittelineaarselt 23 . Meie küllastunud FED lähenemisviisi korral tehakse fluorestsentsküllastunud olekus ainult negatiivseid konfokaalseid kujutisi. Kontaktivaba pildistamine toimub endiselt küllastumata juhtumite korral. Seega tuleks negatiivse konfokaalse mikroskoopia PSF ümber kirjutada kujul
Image
Siin
Image
tähistab küllastumata juhul negatiivse konfokaalse mikroskoopia PSF-i ja
Image
on küllastustegur, mida määratletakse järgmiselt:
Image
, kus
Image
on ergastuskiire tipptugevus;
Image
on läve intensiivsus. Lisaks võib saadud küllastunud FED polüesterstaapelkiudu väljendada kui
Image
Erinevate küllastustegurite korral negatiivse konfokaalse ja FED-pildistamise polüesterstaapelkiudude jooneprofiilid on näidatud vastavalt joonistel 2 (d) ja (e). Millal
Image
suureneb, FED-pildi intensiivsuse profiili FWHM väheneb. Seetõttu on parem eraldusvõime võimalik siis, kui negatiivse konfokaalse kujutise fluorestsentsiheide küllastub suure intensiivsusega valgustuskiirega.

FED-i saavutatavat lahutusvõimet saab hinnata kahe tihedalt asetseva fluorestsents-nanoosakese FED-i intensiivsuse jaotuse arvutamisel ja Rayleighi kriteeriumi 24 abil, et hinnata, kas kahte intensiivsuse piiki saab eristada. Joonis 2 (f) ja täiendava tabeli S1 andmed näitavad FED-i ruumilisi eraldusvõimet mitmes olukorras. Pange tähele, et lahutatava teguri väärtus

Image
mõjutab ka FED-i jõudlust. Kõrgem
Image
võib summutada rohkem müra, kuid samal ajal võib see ka pilti lisada esemeid. Seega väärtus
Image
tuleks kehtestada nii, et säiliks tasakaal saavutatava eraldusvõime ja negatiivsete intensiivsuste ilmnemise vahel 19 . Praktikas häälestame pärast vastava konfokaalse ja negatiivse konfokaalse pildi saamist lihtsalt väärtuse
Image
vahemikus 0, 7 kuni 1 (see on empiiriline vahemik), et saavutada kõrgeima kvaliteediga erinev pilt.

Pange tähele, et ülalpool pakutud eraldusvõime hindamise meetod vastab kõige paremini hõredatele proovidele. Suure tihedusega proovide, näiteks mõnede realistlike bioloogiliste rakkude pildistamisel halveneb FED lahutusvõime pisut. Sellistel juhtudel saavutatava ruumilise eraldusvõime hindamiseks viisime kodarataolise prooviga 25 läbi simulatsioonikatse. Seda valimit kasutatakse laialdaselt, kuna pilditehnika eraldusvõimet saab väga lihtsalt hinnata, mõõtes vastavas pildis "lahendamata" keskosa ja "eraldatud" perifeerset ala piiritleva ringi raadiuse. Joonisel 3 näidatud tulemused illustreerivad, et kuigi sinise ringiga tähistatud piirkonna sisemisi tunnuseid ei ole võimalik konfokaalses pildis eristada, saab FED-pildil eristada mõnda samas piirkonnas asuvat funktsiooni, mis näitab täiustatud eraldusvõimet. Pealegi, nagu arvati, olid küllastunud FED-i puhul sinises ringis edasised üksikasjad selgelt lahendatud. Seetõttu on FED teostatav ka nende kõrge tihedusega proovide nanoskoopia jaoks.

Image

a) Uuritav proov. Piirkonna suurus: 8 μm kuni 8 μm, piksli suurus: 20 nm. (b) Konfokaalne pilt. c) FED-pilt lahutusteguriga r = 0, 7. d) Küllastunud FED-pilt lahutusteguriga r = 0, 7 (ζ = 2).

Täissuuruses pilt

FED jõudlust praktikas kontrolliti fluorestsentsi tekitavate nanoosakeste (100 nm, kollakasrohelised FluoSpheres, Molecular Probes) kuvamisega. Valguskiiri varustati impulss-laserdioodidega lainepikkusel 488 nm. Konfokaalsed ja FED-pildid on näidatud vastavalt joonistel fig 4 (a) ja (b). Kasutades FED-pildi dekonvolutsiooni teostamiseks Richardsoni – Lucy algoritmi, saame FED + pildi, nagu on näidatud joonisel 4 (c). Joonised 4 (d) ja (e) on vastavalt joonistel 4 (a) ja (c) roheliste kastidega tähistatud piirkondade suurendused. Intensiivsuse profiil piki joont, mida joonisel 4 (d) näidatud kollaste nooltega, näitab selgelt, et eristada saab kahte nanoosakest, mida eraldab vahemaa 105 nm, mis tähendab, et on saavutatud lahutusvõime ~ λ / 4, 6. Konfokaalsel pildil ilmuvad aga samad kaks nanoosakest. Seetõttu suurendab FED eraldusvõimet. Jooniste fig 4 (g) ja (h) võrdlus, mis on vastavalt joonistel 4 (a) ja (c) valgete kastidega näidatud andmete suurendatud vaated, näitab lisaks FED-i paremat lahutusvõimet võrreldes konfokaalse mikroskoopiaga. . Joonisel 4 (i) on näidatud, et FED lahutas selgelt kolm intensiivsuse piiki, kuid need kolm piiki kattusid konfokaalses pildis ja neid ei saa eristada.

Image

a) Konfokaalne pilt. b) FED-pilt lahutusteguriga r = 0, 75. c) FED + pilt. d) Suurenenud vaade andmetele, mis on tähistatud rohelise kastiga punktis a. e) Suurenenud vaade andmetele, mis on tähistatud rohelise kastiga punktis c. f) Normaliseeritud intensiivsuse profiilid, mis on esitatud punktides d ja e kollaste nooltega tähistatud joontel. g) suurenenud vaade andmetele, mis on tähistatud valge lahtriga punktis a. h) suurenenud vaade andmetele, mis on tähistatud valge lahtriga c. i) Normaliseeritud intensiivsusprofiilid piki joont, mida tähistavad punktides g ja h kollased nooled.

Täissuuruses pilt

Lisaks paremale eraldusvõimele on FED-pildil ka kõrgem SNR. Seda saab seletada FED-kuvamise protsessiga. Konfokaalse pildi polüesterstaapelkiud on kindel, negatiivse konfokaalse pildi puhul aga sõõrikujuline (õõnes). Seega lahutati FED-pildi genereerimisel need ergastamise mustri äärealadel kiirgavad fluorestsentssignaalid, mida võib pidada müraks, parandades SNR-i. Pärast dekonvolutsiooni Richardsoni – Lucy algoritmi abil saab FED-piltide SNR-i veelgi parandada, nagu on näidatud joonisel 4.

Järgmisena näitame roheliste fluorestsentsvalkudega (GFP) märgistatud bioloogiliste rakkude kuvamistulemusi. Kujutisel kasutati inimese embrüonaalse neeru 293 (HEK293) rakkude proovi kahte erinevat piirkonda. HEK293 rakke, mida ekspresseeriti stabiilselt GFP-LC3 abil kogu tsütoplasmas, kasvatati steriilsetel klaaskattel ja fikseeriti 4% formaldehüüdiga. Valgustuskiiri varustati ka impulss-laserdioodidega lainepikkusel 488 nm. Saadud konfokaalseid ja FED-pilte on näidatud joonisel 5. Võrreldes FED-pilte nende konfokaalsete kolleegidega, näitasime eraldusvõime ja SNR-i märkimisväärset paranemist, kui neid bioloogilisi proove pildistas FED. FED-kuvamise abil avalikustati paljud tunnused, mis vastavad valimi tegelikele struktuuridele ja mis olid konfokaalse vaatluse all täielikult peidetud.

Image

(a) HEK293 piirkonna 1 konfoktiline pilt. (b) Piirkonna 2 konfokaalne pilt HEK293-s. (c) HEK293 regiooni 1 FED-i kujutis, lahutamisteguriga r = 0, 95. (d) Piirkonna 2 FED-kujutis HEK293-s, lahutamisteguriga r = 0, 9.

Täissuuruses pilt

Arutelu

Meie katses skaneeriti proovi külgsuunas nano-positsioneerimisastme abil. Ruumilist skannimist saab läbi viia ka resonantspeegli abil, kuna nõutav ooteaeg piksli kohta FED-is võib olla suhteliselt lühike. Sel juhul on võimalik saavutada kujutise kiirus; seda on elusrakkude uurimiseks küllaga. Lisaks võimaldab kõrge skannimiskiirus FED-is võrreldes SSIM-iga palju väiksemat ooteaega piksli kohta, mis vähendab oluliselt fotovalgendamise ja fototoksilisuse võimalust.

Selles töös lahutatakse eksperimendi ajal konfokaalsed ja negatiivsed konfokaalsed pildid kaadrhaaval. Täpsemalt, konfokaalse pildi saamiseks skaneeritakse fluorestsentsproovi esmalt pidevalt pideva valgustusmustri abil. Järgmisena moduleeritakse valgustuskiire sõõrikujuliseks mustriks ja skaneeritakse proovi pidevalt uuesti, et saada negatiivne konfokaalne pilt. Selle protsessi käigus võib proovi triivimise tõttu ilmneda erinev pilt. Selle tulemusel pole skannimispunktide positsioonid kahel pildil täpselt ühesugused, mis mõjutab saadud pildi kvaliteeti. Selle probleemi saab lahendada punktide kaupa lahutamise skeemi abil. Pärast tahke valgustusmustri abil ergastatud fluorestsentsi tuvastamist skaneerimispunktis moduleeritakse valgustuse kiirus sõõrikujuliseks mustriks, mis erutab fluorestsentsi samas skaneerimispunktis. Seejärel teisendatakse valgustusmuster tahkeks ja viiakse järgmisesse skaneerimispunkti. Selles skeemis on sama piksli konfokaalse ja negatiivse konfokaalse tuvastuse vaheline ajavahemik võrdne skaneerimise ooteajaga. Nagu ülalpool arutatud, võib skannimisel resonantspeegli abil viibimise aeg igal pikslil olla väga lühike (~ 0, 3 μs). Seetõttu võib proovide triivi sel perioodil pidada tühiseks.

Fluorestsentsi vilkumine võib mõjutada FED-pildi kvaliteeti, kuna see põhjustab ühe molekuli konfokaalse skaneerimise ja negatiivse konfokaalse skaneerimise eri intensiivsusega fluorestsentsi. Olukord on kõige tõsisem, kui valim skaneeritakse kiire resonantspeegli abil ja rakendatakse punktide kaupa lahutamise skeem. Sel juhul on sama piksli konfokaalse ja negatiivse konfokaalse kujutise vaheline ajavahemik võrreldav fluorestsentsi kõikumise perioodiga. Seetõttu on video kiiruse skannimisel eelistatav valida fluorestsentsvärvid, mis vilguvad aeglaselt.

Kokkuvõtlikult pakuti välja uudne nanoskoopia FED. Kahe erinevalt omandatud pildi intensiivsuse erinevuste põhjal võib FED saavutada kaugel asuvas väljal lahutusvõime <λ / 4, mis on tavapärasest difraktsioonibarjäärist tunduvalt üle. Lisaks saab selle lahutusvõimet veelgi parandada, kui proovi fluorestsentsi emissioon negatiivse konfokaalse kujutise korral on küllastunud. Usume, et seda meetodit saab nanoskaalade uurimisel laialdaselt rakendada.

Meetodid

PSF arvutused FED-is

FED teooria kohaselt saab selle polüesterstaapelkiude arvutada järgmiselt:

Image

kus

Image
ja
Image
tähistavad vastavalt konfokaalse ja negatiivse konfokaalse kujutise polüesterstaapelkiude ning
Image
tähistab lahutavat tegurit.

Konfokaalse mikroskoopia PSF

Image
, on andnud
Image
kus
Image
tähistab PSF-i objektiivil, mida kasutatakse fluorestsentsi ergastamiseks. Teisisõnu, see on proovis ergutusmustri normaliseeritud intensiivsuse jaotus.
Image
tähistab objektiivläätse PSF-i, mida hinnatakse fluorestsentslainepikkusel, ja p ( x , y ) on nööpaugu edastamisfunktsioon. Lihtsuse huvides ignoreerime ergastus- ja fluorestsentskiirte vahelist lainepikkuste erinevust ja eeldame lõpmata väikest ava. Seega
Image
ja
Image
. Siis saab konfokaalse mikroskoopia jaoks mõeldud PSF-i kirjutada järgmiselt
Image
Samamoodi saab negatiivse konfokaalse kujutise PSF-i arvutada järgmiselt:
Image
kus
Image
on proovi õõnsa ergastamise mustri normaliseeritud intensiivsuse jaotus.

Elektrivälja jaotust proovis saab arvutada üldistatud Debye integraali abil

Image
kus
Image
on elektrivälja vektor positsioonil (
Image
), mis on väljendatud silindriliste koordinaatidena, mille lähtekoht asub objektiivi ideaalses fookuspunktis,
Image
nurk kiirguse suuna ja optilise telje vahel,
Image
on asimuutnurk, C on normaliseeritud konstant,
Image
on maatriksühiku vektor langeva tala polarisatsiooni kohta,
Image
on langeva valguse amplituudifunktsioon,
Image
tähistab objektiivi läätse lainefrondi aberratsiooni funktsiooni ja
Image
on langeva tala faasimodulatsiooni funktsioon. Konfokaalsel juhul
Image
, samas kui negatiivse konfokaalse juhtumi korral on valgustuskiire faasimodulatsioon keerisega 0–2
Image
faasiplaat,
Image
.

Lõpuks saab FED-i PSF-i arvutada ekvivalentide abil. (5), (7), (8) ja (9).

FED saavutatava eraldusvõime hinnang

Selles dokumendis määratletakse eraldusvõime väikseima vahekaugusena, mille vahel saab eristada kahte fluorestsentsi omavat nanoosakest. Selle hindamiseks eeldame, et kaks nanoosakest on paigutatud X- teljele üksteise lähedale, eraldatuna üksteisest

Image

ja neid pildistab FED. Sel juhul on vastava konfokaalse pildi intensiivsuse jaotus,

Image
, saab
Image
Siin
Image
tähistab konfokaalse pildistamise PSF-i.

Samamoodi on vastava negatiivse konfokaalse pildi intensiivsuse jaotus,

Image
, võib kirjutada kui
Image
kus
Image
tähistab erinevate küllastustegurite korral negatiivse konfokaalse kujutise PSF-i. Pange tähele, et küllastumata juhul
Image
võib ka kirjutada kui
Image
.

Seejärel saadud FED-pildi intensiivsuse jaotus,

Image
, saab lahutades
Image
alates
Image
.

Kasutame Rayleighi kriteeriumi, et hinnata, kas kaks intensiivsuse piiki on

Image
saab eristada. Rayleighi kriteeriumi kohaselt saab kahe piigi lahutada, kui minimaalne intensiivsus nende vahel on alla 73, 5% piigi intensiivsusest. FED-is, kui vahemaa
Image
kahe nanoosakese vahel väheneb, kahe intensiivsuse tipphetk on
Image
liiguvad lähemale ja minimaalne intensiivsus nende vahel kindlasti suureneb. Kui minimaalne intensiivsuse väärtus ületab Rayleighi läve, ei saa neid kahte piiki enam eristada. Seega saab kindlaks määrata FED-i saavutatava eraldusvõime.

Simulatsioonis muutisime väärtust

Image
pidevalt sisse
Image
samme ja arvutas saadud tulemuse
Image
. Väärtuste muutmine
Image
ja
Image
mõjutab ka saavutatavat resolutsiooni. Siin simuleerisime tingimusi, kui r = 0, 7, r = 0, 85 ja r = 1 ning väärtus
Image
muutub 1-lt 15-le eraldusvõimega 1.

Kujutise seadistamine

Täiendav joonis S1 näitab meie FED-süsteemi häälestamist. Valgustuskiirtena kasutatakse kahte erinevalt moduleeritud tala, kiiret1 ja tala2, millel on sama lainepikkus 488 nm. Kujutise T aja esimesel poolel töötab ainult tala1, teisel poolel aga tala1 on välja lülitatud ja töötab ainult tala2. Modulatsiooni sagedus on seatud pildistamiskiirusele kahekordseks. Kui tala1 on olemas, kasutatakse polarisaatorit (polar1) selle muundamiseks lineaarselt polariseeritud talaks. Pärast peegelpildi peegeldumist ja polarisatsioonikiire jagaja (B. Halle GmbH, Berliin, Saksamaa) läbimist peegeldub 1. kiirgus dikroosse peegli abil (Di02-R488-25 × 36, Semrock) ja polariseeritakse ringikujuliselt veerandlaine abil taldrik. Seejärel fokusseeritakse valgusvihk1 läbi objektiivi (HCX PL APO 100 × / 1, 40–0, 7 Oil, Leica Microsystems, Saksamaa) proovi ja moodustab kindla fookuspunkti. Kiire1 poolt ergastatud fluorestsents kogutakse sama objektiivi poolt ja läbib dikroo peegli, et eraldada see valgusvihust1. Järgmisena puhastatakse fluorestsentskiirt veel ribapääsfiltriga (FF03-525 / 50-25, Semrock), enne kui see fookustatakse multimodeeritud optilisteks kiududeks (M31L02, Thorlabs), mis toimib konfokaalse nööpauguna. Kiud kinnitatakse laviini fotodioodile (SPCM-AQR-16-FC, PerkinElmer), mis tuvastab fluorestsentskiire intensiivsuse. Avastatud fluorestsentsi andmeid töödeldakse loendusmooduliga (PicoHarp 300, PicoQuant GmbH, Saksamaa) ja salvestatakse arvutisse. Proov skaneeritakse ruumiliselt nano-positsioneerimisastme abil (P-734.2, Physik Instrumente GmbH & Co., Saksamaa). Sel viisil saadakse konfokaalne pilt. Siirte2 korral sisestatakse optiliselt teele keerise 0–2π faasiplaat (VPP-A1, RPC Photonics, USA). Selle tulemusel moodustab kiirus2 pärast objektiivi läbimist proovil sõõrikujulise õõnsa fookuspunkti, saades negatiivse konfokaalse kujutise. Saadud fluorestsents tuvastatakse nagu kiirguse1 puhul. Enne pildistamist on vaja kalibreerida, et nii valgusvihu1 kui ka valgusvihk2 valgustaksid proovi ühes ja samas kohas. Omandatud andmeid töödeldakse ja analüüsitakse meie välja töötatud tarkvara abil (täiendav joonis S2).

FED-süsteemi kalibreerimine

Enne pildistamist on vaja kalibreerimist, mis tekitab nii tahked kui ka sõõrikujulised valgusmustrid proovi samas punktis, et tagada saadud FED-piltide kvaliteet. Selles dokumendis saavutatakse kalibreerimine ühe fluorestsentsi omava nanoosakese kujutamisega. Pärast vastavate konfokaalsete ja negatiivsete konfokaalsete piltide saamist (täiendav joonis 3) kohandasime nende intensiivsuse jaotuse Gaussi funktsiooniga, määrates sel viisil nende kahe valgustusmustri keskpunktid. Nende kahe keskse koordinaadi erinevuse määramise abil saame hõlpsalt hinnata valgustuskiirte külgsuunalist nihet ja seda reguleerida, häälestades peegeldava peegli asukohta ja orientatsiooni seadistuses.

FED-i seadistuse kalibreerimine on ilmselgelt palju lihtsam kui STED-süsteem, kuna STED-is saab kalibreerimist teostada ainult metalli nanoosakeste kujutamisega, seetõttu tuleb mitu pildisüsteemi optilist elementi, näiteks ribapääsfilter ja dikroiline peegel, eemaldada või asendatud kalibreerimise ajal. FED-i jaoks pole optilisi elemente vaja muuta.

Täiendav teave

PDF-failid

  1. 1

    Täiendav teave

    lisatoimik

Kommentaarid

Kommentaari esitamisega nõustute järgima meie tingimusi ja kogukonna juhiseid. Kui leiate midagi kuritahtlikku või mis ei vasta meie tingimustele või juhistele, märkige see sobimatuks.