Antibiootikumid ja neerude hargnemise morfogenees: toksilisuse võrdlus | laste uuringud

Antibiootikumid ja neerude hargnemise morfogenees: toksilisuse võrdlus | laste uuringud

Anonim

Õppeained

  • Pediaatrilised uuringud

Abstraktne

Taust:

Paljud enneaegselt sündinud vastsündinud saavad infektsioonide raviks antibiootikume, mida kasutatakse aktiivse nefrogeneesi ajal. Uurisime gentamütsiini ja selle alternatiivide, tseftasidiimi ja meropeneemi kliiniliste kontsentratsioonide mõju kusejuha hargnemisele.

Meetodid:

Hiired metanephroi lõigati lahti embrüonaalsel päeval 13 ja neid kasvatati söötmes gentamütsiini, tseftasidiimi või meropeneemi erinevate kontsentratsioonidega või ilma. Neeru suurust null ja 24 tundi hinnati pindala mõõtmisega ning kusejuha puu visualiseeriti kogu aluse värvimise ja konfokaalse mikroskoopia abil. Hargnemist hinnati loendamise teel ja uuriti Wt1 , Sox9 , Bmp7 , Fgf8 ja Gdnf geeniekspressiooni taset.

Tulemused:

Tseftasidiimi kontsentratsioon 2000 μmol / l kahjustas kusejuhade arengut. Lisaks täheldati vastavalt Fgf8 ja Gdnf 4, 5- ja 2, 5-kordset allareguleerimist. Pärast gentamütsiini või meropeneemi kasutamist ei täheldatud kahjulikke toimeid. Pindala laienemise ja kusejuhi pungade moodustumise vahel seost ei täheldatud, kuid selgitatava pinna pindala oli seotud pungade arvuga pärast 24-tunnist kultiveerimist.

Järeldus:

Tseftasidiim, kuid mitte gentamütsiin ega meropeneem, vähendasid hiirtel kusejuha hargnemist ja viitavad Fgf8 ja Gdnf rollile selle mehhanismis. Metanefrosi pindala mõõtmisi saab kasutada pesakonnasisese ja pesadevahelise varieeruvuse vähendamiseks.

Peamine

Neeru areng, mis viib nefronite moodustumiseni, algab 5. rasedusnädalast ja lõpeb enne sünnitust, raseduse 34–36-ndal nädalal. Selle arenguprotsessi häirimiseks on kirjeldatud paljusid tegureid, mis põhjustavad pikaajalisi probleeme, näiteks hüpertensioon ja krooniline neeruhaigus (1).

Üheks selliseks häirivaks teguriks võib olla (nefrotoksiliste) ravimite kasutamine neerude arengu ajal, näiteks rasedatel või enne nefrogeneesi lõppemist sündinud vastsündinutel. Gentamütsiini, nagu ka teisi aminoglükosiide, kasutatakse laialdaselt vastsündinute (kahtlustatava) bakteriaalse infektsiooni esmase ravi osana gramnegatiivsete infektsioonide vastu võitlemiseks. Hollandi perinataalregistri andmete põhjal ravitakse aminoglükosiididega 62% enne 32 nädalat sündinud vastsündinutest, keda võib pidada kõige haavatavamaks rühmaks (2). Kuna gentamütsiini klassifitseeritakse nefrotoksiliseks ravimiks, on selle ohutuses endiselt vaidlusi, kuna on näidatud, et aminoglükosiidid häirivad neerude arengut ja põhjustavad mõnedel katseloomadel vähenenud nefronite arvu (3, 4, 5, 6) ja orelikultuuri uuringud (7).

Meie uurimistöö eesmärk oli uurida antibiootikumiravi mõju nefrogeneesile varajase nefrogeneesi mudelis. Uuriti gentamütsiini ning ka kliiniliselt olulisi alternatiivseid ravimeetodeid, et võrrelda nende ravimite toksilisi võimalusi kliinilises annusevahemikus. Alternatiivse ravina valisime kolmanda põlvkonna tsefalosporiini, tseftasidiimi ja karbapeneemi meropeneemi. Neil kahel ravimil on omadused, mis käsitlevad gramnegatiivseid baktereid, ja nende toimemehhanismid on gentamütsiiniga võrreldes erinevad. Kuigi beeta-laktaamidel on oma potentsiaal olla nefrotoksiline, võib tseftasidiimi manustada üsna suurtes annustes enne, kui tuubulite proksimaalsed kahjustused on märgatavad (8). Mis puutub meropeneemi, siis peetakse seda ravimit üheks ohutumaks karbapeneemiks (9) selle stabiilsuse tõttu neerudehüdropeptidaas-I suhtes (10), mida kinnitati suures kliinilises uuringus (11). Kuigi need gentamütsiini alternatiivid tunduvad üsna ohutud, puudub teave võimaliku toksilise mõju kohta neerude hargnemise morfogeneesile. Hüpoteesisime, et gentamütsiin takistab neeru varajast arengut ja tseftasidiim ja meropeneem osutuvad ohutuks.

Tulemused

Metanephric kasv

Esiteks uurisime pindala kasvu kasulikkust neerude arengu heaks markeriks. Varasemate uuringute (7, 12, 13) ​​põhjal eeldati neeru arengu otsesemat mõõtmist metanefriidi suuruse laienemise ja kusejugade arvu vahel. Kuid nagu jooniselt 1a võib märkida, ei korreleerunud pinna pindala kusejuhi moodustumisega ( R2 = 0, 005, P = 0, 77) ja seetõttu ei kasutatud seda meie uuringutes markerina.

Image

Korrelatsioon (95% usaldusvahemikuga) pindala mõõtmise ja kusejuha pungade moodustumise vahel ( a ) pärast 24-tunnist elundikultuuri ja ( b ) selgitamisel. Pearsoni korrelatsioonikoefitsiendid olid vastavalt a = b ja R2 = 0, 005228 ja R2 = 0, 5082.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Lisaks sellele täheldasime metanefriisi suuruse muutust pesakonnas (kuni 11%) ja meie pesakondade vahel (± 20%), mis põhinevad pindala erinevustel, mida mõõdeti vahetult pärast selgitamist. Uuriti selle variatsiooni mõju kusejugade pungade tipule 24 tunni möödudes. Nagu võib näha jooniselt fig 1b, täheldati olulist korrelatsiooni metaanfriisi suuruse ja kusejuha pungade arengu vahel ( R2 = 0, 5, P <0, 01). Selle avastuse põhjal korrigeeriti selgitamisel kõiki kusejugade tippe metanefrici pindala suhtes.

Ureteric Tip Imaging

Ureetra tipu arengut uuriti kolmes erinevas antibiootikumiklassis. Testiti kolme annuse vahemikku, et hinnata laia ravivastust ja uurida võimalikku annuse-vastuse suhet ( joonis 2 ).

Image

Kolme antibiootikumi, st ( a ) gentamütsiini, b ) tseftasidiimi ja ( c ) meropeneemi söötmes 24 tundi kasvatatud metanefroi kuseteede pungade kvantitatiivne analüüs. Esitatakse nii individuaalsed andmepunktid kui ka vahendid ravirühma kohta. Testiti madalat, kliinilist ja kõrget kontsentratsiooni. Ravirühmade valimid olid vahemikus 15 kuni 27; 10 ja 15; 10 ja 13 vastavalt gentamütsiini, tseftasidiimi ja meropeneemi jaoks. * P <0, 01.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Nagu jooniselt 2b võib märkida, andis ainult 2000 μmol / l tseftasidiimi kontsentratsioon statistiliselt olulise väiksema kusejuha tipuarvu pärast 24-tunnist kokkupuudet (28, 37 vs 48, 16, P <0, 01). See efekt oli ka visuaalselt selgelt tuvastatav ( joonis 3 ). Alumise ja keskmise annuse kasutamisel ei täheldatud arengule mingit mõju võrreldes kontrolliga. Meie katsetes gentamütsiiniga ( joonis 2a ) oli märgatav trend kusejuhte madalama arvu järgi. Ravi meropeneemiga ( joonis 2c ) ei mõjutanud ureetra tipu arengut võrreldes kontrollitud kontsentratsiooniga ühelgi uuritud kontsentratsioonil.

Image

Kusejuha pungade arengu representatiivne immunohistokeemiline värvimine metanefrois, mida kultiveeriti 24 tundi söötmes ( b ) 2000 umol / l tseftasidiimiimi või ( a ) vehiikli kontrolliga.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Geeniekspressiooni analüüs

Uurisime mRNA ekspressioonianalüüsi abil teadaoleva nefrogeneesi ja apoptoosi radade sihtmärkide valikut ( joonis 4 ). Tugev CT tase näitas, et sihtmärgid olid olemas meie metanefric organkultuurides.

Image

Kolme antibiootikumi, st ( a ) gentamütsiini, b ) tseftasidiimi ja ( c ) meropeneemi söötmes 24 tundi kultiveeritud metanefroiumi oluliste nefrogeneesiradade sihtmärkide geeniekspressioon. Vahendid SEM-ga on esitatud a ) kahe või ( b, c ) kolme katse jaoks, välja arvatud kaspaasi sihtmärgid, mis tehti kahes katses. Testitud kontsentratsioonid olid 30 (valged ribad) ja 300 µmol / l (mustad ribad) gentamütsiini jaoks, 200 (valged ribad) ja 2000 µmol / l (mustad ribad) nii tseftasidiimi kui ka meropeneemi jaoks. Katse kohta ühendati kuus kuni üheksa metanefroi.

Täissuuruses pilt

  • Laadige alla PowerPointi slaid

Töötlemine tseftasidiimiga kontsentratsioonis 2000 umol / l põhjustas Gdnf mRNA 2, 5-kordse allareguleerimise, mis on kusejuha hargnemistees teada-tuntud tegur (14). Lisaks täheldati Fgf8 mRNA 4, 5-kordset allareguleerimist ( joonis 4c ). Pärast 200 umol / l tseftasidiimi töötlemist ekspressioonimustrites muutusi ei täheldatud. Ravi gentamütsiini või meropeneemiga ei mõjutanud meie valitud sihtmärkide mRNA taset. Lisaks püsisid kaspaas 3 ja kaspaas 9 mRNA tasemed kontrollide ja gentamütsiini ning tseftasidiimi suurtes annustes töötlemise vahel sarnastena.

Arutelu

Oleme näidanud, et tseftasidiimi kõrgem kliiniline kontsentratsioon vähendab kusejuha hargnemise morfogeneesi ja on näidanud Fgf8 ja Gdnf radade rolli selle toksilisuses. Ureetra hargnemise või nefrogeneesi põhiteedel ei täheldatud gentamütsiini ja meropeneemi kahjulikke toimeid nende oletatava kliinilise annuse piires.

Varasemates aruannetes on neeru arengu mõõtmiseks kasutatud pindala laienemist (7, 12, 13). Meie uuring ei näidanud korrelatsiooni pinna laienemise ja otsesema neeru arengumarkeri, näiteks ureetra pungade arvu vahel. Seda korrelatsiooni puudumist võib seletada metanefrosiooni lamenemisega elundikultuuris ja selle kolmemõõtmelise struktuuri osalise kadumisega, nagu on varem teatatud (15). Mõju tegelikele mõõtmistele ei olnud siiski uuritud. Näitame, et pindala mõõtmised esimese 24 tunni jooksul pärast selgitamist ei ole neerude arenguks sobiv marker.

Ehkki elundi kultiveerimise ajal algupärase lamendamine muudab neerude arengu kvantitatiivseks määramiseks pinnaanalüüsi, võib seletatav pind osaliselt ennustada näpunäidete kogust, mis metanefroiumi korral arenevad. Leidsime olulise korrelatsiooni eksplantaadi suuruse pindala vahel vahetult pärast lahkamist ja kusejuhiotste arvu vahel, mis loendati pärast 24 tundi. Sellist korrelatsiooni võiks eeldada, kuna neerude areng on emakas rohkem väljendunud kui elundikultuuris (16). Seetõttu võib lahutamise ajal arenenumatel (seega hargnenud ja suurematel) metanefrostidel oodata 24 tunni järel kasvamist rohkem otsaotsakaid. Need andmed võimaldavad raseduse vanuse muutusi korrigeerida. Kasutades meie korrelatsiooni, et korrigeerida pärast selgitamist mõõdetud pinna kõigi kusejuhtide arvu, on arenguetapi varieeruvus piiratum ja on võimalik saada täpsemaid võrdlusi annuserühmade vahel, aga ka pesakondade vahel.

Meie esialgne uurimisküsimus oli, kas gentamütsiini kliiniliselt oluline tase võib mõjutada nefrogeneesi ja kas muud antibiootikumide klassid võivad olla ohutumad.

Gentamütsiini potentsiaal nefrogeneesi mõjutada on rottidel juba kindlaks tehtud. Uuringud viidi enamasti läbi emade annustega (3, 4, 5) või sünnitusjärgse annusega (3, 17). Nendes uuringutes ei täheldatud aktiivse nefrogeneesi ajal varase sünnitusjärgse annustamise korral gentamütsiini mõju neerude arengule. Pärast emade annustamist kinnitati gentamütsiini kuhjumist loote neerudes. Lisaks põhjustas kokkupuude emaka gentamütsiiniga glomerulaaride arvu vähenemist kuni 20% ja muutusi torukujulises struktuuris. Nendes uuringutes oli rasedatele naistele manustatud annus siiski 75 mg / kg ja oli peaaegu 20 korda suurem kui kliiniline annus 4 mg / kg, mille kohta ekstrapoleerisime selles uuringus saadud annuse.

Meie tulemused näitavad, et 24-tunnine kokkupuude gentamütsiiniga ei põhjustanud kahjustatud kusejuha hargnemist ega muutnud võtmeteede ekspressiooni. Isegi kui me märkasime kusejuha hargnemise vähenemise suundumust, ei olnud see erinevus statistiliselt oluline. See on vastuolus Gilbert jt varasemate leidudega. kes leidsid vähendatud kusejuha hargnemist rottide elundite kultuurides gentamütsiini kontsentratsioonil 100 umol / l (7). Peamine erinevus meie lähenemisviiside vahel võib leida loomaliikidest (praeguses uuringus rott vs hiired) ja arenguetapist. Usume, et liikide erinevusel on arengujärgus tõenäoliselt teisejärguline tähtsus, kuna emakasisese gentamütsiini kokkupuute mõju neerude arengule teatati nii rottide, hiirte kui ka merisigade puhul (3, 4, 5, 6, 7, 18). Ehkki vastuvõtlikkuses võib esineda mõningaid erinevusi. Võrreldes Theileri ja Witschi arenguetappe (19), on meie E13 hiired võrreldes E14 roti embrüotega umbes 12–24 tundi küpsemad. On hästi teada, et organite arengu ajal esinevate solvangute ajastamisel on tulemuse jaoks suur tähtsus ja et päev hiljem annustamine võib nende mõju täielikult kaotada (20). Neid tegureid arvesse võttes võib gentamütsiin nefrogeneesi häirida, kuid kliiniline annusevahemik tundus olevat ohutu, kui seda manustati uuritud aja jooksul ja liikides.

Meie valitud võimalike alternatiivide andmete põhjal järeldame, et tseftasidiim ei näi olevat gentamütsiini hea asendaja. Suurte annustega rühmas tuvastati neerude halvenenud areng ja vastavate radade alareguleerimine.

Hüpotees on, et tseftasidiim mõjutab neerude eellasrakkude populatsiooni, põhjustades Fgf8 allapoole ja seejärel Gdnf allareguleerimist, mille tulemuseks on kusejuha pungade kahjustused. Fgf8 on oluline neerude eellasrakkude ellujäämisel rakkudes, mis on Gdnf-i tootmise oluline allikas (21, 22). Seevastu Bmp7-s , mis on lokaliseeritud ka eellasrakkude populatsioonis (23), ekspressioonimuutusi ei täheldatud, mis viitab üldisele eellasrakkude kaotusele koos võimaliku rakkude kaotusega konkreetses alampopulatsioonis. Seda järeldust toetavad Caspase 3 ja Caspase 9 normaalsed ekspressioonitasemed, apoptootiliste solvangute markerid, ning see on oluline ka neerutuubulite võrgu normaalses arengus (24). Teise võimalusena võib tseftasidiim mõjutada otseselt nii mesenhüümi kui ka kusejuhte. Kuigi see suur annus on kümme korda suurem kui meie teoreetiline arvutatud kliiniline annus, pole tegelik rakusisene kontsentratsioon inimese rakkudes teada. Meie tulemuste põhjal tuleks tseftasidiimi ohutus rasedate naiste ravimisel läbi mõelda, kuna see võib olla kahjulik loote varasele neerude arengule. Lisaks on varem teatatud, et tseftriaksoonil on negatiivne mõju rottide nefrogeneesile (25), mis rõhutab emade tsefalosporiinide kasutamise üldist potentsiaalset kahjulikku mõju loote nefrogeneesile.

Seevastu meropeneem ei avaldanud negatiivset mõju oluliste arenguteede kusejugade hargnemisele ega mRNA tasemele ning seetõttu võib see nefrogeneesi osas olla gentamütsiini potentsiaalne kasulik asendaja.

Meie uuringutel on mõned piirangud. Esiteks ei saa me arendusetapi ja antikehade värvimismeetodi tõttu praegu hinnata kusejuha pungade värvumist üle 24 tunni kokkupuute. Seetõttu võib juhtuda, et pikaajaline kokkupuude gentamütsiini või meropeneemiga põhjustab lõpuks neerukahjustusi. Geneetiliselt muundatud hiirte kasutamine, millel on sisemine fluorestsentsvalgu ekspressioon kusejuhas, võib selle probleemi lahendada ja võimaldada selliseid pikemaajalisi uuringuid (16). Teiseks puuduvad andmed ravimite tarbimise kohta rakkudes. Gentamütsiin on osutunud embrüonaalsetes neerurakkudes tuvastatavaks pärast 8-tunnist kokkupuudet (7). Meie ex vivo mudel on pisut küpsem ja erinevat tüüpi liikidest, millel võib olla omastamist mõjutav mõju. Siiski märkisime oma katsetes annusega seotud suundumust ja oleme seetõttu kindlad, et meie mudelisse oli sisse viidud gentamütsiini. Tseftasidiimi ja meropeneemi kohta puuduvad andmed organokultuuri omastamise kohta, mis võib mängida rolli meropeneemiga töödeldud metanefroi mõju puudumisel. Kusejuhade pungaotste vähenenud moodustumine suure annusega tseftasidiimi rühmas viitab aga tseftasidiimi imendumisele metanefrossi poolt mõne tunni jooksul. Lisaks uurisime nefrogeneesi radades sihtmärkide valikut ja uurisime pigem geeniekspressiooni kui valgu ekspressiooni. Prooviti immunohistokeemilist lähenemist, kuid see pole seni lisateavet pakkunud. Lisaks väikestes kudedes metanephroi kujul esinevate valgu ekspressioonitasemete uurimise tehnilistele raskustele näeme, et nende kultiveeritud metanephroi olulised morfoloogilised muutused näitavad muutunud geeniekspressioonitasemete olulisust. Apoptoosi uurimiseks otsustasime uurida 2 erineva kaspaasi mRNA taset. Alternatiivina võiks TUNELi kasutada samal määral ja seda tuleks kasutada ka tulevastes uuringutes. Lõpuks, praegu ei ole meil andmeid arengu erinevate ajapunktide kohta, mil neer võib olla konkreetsete ravimite suhtes haavatavam. See oleks väga oluline edasine samm uuringutulemuste seostamisel inimese embrüonaalse neeru arenguga.

Meie eesmärk oli kindlaks teha, kas need antibiootikumiühendid võivad kliinilistes annustes manustatuna häirida ureetra pungade diferentseerumist basaal arenguprotsessis. Meie andmete põhjal võime järeldada, et lühiajaline ravi gentamütsiini või meropeneemiga neeru embrüonaalses arengujärgus ei avalda nefrogeneesile kahjulikku mõju. Kuid tseftasidiimi inhibeeriti kusejuha hargnemist ning Fgf8 ja Gdnf - neerude arengu kahe olulise teguri - ekspressiooni. Lisaks ei tohiks metaanefri pindala kasvu kasutada neerude arengu ennustajana, vaid selgitava pindala abil saab korrigeerida pesakonnasiseseid ja pesakondade vahelisi erinevusi arengufaasides.

Meetodid

Narkootikumid

Gentamütsiin (G1272) ja tseftasidiimi hüdraat (C3809) saadi ettevõttelt Sigma-Aldrich (Zwijndrecht, Holland). Meropeneem saadi firmalt Fresenius Kabi (Teramo, Itaalia).

Orelikultuur

Katsed kiitis heaks Nijmegeni Radboudi ülikooli loomaeetika komitee. Embrüonaalse 13. päeva rase HSD: ICR-emased hiired (Harlan, Horst, Holland) surmati pärast saabumist emakakaela dislokatsiooni teel ja neerud eraldati embrüodest kahe väikese nõela abil. Intaktset isoleeritud metanefroi hoiti jääl eeljahutatud Leibovitzi söötmes (Gibco, Paisley, Suurbritannia) kuni üleviimiseni elundikultuurisüsteemi. Metanefroid kasvatati 0, 4 um poorisuuruses Millicelli rakukultuuri insertidel (Millipore, Carrigtwohill, Iirimaa), mis asetati kuue süvendiga plaadile, mis sisaldas DMEM / F-12 (1: 1) söödet (Gibco), millele oli lisatud 10 mg / l insuliini, 5, 5 mg / l transferriini ja 5 ug / l naatriumseleniiti (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Sõltuvalt ravist lisati söötmele ravimeid ja metanefroi inkubeeriti 24 tundi temperatuuril 37 ° C ja 5% C02. Gentamütsiini jaoks valiti ravimi kontsentratsioonid 3, 30 ja 300 umol / l. Tseftasidiimi ja meropeneemi testiti mõlemad kontsentratsioonidega 20, 200 ja 2000 µmol / l. Kontsentratsioonitasemed arvutati järgmiselt: Kasutati kliinilist annustamist pediaatrias ja korrigeeriti plasma seondumise ja jaotusruumala osas vastavalt tabelis 1 kirjeldatule (26, 27, 28, 29, 30, 31, 32). Lisaks uuriti kontsentratsioone koefitsiendiga 10 ülalpool ja allpool, et võtta arvesse arvutuste ebamäärasusi ja uurida potentsiaalse doosile reageerimise suhet.

Täissuuruses tabel

Kõik ühe pesakonna metanefroid jaotati juhuslikult ühte ravirühma ja iga ravimi jaoks lisati eraldi ravirühm, mis koosnes samast pesakonnast pärit metanefroiidest. Pesakonna kohta uuriti ühte ravimit, et välistada erinevusi pesakondade varieeruvuse alusel. Uimasti kohta uuriti mitu pesakonda.

Metanephric kasv

Selgitatud metanefroi kasvu määrati pindala laienemise mõõtmisega 24 tunniga. Metanefroi fotod saadi kaameraga Canon EOS 1000D (Canon, Hertogenbosch, Holland), mis oli kinnitatud Zeiss Axiovert 25 mikroskoobiga (Carl Zeiss, Sliedrecht, Holland) kogu suurendusega 12, 5 ×. Taustvalgus seati maksimaalsele intensiivsusele ja kasutati säriaega 40 ms. Fotosid tehti eraldusvõimega 10, 1 megapikslit ja pindala suurust analüüsiti FIJI / ImageJA versiooniga 1.45i (33).

Ureteric Tip Imaging

Ureetra puu visuaalseks muutmiseks pärast 24-tunnist kultiveerimist viidi läbi metanephroi terve immuniseerimine. Metanefroi fikseeriti 10 minutit jääkülmas metanoolis ja pesti 15 minutit fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Seejärel inkubeeriti metanefroid PBS-is, mis sisaldas 2% veise seerumi albumiini, 12 tundi, et blokeerida mittespetsiifiline seondumine. Pärast pesemist PBS-iga, mis sisaldas 1% Triton X-100 (PBS-T), inkubeeriti metanefroi 24 tunni jooksul kalbindiin-D28k (Sigma Aldrich) vastase antikehaga, lahjendatud 1: 100 PBS-T-ga. Pärast PBS-T-ga pesemist inkubeeriti uuesti 24 tunni jooksul Alexa 488 IgG antikehaga (Invitrogen, Eugene, OR) lahjendusega 1: 300 PBS-is, mis sisaldas 2% veise seerumi albumiini. Kõik inkubeerimise ja pesemise etapid viidi läbi temperatuuril 4 ° C. Pärast viimast 15-minutist pesemist PBS-T-s monteeriti metanefroid slaidile kinnituskeskkonnas (Dako, Carpinteria, CA) ja suleti parafiini kasutades.

Iga metanefrosi jaoks visualiseeriti kusejuha hargnemine konfokaalse laserskaneerimise mikroskoobiga, kasutades Leica TCS SP2 mikroskoopi. Optiline lõikamine viidi läbi intervalliga 4 um, suurendusega 10x. Metanefrossi kohta saadi 18–30 pilti eraldusvõimega 1024 × 1 024 pikslit. Seejärel loendati FIJI-s mitmepunktilise tööriista abil kusejuurte arv. Ots määrati kogu hargnemisstruktuuri lõpp-punktiks, millel ei olnud hargnemise märke.

Geeniekspressiooni analüüs

RNA eraldati metanephroist, ühendades Trizoli ekstraheerimismeetodi NucleoSpin RNA II isolatsioonikomplektiga (Machery-Nagel, Düren, Saksamaa). Metaanfoorid suspendeeriti Trizolis (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja inkubeeriti umbes 30 minutit, vahetevahel segades. Pärast kloroformi (Merck) lisamist inkubeeriti proove 5 minutit jääl ja tsentrifuugiti 15 minutit kiirusel 14 000 g , temperatuuril 4 ° C. Vesifaasile lisati seondumistingimuste reguleerimiseks 1: 1 kuni 70% etanooli ja kanti Nucleospin kolonni. Edasine puhastamine viidi läbi vastavalt tootja juhistele. RNA kontsentratsiooni ja kvaliteeti hinnati Nanodrop 2000c spektrofotomeetriga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

Täiendav DNA genereeriti Biozym MJ Research PTC-200 Peltieri termotsükleril, kasutades juhuslikke praimereid (Promega, Madison, WI), oligo dT (Promega) ja M-MLV pöördtranskriptaasi (Invitrogen). Wt1 , Sox9 , Bmp7 , Fgf8 , Gdnf , Casp3 ja Casp9 mRNA taset mõõdeti kvantitatiivse PCR-iga (qPCR), sisemisteks standarditeks Actb ja Hmb .

qPCR viidi läbi Biorad CFX96, kasutades geeniekspressioonisegu ja hüdrolüüsisondide abil ( tabel 2 ), nagu on tellinud Applied Biosystems (Pleasanton, CA). Uuriti delta-delta CT väärtusi ja teguri 2 üles- või alareguleerimist peeti bioloogiliselt oluliseks.

Täissuuruses tabel

Statistika

Metaanfikri pinna laienemist 24 tunni jooksul ja metanefri pinna pindala selgitamisel uuriti nii korrelatsiooni suhtes kusejuhi punga tipu arenguga kui ka testiti Pearsoni korrelatsioonikordajaga.

Ureetra punga tipu arengu võrdlust iga ravi korral uuriti dispersioonanalüüsi ühesuunalise analüüsiga, millele järgnes Dunnett post hoc . Mõlema analüüsi jaoks uuriti statistilist olulisust tasemel α = 0, 05.

Finantstoetuse avaldus

Seda projekti toetas Hollandi Neeru Sihtasutuse (Bussum, Holland) MFS-ile antud Kolffi toetus (KJPB.08.06).

Avalikustamine: avalikustamiseks pole huvide konflikti.